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Mesmo que a função não possa ser diretamente inferida puramente a partir do padrão de enovelamento especíco adotado por uma determinada proteína, os dados estruturais podem ser usados para detectar proteínas com funções semelhantes. Neste contexto, uma estratégia possível é a denição de assinaturas estruturais, que são conjuntos de características capazes de identicar inequivocamente um tipo de enovelamento proteico. O objetivo do corrente trabalho é encontrar possíveis padrões estruturais conservados em proteínas de mesma família. Para demonstrar que um modelo que utiliza as informações posicionais em nível atômico é conservado e discriminativo entre famílias, construiu-se classicadores estruturais. A partir deste estudo, foi possível discriminar os átomos do backbone como a melhor assinatura estrutural estudada. Inserindo pontos intermediários ctícios entre os carbonos alfa, obtêm-se uma poligonal geométrica, similar à poligonal geométrica obtida pela inclusão dos átomos da cadeia principal. Dessa forma, consegue-se um efeito similar à poligonal geométrica da cadeia principal sem a inuência do posicionamento dos átomos CeNe, indiretamente, sem a inuência dos ângulos phi e psi. O corrente estudo sugere que não são as posições desses átomos os fatores determinantes no incremento da precisão da classicação, mas o fortalecimento do caráter geométrico linear da cadeia principal. Portanto, a principal contribuição do presente trabalho é a investigação do uso da disposição geométrica poligonal da cadeia principal (ou dos próprios Cá, caso sejam adicionados pontos intermediários ctícios entre esses) como uma assinatura estrutural discriminativa.

Os polimorfismos de base única (SNPs) são a forma mais comum de variação na sequência de DNA entre humanos, e têm o potencial de afetar a função gênica, principalmente quando estão localizados em regiões codificadoras ou regulatórias. Dentre os diferentes tipos de SNPs, acredita-se que os SNPs não-sinônimos (nsSNPs) têm o maior impacto na função protéica, sendo frequentemente associados a doenças, alterações na resposta a fármacos, e a reações adversas. A motivação deste trabalho é o fato de que uma abordagem computacional pode ter grande utilidade na avaliação preliminar do impacto funcional e estrutural de nsSNPs em genes codificadores de proteínas em humanos, possibilitando assim a priorização de nsSNPs candidatos para estudos experimentais. Com este propósito, fizemos a modelagem de nsSNPs nas correspondentes estruturas protéicas nativas como codificadas pelos genes, buscando determinar o impacto causado por estas variações utilizando diferentes métodos computacionais, tais como o docking molecular e a otimização de estruturas protéicas. Um banco de dados foi montado, relacionando os resultados das análises computacionais feitas com informações já existentes, tais como de doenças, vias metabólicas, alvos terapêuticos, fármacos, enzimas metabolizadoras de fármacos, e anotações de sequências protéicas, possibilitando a integração de resultados obtidos por diferentes métodos utilizados no estudo do impacto de nsSNPs na função protéica. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most common type of genetic variation between humans, and have the potential to affect gene function, especially when they are located in coding or regulatory regions. Among the many types of SNPs, nonsynonymous SNPs (nsSNPs) are believed to have the greatest impact on protein function, often being associated to diseases, changes in drug response, and adverse drug reactions. The motivation of this work was the fact that a computational approach could be highly useful in the preliminary evaluation of the functional and structural impact of nsSNPs in protein encoding genes in humans, hence enabling the prioritization of candidate nsSNPs for experimental studies. For this purpose, nsSNP modeling was carried out in their corresponding native protein structures as coded by their genes, aiming to determine the impact caused by these variations using different computational methods, such as molecular docking and protein structure optimization. A database was built, relating results data from the computational analysis carried out with information which already exist, such as disease, metabolic pathways, drug targets, drugs, drug metabolizing enzymes, and protein sequence annotations, enabling the integration of results obtained by different methods used in the study of the impact of nsSNPs on protein function.

A família gênica masp (proteína de superfície associada a mucina), identificada durante a anotação do genoma do Trypanosoma cruzi, é a segunda maior família mutligênica neste parasito, consistindo de aproximadamente 1400 membros. Membros da família MASP contêm domínios N- e C-terminais conservados que codificam para um peptídeo sinal e um sítio de adição de âncora de GPI, respectivamente. A região central é variável em comprimento e em sequência de aminoácidos, e contém um grande repertório de motivos repetitivos, os quais sugerem que MASP esteja envolvida em interações parasito-hospedeiro. Uma vez que nenhum membro da família MASP foi caracterizado até o momento, decidiu-se estudar as estruturas secundária e terciária de diferentes MASPs. Para este objetivo, optou-se por clonar e expressar em Escherichia coli a região central das sequências de quatro membros MASP. Para isso, algumas características das proteínas alvo foram consideradas, tais como curto comprimento da sequência de aminoácidos, em torno de 170 resíduos, baixo conteúdo de sítios potenciais de glicosilação e baixo grau de desordem estrutural. Uma vez que regiões de baixa complexidade normalmente correspondem a segmentos desenovelados ou estruturas extendidas, foi utilizado o servidor PONDR VL-XT para predizer regiões desordenadas nos quatro membros MASP. Proteínas nativamente desenoveladas têm sido descritas por possuírem elevada taxa de resíduos carregados e baixa taxa de resíduos hidrofóbicos. Gráficos de carga líquida média versus taxa de hidrofobicidade foram obtidos para as regiões centrais das quatro MASPs. Estas análises revelaram a presença das quatro regiões centrais no espaço designado para proteínas nativamente desenoveladas. As sequências foram amplificadas por PCR, clonadas nos sistemas de clonagem TOPO e/ou pGEM-T e submetidas ao sequenciamento de DNA. Posteriormente, os produtos de PCR foram transferidos para dois vetores de expressão derivados do vetor pET-28a (Novagen), que foram modificados no Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas / SP). Em ambos os vetores, o sítio de reconhecimento por trombina foi substituído pelo sítio de reconhecimento da protease TEV (tobacco etch vírus). As quatro proteínas MASP em fusão a cauda de histidina N-terminal foram expressas na forma solúvel, enquanto que aquelas fusionadas a GST N-terminal foram expressas como corpos de inclusão insolúveis, exceto a recombinante MASP1:GST. A purificação da MASP 3 fusionada a cauda de histidina foi realizada por cromatografia de afinidade. Após a clivagem da etiqueta por TEV, a proteína foi purificada por cromatografia de troca iônica. O estudo da estrutura tridimensional de proteínas MASP permitirá uma compreensão mais detalhada destas moléculas, tal como a localização de seus epítopos e seu enovelamento, o que pode contribuir para a identificação de sua função biológica no T. cruzi. The Trypanosoma cruzi masp (mucin associated surface protein) gene family was identified during the annotation of the genome as the second largest gene family in this human pathogen, consisting of approximately 1400 members. MASP members contain N- and C- terminal conserved domains that encode a putative signal peptide and a GPI-anchor addition site, respectively. The central region is variable both in length and in amino acid sequence and contains a large repertoire of repetitive motifs, which suggests MASP may be involved in parasite-host cell interaction. Since no member of the MASP family has been characterized to date, we have decided to study the secondary and tertiary structures of distinct MASPs. For this purpose, we have decided to clone and express in E. coli the central region sequences of four MASP members. For this, some features of the target proteins were considered such as short amino acid sequence length, around 170 residues, low content of potential glycosylation sites and low intrinsic disorder degree. Knowing that sequence regions with low complexity nearly always correspond to nonfolding segments or extended structures, we have used the web server PONDR VL-XT to predict disordered regions in MASPs. Natively unfolded proteins have been described to possess a high ratio of charged residues and a low ratio of hydrophobic residues. The mean net charge versus mean hydrophobicity ratio was ploted for the four MASPs central region. This analysis showed that the four central regions falls in the phase space of natively unfolded proteins. After that, the sequences were PCR amplified and cloned into TOPO and/or pGEM-T cloning systems and submitted to DNA sequencing. Subsequently, the PCR products were transferred to two expression vectors derived from pET-28a vector (Novagen), which were modified in the Center of Molecular and Structural Biology (CeBiME, Campinas/SP). In both vectors, the thrombin recognition site was replaced by a TEV (tobacco etch virus) protease recognition site. The four N-terminal fusion His-tag MASP proteins were expressed in the soluble forms, whereas the N-terminal GST fusion MASPs were expressed as insoluble inclusion bodies, except the recombinant GST:MASP1. Purification of the Histidine-tagged MASP3 was carried out by affinity chromatography. After His-tag cleavage by TEV, the protein was purified by ion exchange chromatography. The study of the three-dimensional structure of MASP proteins will enable a more detailed understanding of these molecules, such as the location of their epitopes and its fold, which may contribute to the identification of its biological function on T. cruzi.