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In the kidney, inwardly rectifying K+ channels of the Kir (KCNJ) family are essential for the control of salt transport. In the basolateral membrane of distal convoluted tubules (DCT), Kir4.1 (KCNJ10) together with Kir5.1 (KCNJ16) appears to be relevant for salt transport and adaptation of DCT to plasma K+ levels, so called K+ sensing. Loss-of-function mutations in KCNJ10 are known to result in EAST/SeSAME syndrome, a complex disorder with a renal salt wasting tubulopathy and alkalosis. Also for Kir5.1 a role in renal transport is likely: Paulais et al. observed hypokalemia, acidosis and hypercalciuria in a Kir5.1-/- mouse model and our collaborator Prof. Konrad identified in a patient with hypokalemia and acidosis a homozygous mutation of Kir5.1 (R35Q). We hypothesized that the mutation R35Q leads to impaired channel function and disturbed salt transport in the kidney, especially in the DCT. To address this question, I characterized the mutant Kir5.1 channel and studied the phenotype of Kir5.1-/- mice. The effect of the Kir5.1R35Q mutant on protein function was analyzed using immunofluorescence and patch-clamp experiments. Although computer algorithms had predicted a functional deficit, I found the conductance of cells transfected with Kir4.1-Kir5.1R35Q heteromers unaltered compared to Kir4.1-Kir5.1wt. Also on the single channel level, the properties of the Kir5.1R35Q mutant were normal and the subcellular localization appeared unaltered. Taken together, the function of the Kir5.1R35Q mutant seems at least largely preserved or normal. However, smaller functional deficits or modified channel regulation might still have escaped our notice. To gain further insights into the role of Kir5.1 in the kidney, I investigated the renal phenotype of another Kir5.1-/- mouse model (not identical to the one of Paulais et al.). Using sorted tubules, I observed high Kir5.1 mRNA expression in DCT and in proximal tubules. Analysis of the Kir5.1-/- mice corroborated the hypokalemia phenotype, but the acidosis appeared compensated. Kir5.1-/- mice displayed a pathologically increased renal salt loss when fed a high NaCl diet pointing to a reduced capacity to adapt to dietary salt intake. To elucidate the role of Kir5.1 for K+ sensing in the DCT, isolated DCTs were exposed to changes of basolateral and apical K+. Fura-2 measurements revealed that only basolateral, but not apical, application of low K+* solution increased intracellular Ca2+ levels. However, deletion of Kir5.1 did not alter the Ca2+ signals suggesting that Kir5.1 channels are not essential for this component of the K+ sensing mechanism. Taken together, this study provided evidence that the rare Kir5.1 variant R35Q is probably not (or not alone) causative for acidosis and hypokalemia observed in a single patient carrying this mutation. Nevertheless, our Kir5.1 knockout showed similar symptoms. Clearly, the role of Kir5.1 in the kidney is very complex and still incompletely understood. Further studies and the data from additional patients are required to decipher the precise role of Kir5.1 in the kidney and its possible role for human diseases., In der Niere spielen die einwärtsgleichrichtenden K+-Kanäle Kir4.1 (KCNJ10) und Kir5.1 (KCNJ16) eine wichtige Rolle. In der basolateralen Membran des distalen Konvoluts (DCT) sind Kir4.1/Kir5.1-Kanäle entscheidend für den Salztransport und die Anpassung des Transports an das Plasma-K+, das so genannte “K+ Sensing”. Mutationen von KCNJ10 führen zum EAST/SeSAME-Syndrom, einem komplexen Krankheitsbild mit renalem Salzverlust und Alkalose. Auch Kir5.1 soll eine Rolle in der Niere haben: Paulais et al. beobachteten Hypokaliämie, Azidose und Hyperkalziurie in einer Kir5.1-/--Maus und unser Kooperationspartner Prof. Konrad identifizierte in einem Patienten mit Hypokaliämie und Azidose eine homozygote Mutation von Kir5.1 (R35Q). Wir hypothetisierten daher, dass die R35Q-Mutation krankheitsverursachend sein könnte und insbesondere den Transport im DCT beeinträchtigt. Um diese Frage zu klären, habe ich daher die R35Q-Mutante charakterisiert und den Phänotyp der Kir5.1-/--Maus untersucht. Die Auswirkungen der Mutation habe ich mittels Immunfluoreszenz und Patch-Clamp untersucht. Obwohl Computeralgorithmen einen Funktionsdefekt vorhersagten, war die Leitfähigkeit von Zellen, die mit Kir4.1/Kir5.1R35Q transfiziert waren, ähnlich denen von Zellen mit Wildtypkanälen. Auch auf der Einzelkanalebene war kein Funktionsdefekt nachweisbar und die subzelluläre Lokalisation erschien unverändert. Zusammengefasst war die Funktion der R35Q-Mutante scheinbar normal oder zumindest weitgehend erhalten. Jedoch ist es denkbar, dass uns kleinere Funktionsdefekte oder eine veränderte Regulation entgangen sind. Um weitere Einblicke in die Rolle von Kir5.1 in der Niere zu erhalten, habe ich den Phänotyp eines von Paulais et al. unabhängigen Kir5.1-Knockoutmausmodells untersucht. Mittels sortierter Tubulussegmente beobachtete ich eine starke Kir5.1 mRNA-Expression im DCT und im proximalen Tubulus. Untersuchungen an der Knockoutmaus bestätigten die Hypokaliämie, die Azidose erschien jedoch kompensiert. Kir5.1-/--Mäuse zeigten einen pathologisch verstärkten renalen Salzverlust unter einer hoch-NaCl-Diät, was für eine beeinträchtige Fähigkeit zur Anpassung an die diätetische Salzaufnahme spricht. Um die Rolle von Kir5.1 für das „K+ Sensing“ im DCT zu untersuchen, wurden isolierte DCTs veränderten K+ Konzentrationen auf der basolateralen oder apikalen Seite ausgesetzt. Fura-2-Messungen zeigten, dass nur die basolaterale, nicht aber apikale Erniedrigung des K+ zu einem intrazellulären Ca2+-Anstieg führte. Jedoch war dieses Ca2+-Signal unabhängig von der Anwesenheit von Kir5.1, was darauf hinweist, dass Kir5.1 bei dieser Komponente des „K+ Sensings“ keine Rolle spielt. Zusammengefasst liefert diese Studie Hinweise, dass die seltene Kir5.1-Variante R35Q vermutlich nicht (oder nicht alleine) für die Azidose und die Hypokaliämie des einzelnen Patienten verantwortlich ist. Nichtsdestotrotz zeigten unsere Kir5.1-Knockoutmäuse einen ähnlichen Phänotyp. Ganz offensichtlich ist die Rolle von Kir5.1 in der Niere sehr komplex und noch immer nur unvollständig verstanden. Weitere Studien und zusätzliche Patientendaten werden nötig sein, um die genaue Funktion von Kir5.1 in der Niere und seine Bedeutung für menschliche Erkrankungen zu klären.

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2013-12-11T14:40:34Z No. of bitstreams: 1 ulfc105667_tm_Catarina_Quintanova.pdf: 1830686 bytes, checksum: 0ef57620ad0fc1c03f33d1991bfbc0f9 (MD5) Made available in DSpace on 2013-12-11T14:40:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc105667_tm_Catarina_Quintanova.pdf: 1830686 bytes, checksum: 0ef57620ad0fc1c03f33d1991bfbc0f9 (MD5) Previous issue date: 2013