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Orientador: Juliana Helena Costa Smetana Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O complexo mTORC1 integra sinais provenientes de nutrientes, energia e fatores de crescimento e coordena o crescimento e o metabolismo celular. A protei?na HBXIP foi inicialmente identificada como um parceiro de interac?a?o para a protei?na HBx do vi?rus da hepatite B que participa do processo de infecc?a?o viral e, mais recentemente, essa protei?na tambe?m foi identificada como uma subunidade essencial do complexo Ragulator. Este complexo pentame?rico, formado por p18, MP1, p14, C7orf59 e HBXIP, ancora as Rag GTPases na superfi?cie do lisossomo e funciona como GEF (fator de troca de nucleoti?deo) dessas GTPases, promovendo um estado ativado que recruta mTORC1 para a superfi?cie do lisossomo e promove sua ativac?a?o. HBXIP e? uma pequena protei?na com um enovelamento do tipo Roadblock que possui duas isoformas descritas, HBXIP longa (18 kDa) e HBXIP curta (11 kDa). Apesar de sua importa?ncia como subunidade do Ragulator e parceira de interac?a?o de HBx, pouco se sabe sobre as diferenc?as entre essas isoformas. Neste projeto, investigamos a relac?a?o evolutiva do complexo Ragulator com a protei?na viral HBx e a relac?a?o funcional entre eles. Usando ferramentas de bioinforma?tica, verificamos sinais de seleção positiva na seque?ncia da isoforma longa de HBXIP, o que caracteriza uma assinatura de conflito genético em relações evolutivas de parasita e hospedeiro. Análises de bioinformática também revelaram a existência de duas isoformas adicionais de HBXIP que se assemelham à isoforma curta exceto por uma pequena região N-terminal, e o padrão de expressão das quatro isoformas de HBXIP em diferentes tecidos humanos foi analisado em um banco de dados de RNA-seq revelando padrões tecido-específicos. Em células transfectadas, HBx colocaliza com as subunidades do Ragulator p14, C7orf59 e isoforma longa de HBXIP, mas não com p18, em estruturas que também são positivas para o corante mitocondrial Mitotracker Deep Red. O padrão de localização subcelular das subunidades do Ragulator é afetado pela expressão de HBx, que induz um padrão perinuclear indicativo do processo de mitofagia. Além disso, HBx interage com p14, C7orf59 e isoforma longa de HBXIP em células transfectadas. MP1 e a isoforma curta de HBXIP não foram testadas nesses experimentos. Esses resultados sugerem que HBx é capaz de interagir com todo o complexo Ragulator, possivelmente excluindo p18, em um complexo que provavelmente está envolvido no processo de mitofagia, e que a isoforma longa de HBXIP é uma aquisição evolutiva recente relacionada ao processo de infecção viral Abstract: The mTORC1 complex integrates signals arising from nutrients, energy, and growth factors and coordinates cell growth and metabolism. The HBXIP protein was initially identified as an interaction partner for the hepatitis B virus HBx protein that participates in the viral infection process, and more recently this protein has also been identified as an essential subunit of the Ragulator complex. This pentameric complex, formed by p18, MP1, p14, C7orf59, and HBXIP, anchors the Rag GTPases on the surface of the lysosome and functions as GEF (nucleotide exchange factor) of these GTPases, promoting an activated state that recruits mTORC1 to the surface of the lysosome and promotes its activation. HBXIP is a small protein with a Roadblock folding type that has two isoforms, HBXIP long (18 kDa) and HBXIP short (11 kDa), originating from alternative transcription initiation sites. Despite its importance as a Ragulator subunit and HBx interaction partner, little is known about the differences between these isoforms. In this project, we investigated the evolutionary relationship of the Ragulator complex with the viral protein HBx and the functional relationship between them. Using bioinformatics tools, we found signs of positive selection in the long isoform of HBXIP, which characterizes a signature of genetic conflict in evolutionary parasite-host relationships. Bioinformatics analyzes also revealed the existence of two additional HBXIP isoforms that resemble the short isoform except for a small N- terminal region, and the expression pattern of the four HBXIP isoforms in different human tissues was analyzed in an RNA-seq database revealing tissue- specific patterns. In transfected cells, HBx colocalizes with the subunits of Ragulator p14, C7orf59 and long isoform of HBXIP, but not with p18, in structures that are also positive for the mitochondrial dye Mitotracker Deep Red. The subcellular localization pattern of the Ragulator subunits is affected by the expression of HBx, which induces a perinuclear pattern indicative of the mitophagy process. In addition, HBx interacts with p14, C7orf59 and long isoform of HBXIP in transfected cells. MP1 and the short isoform of HBXIP were not tested in these experiments. These results suggest that HBx interacts with the entire Ragulator complex, possibly excluding p18, in a complex that is probably involved in the mitophagy process, and that the long isoform of HBXIP is a recent evolutionary acquisition related to viral infection Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular CAPES 8882.329493/2019-01 FAPESP

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019 Made available in DSpace on 2020-05-04T22:58:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2019-10-11

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos, Financiadora de Estudos e Projetos FAPERJ - Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro In Brazil and in other tropical areas Zika virus infection was directly associated with clinical complications as microcephaly in newborn children whose mothers were infected during pregnancy and the Guillain-Barré syndrome in adults. Recently, research has been focused on developing new vaccines and drug candidates against Zika virus infection since none of those are available. In order to contribute to vaccine and drug development efforts, it becomes important the understanding of the molecular basis of the Zika virus recognition, infection and blockade. To this purpose, it is essential the structural determination of the Zika virus proteins. The genome sequencing of the Zika virus identified ten proteins, being three structural (protein E, protein C and protein prM) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5). Together, these proteins are the main targets for drugs and antibody recognition. Here we examine new discoveries on high-resolution structural biology of Zika virus, observing the interactions and functions of its proteins identified via state-of-art structural methodologies as X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance spectroscopy and cryogenic electronic microscopy. The aim of the present study is to contribute to the understanding of the structural basis of Zika virus infection at an atomic level and to point out similarities and differences to others flaviviruses.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O Citomegalovírus (HCMV) é o maior vírus pertencente à classe dos herpesvírus humanos, da família Herpesviridae. Em pacientes imunocompetentes, a infecção primária por HCMV é geralmente oligoassintomática e sua reativação muito infrequente. Entretanto, em pacientes imunussuprimidos, a doença primária é acompanhada de alta morbimortalidade e os episódios de reativação muito recorrentes e sintomáticos. Em pacientes transplantados de órgãos ou tecidos trata-se de um problema praticamente universal. O HLA é um importante sistema que participa da resposta imune adaptativa a agentes infecciosos, sendo o principal responsável pela apresentação de antígenos derivados de patógenos a linfócitos T. O HLA é uma molécula extremamente polimórfica e cada tipo específico apresenta maior ou menor afinidade com os antígenos apresentados. O objetivo deste estudo foi determinar o grau de interação do HLA com os peptídeos das 10 principais proteínas antigênicas do HCMV e sua relação com o polimorfismo HLA. A sequência peptídica das proteínas foi obtida da base de dados UniProt e os peptídeos imunogênicos foram testados in silico através da predição de ligação de epítopos às moléculas do MHC. Redes neurais artificiais foram exploradas na ferramenta do website Immune Epitope Database para o cálculo do grau de afinidade (Ic50) dos 27 tipos de HLAs do tipo I quando testados com as 10 proteínas. As afinidades dos peptídeos foram classificadas por Ic50 em alta ( 500 nM). A maioria dos peptídeos previstos (98,30%, variando de 82,3% a 99,7% para as 10 proteínas) foram de baixa afinidade, com pouca chance de interagir com os HLAs. Em média, 0,41 peptídeos mostram alta afinidade de Ic50 com alguns HLAs. Quando classificado pelo número de peptídeos imunogênicos (Ic50 abaixo de 500 nM), a UL48 (maior) foi a mais imunogênica seguido por UL55, UL29, UL32, UL28, Pp65 (mais estudada), UL122, UL123, US3, US32. Essas análises revelaram que alguns HLA são ótimos para apresentar epítopos de HCMV, como A*02:03, A*02:06, A*31:01, A*68:01; enquanto outros são maus apresentadores como A*01:01, A*26:01, B*51:01, B*44:02. O HLA A *02:03 foi o melhor HLA para responder contra os peptídeos do HCMV que exibem níveis elevados de interação com todos os peptídeos da proteína, exceto o US32. Em contraste, os HLAs A*26:01, A*01:01, B*51:01 foram os piores HLAs a apresentar peptídeos de HCMV, exibindo nenhuma ou pouca interação com peptídeos previstos de todas as proteínas. No contexto clínico, conhecer a interação entre os HLAs e as proteínas do HCMV, pode ajudar a inferir o risco de infecção viral no pós-transplante. Cytomegalovirus (HCMV) is a common human herpesvirus mostly asymptomatic in immunocompetent population. In immunosuppression, as transplantation, HCMV can reactive and affect transplant outcome, causing changes in clinical status. HLA is an important system that participates in antigen presentation and T cell activation, which imposes important barrier to transplantation. Matches between HLA guides donor-receptor compatibility. We asked if different HLA would be associated with resistance to HCMV. We chose 10 most immunogenic HCMV proteins related to CD8+ response. The proteins sequence was taken from UniProt Database and immunogenic peptides for MHC-I were predicted by T Cell Epitopes MHC binding Prediction using Artificial Neural Networks to calculate predicted Ic50 at Immune Epitope Database website against 27 types of I HLAs. The peptides affinities were classified by Ic50 into high (500 nM). The majority of predicted peptides (98.30%, varying 82.3% to 99.7% for the 10 proteins) were low affinity with little chance to interact with HLAs. On average, 0.41 peptides show high affinity Ic50 in the HLA. When classified by the number of immunogenic peptides (Ic50 below 500 nM), UL48 (biggest) were found to be the most immunogenic followed by UL55, UL29, UL32, UL28, Pp65 (most studied), UL122, UL123, US3, US32. These analyses revealed that some HLA are optimal to present HCMV epitopes, as A*02:03, A*02:06, A*31:01, A*68:01; while others are poor presenters as A*01:01, A*26:01, B*51:01, B*44:02. HLA A*02:03 was the best HLA to respond against HCMV peptides displaying high levels of interaction with all protein peptides but US32. In contrast HLA A*26:01, A*01:01, B*51:01 were the worst HLAs to presents HCMV peptides displaying none or just few interactions with predicted peptides from all proteins. Clinical context, knowing the interaction between the HLAs and HCMV proteins might help infer the risk of virus infection on post transplantation.

Los mecanismos innatos antivirales han resultado de gran interés debido a su uso potencial para la prevención y tratamiento de la infección por el VIH. En particular, los factores solubles antivirales han sido objeto de múltiples investigaciones por su capacidad de inhibir diferentes pasos del ciclo replicativo viral y de potenciar la respuesta inmune del hospedero. Entre estos factores solubles se destacan TRIM-5α, APOBEC3G, SAMHD1, ELAFIN, SERPINA1 y SLPI, que actúan directamente sobre la partícula viral o la célula, o promueven la producción de moléculas involucradas en la respuesta inmune contra el virus. Algunos de ellos se han correlacionado con un bajo riesgo de adquirir la infección por el VIH o con una lenta progresión a sida. La exploración de los mecanismos antivirales de estas proteínas es requisito para el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas. Antiviral innate mechanisms have a potential use in developing preventive and therapeutic strategies against HIV. Specifically, antiviral soluble factors have been evaluated in multiple investigations, based on their capacity to inhibit different steps of the viral cycle, and to increase the host immune response. Among these factors, TRIM-5α, APOBEC3G, SAMHD1, ELAFIN, SERPINA1 and SLPI are of particular interest, as they can act directly on the viral particle or the cell, or promote the production of molecules related to the viral immune response. Some of these factors have been associated with a low risk of HIV infection or slow progression to AIDS. Evaluation of mechanisms exhibited by antiviral proteins is a requirement for developing new therapeutic alternatives. Os mecanismos inatos antivirais resultaram de grande interesse devido a seu uso potencial para a prevenção e tratamento da infecção pelo HIV. Em particular, os fatores solúveis antivirais foram objeto de múltiplas pesquisas por sua capacidade de inibir diferentes passos do ciclo replicativo viral e de potenciar a resposta imune do hospedeiro. Entre estes fatores solúveis se destacam TRIM-5α, APOBEC3G, SAMHD1, ELAFIN, SERPINA1 e SLPI, que atuam diretamente sobre a partícula viral ou a célula, ou promovem a produção de moléculas envolvidas na resposta imune contra o vírus. Alguns deles se correlacionaram com um baixo risco de adquirir a infecção pelo HIV ou com uma lenta progressão a aids. A exploração dos mecanismos antivirais destas proteínas é requisito para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:21Z : No. of bitstreams: 1 000846728.pdf: 2846465 bytes, checksum: 18af526d81e692060fa0256a7c869b01 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Dengue é a infecção por arbovírus mais comum em todo o mundo e é causada por quatro sorotipos distintos (DENV 1-4). No presente trabalho analisamos a transmissão do Dengue virus (DENV) em São José do Rio Preto (SP) no período entre 2011 e 2014. Foram utilizadas amostras de sangue de pacientes febris que procuraram o serviço de saúde do município. A pesquisa do DENV foi realizada através da técnica Multiplex RT-PCR utilizando primers que se ligam a regiões do gene da proteína não estrutural NS5 e da proteína estrutural C, seguido por Nested-PCR com iniciadores espécie-específicos. Foram analisadas 1.098 amostras no período entre agosto de 2011 a junho de 2014. Setecentos e noventa e oito amostras (798/1098, 72%) foram confirmadas como positivas por Multiplex-Nested-PCR. Os sorotipos de DENV encontrados foram: 65,41% (522/798) DENV-4, 22,56% (180/798) DENV-1, 11,28% (90/798) DENV-2 e 0,75% (6/798) co-infecção (DENV-1/DENV-4, DENV- 1/DENV-2), mostrando um padrão complexo de circulação dos sorotipos. Com a utilização de técnicas de geoestatística dos casos de dengue foi possível a detecção de áreas (zona Norte de São José do Rio Preto) com risco relativo elevado de ocorrência de DENV-4, áreas estas que foram priorizadas com relação ao emprego de medidas de vigilância e controle. Trinta e três amostras de DENV-4 foram submetidas ao sequenciamento do gene do envelope, assim como, à reconstrução filogenética. Dentre as 33 amostras, dez tiveram o genoma completo sequenciado, sendo filogeneticamente classificadas. As análises filogenéticas mostram que as amostras identificadas neste estudo foram agrupadas no genótipo Americano, que circula no Brasil. O genótipo Americano demonstrou apenas um clado agrupando todas as amostras de SJRP, indicando a circulação de uma única linhagem. A análise filogenética do genoma completo de DENV-4 mostra relação entre os isolados... Dengue is the most common arboviral infection worldwide and is caused by four distinct serotypes. In the present study we assessed the Dengue virus (DENV) transmission in São José do Rio Preto (SP) from 2011 to 2014. We analyzed blood samples from febrile patients who where attended at health care services in São José do Rio Preto. The DENV detection was performed with Multiplex RT-PCR using Flavivirus generic primers based on nonstructural protein (NS5) and structural protein (C), followed by Nested-PCR assay with species-specific primers. We analyzed 1098 samples from August 2011 to June 2014. Seventy two samples (798/1098, 72%) were confirmed as positive by multiplex RT-PCR. The DENV serotypes distribution were: 65.41% (522/798) DENV-4, 22.56% (180/798) DENV-1, 11.28% (90/798) DENV-2 and 0.75% (6/798) coinfection (DENV-1/DENV-4, DENV-1/DENV-2), showing a complex serotypes circulation pattern a of serotypes circulation. With the use of geostatistical techniques of dengue cases it was possible to detect areas (northern zone of São José do Rio Preto) with high relative risk of DENV-4 occurrence, these areas should be prioritized regarding the employment of surveillance and control measures. Thirty-three DENV-4 have been subjected to sequencing of the entire envelope gene and were used for phylogenetic reconstruction. Among the 33 samples ten had the full genome sequenced and were classified phylogenetically. The phylogenetic analyses showed that the samples identified in this study were grouped with American genotype that circulating in Brazil. The American genotype showed only one clade grouped with all SJRP samples, indicating the circulation of a single lineage. Phylogenetic analysis of DENV-4 complete genome shows a relationship between isolates from São José do Rio Preto with isolates found in northern region of south America. Amino acid substitutions were observed in the structural proteins (21%) and non-structural proteins...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:21:44Z : No. of bitstreams: 1 oliva_cb_dr_sjrp.pdf: 1844534 bytes, checksum: 40948c5116118b7b10a75b5b44e849cc (MD5) A Hepatite C é uma doença presente em todo o mundo. O vírus da Hepatite C (HCV), o agente etiológico dessa doença, é um vírus de RNA de fita simples positiva. Seu genoma codifica uma única poliproteína precursora que após processamento origina dez proteínas virais. A NS5A, uma das proteínas virais não estruturais, esta associada com a resposta ao tratamento baseado em Interferon, tratamento aprovado para Hepatite C no Brazil.O HCV tem uma alta taxa de mutação levando a uma alta variabilidade, fator importante para a evasão da resposta imune e a resposta ao tratamento. O objetivo deste trabalho foi analisar a evolução das quasiespécies antes, durante e após o tratamento em pacientes infectados com HCV genótipo 3a que apresentaram diferentes respostas ao tratamento. O RNA viral foi extraído, o cDNA sintetizado, a região NS5A amplificada e clonada e 15 clones de cada ponto de coleta foram seqüenciados. As sequências foram analisadas com relação a história evolutiva, diversidade genética e seleção. Nossas análises mostram que a população viral que persiste após o tratamento na maioria dos pacientes não respondedores está presente em amostras pré-tratamento sugerindo uma aptidão para evadir o tratamento. Ainda a maioria das amostras pré-tratamento de pacientes respondedores ao final do tratamento ou não apresentou a população encontrada nas amostras pós-tratamento ou apresentou em menor freqüência. As exceções ilustram a característica única do processo evolutivo e conseqüentemente o processo de resistência ao tratamento em cada paciente. A evolução do vírus da Hepatite C ao longo do tratamento aparenta ser o resultado de uma relação evolutiva única entre as cepas virais e cada hospedeiro humano, levando a persistência do vírus ou a resposta ao tratamento Hepatitis C is a disease spread throughout the world. Hepatitis C virus (HCV), the etiological agent of this disease, is a single-stranded positive RNA virus. Its genome encodes a single precursor protein that yields ten proteins after processing. NS5A, one of the non-structural viral proteins, is most associated with interferon-based therapy response, the approved treatment for hepatitis C in Brazil. HCV has a high mutation rate and therefore high variability, which may be important for evading the immune system and response to therapy. The aim of this study was to analyze the evolution of NS5A quasispecies before, during, and after treatment in patients infected with HCV genotype 3a who presented different therapy responses.Viral RNA was extracted, cDNA was synthesized, the NS5A region was amplified and cloned, and 15 clones from each time-point were sequenced. The sequences were analyzed for evolutionary history, genetic diversity and selection. Our analysis shows that the viral population that persists after treatment for most non-response patients are is present in before-treatment samples, suggesting it is fitted to evasion of treatment. Accordingly, most before-treatment samples from end-of-treatment response patients either did not show the population found after the relapse or showed it in low abundance. The exceptions illustrate the uniqueness of the evolutionary process, and therefore the treatment resistance process, in each patient.Hepatitis C virus evolution throughout treatment appears to be the result of a unique evolutionary relationship between viral strains and each human host, leading to either persistence or clearance

Orientadores: Angela Maria Moraes, Ronaldo Zucatelli Mendonça, Thomas Noll Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: Células embrionárias de dípteros como as de Drosophila melanogaster S2 estão sendo utilizadas com sucesso na expressão de diversas proteínas recombinantes. Em comparação a células de mamíferos, este sistema de expressão mostra-se capaz de realizar modificações pós-tradução na complexidade requerida, apresentando maior facilidade de cultivo. O objetivo deste trabalho foi formular um meio de cultura livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, que proporcionasse o crescimento de células S2, aplicável a linhagens transfectadas (S2AcGPV2) produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Para tal, foi empregado o meio basal IPL-41 e avaliados os efeitos das concentrações de glicose, frutose, lactose, glutamina, metionina e tirosina, do hidrolisado de leveduras yeastolate, do agente Pluronic F68, assim como de uma emulsão lipídica, sobre a concentração de células viáveis e a viabilidade celular. Em adição, foram avaliadas a velocidade específica de crescimento, a produtividade celular e a produção de GPV nas formulações testadas. Os ensaios foram realizados primeiramente em frascos do tipo schott, e, após a obtenção da formulação do meio de cultura mais adequada, realizaram-se ensaios cinéticos, em maior escala, em frascos do tipo spinner, nos quais se pode estudar a influência da concentração de oxigênio dissolvido e do pH no cultivo. Durante o estudo foram empregados dois modos de operação de cultivo, batelada e batelada alimentada. Nos estudos enfocando a formulação do meio de cultura, verificou-se que o meio IPL-41 suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de frutose, 2 g/L de lactose, 3,5 g/L de glutamina, 0,6 g/L de tirosina, 1,48 g/L de metionina, 6 g/L de yeastolate, 1 % de emulsão lipídica e 0,05 % de Pluronic F68 mostrou-se como o mais adequado para a obtenção de elevadas concentrações celulares (superiores a 300 x 105 células/mL). Com esta formulação, foram realizados os ensaios em frascos spinner, no sistema Cellferm-pro®. Neste sistema as células S2AcGPV2 atingiram a maior concentração (368 x105 células/mL) e o maior teor de GPV (9,39 ng/106 células) quando mantidas na concentração de 40 % de oxigênio dissolvido e pH 6,3. A avaliação do metabolismo celular mostrou que asparagina, serina, prolina, glutamina, glicose e a maltose foram os principais nutrientes consumidos e que alanina, lactato e amônia foram os principais metabólitos produzidos Abstract: Drosophila melanogaster Schneider 2 cells have been used with success to produce several recombinant proteins. This expression system presents several advantages when compared with mammalian cells expression system, and usually provide an adequate postradutional protein processing, being easier to culture. The aim of this work was to produce an animal component-free medium for S2 cells growth, and also for transfected cells (S2AcGPV2) producing the G glycoprotein from rabies virus (GPV). The basal IPL-41 medium was used and the effects of supplements glucose, fructose, lactose, glutamine, methionine, tyrosine, yeastolate ultrafiltrate, Pluronic F68 and lipid emulsion on viable cell concentration and cellular viability were evaluated. In addition, the cell specific growth rate, cellular productivity and GPV production were analyzed in the formulations studied. The experiments were carried out in schott flasks, as well as in spinner flasks. The effects of dissolved oxygen concentration and pH were evaluated in spinner flasks. During the study, batch and fed- batch mode operation were used. In the studies focusing media formulation developed, IPL-41 supplemented with 10 g/L of glucose, 0.5 g/L of fructose, 2 g/L of lactose, 3.5 g/L of glutamine, 0.6 g/L of tyrosine, 1.48 g/L of methionine, 6 g/L of yeastolate, 1 % of lipid emulsion and 0.05 % of Pluronic F68 provided high cell density (above 300 x105 cells/mL). In the experiments performed in spinner flasks, using the Cellferm-pro® system, S2AcGPV2 cells reached the highest cell concentration (368 x105 cells/mL) and protein content (9.39 ng/106 cells), at 40 % of dissolved oxygen concentration and pH of 6.3. The cell metabolism shown that, amino acids as asparagine, serine, proline, glutamine, and carbohydrates as glucose and maltose were consumed. The main metabolities produced were alanine, ammonia and lactate Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutor em Engenharia Química

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007 Nível de preservação: critical, Criado em: 2008-06-06 15:34:20, Criado por: super:MARTA, Alterado em: 2009-08-13 11:14:06, Modificado por: super:MARTA Made available in DSpace on 2010-07-22T08:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16201_Joana%20Loureiro%20Tese.pdf: 8949881 bytes, checksum: 8fdaddd193d79aecb2d77c09077b014b (MD5) 16201.xml: 16810 bytes, checksum: 310fdce84d6f001c920ed7edc906c97a (MD5) Previous issue date: 2006 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e Fundação Calouste Gulbenkian (FCG)