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Los alcaloides de la pirrolizidina (AP) son un tipo de alcaloides derivados de la ornitina sintetizados exclusivamente por plantas. Están formados por una base de necina esterificada con ácido nécico y son estructuralmente muy diversos debido a las numerosas combinaciones posibles entre las bases de necina y los diferentes tipos de ácidos nécicos. Estos alcaloides se encuentran ampliamente distribuidos, especialmente en las familias Apiaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Orchidaceae y Urticaceae. De esta forma, los AP pueden ser ingeridos accidentalmente por los seres humanos a través de productos medicinales derivados de plantas, infusiones de té, suplementos a base de polen, miel contaminada y plantas de cultivo. Los AP no son tóxicos en su forma original, sino que requieren de una bioactivación hepática previa, siendo los metabolitos pirrólicos los responsables de los efectos tóxicos y el hígado, el órgano más afectado. La presente revisión tiene, por tanto, como objetivo, poner de manifiesto en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo los efectos tóxicos que se producen tras la exposición a los AP. Para ello, se han seleccionado un total de 27 artículos en relación con la toxicidad de los AP. En ellos se evidencia una clara dependencia de la estructura con el potencial tóxico de cada AP. Además, los resultados observados incluyeron numerosos mecanismos de acción de los AP, siendo los principales la formación de aductos con proteínas, glutatión y ADN y la alteración de la homeostasis de ácidos biliares y del ciclo celular. Por lo tanto, se considera que los AP presentan un alto potencial hepatotóxico y genotóxico y, debido a su presencia en alimentos consumidos ampliamente en todo el mundo, suponen un riesgo potencial para la salud.

En la presente Tesis Doctoral, se investigó la toxicidad de diferentes materiales derivados de grafeno, como el óxido de grafeno (OG), el óxido de grafeno reducido (OGr) y sus derivados funcionalizados con dodecil amina (DA) y cloruro de [2-(metacriloiloxi) etil] trimetilamonio (MTAC), para su uso en la industria alimentaria en el área de envasado alimentario. Para garantizar la seguridad de estos materiales en contacto con alimentos, se llevaron a cabo extensos estudios toxicológicos. Como paso previo al estudio de su seguridad se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica sobre la toxicidad de los materiales de grafeno en el marco del riesgo alimentario, publicados en la literatura científica hasta la actualidad. Con el fin de determinar las diferentes propiedades fisicoquímicas y así conocer la identidad de cada uno de los derivados de estudio, se llevó a cabo una caracterización fisicoquímica y morfológica de los derivados de grafeno elegidos. Los resultados revelaron diferente contenido atómico y diferente carga, además de la aglomeración de las partículas. La evaluación toxicológica se centró modelos posibles diana de una exposición oral. Se realizaron ensayos in vitro utilizando líneas celulares representativas del sistema digestivo (Caco-2) y el hígado (HepG2). Se observó la internalización de los materiales en estas células, y se detectó citotoxicidad y estrés oxidativo, especialmente a las concentraciones más altas. Se llevó a cabo una digestión gastrointestinal in vitro para simular las condiciones del tracto digestivo y evaluar cómo afectaba a la toxicidad de los materiales. Se encontraron cambios en la morfología de las partículas y en la toxicidad después de la digestión, con disminución de la toxicidad en el caso de OGr pero aumento en los derivados funcionalizados. Para la posible comercialización de estos compuestos y antes de su incorporación a los envases alimentarios, se debe llevar a cabo una evaluación del potencial mutagénico y genotóxico (

The work presented here is an innovative teaching experience in the Toxicology module of the Pharmacy Laboratory course taught both in the Degree in Pharmacy and in the Double Degree in Pharmacy and Optics and Optometry. To this end, the usual way of teaching the theoretical part of the laboratory practices, which was carried out through lectures, has been changed to a teaching methodology in which both students and teachers develop the theoretical part of the practices in a pleasant and joint way through the elaboration of a content map that allows establishing connections between the different theoretical concepts. In this way, the students will obtain the necessary knowledge to be able to carry out the practices in such a way that they are able to think critically. The aim is to show the students the benefit and significance of the knowledge they will acquire, not only in order to be able to pass the subject exam, but also so that it will be useful in their working life. Based on the results obtained by the students in the initial and final questionnaires, it has been possible to verify the usefulness of the content maps when teaching classes. Therefore, and as a conclusion, I will continue to introduce new teaching methodologies that will be useful to students in my future teaching., El trabajo que se presenta se trata de una experiencia de innovación docente en el módulo de Toxicología de la asignatura de Laboratorio de Farmacia que se imparte tanto en el Grado en Farmacia como en el Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría. Para ello, se ha modificado el modo de impartición habitual de la parte teórica de las prácticas, la cual se realizaba mediante clases magistrales, por una metodología docente en la que tanto alumnos como profesor van desarrollando de modo ameno y conjunto la parte teórica de las prácticas mediante la elaboración de un mapa de contenidos que permite establecer conexiones entre los diferentes conceptos teóricos. De este modo los alumnos obtendrán los conocimientos necesarios para poder llevar a cabo la realización de las prácticas de modo que sean capaces de pensar de modo crítico. Con ello se pretende, mostrarles a los alumnos el beneficio y significación de los conocimientos que van a adquirir no solo con el objetivo de poder aprobar el examen de la asignatura, sino también con el fin de que les sea útil en su vida laboral. En base a los resultados obtenidos por los alumnos en los cuestionarios iniciales y finales, se ha podido comprobar la utilidad de los mapas de contenidos a la hora de impartir las clases. Por ello y como conclusión, seguiré introduciendo nuevas metodologías de enseñanza que les sean útiles a los alumnos en mi futura docencia.

The " Scientific dissemination conference: Contributions of Toxicology in substance safety research and for society" were held on May 19th, 2023 at the Faculty of Pharmacy of the University of Seville, thanks to a financial support received by the VII Plan Propio of the University of Seville (VII PPIT-US) for scientific dissemination activities. The objective was to disseminate scientific knowledge among our students by highly qualified teaching and scientific personnel, and also to inform society in general of the high-level scientific research work that is being carried out in the University of Seville. The activity was aimed at students of the subjects of "Toxicology", "Chemoinformatics, Research and History of Pharmacy", " Laboratory of Pharmacy" (of the Degree in Pharmacy, Degree in Optics and Optometry, and Double Degree in Pharmacy and Optics and Optometry), and the subjects of "Toxicology of the Drugs of Abuse" or "Introduction to Forensic Sciences" (Degree in Criminology). During the Conference, which lasted 5.5 hours, 6 oral communications were given on graphene, cyanotoxins, alliaceous additives in human and animal feed, stilbenes in wines, or biopesticides. All of them were synthesized in informative triptychs distributed among the attendees for their dissemination in their social environment. Likewise, 2 invited presentations were given by experts in Forensic and Environmental Toxicology, respectively. The activity had 75 attendees and the results of the surveys generally showed a high degree of satisfaction with them, showing the Conference as an enriching outreach activity, due to the variety of topics covered, the new knowledge acquired and the approach to research and interest aroused among attendees., Las “Jornadas de divulgación científica: Aportaciones de la Toxicología en la investigación de la seguridad de las sustancias y para la sociedad” se celebraron el 19 de mayo de 2023 en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, gracias a una Ayuda recibida por el VII Plan Propio de la Universidad de Sevilla (VII PPIT-US) para actividades de divulgación científica. El objetivo fue divulgar entre nuestros alumnos los conocimientos científicos por parte de personal docente e investigador altamente cualificado, y también dar a conocer a la sociedad en general el trabajo de investigación científica de alto nivel que se está realizando en la US. La actividad iba dirigida a los alumnos de las asignaturas de “Toxicología”, “Quimioinformática, Investigación e Historia de la Farmacia”, “Laboratorio de Farmacia” (del Grado en Farmacia, Grado en Óptica y Optometría, y Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría), y las asignaturas de “Toxicología de las Drogas de Abuso” o “Introducción a las Ciencias Forenses” (Grado en Criminología). Durante las Jornadas, que duraron 5,5 horas, se impartieron un total de 6 comunicaciones orales con diferente temática: el grafeno, las cianotoxinas, los aditivos aliáceos en alimentación humana y animal, los estilbenos en los vinos, o los bioplaguicidas; todas ellas sintetizadas en unos trípticos divulgativos repartidos entre los asistentes para su divulgación en su entorno social. Asimismo, se realizaron 2 ponencias invitadas por parte de expertos en Toxicología Forense y Ambiental, respectivamente. La actividad contó con casi un total de 75 asistentes y los resultados de las encuestas mostraron en general un alto grado de satisfacción con las mismas, mostrando las Jornadas como una enriquecedora actividad de divulgación científica, por la variedad de temas tratados, los nuevos conocimientos adquiridos y el acercamiento a la investigación e interés suscitado entre los asistentes.

Las “Jornadas de divulgación científica: Aportaciones de la Toxicología en la investigación de la seguridad de las sustancias y para la sociedad” se celebraron el 19 de mayo de 2023 en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, gracias a una Ayuda recibida por el VII Plan Propio de la Universidad de Sevilla (VII PPIT-US) para actividades de divulgación científica. El objetivo fue divulgar entre nuestros alumnos los conocimientos científicos por parte de personal docente e investigador altamente cualificado, y también dar a conocer a la sociedad en general el trabajo de investigación científica de alto nivel que se está realizando en la US. La actividad iba dirigida a los alumnos de las asignaturas de “Toxicología”, “Quimioinformática, Investigación e Historia de la Farmacia”, “Laboratorio de Farmacia” (del Grado en Farmacia, Grado en Óptica y Optometría, y Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría), y las asignaturas de “Toxicología de las Drogas de Abuso” o “Introducción a las Ciencias Forenses” (Grado en Criminología). Durante las Jornadas, que duraron 5,5 horas, se impartieron un total de 6 comunicaciones orales con diferente temática: el grafeno, las cianotoxinas, los aditivos aliáceos en alimentación humana y animal, los estilbenos en los vinos, o los bioplaguicidas; todas ellas sintetizadas en unos trípticos divulgativos repartidos entre los asistentes para su divulgación en su entorno social. Asimismo, se realizaron 2 ponencias invitadas por parte de expertos en Toxicología Forense y Ambiental, respectivamente. La actividad contó con casi un total de 75 asistentes y los resultados de las encuestas mostraron en general un alto grado de satisfacción con las mismas, mostrando las Jornadas como una enriquecedora actividad de divulgación científica, por la variedad de temas tratados, los nuevos conocimientos adquiridos y el acercamiento a la investigación e interés suscitado entre los asistentes., The " Scientific dissemination conference: Contributions of Toxicology in substance safety research and for society" were held on May 19th, 2023 at the Faculty of Pharmacy of the University of Seville, thanks to a financial support received by the VII Plan Propio of the University of Seville (VII PPIT-US) for scientific dissemination activities. The objective was to disseminate scientific knowledge among our students by highly qualified teaching and scientific personnel, and also to inform society in general of the high-level scientific research work that is being carried out in the University of Seville. The activity was aimed at students of the subjects of "Toxicology", "Chemoinformatics, Research and History of Pharmacy", " Laboratory of Pharmacy" (of the Degree in Pharmacy, Degree in Optics and Optometry, and Double Degree in Pharmacy and Optics and Optometry), and the subjects of "Toxicology of the Drugs of Abuse" or "Introduction to Forensic Sciences" (Degree in Criminology). During the Conference, which lasted 5.5 hours, 6 oral communications were given on graphene, cyanotoxins, alliaceous additives in human and animal feed, stilbenes in wines, or biopesticides. All of them were synthesized in informative triptychs distributed among the attendees for their dissemination in their social environment. Likewise, 2 invited presentations were given by experts in Forensic and Environmental Toxicology, respectively. The activity had 75 attendees and the results of the surveys generally showed a high degree of satisfaction with them, showing the Conference as an enriching outreach activity, due to the variety of topics covered, the new knowledge acquired and the approach to research and interest aroused among attendees.

The growing interest in graphene derivatives is a result of their variety of applications in many fields. Due to their use, the oral route could be a potential way of entrance for the general population. This work assesses the biotransformation of reduced graphene oxide (rGO) after an in vitro digestion procedure (mouth, gastric, intestinal, and colon digestion), and its toxic effects in different cell models (HepG2, Caco-2, and 3D intestinal model). The characterization of rGO digestas evidenced the agglomeration of samples during the in vitro gastrointestinal (g.i.) digestion. Internalization of rGO was only evident in Caco-2 cells exposed to the colonic phase and no cellular defects were observed. Digestas of rGO did not produce remarkable cytotoxicity in any of the experimental models employed at the tested concentrations (up to 200 µg/mL), neither an inflammatory response. Undigested rGO has shown cytotoxic effects in Caco-2 cells, therefore these results suggest that the digestion process could prevent the systemic toxic effects of rGO. However, additional studies are necessary to clarify the interaction of rGO with the g.i. tract and its biocompatibility profile.

El trabajo que se presenta se trata de una experiencia de innovación docente en el módulo de Toxicología de la asignatura de Laboratorio de Farmacia que se imparte tanto en el Grado en Farmacia como en el Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría. Para ello, se ha modificado el modo de impartición habitual de la parte teórica de las prácticas, la cual se realizaba mediante clases magistrales, por una metodología docente en la que tanto alumnos como profesor van desarrollando de modo ameno y conjunto la parte teórica de las prácticas mediante la elaboración de un mapa de contenidos que permite establecer conexiones entre los diferentes conceptos teóricos. De este modo los alumnos obtendrán los conocimientos necesarios para poder llevar a cabo la realización de las prácticas de modo que sean capaces de pensar de modo crítico. Con ello se pretende, mostrarles a los alumnos el beneficio y significación de los conocimientos que van a adquirir no solo con el objetivo de poder aprobar el examen de la asignatura, sino también con el fin de que les sea útil en su vida laboral. En base a los resultados obtenidos por los alumnos en los cuestionarios iniciales y finales, se ha podido comprobar la utilidad de los mapas de contenidos a la hora de impartir las clases. Por ello y como conclusión, seguiré introduciendo nuevas metodologías de enseñanza que les sean útiles a los alumnos en mi futura docencia., The work presented here is an innovative teaching experience in the Toxicology module of the Pharmacy Laboratory course taught both in the Degree in Pharmacy and in the Double Degree in Pharmacy and Optics and Optometry. To this end, the usual way of teaching the theoretical part of the laboratory practices, which was carried out through lectures, has been changed to a teaching methodology in which both students and teachers develop the theoretical part of the practices in a pleasant and joint way through the elaboration of a content map that allows establishing connections between the different theoretical concepts. In this way, the students will obtain the necessary knowledge to be able to carry out the practices in such a way that they are able to think critically. The aim is to show the students the benefit and significance of the knowledge they will acquire, not only in order to be able to pass the subject exam, but also so that it will be useful in their working life. Based on the results obtained by the students in the initial and final questionnaires, it has been possible to verify the usefulness of the content maps when teaching classes. Therefore, and as a conclusion, I will continue to introduce new teaching methodologies that will be useful to students in my future teaching.

Cyanotoxins are secondary metabolites produced by different types of cyanobacteria. Among them, Cylindrospermopsin (CYN) and Microcystins (MCs) stand out due to their wide geographical distribution and toxicity in various organs, including the kidney, which is involved in their distribution and elimination. However, the renal toxicity caused by CYN and MCs has hardly been studied. The aim of this work was to assess the cytotoxicity effects caused by CYN and MC-LR in the renal cell line HEK293, and for the first time, the influence of CYN on the gene expression of selected genes in these cells by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). CYN caused an upregulation in the gene expression after exposure to the highest concentration (5 µg/mL) and the longest time of exposure (24 h). Moreover, shotgun proteomic analysis was used to assess the molecular responses of HEK293 cells after exposure to the individuals and combinations of CYN + MC-LR. The simultaneous exposure to both cyanotoxins caused a greater number of alterations in protein expression compared to single toxins, causing changes in the cellular, lipid and protein metabolism and in protein synthesis and transport. Further studies are needed to complete the toxicity molecular mechanisms of both CYN and MC-LR at the renal level.

The occurrence of toxic cyanobacteria and their cyanotoxins production are increasing phenomena reported worldwide. Cyanotoxins, secondary metabolites of different cyanobacterial species, are considered a potential hazard that can become a risk for human and environmental health after exposure. Global changes (rising temperatures, eutrophication due to human activities, etc.) favour their appearance leading to increased exposures and, consequently, risks. In order to avoid their negative impacts, the World Health Organization has established provisional drinking-water and recreational-water guideline values, and different countries have implemented limits in their regulations. However, these limits are not enough taking into account the increasing number of known cyanotoxins. Also, the establishment of these legal limits is hampered by the gaps in the knowledge of their toxicological profiles. Thus, this work aimed to establish the state of the art on the human toxicity of cyanotoxins (mainly microcystins, cylindrospermopsin and anaxotin-A) and to shed light on aspects not completely elucidated, such as target organ toxicity, immunotoxicity or genotoxicity.

Propyl-propanethiosulfinate (PTS) is a component of Allium essential oils. This organosulfur molecule can be used as a feed additive to decrease the appearance of bacterial resistances caused by the residues of antibiotics. In previous in vitro genotoxicity studies, contradictory results were reported for PTS. In this work, the in vivo genotoxicity of PTS in male and female rats was assessed for the first time, following OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) guidelines. After oral administration (doses: 5.5, 17.4, and 55.0 mg/kg PTS body weight), a combination of the micronucleus (MN) assay (OECD 474) in bone marrow and the standard and enzyme-modified comet assay (OECD 489) was performed. After necropsy, histopathological studies were also carried out. The results did not show the in vivo genotoxicity of PTS at any doses assayed, revealed by the absence of increased MN, and DNA strand breaks or oxidative DNA damage in the standard and enzyme-modified comet assays. The histopathological study revealed that only the highest dose tested (55.0 mg/kg) in the liver and all dose groups in the stomach presented minimal pathological lesions in the organs studied. Consequently, the present work confirms that PTS is not genotoxic at the doses assayed, and it is a promising natural alternative to synthetic preservatives and antibiotics in animal feed.

Cyanotoxin occurrence is gaining importance due to anthropogenic activities, climate change and eutrophication. Among them, Microcystins (MCs) and Cylindrospermopsin (CYN) are the most frequently studied due to their ubiquity and toxicity. Although MCs are primary classified as hepatotoxins and CYN as a cytotoxin, they have been shown to induce deleterious effects in a wide range of organs. However, their effects on the immune system are as yet scarcely investigated. Thus, to know the impact of cyanotoxins on the immune system, due to its importance in organisms’ homeostasis, is considered of interest. A review of the scientific literature dealing with the immunotoxicity of MCs and CYN has been performed, and both in vitro and in vivo studies have been considered. Results have confirmed the scarcity of reports on the topic, particularly for CYN. Decreased cell viability, apoptosis or altered functions of immune cells, and changed levels and mRNA expression of cytokines are among the most common effects reported. Underlying mechanisms, however, are still not yet fully elucidated. Further research is needed in order to have a full picture of cyanotoxin immunotoxicity.

Stilbenes are secondary metabolites of great interest produced by many plant species due to their important bioactive properties. These phytochemicals have become of increasing interest in the wine industry as a natural alternative to sulphur dioxide, which has been associated with human health risks. However, there is still little toxicological information on stilbenes and the results thus far have been contradictory. Considering the key role of genotoxicity in risk assessment and the need to offer safe products in the market, the aim of this study was to assess the mutagenic and genotoxic potential of a stilbene extract with 99% purity (ST-99 extract). A complete series of different in vitro tests (Ames test, micronucleus (MN) test, and standard and enzyme-modified comet assays) was performed before its use as a preservative in wines. The ST-99 extract induces a significant increase of binucleated cells with micronuclei only in presence of the metabolic fraction S9 at the highest concentration assayed. Neither the Ames test nor the comet assay revealed the extract's genotoxic potential. Further studies are necessary, including in vivo assays, to ensure consumer safety before it can be used.

Genotoxic data of substances that could be used as food additives are required by the European Food Safety Authority. In this sense, the use of an extract from grapevine shoots containing a stilbene richness of 99% (ST-99), due to its antioxidant and antibacterial activities, has been proposed as an alternative to sulfur dioxide in wine. The aim of this work was to study, for the first time, the in vivo genotoxic effects produced in rats orally exposed to 90, 180, or 360 mg ST-99/kg body weight at 0, 24, and 45 h. The combination of micronucleus assay in bone marrow (OECD 474) and standard (OECD 489) and enzyme-modified comet assay was used to determine the genotoxicity on cells isolated from stomach, liver, and blood of exposed animals. The ST-99 revealed no in vivo genotoxicity. These results were corroborated by analytical studies that confirm the presence of stilbenes and their metabolites in plasma and tissues. Moreover, to complete these findings, a histopathological study was performed under light microscopy in liver and stomach showing only slight modifications in both organs at the highest concentration used. The present work confirms that this extract is not genotoxic presenting a good profile for its potential application as a preservative in the wine industry.

The co-occurrence of various cyanobacterial toxins can potentially induce toxic effects different than those observed for single cyanotoxins, as interaction phenomena cannot be discarded. Moreover, mixtures are a more probable exposure scenario. However, toxicological information on the topic is still scarce. Taking into account the important role of mutagenicity and genotoxicity in the risk evaluation framework, the objective of this study was to assess the mutagenic and genotoxic potential of mixtures of two of the most relevant cyanotoxins, Microcystin-LR (MC-LR) and Cylindrospermopsin (CYN), using the battery of in vitro tests recommended by the European Food Safety Authority (EFSA) for food contaminants. Mixtures of 1:10 CYN/MC-LR (CYN concentration in the range 0.04-2.5 µg/mL) were used to perform the bacterial reverse-mutation assay (Ames test) in Salmonella typhimurium, the mammalian cell micronucleus (MN) test and the mouse lymphoma thymidine-kinase assay (MLA) on L5178YTk± cells, while Caco-2 cells were used for the standard and enzyme-modified comet assays. The exposure periods ranged between 4 and 72 h depending on the assay. The genotoxicity of the mixture was observed only in the MN test with S9 metabolic fraction, similar to the results previously reported for CYN individually. These results indicate that cyanobacterial mixtures require a specific (geno)toxicity evaluation as their effects cannot be extrapolated from those of the individual cyanotoxins.

The reduction of sulfur dioxide in wine is a consumer’s demand, considering the allergic effects that may occur in people who are sensitive to it. Stilbenes are candidates of great interest for this purpose because of their antioxidant/antimicrobial activities and health properties, and also because they are naturally found in the grapevine. In the present study, the in vitro toxicity of an extract from grapevine shoots (with a stilbene richness of 45.4%) was assessed in two human cell lines. Significant damage was observed from 30 μg/mL after 24 h, and 40 µg/mL after 48 h of exposure. Similarly, the ultrastructural study revealed a significant impairment of cell growing. The extract was able to protect cells against an induced oxidative stress at all concentrations studied. In view of the promising results, a more exhaustive toxicological assessment of the extract is needed to confirm the safety of its further use as additive in wine.

Natural preservatives are used in food packages to improve the shelf life of perishable products. Carvacrol and thymol, the main components of oregano essential oil (OEO), are used in active packaging due to their antimicrobial and antioxidant properties. Here, the effect of a bioactive polylactic acid (PLA)/polybutylene succinate (PBS) package in the conservation of lettuce compounds with dietetic value is studied. Analytical pyrolysis (Py-GC/MS) was used to detect changes in dietary components such are phytosterols (PHSTs) and polyunsaturated fatty acids (PUFAs) after 1, 4 and 8 days of packaged in PLA/PBS (95:5%) films containing different OEO concentrations (2–10%). Lettuce PUFAs and PHSTs content decreased when packed in films without OEO. However, when packed in films containing 5 and 10% OEO, these bioactive components were preserved during the estimated lettuce shelf life, for up to 8 days of storage.

Las cianobacterias son bacterias Gram negativas fotosintéticas capaces de producir floraciones a nivel mundial. Estas cianobacterias pueden producir también cianotoxinas perjudiciales para la salud de humanos, animales y plantas, y pueden actuar como hepatotoxinas, citotoxinas, neurotoxinas o dermatotoxinas. Las cianotoxinas de mayor in terés son las microcistinas (MC) y la cilindrospermopsina (CYN) por su extensa distribución y toxicidad. Aunque se conoce que principalmente las MC son hepatotóxica s y la CYN citotóxica , se ha observado que pueden producir alteraciones en otros órganos y s istemas, de los cuales el sistema inmune está aún escasamente estudiado. La presente revisión tiene, por tanto, como objetivo poner de manifiesto en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo las alteraciones que se producen en el sistema inmune tr as la exposición a estas cianotoxinas y la importancia que ello tiene en la respuesta inmunitaria. Tras la realización de una búsqueda bibliográfica se seleccionaron veintitrés y siete artículos relacionados con la inmunotoxicidad de MC y CYN, respectivame nte. En ellos se evidencia el efecto de las MC sobre la proliferación de los linfocitos y la expresión de múltiples citoquinas, entre otros. Así mismo, se ha observado el efecto de la CYN sobre la viabilidad y capacidad de los linfocitos a pesar de que los estudios de inmunotoxicidad sobre ésta sean escasos. Por tanto, ambas cianotoxinas presentan potencial inmunotóxico que debería ser estudiado en mayor profundidad, especialmente en el caso de la CYN.

Las cianobacterias se encuentran distribuidas globalmente, siendo las aguas dulces su hábitat más común. Dichos microorganismos son capaces de sintetizar numerosos metabolitos, entre ellos los denominados cianotoxinas. Dentro de dichas toxinas destaca la Cilindrospermopsina (CYN), cianotoxina emergente de los últimos años, siendo responsable de episodios hepatoentéricos en Australia y Brasil. La CYN, con una estructura de alcaloide tricíclico, posee distintos mecanismos de acción, tales como la inhibición de la síntesis de proteínas y del glutatión, el incremento de especies reactivas de oxígeno y la capacidad para actuar como agente genotóxico. Sin embargo, hasta la fecha, estudios que se centren en la determinación de sus efectos genotóxicos y epigenéticos son escasos y contradictorios. Es por ello, que el presente trabajo indaga acerca del potencial genotóxico de la CYN, usando como modelo experimental la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, la cual se expuso a concentraciones de CYN de 0, 0,625, 1,25 y 2,5 μg/ml durante 24 y 48 h. Se ha utilizado el ensayo cometa estándar, para la evaluación del daño genotóxico directo, y su versión modificada con las enzimas Formamido pirimidina ADN glicosilasa (FPG) y Endonucleasa III (Endo III). Estas enzimas permiten reconocer las bases del material genético que se hayan oxidado, evaluando de esa forma el proceso de oxidación de las bases púricas y pirimidínicas, respectivamente. Los resultados obtenidos mostraron que la CYN no produce daño genotóxico directo en la hebra de ADN de las células Caco-2 a ninguna de las concentraciones de exposición empleadas. Del mismo modo, la incubación con las enzimas de restricción no mostró oxidación en las hebras de ADN. Estos resultados son de gran utilidad para esclarecer el perfil toxicológico de esta cianotoxina emergente. Sin embargo, sería necesario completar dicho estudio con otros ensayos de genotoxicidad para confirmar los resultados negativos que hemos obtenid

Las floraciones de cianobacterias en agua dulce están asociadas con la producción de cianotoxinas, sustancias perjudiciales para los animales, las plantas y los seres humanos. De todas ellas, las más abundantes en la naturaleza y por tanto las más estudiadas de forma individual son la cilindrospermopsina (CYN) y la microcistina-LR (MC-LR). La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el estudio las mezclas de cianotoxinas, ya que es frecuente encontrar en estas floraciones de cianobacterias varias cianotoxinas juntas, y es importante conocer si existe alguna variación en los efectos tóxicos que producen, respecto a los producidos por separado. En el presente trabajo se estudia la genotoxicidad producida por la mezcla de CYN y MC-LR en células de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 mediante el ensayo cometa estándar y modificado con las enzimas endonucleasa III (Endo III) y formamidopiridina ADN glicosilasa (FPG) con el fin de determinar el potencial genotóxico y posible daño oxidativo en el ADN producido por la oxidación de las bases pirimidínicas y púricas, respectivamente. Se evaluó la mezcla de ambas cianotoxinas en un rango de diferentes concentraciones preservando siempre la ratio 1:10, siendo así para la CYN 0.6, 1.5, 2.5 μg/ml y para MC-LR 6, 12.5 y 25 μg/ml, durante 24 y 48 h de exposición. De forma general se observó una ausencia de genotoxicidad así como daño oxidativo del ADN bajo las condiciones ensayadas. Serían necesarios más estudios para poder contar con un conocimiento más amplio sobre el efecto genotóxico producido por la combinación de las diferentes cianotoxinas

En la actualidad, la industria alimentaria está apostando por la incorporación de sustancias naturales a envases alimentarios con el fin de incrementar la perdurabilidad de los alimentos en el mercado. Con estas prácticas se intentan satisfacer las necesidades de los consumidores de tal modo que su uso suponga ventajas tecnológicas y beneficios para el consumidor. Sin embargo, para que una sustancia sea admitida como aditivo debe estar bien caracterizada químicamente y debe superar los controles toxicológicos establecidos por parte de los correspondientes organismos sanitarios debido al desconocimiento del uso de estos componentes y sus posibles consecuencias. Entre las sustancias naturales que se emplean con este fin destacan los AEs, los cuales han sido tradicionalmente utilizados por sus propiedades farmacológicas. En nuestro caso, tanto un extracto del género Allium, denominado comercialmente PROALLIUM AP®, como alguno de sus componentes (PTSO y su análogo PTS) pretenden ser utilizados como antimicrobianos en la industria alimentaria formando parte de envases activos. Como paso previo al estudio de su seguridad se realizó una revisión bibliográfica de los datos de toxicidad disponibles hasta el momento en la literatura científica, tras la cual se puso de manifiesto la ausencia de estudios requeridos en diferentes compuestos con interés en la conservación de alimentos y la disparidad de los resultados disponibles. La evaluación toxicológica realizada en la presente tesis doctoral comenzó con una batería de ensayos tanto in vitro, con células que estarían en contacto con estas sustancias al ser ingeridas, como in vivo, en ratas tras un consumo agudo y crónico, para investigar los posibles efectos tóxicos, destacando los estudios de genotoxicidad, que pueden desencadenarse tras la exposición a PROALLIUM AP®, PTSO y PTS. La relevancia de la información toxicológica de estas sustancias resulta fundamental para su futuro uso ya que constituye un requisito reglamentari, Currently, the food industry is betting on the incorporation of natural substances into food packaging in order to increase the durability of food in the market. These practices are intended to satisfy the needs of consumers so that their use entails technological advantages and benefits for the consumer. However, in order to admit a substance as an additive, it must be well characterized chemically and must overcome the toxicological assessment established by the corresponding health agencies, due to the lack of knowledge of the use of these components and their possible consequences. Among the natural substances used for this purpose are Essential Oils (EOs), which have traditionally been used for their pharmacological properties. In our case, both an extract of the genus Allium, commercially known as PROALLIUM AP®, as well as some of its components (PTSO and its analog PTS) are intended to be used as antimicrobials in the food industry as part of active packaging. As a preliminary step to the study of its safety, a bibliographical review of the toxicity data available so far was made in the scientific literature. Afterwards, the lack of studies required in different compounds with interest in food preservation and the disparity of available results have been evidenced. The toxicological evaluation carried our in the present Thesis started with a battery of tests both in vitro, with cells that would be in contact with these substances when ingested, and in vivo, in rats after acute and chronic consumption, in order to investigate possible toxic effects, mainly genotoxicity, which may be triggered upon exposure to PROALLIUM AP®, PTSO and PTS. Tre relevance of the toxicological information of these substances is essential for their future use since it is a regulatory requirement by the competent authorities prior to their commercialization. All these experiments has led to the following publications: GENOTOXICITY ASSESSMENT OF PROPYL THIOSULFINATE OXIDE, AN ORGANOSU

Cylindrospermopsin (CYN) is a cyanotoxin produced by various cyanobacterial species. It is a water soluble zwitterion, stable at extreme temperatures and pH. Despite the main route of exposure to CYN is through drinking water and food, there is a lack of data concerning its intestinal absorption and the mechanisms implicated. The aim of this study was to characterize the mechanisms involved in the intestinal absorption of CYN, using Caco-2 human cell line as a model of the intestinal epithelium. The results obtained in the present work increases the limited knowledge regarding CYN transport across the intestinal epithelium and identifies the paracellular route as an important pathway in CYN absorption. A minor carrier-mediated transcellular transport has been evidenced. This transport is not affected by low temperatures, suggesting that an active mechanism is not involved. Moreover, the transport through the intestinal monolayer is H+ and GSH dependent and Na + independent. The transport characteristics elucidated in this study prepare the ground for future studies directed at identifying transporters involved in the intestinal absorption of this toxin.

Oregano essential oil (Origanum vulgare L. virens) (OEO) is being used in the food industry due to its useful properties to develop new active packaging systems. In this concern, the safety assessment of this natural extract is of great interest before being commercialized. The European Food Safety Authority requests different in vivo assays to ensure the safety of food contact materials. One of these studies is a 90 days repeated-dose oral assay in rodents. In the present work, 40 male and 40 female Wistar rats were orally exposed to 50, 100 and 200 mg/kg body weight (b.w.) OEO during 90 days following the OECD guideline 408. Data revealed no mortality and no treatment-related adverse effects of the OEO in food/water consumption, body weight, haematology, biochemistry, necropsy, organ weight and histopathology. These findings suggest that the oral no-observed-adverse-effect level (NOAEL) of this OEO is 200 mg/kg b.w. in Wistar rats, the highest dose tested. In conclusion, the use of this OEO in food packaging appears to be safe based on the lack of toxicity during the subchronic study at doses 330-fold higher than those expected to be in contact consumers in the worst scenario of exposure.

Cyanobacterial toxins, particularly microcystins (MCs) and cylindrospermopsin (CYN), are responsible for toxic effects in humans and wildlife. In order to counteract or prevent their toxicity, various strategies have been followed, such as the potential application of chemoprotectants. A review of the main substances evaluated for this aim, as well as the doses and their influence on cyanotoxin-induced toxicity, has been performed. A search of the literature shows that research on MCs is much more abundant than research on CYN. Among chemoprotectants, antioxidant compounds are the most extensively studied, probably because it is well known that oxidative stress is one of the toxic mechanisms common to both toxins. In this group, vitamin E seems to have the strongest protectant effect for both cyanotoxins. Transport inhibitors have also been studied in the case of MCs, as CYN cellular uptake is not yet fully elucidated. Further research is needed because systematic studies are lacking. Moreover, more realistic exposure scenarios, including cyanotoxin mixtures and the concomitant use of chemoprotectants, should be considered.

Con el fin de reducir el uso de conservantes sintéticos, la industria alimentaria ha comenzado a desarrollar nuevos sistemas de envasado incorporando al embalaje aceites esenciales (AEs) que, por sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes, contribuyan a aumentar la vida útil y calidad de los alimentos perecederos. Aunque el uso de estos AEs en el envasado de los alimentos no está permitido aún en Europa actualmente, los estudios que evalúan la seguridad de sus principales componentes son de gran interés. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar por primera vez el potencial genotóxico de Propil Propano Tiosulfinato (PTS), uno de los componentes del Proallium AP®, un extracto comercial basado en los AEs del ajo (Allium sativum) y la cebolla (Allium cepa) destinado a ser utilizado en el envasado activo. Para ello, se estudió el daño genotóxico y la oxidación del ADN en la línea celular intestinal humana Caco-2. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de PTS (70, 140 y 280 μM) durante 24 y 48 h. Se evaluó el daño genotóxico directo mediante el empleo del ensayo cometa estándar y la oxidación del ADN mediante el empleo de las enzimas endonucleasa III (Endo III) y formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) a través del ensayo cometa modificado. Los resultados demostraron que el PTS provoca cierto daño genotóxico a 280 μM. Sin embargo, a las concentraciones de interés para el envasado activo, el PTS no provocó rotura directa de la hebra de ADN. Por otra parte, los valores obtenidos tras la incubación con enzimas de restricción, no muestran oxidación de las bases nitrogenadas del ADN. A pesar de que se requieren más ensayos con el fin de determinar el perfil toxicológico del PTS, este compuesto organosulfurado se presenta actualmente como una buena alternativa natural a otros aditivos sintéticos utilizados en la industria alimentaria

Los aceites esenciales (AEs) que proceden del género Allium spp, como es el caso del ajo (Allium sativum) y la cebolla (Allium cepa) se caracterizan por poseer numerosas propiedades, destacando sus actividades antioxidante y antimicrobianas, las cuales se les atribuye a sus compuestos organosulfurados. Estas características están siendo utilizadas por la industria para el desarrollo de nuevos envases activos que mejoren y conserven las características del alimento así como su vida útil. Antes de aprobar su uso, estas sustancias deben ser evaluadas a través de distintos ensayos toxicológicos que confirmen su seguridad. En este sentido, y siguiendo las recomendaciones de la EFSA (European Food Safety Authority) para la evaluación genotóxica de sustancias que van a estar en contacto con el alimento, el objetivo de este trabajo es evaluar por primera vez el potencial genotóxico de Propil Propano Tiosulfinato (PTS) presente en el extracto comercial Proallium AP®. El PTS se evaluó in vitro en la línea celular L5178Tk± de células de linfoma de ratón a través del ensayo de micronúcleos (MN) (0-25 μM) siguiendo el protocolo de la OECD 487. Se evaluó durante 24h en ausencia de S9 y durante 4h en presencia de S9. Los resultados obtenidos, muestran como el PTS en ausencia de S9 produce un leve pero significativo incremento en la frecuencia de MN en células binucleadas a la concentración de 17,25 μM. Sin embargo, en presencia de la fracción microsómica, el compuesto estudiado no actúa como agente clastogénico o aneugénico. No obstante, es necesario completar estos estudios con otros ensayos in vitro que confirmen la seguridad del PTS. En caso de obtener resultados contradictorios, y siguiendo las recomendaciones de las autoridades europeas sería necesario realizar la evaluación del PTS in vivo, para confirmar su seguridad antes de autorizar su uso en el envase alimentario.

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende vitamina E (vit E) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, tracto gastrointestinal, branquias y/o cerebro. Además, dicha composición se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional.

El aceite esencial de especies del género Allium sp. contiene sustancias biológicamente activas, incluyendo algunas sustancias volátiles organosulfuradas, responsables de sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes. El aislamiento químico del propil propano tiosulfonato (PTSO) da lugar a un preparado activo que podría usarse en la industria alimentaria. Dicho compuesto se incorporaría a una matriz comercial inerte, con el fin de ser utilizado como envase activo. Con el objetivo de poder evaluar la genotoxicidad in vivo de dicho organosulfurado, y teniendo en cuenta el protocolo de la OCDE 489 y 474, es necesario en primer lugar determinar la presencia del compuesto en plasma y/o órganos seleccionados para su posterior evaluación. Por ello, el presente estudio se centra en la determinación de PTSO en plasma, estómago e hígado de ratas intoxicadas por sonda gástrica a 55 mg/kg. La cuantificación del PTSO en plasma fue determinada por UHPLC¿MS/MS Orbitrap. En el estómago e hígado, la identificación de PTSO y/o sus productos de degradación se llevaron a cabo por pirólisis analítica. Además, los productos de degradación fueron separados por cromatografía y combinados y detectados con un espectrómetro de masas (Py-GC¿MS). El PTSO no fue detectado a ninguna de las concentraciones ensayadas en plasma; sin embargo, se detectaron seis componentes organosulfurados derivados de PTSO en estómago. Entre ellos, se encontró el disulfuro de dimetilo y propildisulfito de metilo, los cuales probablemente se originaron directamente a partir de PTSO, tras sufrir reacciones de hidrólisis. Tanto en el hígado de ratas tratadas se encontró el compuesto 2-metil-2-(metiltioltio)-propano indicando la influencia de los procesos de distribución y metabolismo de PTSO en ratas. En este trabajo se demuestra por primera vez la utilidad de la pirolisis analítica como técnica innovadora que permite confirmar la absorción e identificación de PTSO así como sus metabolitos en tejidos dianas.

El aceite esencial de orégano (Origanum vulgare L. virens) (OEO) es uno de los extractos naturales más interesantes para la industria alimentaria por sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas. El carvacrol, su compuesto mayoritario, es uno de los compuestos fenolicos que le confiere estas propiedades al aceite. Para evaluar la seguridad de estas sustancias, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) exige una serie de ensayos tanto in vitro como in vivo que estudien la capacidad genotóxica de las mismas. Para poder evaluar in vivo la genotoxicidad de carvacrol mediante la combinación del test de micronúcleos (MN) y del ensayo cometa, es necesario confirmar la exposición de los tejidos a esta sustancia. En este sentido, en el presente trabajo se evaluó mediante técnicas de pirólisis analítica (Py-CG/MS) la presencia de carvacrol en estómago e hígado de ratas Wistar expuestas por vía oral a distintas dosis de carvacrol (81, 256, 810 mg/ kg). Los resultados muestran por primera vez la presencia del compuesto en todos los órganos analizados. Por ello, demostramos que la técnica de pirólisis analítica es útil para obtener información sobre la exposición de los tejidos biológicos al agente activo.

Due to its bioactive properties, oregano essential oil (OEO) is being included in new food packaging materials. However, due to essential oils (EOs) high volatility, ageing and conditions of films preparation may cause losses and diminish the activity, Analytical pyrolysis (Py-GC/MS) is a tool providing fingerprinting and precise information about composition, quality and additives in active packages made with biogenic polymers, In a previous work, we used Py-GC/MS combined with d13C analysis to ensure that no appreciable EO losses occurred when our polylactic acid (PLA) polybutylene succinate (PBS) (95:5) films containing OEO were developed. We confirmed that the OEO remained in adequate quantities and bioactive after the extrusion process. In a subsequent study, the effect of this bio-package in lettuce shelf life and its effect in the chemical composition of the food that contains was evaluated, and specifically in the conservation of specific compounds with dietetic value. In this work we describe a detailed Py-GC/MS study performed to detect changes in the relative contents of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and phytosterols in iceberg lettuce after 1, 4 and 8 days packaged in PLAlPBS (95:5) films containing different quantities of OEO (O , 2, 5 and 10%). Our results indicate that films containing any quantity of OEO, used in packages with a proportion of 5.5 9 of film/kg lettuce, allow maintaining the profile of lettuce PUFAs and phytosterols during the shelf life of the packed food.

Oregano essential oil is being included in new packaging materials due to its bioactive properties. Carvacrol, main compound of this essential oil, with antioxidant and antimicrobial properties, is intended to be used in food packaging. According to the recommendation of the EFSA for the genotoxic assessment of substances in food, the in vivo negative results are acceptable when direct or indirect evidence supportive of exposure of the target tissues have been demonstrated. Previous studies reported negative results for comet assay in stomach and liver of rats orally exposed to carvacrol (81, 256 and 810 mg/kg bw). Hence, in this work, direct pyrolysis–gas chromatography–mass spectrometry (Py–GC/MS) analysis was performed using a double-shot pyrolyzer attached to a GC/MS system to ensure the exposure of such tissues to carvacrol. Results showed the presence of carvacrol in stomach and liver in all of the concentrations assayed. Moreover, pyrolysis technique showed clear and distinct dose–response relationships depending on the tissue evaluated. However, the ingestion of concentrations over 256 mg/kg bw in the liver, exhibited no-linear relation. This does not relate to the ratios predicted by the linear model found in the stomach. In this regard, the differences observed in those curves may be related to carvacrol metabolism in rats and the possible occurrence of saturation mechanisms limiting an excess of carvacrol metabolization/presence in liver. Therefore, our results indicate that Py–GC/MS is a valuable tool to evaluate the exposure of biological tissues to carvacrol avoiding sample pre-treatmen

Garlic and onion contain biologically active substances, including volatile organosulfur compounds (OSCs), which may be responsible for their antimicrobial and antioxidant properties. The isolation of the compound propyl propane thiosulfonate (PTSO) affords a stable, active agent to be used in the food industry. PTSO may be incorporated into an inert commercial alimentary support to produce active packaging. According to the recommendations of the OECD 489 and 474, several methods are necessary to verifying that the compound could reach to the target tissue or general circulation. In this sense, the aim of this study was determinate the presence of PTSO in plasma and tissues (stomach and liver) of rats following oral administration (55 mg/kg bw) for later assessed the genotoxicity. The quantification of PTSO in plasma was performed by UHPLC–MS/MS Orbitrap and its identification and degradation products in tissues (stomach and liver) was performed by analytical pyrolysis (Py-GC–MS). PTSO was not detected at any concentration tested in plasma, and in the stomach six OSCs compounds of PTSO were detected. Among these, dimethyl disulphide and methyl propyldisulphide are likely to have originated from PTSO, which seems to suffer hydrolysis reactions. Signs of the presence of PTSO were also found in liver of treated rats by detecting a single OSC: 2-methyl-2-(methylthio) propane, indicating the influence of distribution and metabolism processes. These results indicate that Py-GC-MS is an adequate technique that provides first evidences of the absorption of PTSO and its presence including metabolites in tissues.

Genotoxic data of substances which could be incorporated into food packaging are required by the European Food Safety Authority. Due to its antioxidant and antibacterial properties carvacrol is one of these compounds. This work aims to study for the first time the in vivo genotoxic effects produced in rats orally exposed to 81, 256 or 810 mg cavacrol/kg body weight (bw) at 0, 24 and 45 h. A combination of the micronucleus assay (OECD 474) in bone marrow and the standard (OECD 489) and enzyme-modified comet assay was used to determine the genotoxicity on cells isolated from stomach and liver of exposed animals. In addition, a histopathological study was performed on the assayed tissues, and also in the lungs due to the volatility of carvacrol. Direct analytical pyrolysis was used to search for carvacrol in viscera and to ensure that the compound reaches stomach and liver cells. Results from MN-comet assay revealed that carvacrol (81-810 mg/kg bw) did not induce in vivo genotoxicity or oxidative DNA damage in any of the tissues investigated. Moreover, no histopathological changes were observed. Altogether, these results suggest lack of genotoxicity of carvacrol and therefore its good profile for its potential application as food preservative.