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Contexte : alors que la réponse humorale observée après la vaccination COVID est diminuée chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) traités par Rituximab (RTX), la réponse immunitaire cellulaire spécifique contre Spike semble être préservée. Étant donné que cette altération de la réponse humorale modifie le schéma de rappel vaccinal proposé aux patients sous RTX, l'analyse de la réponse T spécifique du SARS-CoV-2 et de sa persistance éventuelle à long terme pourrait constituer un outil décisionnel utile en pratique courante. Cette étude a pour but de confirmer l’existence et d’évaluer la persistance de l’immunité médiée par les lymphocytes T après la dernière vaccination ou infection COVID (dernier boost COVID) chez des patients atteints de PR traités par RTX. Les paramètres cliniques et biologiques pouvant influencer cette immunité ont également été étudiés. Méthodes : notre étude de cohorte observationnelle a inclus des patients atteints de PR ayant reçu au moins une dose de vaccin anti-SARS-CoV-2 à ARN messager. La réponse immunitaire cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant une approche simplifiée de la caractérisation des cellules T spécifiques d’antigène. Cette méthode est basée sur l'incubation initiale d'échantillons de sang total avec des peptides de Spike et s'appuie ensuite sur l’étude de l’expression de molécules de surface tels que CD69, CD154, CD137 et CD107a pour mesurer l'activation des lymphocytes T.Résultats : nous avons inclus 51 patients atteints de PR traités par RTX et 24 patients atteints de PR traités par d’autres traitements anti-rhumatismaux de fond, conventionnels synthétiques (csDMARDs) ou biologiques (bDMARDs). Nous avons observé une diminution significative de la réponse humorale chez les patients atteints de PR sous RTX (PR RTX) avec un taux moyen d’Ac anti-SARS-CoV-2 de 562 BAU/mL contre 839 BAU/mL chez les patients atteints de PR non traités par RTX (PR non RTX) (p = 0.034). Tous les patients de notre étude ont présenté une réponse lymphocytaire T4 (LT4) et lymphocytaire T8 (LT8) spécifique de Spike avec une meilleure réponse LT8 chez les patients PR RTX (p < 0.001). Les patients PR RTX ont montré une persistance de cette réponse T spécifique de Spike sans diminution jusqu’à 18 mois après le dernier boost COVID. Conclusion : bien que le traitement par RTX diminue la réponse humorale au vaccin COVID chez les patients atteints de PR, une réponse lymphocytaire T spécifique de Spike robuste a été observée et persiste jusqu'à 18 mois après le dernier boost COVID.

La maladie à coronavirus (COVID-19) est une infection virale hautement contagieuse causée par le virus SRAS-CoV-2. La maladie s’est rapidement propagée entrainant une épidémie mondiale, causant la mort des personnes à risque. De nombreuses mesures sanitaires ont été prises durant ces deux dernières années, cependant la maladie n’est pas encore éradiquée. Considérant l’importance du système immunitaire dans le contrôle des maladies infectieuses et dans l’induction d’une mémoire immunitaire de longue durée, le SRAS-CoV-2 pourrait être une cible du système immunitaire, en particulier du système adaptatif représenté par les lymphocytes B et T. La réponse humorale induite chez les personnes convalescentes est largement perçue comme étant efficace pour combattre le virus. Par conséquent, toutes les plateformes de vaccination actuelles se sont basées sur la réponse humorale induite, particulièrement par la protéine SPIKE du virus. Compte tenu de la variabilité des réponses humorales ainsi que leur déclin rapide observé chez certains patients, et l’émergence de variants, il est nécessaire d’inclure d’autres stratégies permettant de renforcer la réponse immunitaire. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse cellulaire pouvait être induite par les lymphocytes T contre les différentes protéines virales du SRAS-CoV-2. Dans cette étude nous avons détecté la réactivité des lymphocytes T contre les protéines virales (SPIKE, membrane, nucléocapside) par ELISPOT chez les patients convalescents. Nous avons ensuite identifié plus précisément les séquences riches en épitopes au niveau de la protéine membranaire et de la nucléocapside en préparant des délétants successifs (approche « mRNA PCR-based epitope chase technique” ou mPec). La validation de ces séquences a été confirmée par l’utilisation de banques de peptides dans des zones définies, se chevauchant de 12 acides aminés. En vue d’inclure ces régions dans une stratégie vaccinale future, une protéine de fusion MN contenant les séquences riches en épitopes a été créée et la réactivité des lymphocytes T contre la protéine MN a été évaluée de nouveau par ELISPOT. Nos données démontrent une réponse T dirigée principalement contre la nucléocapside et la protéine membranaire. Trois zones immunogènes sont identifiées au niveau de la nucléocapside et une zone au niveau de la membrane. La réactivité observée contre la protéine de fusion MN souligne le potentiel pouvoir immunogène des protéines (membrane et nucléocapside) et l’importance d’inclure ces protéines dans une stratégie vaccinale future afin de solliciter une réponse immunitaire cellulaire protectrice., Coronavirus disease (COVID-19) is a highly contagious viral infection caused by the SARS-CoV-2 virus. The disease has spread rapidly resulting in a worldwide epidemic, causing death in those at risk. Numerous health measures have been taken over the past two years, but the disease has not yet been eradicated. Considering the importance of the immune system in the control of infectious diseases and in the induction of a long-lasting immune memory, SARS-CoV-2 could be a target of the immune system, in particular of the adaptive system represented by B and T lymphocytes. The humoral response induced in convalescent individuals is widely used as an effective therapy to combat the virus. Therefore, all current vaccination platforms have relied on the humoral response induced particularly by the virus' SPIKE protein. Given the variability of humoral responses and their rapid decline in some patients, and the emergence of variants, it is necessary to include other strategies to enhance the immune response. We hypothesized that a cellular response could be induced by T cells against the different viral proteins of SARS-CoV-2. In this study, we detected the reactivity of T cells against viral proteins (SPIKE, membrane, nucleocapsid) by ELISPOT in convalescent patients. We then identified more precisely the immunogenic sequences at the level of the membrane protein and the nucleocapsid by successive deletants using the mRNA PCR-based epitope chase technique (mPec). The validation of these sequences was confirmed by the use of small peptide libraries (overlapping by 12 amino acids), covering defined sequences rich in epitopes. In order to include these regions in a future vaccine strategy, a MN fusion protein containing the selected sequences was created and T cell reactivity against the MN protein was further confirmed by ELISPOT. Our data show a T-cell response primarily against the nucleocapsid and membrane protein. Three immunogenic zones were identified at the nucleocapsid level and one zone at the membrane level. The reactivity observed against the MN fusion protein cassette rich in epitopes, highlights the potential immunogenicity of the proteins (membrane and nucleocapsid) and the importance of including these proteins in a future vaccine strategy.

Les facteurs exogènes à l’organisme humain peuvent à son contact, provoquer une modulation de sa physiologie. Certains xénobiotiques comme les oxydants, les rayons ionisants, les métaux ou les biotoxines microbiennes génèrent une toxicité dont les effets peuvent être modulés par des composés comme ceux apportés par l’alimentation tels que les composés phénoliques d’origine végétale : l’acide caféique et les vitamines. L’analyse des effets de ces facteurs toxiques et protecteurs dans un système vivant se fait à différents niveaux. Mes travaux ont exploré ces interactions aux échelles moléculaire et cellulaire ainsi qu’au travers d’un modèle préclinique de type rongeur. Ils ont permis d’évaluer le potentiel antioxydant de ces composés sous différent angles et dans le contexte insulaire de l’île de La Réunion.La population réunionnaise et plus largement celles des îles de la zone du sud-ouest de l’océan Indien est exposée à des pathogènes présents dans les zones tropicales, plus particulièrement les arbovirus (alphavirus et flavivirus) et les bactéries leptospires. Ces pathogènes infectent l’homme par l’intermédiaire des moustiques vecteurs pour les arbovirus (dengue, zika) et de petits rongeurs réservoirs excréteurs pour les leptospires. A l’UMR PIMIT, mes recherches portent sur ces pathogènes, leurs facteurs de virulence notamment la protéine NS1 de la dengue, et les conséquences physiopathologiques chez l’homme. Les individus infectés se trouvent, particulièrement à la Réunion, dans des contextes métaboliques aggravants de pathologies diabétiques ou d’obésité. Ces comorbidités doivent être prises à prendre en compte dans l’évaluation du rôle de la pathogénicité dans l’évolution de la maladie. Dans cette vision, mes travaux indiquent que les réactivités moléculaires et les atteintes cellulaires sont variables, tout en étant informatives sur le fonctionnement des pathogènes (bactériens et viraux) et de leurs déterminants microbiens dont les PAMPs permettant d’envisager une thérapie adaptée.

The field of electropermeabilization, or electroporation, is advancing and has found successful biomedical applications such as electrochemotherapy, tissue ablation, gene therapy and transdermal drug delivery. Despite significant progress in the last decades, a better understanding of underlying mechanisms and advancement in technology are needed to improve outcomes. In this thesis, the performance of the conducting polymer PEDOT:PSS as an electrode coating material is explored in the context of electropermeabilization. Microfabricated PEDOT:PSS coated electrodes are investigated, both, to deliver stimulation pulses and to monitor changes in impedance as a consequence of cell electropermeabilization. The results can be summarized in three parts.Firstly, increased PEDOT:PSS coating thickness improves the polymer-electrolyte interaction due to a higher electrode capacitance. Thicker coatings exhibit higher stimulation thresholds before electrode failures such as delamination is observed. This emphasizes the importance of PEDOT:PSS coating thickness as a design parameter for optimized performance and increased stability of stimulation electrodes.Secondly, electrical stimulation with PEDOT:PSS coated electrodes strongly reduces irreversible electrochemical reactions at the electrode interface that otherwise lead to changes in pH and the generation of reactive oxygen species. These findings indicate that charging in PEDOT:PSS is dominated by reversible processes, also at voltage beyond the water window. In addition, coated electrodes induce nearly no electropermeabilization at voltages that greatly exceed the threshold for uncoated electrodes. The absence of Faradaic reactions in combination with marginal electropermeabilization reveals that electrochemical events at the electrode surface play an important role in the cellular response. Moreover, PEDOT:PSS separates the delivery of electric pulses from chemical changes which paves the way for future experiments that could lead to a better understanding of underlying mechanisms.Thirdly, an array of PEDOT:PSS coated sensing electrodes is integrated with a pair of uncoated stimulation electrodes. Reduced impedance of the sensing electrodes due to the PEDOT:PSS coating significantly improves the sensitivity of impedance monitoring during the growth of adherent cells and treatment with electrical pulses. Such microscale electrodes enable accurate assessment of changes in cellular impedance with high spatial resolution which can be used to study electroporation dynamics and monitor treatment progression.; L’électroperméabilisation, ou électroporation, a été utilisée avec succès dans des applications biomédicales telles que l’électrochimiothérapie, l’ablation tissulaire, la thérapie génique et la libération transdermique de médicaments. En dépit des progrès significatifs de ces dernières décennies, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents ainsi que de nouveaux développements technologiques pourraient améliorer les résultats obtenus. Dans cette thèse, les performances du polymère conducteur PEDOT:PSS, utilisé comme revêtement pour les électrodes, sont étudiées dans le cadre de l’électroperméabilisation. L’utilisation des microélectrodes recouvertes de PEDOT:PSS a été investiguée pour, d’une part, délivrer des impulsions de stimulation, et d’autre part, surveiller les changements d’impédance résultants de l’électroperméabilisation de la cellule. Les résultats obtenus peuvent être classés en trois catégories.Premièrement, l’augmentation de l’épaisseur du revêtement de PEDOT:PSS améliore l’interaction polymère/électrolyte grâce à une capacité d’électrode plus élevée et montre également des seuils de stimulation plus élevés avant la défaillance des électrodes, principalement due à une délamination du film de PEDOT:PSS. Ce résultat montre l’importance d’utiliser un revêtement de PEDOT:PSS pour optimiser les performances et augmenter la stabilité des électrodes de stimulation.Deuxièmement, la stimulation électrique avec les électrodes recouvertes de PEDOT:PSS réduit considérablement les réactions électrochimiques irréversibles à l’interface avec l’électrode qui autrement produisent une modification du pH et des espèces réactives de l’oxygène. En outre, les électrodes recouvertes de PEDOT:PSS ne montrent quasiment pas d’électroperméabilisation pour des tensions qui excèdent largement le seuil pour des électrodes nues. Ces résultats montrent que charger le PEDOT:PSS est dominé par des processus réversibles. De plus, l’absence de réactions faradiques combinée avec une électroperméabilisation marginale indique que les processus électrochimiques à la surface de l’électrode jouent un rôle important dans la réponse cellulaire. Le PEDOT:PSS permet de séparer l’application d’impulsions électriques des changements chimiques, ce qui ouvre la voie à de futures expériences qui pourraient déboucher sur une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents.Troisièmement, pour surveiller l’évolution d’un traitement par électroperméabilisation, une matrice de microélectrodes recouvertes de PEDOT:PSS a été intégrée avec des électrodes de stimulation interdigitées et nues. L’impédance réduite des électrodes recouvertes de PEDOT:PSS améliore grandement la surveillance des changements d’impédance des cellules lors de l’électroperméabilisation. Ces électrodes microscopiques conduisent à des mesures précises de changement d’impédance cellulaire avec une haute résolution spatiale, permettant ainsi une meilleure surveillance de la progression du traitement.

Les facteurs exogènes à l’organisme humain peuvent à son contact, provoquer une modulation de sa physiologie. Certains xénobiotiques comme les oxydants, les rayons ionisants, les métaux ou les biotoxines microbiennes génèrent une toxicité dont les effets peuvent être modulés par des composés comme ceux apportés par l’alimentation tels que les composés phénoliques d’origine végétale : l’acide caféique et les vitamines. L’analyse des effets de ces facteurs toxiques et protecteurs dans un système vivant se fait à différents niveaux. Mes travaux ont exploré ces interactions aux échelles moléculaire et cellulaire ainsi qu’au travers d’un modèle préclinique de type rongeur. Ils ont permis d’évaluer le potentiel antioxydant de ces composés sous différent angles et dans le contexte insulaire de l’île de La Réunion.La population réunionnaise et plus largement celles des îles de la zone du sud-ouest de l’océan Indien est exposée à des pathogènes présents dans les zones tropicales, plus particulièrement les arbovirus (alphavirus et flavivirus) et les bactéries leptospires. Ces pathogènes infectent l’homme par l’intermédiaire des moustiques vecteurs pour les arbovirus (dengue, zika) et de petits rongeurs réservoirs excréteurs pour les leptospires. A l’UMR PIMIT, mes recherches portent sur ces pathogènes, leurs facteurs de virulence notamment la protéine NS1 de la dengue, et les conséquences physiopathologiques chez l’homme. Les individus infectés se trouvent, particulièrement à la Réunion, dans des contextes métaboliques aggravants de pathologies diabétiques ou d’obésité. Ces comorbidités doivent être prises à prendre en compte dans l’évaluation du rôle de la pathogénicité dans l’évolution de la maladie. Dans cette vision, mes travaux indiquent que les réactivités moléculaires et les atteintes cellulaires sont variables, tout en étant informatives sur le fonctionnement des pathogènes (bactériens et viraux) et de leurs déterminants microbiens dont les PAMPs permettant d’envisager une thérapie adaptée.

Bacterial growth requires coordination between the main cell cycle processes that are DNA replication and segregation, elongation and cell division. During their life, bacteria are exposed to different endogenous or exogenous stresses (antibiotics, pH, nutrients starvation…) that can disturb the bacteria cell cycle. Those hostile life conditions trigger a cellular response aiming at improving survival in stress conditions. In E. coli, DNA breaks induce the SOS response that inhibits cell division while the bacteria continue to elongate, resulting in the formation of a filamentous cell. Filamentation has long been considered as a symptom of cell death, however recent studies suggest that this phenotype could instead be a transient morphology change improving the survival in hostile environments. The main objective of this thesis is to characterize the filamentation process, especially the restart of the filament division allowing to resume normal bacterial growth. To do so, I developped an approach combining live-cell microscopy in microfluidic chamber, flow cytometry, traditional microbiology technics and bacterial genetics. Association of those techniques constitutes a global approach allowing characterization of the stress effect on bacterial viability, morphology and DNA content, from the single cell to the population level. This experimental framework allowed to describe how filamentous cells quickly divide into viable cells, thus understanding how this transient and reversible cellular differentiation state constitute an efficient stress-survival strategy. Furthermore, the expertise I developed during this ph.D. project allowed me to be involved into the study of drug-resistance acquisition by gene transfer through bacterial DNA conjugation. Besides, I contributed to the characterization of the effects of biocides inducing envelop stress response and to the characterize the impact on E. coli of the production of Acinetobacter baumannii toxins predicted to be involved in contact-dependant growth inhibition, La prolifération bactérienne requiert la coordination entre les grands processus du cycle cellulaire qui sont la réplication et la ségrégation de l’ADN, l’élongation et la division cellulaire. Durant leur vie, les bactéries sont exposées à différents stress endogènes ou exogènes (antibiotiques, pH, manque de nutriments…) qui peuvent perturber le cycle cellulaire. Ces conditions défavorables activent alors une réponse cellulaire qui vise à améliorer la survie aux stress. Chez E. coli, la formation de cassures sur le chromosome induit la réponse SOS qui inhibe la division des cellules. Dans ce contexte, la bactérie continue à s’allonger ce qui aboutit à la formation d’une cellule filamenteuse. La filamentation a longtemps été considérée comme un symptôme de mort cellulaire, mais des études récentes suggèrent qu’il s’agirait plutôt d’un changement de morphologie transitoire qui améliorerait la survie en conditions défavorables. L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le processus de filamentation et surtout le redémarrage de la division du filament, permettant un retour à une croissance normale de la bactérie. J’ai pour cela mis en place une approche combinant la microscopie en cellules vivantes en chambre microfluidique, la cytométrie en flux, la microbiologie traditionnelle et la génétique bactérienne. L’association de ces techniques constitue une approche globale permettant de caractériser l’effet d’un stress sur la viabilité, la morphologie et le contenu en ADN des bactéries, et ce de la cellule unique à l’échelle de la population. Cette approche a permis de décrire comment les cellules filamenteuses se divisent rapidement en cellules viables et de comprendre comment cet état de différenciation cellulaire transitoire et réversible constitue une stratégie efficace de survie aux stress. Par ailleurs, l’expertise développée au cours de ces travaux m’a permis d’être impliqué dans l ‘étude du transfert de gène de résistance à la tétracycline par conjugaison bactérienne. Ces mêmes expertisent ont aussi permis la caractérisation de l’effet de biocides induisant la réponse aux stress de l’enveloppe et la visualisation de l’effet de la production chez E. coli de deux toxines prédites pour être impliquées dans un système d’inhibition de croissance contact-dépendant chez A. baumannii.

Recombinant follicle-stimulating hormone (FSH) (follitropin alfa) and biosimilar preparations are available for clinical use. They have specific FSH activity and a unique glycosylation profile dependent on source cells. The aim of the study is to compare the originator (reference) follitropin alfa (Gonal-f (R))- with biosimilar preparations (Bemfola (R) and Ovaleap (R))-induced cellular responses in vitro. Gonadotropin N-glycosylation profiles were analyzed by ELISA lectin assay, revealing preparation specific-patterns of glycan species (Kruskal-Wallis test; p < 0.05, n = 6) and by glycotope mapping. Increasing concentrations of Gonal-f (R) or biosimilar (1 x 10(-3) -1 x 10(3) ng/ml) were used for treating human primary granulosa lutein cells (hGLC) and FSH receptor (FSHR)-transfected HEK293 cells in vitro. Intracellular cAMP production, Ca2+ increase and beta-arrestin 2 recruitment were evaluated by BRET, CREB, and ERK1/2 phosphorylation by Western blotting. 12-h gene expression, and 8- and 24-h progesterone and estradiol synthesis were measured by real-time PCR and immunoassay, respectively. We found preparation-specific glycosylation patterns by lectin assay (Kruskal-Wallis test; p < 0.001; n = 6), and similar cAMP production and beta-arrestin 2 recruitment in FSHR-transfected HEK293 cells (cAMP EC50 range = 12 +/- 0.9-24 +/- 1.7 ng/ml; beta-arrestin 2 EC50 range = 140 +/- 14.1-313 +/- 18.7 ng/ml; Kruskal-Wallis test; p >= 0.05; n = 4). Kinetics analysis revealed that intracellular Ca2+ increased upon cell treatment by 4 mu g/ml Gonal-f (R), while equal concentrations of biosimilars failed to induced a response (Kruskal-Wallis test; p < 0.05; n = 3). All preparations induced both 8 and 24 h-progesterone and estradiol synthesis in hGLC, while no different EC(50)s were demonstrated (Kruskal -Wallis test; p > 0.05; n = 5). Apart from preparation-specific intracellular Ca2+ increases achieved at supra-physiological hormone doses, all compounds induced similar intracellular responses and steroidogenesis, reflecting similar bioactivity, and overall structural homogeneity.

Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) can contribute to the regulation of the host immune response by crosstalk with innate and adaptive leukocytes, including NK cells. Mechanisms by which this immunoregulation process occurs remain incompletely understood. Here, we focused on the effect of human neutrophil-derived serine proteases on NKp46, a crucial activating receptor expressed on NK cells. We used flow cytometry, Western blotting, and mass spectrometry (MS) analysis to reveal that cathepsin G [CG; and not elastase or proteinase 3 (PR3)] induces a time- and concentration-dependent, down-regulatory effect on NKp46 expression through a restricted proteolytic mechanism. We also used a functional assay to demonstrate that NKp46 cleavage by CG severely impairs NKp46-mediated responses of NK cells, including IFN-γ production and cell degranulation. Importantly, sputa of cystic fibrosis (CF) patients, which have high concentrations of CG, also alter NKp46 on NK cells. Hence, we have identified a new immunoregulatory mechanism of neutrophils that proteolytically disarms NK cell responses.

En période néonatale, la muqueuse intestinale est immature et particulièrement perméable, notamment aux facteurs environnementaux comme les toxiques, les infections mais aussi les événements stressants. De la bonne maturation de la barrière intestinale va dépendre la mise en place de l'homéostasie intestinale et donc la tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux. La survenu d’évènements stressants durant la petite enfance est associée au déclenchement et/ou l’entretien de pathologies gastro-intestinales fonctionnelles comme le Syndrome de l’Intestin Irritable (SII) mais aussi organiques comme les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI). De plus, ces pathologies malgré leurs différences dans la sévérité et les signes cliniques, partagent un certain nombre de caractéristiques physiopathologiques communes, comme la rupture de l’intégrité de la barrière intestinale associée à une rupture de tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux et plus particulièrement contre le microbiote intestinal. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les effets d’un Stress de Séparation Maternelle (SSM) sur l’homéostasie intestinale et la réponse immunitaire vis-à-vis du microbiote commensal chez la souris jeune adulte. Nos résultats ont mis en évidence un dimorphisme sexuel dans ce modèle. Chez les souris mâles jeunes adultes, le SSM diminue les fonctions de la barrière intestinale associé à une altération de la réponse humorale et cellulaire au niveau systémique vis-à-vis du microbiote commensal, ainsi qu’à un défaut des cellules présentatrices d’antigènes, conduisant à une inflammation de bas grade malgré un profil proinflammatoire des lymphocytes T. Chez les souris femelles jeunes adultes, le SSM altère la fonctionnalité des cellules de Paneth associée à surpopulation bactérienne intestinale, responsable de la sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale et une réponse humorale systémique dirigée contre le microbiote commensal. Nous avons mis en évidence une empreinte du SSM chez le jeune adulte, capable d'induire des modifications profondes de l’homéostasie intestinale ainsi que de la réponse immunitaire systémique contre le microbiote intestinal. Le SSM altère l'homéostasie intestinale et reproduit des caractéristiques communes aux pathologies digestives à savoir une rupture de barrière associée à une réponse immunitaire contre le microbiote sans symptômes majeurs. Ce travail a permis d'identifier la survenue d'événements stressants pendant la petite enfance comme un facteur environnemental important capable d'altérer l'homéostasie intestinale chez des individus sains et qui pourrait contribuer au déclenchement de pathologies intestinales chez des individus génétiquement prédisposés.

Type IV Pili (TFP) are widespread filamentous organelles extending from the surface of many Gram-negative bacteria that mediate multiple functions and play a key role in the pathogenesis of several important human pathogens, including our model, Neisseria meningitidis. The assembly of TFP requires a complex machinery composed by at least twenty proteins that are localized in the inner membrane, the outer membrane and the periplasm. Three of these proteins, called minor pilins, are not required for the biosynthesis of the TFP, but support their functions. Based on the phenotypes associated with the mutants, their role on TFP functions has been determined. The minor pilin Comp is required for natural competence for DNA transformation, PilV is required for the deformation of the host cell plasma membrane and PilX is essential for the adhesion of bacteria to epithelial and endothelial cells, the bacterial aggregation and the deformation of the host cell plasma membrane. Many similarities with the major pilin PilE suggests that minor pilin are inserted into the fiber of TFP to exert their functions, although it has never been demonstrated. How these proteins carry out their functions mechanistically is not elucidated. The general objective of this thesis was to understand how a single fiber can provide such a variety of functions. To achieve this, the study of the mode of action of minor pilins was undertaken. Contrarily to what has been previously proposed, the PilV and PilX minor pilins seem to exert their functions from the periplasmic space to modulate the amount of surface exposed pili. Indeed, pilV and pilX strains show piliation defects of 39 % and 63 % respectively compared to the wild type. Besides, we have shown that TFP functions require a large amount of TFP, at least 40 % for the aggregation and adhesion and 70% to induce the reorganization of the plasma membrane. Thus these modest decreases in the amount of pili explain the phenotypes of these mutants. These results indicate that the minor pilins are involved in the biogenesis of TFP rather than in the direct support of their biochemical properties. Moreover, the piliation defect of these mutants is restored in the absence of retraction, indicating that the PilV and PilX minor pilins play a role in the stability of TFP. To understand how PilV and PilX minor pilins modulate surface exposed pili level, we performed a structure/ function analysis of these two proteins. Blocking the PilV and PilX minor pilins in the inner membrane abolishes piliation, indicating a direct interaction with the machinery of TFP, probably via the major pilin PilE. We have also shown that an interaction between the minor pilins and the major pilin occurs in the inner membrane and upstream of the pilus assembly. However, these results, obtained by biochemical techniques, need to be confirmed by additional controls. By a mutagenesis strategy, we finally demonstrated that the D region of PilV and the α/β and β2/β3 loops of PilX are necessary for their functions. This study has shown that a relatively modest decrease in the amount of pili displayed on the bacterial surface leads to a strong effect on the functions carried by TFP. Minor pilins act in the periplasm to promote the biosynthesis of pili, which highlights the direct role of the major pilin in the TFP-dependent functions.; Les pili de type IV (PT4), certainement les organelles les plus répandues des bactéries à Gram-négatif, sont des machineries à multiples fonctions qui jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de nombreux pathogènes humains, notamment notre modèle Neisseria meningitidis. L’assemblage des PT4 nécessite une machinerie complexe incluant au moins vingt protéines localisées dans la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. Certaines de ces protéines ne sont pas nécessaires pour la biosynthèse des PT4, mais supportent les fonctions qui leur sont associées. Ces protéines, appelées pilines mineures, sont au nombre de trois. Par l’analyse phénotypique des mutants dans les gènes codant pour les pilines mineures, le rôle de chacune a pu être déterminée. Ainsi la piline mineure ComP est nécessaire pour la compétence pour la transformation d’ADN, PilV est requise pour la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte et PilX est essentielle pour l’adhésion des bactéries sur les cellules épithéliales et endothéliales, la formation d’agrégats bactériens et la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte. De nombreuses similarités avec la piline majoritaire laissent penser que les pilines mineures s’insèrent dans la fibre des PT4 pour exercer leurs fonctions, bien que ceci n’a jamais été démontré. Si on connait bien les fonctions des pilines mineures, leur mode d’action n’est toujours pas compris. L’objectif global de ce travail de thèse a été de comprendre comment une fibre protéique peut assurer une diversité de fonctions aussi importante. Pour y parvenir, l’étude du mode d’action des pilines mineures a été entreprise. Contrairement à ce qui prévalait dans le modèle dominant, les pilines mineures PilV et PilX exercent leur fonction à partir de l’espace périplasmique pour moduler la quantité de pili exprimés en surface. En effet, les mutants pilV et pilX présentent respectivement des défauts de piliation de l’ordre de 39% et de 63% par rapport à la souche sauvage. Ces défauts expliquent cependant les phénotypes des mutants. En effet, l’ensemble des fonctions dépendantes des PT4 nécessite une forte quantité de PT4, soit au moins 40% pour l’agrégation et l’adhésion et 70% pour le déclenchement de la réponse cellulaire. Ces résultats révèlent que les pilines mineures sont impliquées dans la biogenèse des PT4 plutôt que dans le support biochimique direct de leurs propriétés. Le défaut de piliation de ces mutants est restauré par l’absence de rétraction, indiquant que les pilines mineures PilV et PilX jouent un rôle dans la stabilité des PT4. Nous avons également montré que la piline mineure ComP est nécessaire pour la piliation et qu’elle présente une fonction redondante avec la piline mineure PilV. Afin de comprendre comment les pilines mineures PilV et PilX exercent leur rôle sur la quantité de pili exprimés en surface, nous avons réalisé une étude structure/fonction de ces deux protéines. Nous avons observé une absence de piliation, en bloquant les pilines PilV et PilX dans la membrane interne, indiquant une interaction directe avec la machinerie des PT4 probablement via la piline majeure PilE. Nous avons également montré qu’il existe une interaction entre les pilines mineures et PilE au niveau de la membrane interne et en amont de l’assemblage des pili. Ces résultats, obtenus par une technique de pontage disulfure, ont cependant besoin d’être confirmés par des contrôles supplémentaires. Par une stratégie de mutagenèse, nous avons enfin mis en évidence que la région D de PilV et les boucles α/β et β2/β3 de PilX sont nécessaires à leur fonctionnement. Ces travaux ont permis de montrer que la quantité de pili exprimés par la bactérie est un facteur déterminant pour définir les propriétés des PT4. Les pilines mineures agissent au niveau du périplasme pour promouvoir la biosynthèse des pili, ce qui met en avant le rôle direct de la piline majeure PilE dans les fonctions associées aux PT4.

International audience; The development of an effective vaccine against Toxoplasma gondii infection is an important issue due to the seriousness of the related public health problems, and the economic importance of this parasitic disease worldwide. Rhoptry neck proteins (RONs) are components of the moving junction macromolecular complex formed during invasion. The aim of this study was to evaluate the vaccine potential of RON4 using two vaccination strategies: DNA vaccination by the intramuscular route, and recombinant protein vaccination by the nasal route. We produced recombinant RON4 protein (RON4S2) using the Schneider insect cells expression system, and validated its antigenicity and immunogenicity. We also constructed optimized plasmids encoding full length RON4 (pRON4), or only the N-terminal (pNRON4), or the C-terminal part (pCRON4) of RON4. CBA/J mice immunized with pRON4, pNRON4 or pCRON4 plus a plasmid encoding the granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor showed high IgG titers against rRON4S2. Mice immunized by the nasal route with rRON4S2 plus cholera toxin exhibited low levels of anti-RON4S2 IgG antibodies, and no intestinal IgA antibodies specific to RON4 were detected. Both DNA and protein vaccination generated a mixed Th1/Th2 response polarized towards the IgG1 antibody isotype. Both DNA and protein vaccination primed CD4+ T cells in vivo. In addition to the production of IFN- , and IL-2, Il-10 and IL-5 were also produced by the spleen cells of the immunized mice stimulated with RON4S2, suggesting that a mixed Th1/Th2 type immune response occurred in all the immunized groups. No cytokine was detectable in stimulated mesenteric lymph nodes from mice immunized by the nasal route. Immune responses were induced by both DNA and protein vaccination, but failed to protect the mice against a subsequent oral challenge with T. gondii cysts. In conclusion, strategies designed to enhance the immunogenicity and to redirect the cellular response towards a Th1 type response against RON4 could lead to more encouraging results.

Plant immune responses to pathogen attack include the hypersensitive response (HR), a form of programmed cell death occurring at invasion sites. We previously reported on Arabidopsis thaliana MYB30, a transcription factor that acts as a positive regulator of a cell death pathway conditioning the HR. Here, we show by microarray analyses of Arabidopsis plants misexpressing MYB30 that the genes encoding the four enzymes forming the acyl-coA elongase complex are putative MYB30 targets. The acyl-coA elongase complex synthesizes very-long-chain fatty acids (VLCFAs), and the accumulation of extracellular VLCFA-derived metabolites (leaf epidermal wax components) was affected in MYB30 knockout mutant and overexpressing lines. In the same lines, a lipid extraction procedure allowing high recovery of sphingolipids revealed changes in VLCFA contents that were amplified in response to inoculation. Finally, the exacerbated HR phenotype of MYB30-overexpressing lines was altered by the loss of function of the acyl-ACP thioesterase FATB, which causes severe defects in the supply of fatty acids for VLCFA biosynthesis. Based on these findings, we propose a model in which MYB30 modulates HR via VLCFAs by themselves, or VLCFA derivatives, as cell death messengers in plants.

International audience

A single ion facility has been developed at CENBG for applications in radiobiology at the cellular scale. The development of this set-up was based on the existing nuclear microprobe, which is able to focus protons or alpha particles from 1 to 3 MeV down to one micrometer under vacuum. The main part of this work was dedicated to adapt an irradiation stage on the microbeam line to deliver particles in air with an absolute precision of a few micrometers. A control software, used to drive the overall experiment including the automatic phases of calibration and irradiation, has also been developed. Monte Carlo simulation tools, required for set-up characterisation and enhancement, have been validated at micrometer scale by comparison with experimental data. Experimental validation of the facility, in terms of beam control, spatial resolution and targeting accuracy have been performed. These tests allow to consider the first use of the facility in the frame of radiobiological studies. In the near future, this facility will allow studies of cellular responses to low doses of radiation, including extreme situations like exposure to a single ionising particle. Studies of fundamental cellular mechanisms like signalling, intercellular communication or programmed cell death (apoptosis) will also be possible., Un dispositif micro-irradiation par ions isolés a été développé au CENBG pour des applications en radiobiologie à l'échelle cellulaire. Cette installation consiste en un aménagement de la ligne microfaisceau préexistante qui permet déjà d'obtenir un faisceau de protons ou de particules alpha entre 1 et 3 MeV, de faible intensité, et d'une résolution spatiale sous vide inférieure au micromètre. La majeure partie de ce travail a consisté à développer un étage d'irradiation adaptable sur la microsonde et permettant de délivrer les ions à l'air avec une précision absolue de quelques micromètres. Un programme permettant le contrôle de la totalité des instruments ainsi que des phases d'étalonnage et d'irradiation automatiques a également été mis au point. Des outils de simulation Monte Carlo, nécessaires à la caractérisation et à l'optimisation du dispositif et notamment en terme de résolution spatiale, ont été validés à l'échelle du micromètre par comparaison à des résultats expérimentaux. Les performances du dispositif, notamment en terme de contrôle du nombre d'ions, de résolution spatiale et de précision d'irradiation ont été testées sous faisceau. Les résultats obtenus permettent d'envisager les premières applications dans des études de radiobiologie. Dans un futur proche cet outil va permettre l'étude des réponses cellulaires aux faibles doses, allant jusqu'au cas extrême d'un ion pour une cellule. Il devrait permettre par ailleurs d'aborder des mécanismes cellulaires fondamentaux tels la signalisation, la communication intercellulaire ou encore la mort cellulaire programmée (apoptose).