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We have assayed genetic polymorphisms in several species of parasitic protozoa by means of random amplified polymorphic DNA (RAPD). One goal was to ascertain the suitability of RAPD markers for investigating genetic and evolutionary problems, particularly in organisms, such as the parasitic protozoa, unsuitable for traditional methods of genetic analysis. Another goal was to test certain hypotheses concerning Trypanosoma cruzi, and other protozoa, that have been established by multilocus enzyme electrophoresis. The RAPD results corroborate the hypothesis that the population structure of T. cruzi is clonal and yield a phylogeny of the clonal lineages in agreement with the one obtained by enzyme electrophoresis. This parity between the two sets of results confirms that RAPD markers are reliable genetic markers. The RAPD markers are also suitable for reconstructing species phylogenies and as diagnostic characters of species and subspecific lineages. The number of DNA polymorphisms that can be detected by the RAPD method seems virtually unlimited, since the number of primers can be increased effectively at will. The RAPD method is well suited for investigating genetic and evolutionary questions in certain organisms, because it is cost effective and demands no previous genetic knowledge about the organism.

Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers combined with the Simple Matching index for calculating the distance matrix were used to determine the genetic diversity of African cassava clones. A preliminary study of three Manihot species using 20 primers clearly showed that RAPD markers were relevant for analyzing their genetic diversity. DNAs from 19 cultivars of Manihot esculenta Crantz (cassava) were amplified using 8 primers. Cultivars were well discriminated and coherently distributed, comparing to previous results from isozymes and RFLP studies. Genetic diversity analysis, characterization of collections and study of introgression are the domains that RAPD markers can contribute to the improvement of cassava.

La variabilité inter et intraspécifique de #Globodera$ parasites des Solanacées est évaluée par leurs gammes d'hôtes et leurs profils RAPD. Divers espèces et cultivars de tabac sont testés vis-à-vis de #Globodera tabacum$ sensu lato et de #G. "mexicana"$. les profils RAPD sont étudiés sur 26 populations appartenant aux six espèces (publiées ou non) de #Globodera$. De fortes différences dans la gamme d'hôtes permettent de classer les populations en groupes de virulence. Huit amorces Operon de dix bases (OPG-1, OPG-2, OPG-3, OPG-4, OPG-5, OPL-3, OPL-4, OPL-6) permettent d'identifier 222 marqueurs RAPD. Divers programmes d'analyses en grappes et en composante principale sont réalisés en utilisant ces marqueurs, avec de très faibles différences de classification entre programmes. Les dendrogrammes obtenus montrent l'existence de quatres unités taxinomiques, à savoir #G. rostochiensis$, #G. pallida$, #G. tabacum$ et #G. "mexicana"$. Ils sont semblables à ceux obtenus précédemmenet avec l'analyse de restriction des ITS. Ils révèlent des apparentements congruents avec ceux déterminés par la gamme d'hôtes et non contradictoires avec les barrières génétiques précédemment mises en évidence par les hybridations in vitro. (Résumé d'auteur)

Trypanosoma congolense$ est une espèce de protozoaire parasite, qui est un des responsables majeurs de la trypanosome animale sévissant en Afrique. Il fait partie du sous-genre #Nannonomas$, de la famille des #Trypanosomatidae$. Selon la taxonomie actuellement en vigueur il se subdivise en 3 groupes écogéographiques appelés : "Savannah", "Forest", et "Kilifi". Notre travail a eu pour objectif d'étudier la variabilité génétique de ce parasite par électrophorèse multilocus d'isoenzymes et par amplification de manière aléatoire de l'ADN ou Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), et surtout, d'appliquer à l'analyse de ces données les méthodes de la génétique de l'évolution. Nous avons analysé à cet effet 49 stocks d'origines géographiques diverses avec 18 systèmes isoenzymatiques polymorphes et 23 amorces RAPD. Nous avons d'abord commencé par mettre au point un milieu de culture qui permet de maintenir de façon pérenne #T. congolense$ in vitro. Les résultats obtenus sur les analyses génétiques corroborent la subdivision actuelle de #T. congolense$ en 3 groupes distincts. Dans l'analyse phylogénétique, #T. congolense$ n'apparaît pas comme un groupe monophylétique distinct des autres espèces incluses dans notre analyse (#T. simiae$, #T. godfreyi$). Il est impossible de savoir si ce résultat est dû au fait que le niveau de résolution des isoenzymes et des RAPD est mal adapté pour étudier des niveaux de divergence phylogénétique aussi importants (horloge moléculaire trop rapide), ou si #T. congolense$ est un groupe réellement polyphylétique. Nous avons comparé la variabilité RAPD de #T. congolense$ avec celles d'autres parasites voisins (#Trypanosoma brucei$ sensu lato, agent de la trypanosomose africaine, #T. cruzi$, agent de la maladie de Chagas, et diverses espèces de #Leishmania$, agents des leishmanioses). (Résumé d'auteur)

La technique des RAPD a été utilisée pour évaluer la variabilité intra- et inter-spécifique chez des lignées de #Meloidogyne$ tropicaux. La reproductibilité de la technique a été évaluée ; pour chaque couple "amorce - ADN testé", l'ADN des différentes lignées de #Meloidogyne$ testées n'est pas en cause pour expliquer les différences de reproductibilité ; ce sont les amorces qui en sont responsables, certaines se révélant meilleures que d'autres en terme de reproductibilité des résultats et donc de fiabilité. #M. arenaria$ montre la variabilité intraspécifique la plus importante ; quelques amorces seulement suffisent à distinguer les espèces bien que les données produites par certaines d'entre elles révèlent plus de similitude entre certaines lignées de #M. arenaria$ et de #M. javanica$ qu'au sein même du groupe de lignées de #M. arenaria$. Trois lignées virulentes de #M. arenaria$ peuvent être distinguées tant des autres lignées, non virulentes, de #M. arenaria$ que des autres lignées de #M. javanica$, #M. incognita$, #M. mayaguensis$ et #M. hapla$. La comparaison des données obtenues sur le même jeu de lignées par RFLP et RAPD révèle des valeurs équivalentes en terme de différence interspécifique mais la technique des RAPD met en évidence une variation plus importante au niveau intraspécifique. (Résumé d'auteur)

Le présent travail a comparé la diversité génétique d'un procaryote, #Escherichia coli$ et d'un microorganisme eucaryote #Trypanosoma cruzi$, protozoaire parasite agent de la maladie de Chagas. L'étude a confirmé que les populations d'#Escherichia coli$ présentent un fort déséquilibre de liaison, non imputable à la distance géographique. Ceci constitue un argument indirect classique pour une structure clonale, et confirme les hypothèses précédemment proposées par d'autres auteurs. La comparaison directe a montré que les populations d'#E. coli$ apparaissent cependant moins structurées que celles de #T. cruzi$, comme le suggère la dispariton du déséquilibre de liaison quand on considère chaque groupe isolément, ou quand on élimine les génotypes répétés de l'analyse. L'analyse phylogénétique d'#E. coli$ recoupe dans ses grandes lignes celle présentée par d'autres auteurs. Il est à noter que la distance de migration séparant les électromorphes est constamment moindre chez #E. coli$ que chez #T. cruzi$, ce qui suggère des niveaux de divergence phylogénétique inférieurs. D'une manière générale, l'approche comparative directe conduit à minimiser les similitudes évolutives entre #E. coli$ et #T. cruzi$ suggérées par l'analyse des seules données de la littérature. Le présent travail doit être considéré comme préliminaire, et devra être complété par des analyses plus poussées reposant sur des techniques davantage perfectionnées. (Résumé d'auteur)

Des marqueurs RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ont été utilisés avec succès pour analyser la diversité génétique parmi des accessions sauvages et cultivées de #Coffea arabica$. La base génétique étroite des cultivars est confirmée. En revanche, une relative large diversité est observée dans le matériel sauvage illustrant l'intérêt des prospections. Des résultats suggèrent une différenciation génétique Est-Ouest en Ethiopie qui constitue le centre primaire de diversification de #C. arabica$. L'important effet d'hétérosis observé chez des hybrides intergroupes pourrait être lié à cette différenciation génétique. La méthode RAPD apparaît performante pour l'étude de la variabilité génétique et la classification du germplasm de #C. arabica$. (Résumé d'auteur)

In order to study the genetic diversity of the #Leishmania$ genus, Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) was performed on a set of 18 #Leishmania$ stocks representative of the main species of the genus. We tested on these sample one hundred decamer primers in parallel with samples of other microorganisms (#T. cruzi$, #T. congolense$, #Candida albicans$, #M. tuberculosis$). Several lines of results have been reached. Twenty three primers gave easily scoreable multiband profiles. The combined use of a fair set of these primers will make it possible to perform both, highly discriminative strain identification and population genetic analyses. Some of them showed a synapomorphic specificity, that is to say : they can specifically identify given phylogenetic subdivisions, either at a subspecific or at a specific level. For example, one primer showed a profile specific of #Leishmania peruviana$. Other primers revealed different profiles between #L. guyanensis$, #L. braziliensis$, #L. lainsoni$ and #L. chagasi$. Lastly, some primers appeared to be linked with specific virulence patterns. Some of them, for example, seemed to be able to distinguish the stocks isolated from mucocutaneous forms from the stocks isolated from cutaneous forms for #L. braziliensis$. The great interest of the RAPD method in comparison with isoenzyme analysis is to allow the purification and sequence characterisation of those fragments which are of a specific interest, for designing probes and PCR diagnoses. (Résumé d'auteur)

L'hétérogénéité génétique à l'intérieur et entre des populations naturelles du Lémurien #Lepilemur mustelinus ruficaudatus$ a été étudiée par l'amplification au hasard d'ADN polymorphique (RAPD). Les populations sont localisées dans la région occidentale de Madagascar et ont subi différents niveaux de fragmentation. Par l'utilisation de six marqueurs arbitrairement marqués (AP-) PCR un total de 153 produits RAPD ont été comparés dans un échantillon de 48 individus. Dans les données disponibles aucun effet de taille de la population sur la variabilité génétique n'a été observé. Cependant, basé sur la diversité des nucléotides, le degré de variabilité moléculaire observé reflète des tendances vers un comportement d'accouplement non hasardeux. (Résumé d'auteur)

Les méthodes de taxonomie classique de même que des essais de croisement et l'amplification au hasard de l'ADN polymorphique (RAPD) ont été utilisés pour détecter les différences morphologiques et génétiques entre populations d'#Heterorhabditis$ Pointar, 1975 provenant de Californie. Une nouvelle espèce, #Heterorhabditis hepialius$ sp. n., présente dans des chenilles d'#Hepialis californicus$ provenant de la baie de Bodega (Californie, Etats-Unis d'Amérique) est décrite et illustrée. Représentant la huitième espèce du genre, #H. hepialius$ sp. n. est caractérisé par la morphologie des spicules, du gubernaculum, et de la queue de la femelle ainsi que les rapports E et F chez les juvéniles infestants. Des données sur sa biologie sont également fournies. (Résumé d'auteur)

Trypanosoma cruzi$ natural populations have been shown to be highly heterogeneous and subdivided into a number of genetically distant clonal lineages. We have selected 21 highly resolutive primers, out of 120 tested, to analyse 50 stocks representative of the major genetic subdivisions of the parasite. Stocks were isolated from diverse hosts and from different geographic areas. Other trypanosomatids, including #Leishmania$ and #T. congolense$, were analysed in parallel in order to directly compare their genetic diversity with #T. cruzi$. The results show the marked genetic structuration of #T. cruzi$ in a few distinct genetic groups, confirming previous MLEE and RAPD data. These groups are interpreted as clonal lineages. RAPD markers specific for each group are numerous and will be used to develop probes for specific diagnostic purposes. The huge genetic heterogeneity of #T. cruzi$ is confirmed by the divergence between lineages of this parasite which is similar to that observed between species, and even species complexes, within the #Leishmania$ genus. The phylogenetic relationships between the #T. cruzi$ groups were investigated by multivariate and phylogenetic analysis. The monophyly of each group appears robust, but the hierarchical relationships between groups are problematic. Moreover, some groups display features that could be interpreted as the result of a hybridization event between strains of two other groups. These findings suggest the possibility of an evolutionary process involving both occasional recombination leading to new genotypes and clonal evolution of successful lineages. (Résumé d'auteur)

Les relations génétiques des deux genres de nématodes entomopathogènes #Heterorhabditis$ et #Steinernema$ ont été étudiées grâce à des marqueurs d'ADN polymorphes amplifiés au hasard (RAPD). Les espèces appartenant à ces genres sont en effet dotées d'un fort potentiel de contrôle biologique des insectes nuisibles et leur identification rapide et sûre est importante pour leur utilisation. Quatre-vingts amorces de séquence aléatoire de dix bases ont été testées en vue de leur utilisation pour déterminer la variabilité génétique existant chez des isolats d'#Heterorhabditis bacteriophora$, #H. megidis$, #Steinernema glaseri$, #S. carpocapsae$ et #S. feltiae$. Une similarité de 0 à 6% est observée entre les membres des différents genres ; cette valeur est de 20% pour les espèces congénères. Une analyse génétique utilisant sept amorces de différents isolats d'#Heterorhabditis$ d'origines variées a révélé une similarité de 24-96%. Ces résultats confirment d'autres observations montrant de nombreuses différences génétiques entre les isolats. L'analyse en RAPD décrite ici peut être utilisée pour l'évaluation de la variabilité génétique chez les espèces et isolats de nématodes entomopathogènes. (Résumé d'auteur)

La variabilité génétique d'#Onchocerca volvulus$ a été étudiée sur plusieurs isolats du Cameroun. Cette filaire est la deuxième cause infectieuse de cécité dans le monde et affecte, selon l'OMS, environ 17 millions de personnes en Afrique, en Amérique Centrale et en Amérique du Sud. La complexité de l'épidémiologie de l'onchocercose apparaît liée à l'existence de différentes souches du parasite qui sont à l'origine de taux de cécités très variables selon les régions étudiées. Plusieurs types de marqueurs ont été utilisés pour étudier différentes populations d'#O. volvulus$ du Cameroun ; les sondes spécifiques des souches de savane d'Afrique de l'Ouest s'hybrident avec tous les isolats étudiés. De nouveaux marqueurs ont donc été recherchés. Il s'agissait des RAPD et des séquences microsatellites, deux techniques basées sur la PCR qui présentaient l'avantage de pouvoir travailler sur des faibles quantités de matériel biologique. La technique des RAPD a été utilisée, dans un premier temps, sur différentes espèces de filaires du genre #Onchocerca$ proches d'#O. volvulus$ afin de déterminer sa capacité à visualiser du polymorphisme interspécifique. Appliquée à différents isolats d'#O. volvulus$ du Cameroun, la technique des RAPD a montré la grande hétérogénéité de cette espèce entre vers issus de foyers géographiquemnet proches, confirmant ainsi un phénomène déjà mis en évidence par la technique des isoenzymes. Cependant, en raison des difficultés rencontrées lors de la mise au point de cette technique (problèmes de reproductibilité), de nouveaux marqueurs de populations ont été recherchés. Nous avons ainsi isolé, pour la première fois chez un parasite, des séquences microsatellites du génome d'#O. volvulus$. Celles-ci ont permis de séparer les isolats provenant de quatre foyers du Cameroun et même des individus provenant de deux modules excisés d'un même patient. (Résumé d'auteur)

Des caractères morphologiques et la longueur de fragments d'ADN amplifiés au hasard (RAPD) ont été utilisés pour réaliser une analyse phylogénique des nématodes entomopathogènes du genre #Steinernema$. Les résultats concernant les relations phylogéniques entre espèces de #Steinernema$ fondées sur différentes bases de données n'ont pas été concluants. Les fragments de RAPD ont correctement séparé les espèces, mais la divergence entre espèces est si importante que cette analyse n'a apporté que peu d'information sur les relations phylogéniques entre espèces. Néanmoins, les fragments de RAPD peuvent être utilisés pour étudier la phylogénie des populations d'une même espèce car nombre de fragments de RAPD communs ont été trouvés parmi les populations d'une même espèce. La phylogénie déduite des caractères morphologiques est similaire à celle déduite de l'analyse de polymorphisme de fragments d'ADN ribosomal. Le rapport D (distance de l'avant au pore excréteur divisée par la distance de l'avant à la base du pharynx) chez les mâles et les juvéniles infestants montre un index de consistance individuelle de 1, ce qui pourrait se révéler important pour l'évaluation de la phylogénie. (Résumé d'auteur)

La sélection, pendant sept générations, d'une population de #Globodera pallida$ pour sa virulence envers le cultivar de pomme de terre partiellement résistant Darwina (Marijke x VTN2 62.33.3) provoque une augmentation du taux de reproduction indiquant un rapport élevé de génotypes virulents au sein de la sélection ainsi réalisée. Les modèles d'ADN polymorphes amplifiés au hasard (RAPD) appartenant aux populations sélectionnée et non sélectionnée se sont révélés généralement très similaires pour les 40 amorces testées. Pour deux de ces amorces cependant, deux fragments additionnels non homologués d'ADN ont été amplifiés dans la population sélectionnée. L'analyse par RAPD de kystes isolés démontre que les propriétés de l'ADN conduisant à ces fragments amplifiés sont très enrichies en ce qui concerne la population sélectionnée. L'un de ces fragments d'ADN a été cloné et utilisé pour tester l'ADN amplifié de seize populations de #G. pallida$. Une hybridation n'est observée qu'avec les populations montrant un taux de reproduction élevé sur le cv. Darwina, ce qui peut indiquer une corrélation entre le fragment d'ADN et un type particulier de virulence. (Résumé d'auteur)

Studies on the population genetics of #T. cruzi$ revealed substantial variability of these organisms regarding the isozyme genotype and the main conclusion of these analyses is that the population structure of the protozoa is clonal rather than sexual. Other molecular methods such as schizodemes and RAPD also defined highly variable groups. In order to analyze the genetic diversity in #T. cruzi$, we applied two independent nuclear genes that have proven to be useful as molecular markers of 1) evolution in most cell types - the ribosomal RNA genes and 2) genomic variation in trypanosomatids - the mini-exon gene. The measure of diversity among #T. cruzi$ isolates consists of 110 bp or 125 bp amplification products derived from the 24Sa rRNA gene using the same pair of primers, and the mini-exon gene non-transcribed spacer region that shows 40% divergency between the two groups. A dimorphism in the #T. cruzi$ mini-exon non-transcribed region is able to cluster 66 isolates in two distinct groups (1 and 2) that correlates with the ribosomal DNA dichotomy in 57 samples. In a portion of the samples (9), both the 125 and 110 bp products derived from the 24Sa rRNA gene were amplified (group 1/2). Since 6 of these samples were clonal lines, the possibility of mixed population is ruled out. These nine samples were typed as mini-exon gene group 1. Analysis of these two independent nuclear markers and confirmatory RAPD data suggested the division of #T. cruzi$ isolates into two major groups. The presence of the rRNA gene group 1/2 calls the attention to the possibility of gene flow in these parasites. (Résumé d'auteur)

L'analyse de 57 souches de #Trypanosoma cruzi$ par amplification de l'ADN par amorces aléatoires (Random Amplification of Polymorphic DNA=RAPD), et la comparaison des résultats avec des données isoenzymatiques obtenues indépendamment, ont permis de confirmer la valeur de cette nouvelle méthode comme outil épidémiologique et phylogénique. Cette étude, basée sur un marquage génétique très résolutif, a montré une variabilité génotypique non négligeable au sein des souches appartenant à un "clonet" (ensemble de génotypes clonaux apparaissant comme identiques pour une série de marqueurs donnée) antérieurement décrit. Dans le cadre d'un débat récemment ouvert, du fait d'un manque de puissance des tests statistiques dû à une variabilité génétique insuffisante, les présentes données ne permettent pas de dire si ce "clonet" est effectivement composé de génotypes clonaux, ou s'il correspond au contraire à une espèce cryptique sexuée. Cependant, la méthodologie nécessaire pour reprendre la question a été dégagée. (Résumé d'auteur)

La réaction de polymérase en chaîne (RAPD) a été utilisée pour comparer l'ADN de quatorze populations de #Radopholus similis$ provenant de différentes plantes hôtes et de régions variées du Sri Lanka, ainsi que l'ADN d'une nouvelle espèce de #Radopholus$ originaire de l'est de Java. Quatre populations isolées d'aréquier, théier, bananier et citrus semblent très différentes d'après leur profil de RAPD. L'analyse hiérarchisée des groupes des données obtenus d'après les profils de RAPD a permis un essai de regroupement des quinze populations en trois groupes et a montré l'éloignement de trois isolats demeurant jusqu'à maintenant monotypiques. Les résultats sont examinés dans le contexte de l'existence de biotypes de #R. similis$ et de leur divergence génétique au Sri Lanka. (Résumé d'auteur)

Isoenzyme analysis of Chilean and Paraguayan stocks of #Trypanosoma cruzi$, the agent of Chagas' disease, was performed at 19 variable genetic loci. The results were interpreted in terms of evolutionary and population genetics. As previously shown for this parasite in other geographic areas, a basically clonal population structure was evidended, by both strong departures from Hardy-Weinberg expectations and high linkage disequilibrium. The isoenzyme variants of #Trypanosama cruzi$ (or zymodemes) behave as natural clones, stable in space and time, and should be considered as the relevant taxonomic unit for medical studies. Two main clusters of clones were evidenced, separated by high genetic distances. Comparison between clonal populations in sylvatic and domestic transmission cycles of the disease in Chile strongly suggested that these two cycles are at least partly separated from one another. For comparison purposes with the isoenzyme results, two molecular techniques were performed, namely DNA-probe analysis of the kinetoplast DNA (an extranuclear genome) and Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction (AP-PCR). The results of these two methods corroborated the isoenzyme data, and AP-PCR appeared as a new and promising tool for #Trypanosoma cruzi$ strain identification. (Résumé d'auteur)

A methodological approach is proposed to select rapidly DNA sequences characterized by a well defined specificity and potentially interesting to be used as diagnostic probes or as taxonomic and phylogenetic markers. A fragment amplified from a diversified sample of #Trypanosoma cruzi$ stocks by the RAPD (random amplified polymorphic DNA) method with the A8 primer, previously found to be monomorphic in all stocks, was separated in 2 fragments using polyacrylamide electrophoresis. RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis of the 750-bp fragment common to all stocks revealed some sequence heterogeneity within the #T. cruzi$ species, whereas hybridization experiments showed a high homology between fragments amplified from different #T. cruzi$ stocks. These results suggest that sequence analysis will allow the design of internal primers to be used as probes to target specific taxonomic levels (clone, family of related clones, or species) and for diagnosis. (Résumé d'auteur)