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Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: Este trabalho descreve a toxicidade e o valor protéico relativos a doze cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris, L.), produzidos pelo Instituto Agronômico de Campinas, ou seja: Aroana, Cara Suja, Jalo, Goiano Precoce, Carioca, Piratã-l, Iguaçú, Rico-23, Aeté-l, Aeté-3, Rosinha G2 e Roxinho. Estabelecida a composição centesimal dos grãos de todos os cultivares, seguiu-se o estudo da toxidez verifi-cando-se que ratos Wistar alimentados com farinha integral de grãos crus, como única fonte protéica, sucumbiam no período de 3,8 ('Goiano precocel) a 8,4 dias ('Aroan~'). Quando esta farinha integral foi misturada com caseína, evidenciaram-se prejuízos no aproveitamento da ração e no desenvolvimento dos animais, expressos pelas diminuições de peso, de digestibilidade, de valor biológico e de utilização líquida das proteinas (NPU). Estabeleceu-se um correlacionamento positivo e significativo entre a toxicidade, expressa em perda de peso proteína inger! -da, e a atividade hemaglutinante total, enquanto que a atividade antitríptica e o conteúdo de taninos não mostraram correlação com o efeito tóxico.O efeito prejudicial das lectinas manifestou-se pela interação das mesmas com as vilosidades intestinais, causando-lhes graves danos e levando os animais a um aproveitamento inadequado dos nutrientes da ração. Estes efeitos, quando intensos e prolongados, podem levar os ratos ã morte,apesar da capacidade de adaptação e/ou recuperação, demonstrada pelos mesmos. As análises de aminoácidos, por cromatografia gasosa ou de troca iônica, revelaram-se equivalentes e comprova ram que as proteínas dos grãos dos cultivares estudados são deficientes em aminoácidos sulfurados e relativamente ricos em lisina, leucina,' isoleucina, fenilalanina + tirosina e treonina. Não se detectou correlacionamento entre o conteúdo de enxofre total e os teores de aminoácidos sul furados. Contudo, foram encontradas correlações positivas e significativas entre o conteúdo deste elemento e os valores de NPR, ganho de peso, ganho de peso/consumo de proteina, determinados com grãos autoclavados. O conteúdo de metionina potencialmente disponível, da proteína dos grãos, determinado através da reação com BrCN e avaliação por cromatografia gasosa, apresenta correlação significativa com o de metionina biologicamente disponível. O tratamento térmico foi bastante efetivo na eliminação da toxidez natural dos grãos, tornando suas proteínas capazes de promover o desenvolvimento dos ratos. A baixa digestibilidade destas proteínas, também foi atribuída ã eliminação fecal de elevado teor glicoprotéico decorrente da exaustão e degradação, das células caliciformes, causada pela passagem do feijão através do trato intestinal dos animais. Apesar das diferenças. significativas na toxicidade de grãos crus dos cultivares estudados, o valor protéico foi equivalente para todos, quando estes foram tratados térmicamente Abstract: In the present work, the relative toxicity and protein value of seeds of twelve cultivars of common beans(Phaseolusvulgaris~ L.) were studied. Seeds of the cultivars Aroana, Cara Suja, Jalo, Goiano Precoce, Carioca,Piratã-l,Iguaçú, Rico-23, Aeté-l, Aeté-3, Rosinha G2 and Roxinho, were obtained from the Instituto Agronômico de Campinas, SP. The percent composition of the seeds of all cultivars was ascertained. Toxicity studies showed that Wistar rats died within 3,8 ('Goiano Precoce') to 8,4 days ('Aroana')when fed whole seed flour, as the only protein source. When whole seed flour was mixed with casein, strong impairment to ration utilization and animal deveIopment, were observed, and they were expressed as loss of weight, decreased protein digetibility, biological value and net protein utiIization. positive and significant correlation between toxici ty and hemaggIutinin activity was stabIished. On the other hand, antitriptic activity and tannin content did not show any correlation with -the toxic effect. The detrimental effect of lectins was evident by their interaction with the intestinal villi, which resulted in strong structure damage and, thus causing inadequate utilization of ration nutrients. These effects when strong and prolongated can cause the rat' s death, in spite of their adaptive and recovering capacity. Amino acid determination by gas or ion exchange chromatography, showed equivalent results: the seed proteins of alI cultivars studied were deficient in sulfur amino acids, but relatively rich in lysine, leucine, isoleucine, phenylalanine + tyrosine and threonine. No correlation was detected between the total sulfur content and the content of sulfur amino acids in the protein. However, a positive and significant correlation was obtained between the sulfur content and NPR, weight gain/ protein consumption, determined in autoclaved seeds. The content of biologically available methionine of seed proteins, was correlated with the content of chemical ly available methionine as determined by the reaction withBrCN and gas chromatography. "Heat treatment was effective for removing the natural toxicity of common beans, enabling the seed proteins to serve as growth promoters for the rato The low digestibili ty of these proteins was believed to be due to the fecal elimination of high.quantities of nitrogen, mainly glycoprotein as a consequenGe of the exahustion and degradation of goblet cellsi a direct result of the passage of raw bean components throught the intestinal tract of the animaIs. In spite of high difference in toxicity among the cultivars, the protein value was about the same for all cultivars studied. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Recombinant proteins expressed in cell culture have been shown to be relevant in the biopharmaceutical production focusing human heaths. Insulin, interferon and vaccine against B hepatitis are products obtained from recombinant expression system. Importantly, the precipitation is a widely used technique for separating proteins from a mixture due to its simplicity, and the process is incremented by the use of salts. This study initially dealt with the validation of the salt precipitation method by using the purified BSA and trypsin, and then, to investigate the precipitation process of recAVLOEc protein synthesized by cells of E. coli BL21 (DE3) pLysS used as expression system for the AVLO. This protein has shown antiviral activity and it found in the hemolymph of Lonoimia obliqua caterpillar. The precipitation was conducted by the use of conventional salts (ammonium sulfate and sodium sulfate) and the volatile salt ammonium carbamate. The proteins of the bacterial expression system were evaluated for their antiviral potential virus-infected cell cultures. Bacterial cells were resuspended in phosphate buffer and lysade by ultrasound. In the experimental procedure, the saturated salt solution (ammonium sulfate, sodium sulfate or ammonium carbamate) was added dropwise to the protein solution. This mixture was kept at constant temperature of 5°C for 24 h. The supernatant phase was separated from the precipitate phase by centrifugation. The protein precipitate obtained from bacterial lysate was then added to cultures of L929 and Vero cells to evaluate the cytotoxic effect; and cultures of these cells were subsequently infected with virus (EMC and measles). The results showed better efficiency of sodium sulfate on the precipitation of BSA compared to ammonium sulfate, while for trypsin, the ammonium carbamate showed more effective. Toxic effect on the culture of L929 cells was observed for the precipitate obtained by the use of ammonium sulfate and sodium sulfate. However, as expected, the precipitated protein obtained by the use of volatile ammonium carbamate salt showed a lower cytotoxic effect. Tests in L929 cultures infected with EMC, were performed; however, protein samples obtained by conventional and volatile salts used as a precipitating agent did not show antiviral action. In Vero cell cultures, the precipitated protein from cell lysate by sodium sulfate showed antiviral action for measles. Proteínas recombinantes, expressas em culturas celulares, têm se mostrado importantes na produção de fármacos de interesse para a saúde humana. Insulina, interferons e a vacina contra a hepatite B são exemplos de produtos obtidos a partir de sistemas recombinantes de expressão. A precipitação é uma técnica amplamente empregada para separação de proteínas a partir de uma mistura devido à sua simplicidade, sendo tal fato potencializado pelo uso de sais. Este estudo, inicialmente, abordou a validação do método de precipitação salina das proteínas puras BSA e tripsina e em adição a investigação do processo de precipitação da proteína recAVLOEc, sintetizada por células de E. coli BL21 (DE3) pLysS utilizadas como sistema de expressão. Tal proteína é originalmente encontrada na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. A precipitação foi conduzida por meio do uso de sais convencionais (sulfato de amônio e de sódio) e do sal volátil carbamato de amônio. As células bacterianas foram ressuspendidas em tampão fosfato e submetidas à lise mecânica. No procedimento experimental estabelecido, o contato de um concentrado proteico com uma solução salina saturada (sulfato de amônio, sulfato de sódio ou carbamato de amônio) foi mantido por 24 horas a 5°C. O sobrenadante foi isolado do precipitado por meio de centrifugação e estas frações tiveram sua concentração proteica determinada através do método de Bradford. O precipitado proteico obtido do lisado bacteriano foi então administrado em culturas de células L929 e Vero para a avaliação do efeito citotóxico e posteriormente para a verificação da ação antiviral para o EMC e o sarampo. Os resultados demonstraram maior eficiência do sulfato de sódio na precipitação da BSA quando comparado ao sulfato de amônio. Enquanto que para a tripsina o carbamato de amônio foi mais efetivo. Um efeito tóxico em culturas de L929 foi observado para os precipitados obtidos pelo uso de sulfato de amônio e de sódio. Entretanto, como esperado, o precipitado proteico obtido pelo uso do sal volátil carbamato de amônio apresentou menor efeito citotóxico. Os testes em culturas de L929 infectadas com o vírus EMC foram efetuados e as amostras de proteínas precipitadas com os sais convencionais e o sal volátil não resultaram em ação antiviral. Em culturas de células Vero, o uso do sulfato de sódio como agente de precipitação das proteínas contidas no lisado bacteriano resultou em ação antiviral para o sarampo. Mestre em Engenharia Química

Orientador: Antonio Celso Ramalho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar as possíveis alterações testiculares decorrentes da extirpação bilateral da glândulas salivares submandibulares e sublinguais de ratos jovens, alimentados com dietas contendo diferentes teores de proteína. Foram utilizados 48 ratos (Rattus norvergicos, albinos, Wistar), machos com 20 dias de idade, distribuídos em 2 grupos experimentais, alimentados com dieta com teores de proteína diferentes (Grupo A = 17,5% de proteína; Grupo B = 10% de proteína). Em cada grupo um terço dos ratos foram submetidos à extirpação bilateral das glândulas submandibulares ¿ sublinguais e os dois terços restantes sofreram apenas anestesia, incisão cervical e sutura. Em seguida, tanto no grupo A quanto no B, foram redistribuídos em 3 subgrupos, de forma que cada deles ficou constituído de 8 animais normais, (NO) 8 sialoadenectomizados (SI) e 8 normais alimentação pareada (NP). Todos os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas individuais durante os 24 dias de experimentação. Ao final de cada período de 4 dias, verificou-se o peso dos ratos sempre à mesma hora. Anotou-se a ingestão diária de dieta bem como após cada período de 4 dias. Após 24 dias de observação, os animais foram sacrificados por decapitação e, na necropsia, os testículos e epidídimos esquerdos foram retirados por via abdominal. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Not informed. Mestrado Fisiologia Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Marcos Antonio Machado Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que leva a severas perdas econômicas devido à contaminação e à erradicação de plantas de citros. Com o seqüenciamento completo do genoma de Xac, vários genes supostamente envolvidos com a patogenicidade de Xac foram identificados. Os genes ligados à resposta de hipersensibilidade (hrp) e avirulência (avr) em geral estão relacionados à patogenicidade de Xanthomonas, entretanto, poucos estudos funcionais destes genes de Xac foram feitos. Foram construídas linhagens mutantes de Xac para a perda de função dos genes hrpF e avrXacE2 e, nas análises in vivo, foi verificado que hrpF está envolvido na patogenicidade de Xac e é essencial para a manifestação dos sintomas primários da doença. A mutação de avrXacE2 não provocou alterações na capacidade de Xac em provocar os sintomas do cancro, portanto, este gene não parece ser essencial para a patogenicidade da bactéria, podendo não estar envolvido diretamente na patogenicidade de Xac. Os genes hrpF e avrXacE2 foram clonados em vetores de expressão e foram realizados testes de indução da expressão destas proteínas em sistemas heterólogos. Somente a proteína AvrXacE2 foi expressa, purificada e submetida a teste de interação com as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante de Xac para o gene avrXacE2. Os testes de interações não confirmaram a identificação de proteínas com afinidade específica pela proteína recombinante AvrXacE2. A proteína HrpF não foi super-expressa em sistema heterólogo. Nas análises de proteoma comparativo da linhagem de Xac selvagem versus linhagem mutante para o gene hrpF, foram detectadas alterações na expressão de proteínas citoplasmáticas e "pericelulares". Com base nas observações pode-se supor que HrpF possa influenciar processos celulares relacionados à respostas à situações de estresse e não somente atuar na translocação de moléculas efetoras via T3SS. A partir do que foi exposto neste trabalho, sugere-se que as técnicas de estudos funcionais de genes e análises proteômicas podem conjuntamente permitir que novos mecanismos relacionados a patogenicidade de Xac sejam interpretados. Com os mutantes produzidos neste estudo, espera-se criar condições para novos ensaios funcionais visando a melhor compreensão da patogenicidade de Xac e buscar novas formas de combate ao cancro cítrico Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of the citrus canker disease, which leads to economic losses due the contamination and erradication of citrus plants. The complete sequencing of its genome identified a number of genes supposedly involved with pathogenicity. Genes that code for hipersensitivity response (hrp) and avirulence (avr), in general, are related to the pathogenicity of Xanthomonas, however, only a few functional studies of these genes in Xac have been made. Here we report findings based on genomics and proteomics methods for Xac. Mutant strains of Xac for genes hrpF and avrXacE2 and in vivo assays demonstrated that hrpF is strongly involved in the pathogenicity of Xac and is essential for the manifestation of the primary symptoms of the citrus canker. On the other hand, the lack of avrXacE2 expression did not result in modifications in the capacity of Xac to elicite the symptoms of canker, therefore, this gene does not seem to be essential for the pathogenicity of the bacterium. The genes hrpF and avrXacE2 were cloned in expression vectors and tests of induction of the expression of these proteins in heterologous systems were carried out. The protein AvrXacE2 was expressed, purified and tested on interaction assays with cytoplasmic proteins of the mutant of Xac for the gene avrXacE2. The tests of interactions had not confirmed the identification of proteins with specific affinity for the recombinant protein AvrXacE2. The protein HrpF was not overexpressed in heterologous system. In the comparative proteome of the wild versus mutant strains for hrpF, modifications in the cytoplasmic protein expression and "pericellular" expression levels were detected. We postulate that, besides acting as a translocator of molecules through T3SS, HrpF may influence stress-related cellular responses. Thus, it is an opportune time to highlight the new and different ways in which HrpF serves Xac function. Moreover, we can assume that the techniques of functional genomics and proteomics analyses will clarify the mechanisms of pathogenicity used by Xac to cause citrus canker and, thus, enable the search for additional information to control the disease Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Aluisio Jose Antunes Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: As larvas das espécies Chrysomya albiceps, Chrysomya chloropyga e Chrysomya megacephala foram inicialmente utilizadas neste estudo. A espécie C. chloropyga, foi selecionada por seu comportamento semelhante em dieta natural (carcaça) e na dieta de leite e levedura (STOFFOLANO, 1974). Verificou-se inicialmente, o efeito de diferentes niveis de proteína na dieta, no desenvolvimento das larvas, utilizando-se a:rcD fonte proteica leite em pó integral, leite em pó integral combinado com levedura, caseína e caseína combinada com levedura, nos níveis de 2, 4, 6, 8 e 10%. Nas dietas de leite e de leite e levedura, as porcentagens de ganho de peso foram proporcionais ao nível de proteína das dietas nos níveis 2 e 4%. Nos níveis 6, 8 e 10%, não houve crescimento, provavelmente devido à alta concentração de sólidos nas dietas. Com a utilização de caseína e caseína combinada com levedura, obtivemos respostas de crescimento proporcionais ao níve1 de proteína das dietas até o nível 8% para as dietas de caseína e levedura e até o nível 10%, para as dietas de caseína. Como as dietas contendo levedura apresentaram resultados superiores aos obtidos somente com leite ou caseína como fontes proteicas e, sendo levedura uma fonte rica em ácido ribonucleico, este substituiu a levedura nas dietas de caseína, obtendo-se resultados superiores aos até então obtidos.- A série de dietas contendo caseína e RNA foi por este motivo utilizada como padrão nos ensaios subseqüentes. Verificamos então, respostas das larvas quando proteinas de diferentes origens eram adicionadas às dietas. No primeiro grupo de dietas as farinhas das leguminosas feijão e soja foram utilizadas, testando-se também o efeito de tratamento térmico e o de suplementação com metionina no desenvolvimento das larvas. A suplementação de feijão crú com metionina não aumentou a porcentagem de ganho de peso das larvas, o que ocorreu após o tratamento térmico e também com a suplementação da farinha tratada. Nas dietas com farinha de soja crua, quando suplementadas com metionina, as larvas apresentaram porcentagem de ganho de peso maior do que as dietas não suplementadas. O tratamento térmico também melhorou a qualidade das dietas. Os cereais arroz, milho e trigo foram utilizados como contendo cereal como única fonte proteica, para milho e trigo. A suplementação das dietas com aminoácidos limitantes produziu resultados superiores ou próximos aos obtidos com as dietas complementadas. Um último ensaio foi realizado utilizando-se ovo integral liofilizado como fonte proteica, obtendo-se resultados bastante satisfatórios, embora as dietas não contivessem RNA adicionado, confirmando que o desempenho da dieta depende do balanço adequado de nutrientes Abstract: The growth of Chrysomya albiceps, Chrysomya chloropyga and Chrysomya megaceplala larvae toward a natural (mice carcass) and milk-yeast diets was studied. The larva of C. chloropyga was selected because of its identical growth in both diets. Experiments were carried out to study the effect of different protein levels and different protein sources as well. Four pratein sources were utilized in this study: l)dried whole milk, 2) dried whole milk-plusyeast, 3) casein and 4) casein cornbined with yeast. The protein levels were 2, 4, 6, 8 and 10% for each one of the diets. In the dried whole milk and dried whole milk-plus-yeast the gain in body weight was proportional to the protein content of the diets, at the levels af 2 and 4%. At 6, 8 and 10% the growth was impaired, probably due to the high solid concentration in the diets. When the caseio and the casein-plus-yeast diets were utilized, the growth was proportional to the protein content of the diets up to the leveI of 8%, in the case of the casein plus-yeast diet, and up to 10% for the casein diet. When yeast was incorporated to the diets, the growth rates were always higher than those obtained without it. This result was not surprising sinee yeasts are a good natural source of ribonucleic acid. The addition of RNA to the casein diet showed even better results, in terms of growth, than the casein-plus-yeast diet. For this reason, the casein diet to which RNA was added, was taken as the standard diet throughout this study. The effect af different protein saurces on the growth rates of C. chloropyga larvas was investigated in another set of experiments. The ability of bean (Phaseolus vulgaris) and soy-bean (Glycine max) proteins to support grawth as well as the effect of heat treatment and L-methionine supplementation were studied. The larvae did not respond to the supplementation of the unheated bean protein with L-methionine, however the growth rates were higher when the flour was heat-treated and when the heated-treated flour was supplemented with L-methionine. In the case of unheated soy flour, there was a better growth response after L-methionine addition; heated soy flour supported higher growth rates than the unheat flour both with and without L-methionine addition. Rice corn and wheat were also testes as protein sources for the C. Chloropyga larvae. Corn and wheat when supplemented with limiting amino acids elicited a better growth response than the unsupplemented sources. Supplementation of corn, rice and wheat with bean and soy-bean protein was beneficial to the growth of C. Chloropyga larvae. Dried whole egg vlas also tested, giving higher growth rates when compared with any other protein source Mestrado

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer. As fosfatases, enzimas que removem grupamentos fosfato dos substratos de quinases, dependem principalmente de subunidades regulatórias para definir sua especificidade. As fosfatases do tipo 2A constituem a subfamília PPP, que é formada por PP2A, PP4 e PP6. PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65/A). Em levedura, as fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42. A proteína Tip41 foi identificada como um parceiro de interação de Tap42 e regulador da via da quinase TOR em levedura. A homóloga de Tap42 em mamíferos, chamada de a4, está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento, migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A. A homóloga em mamíferos de Tip41, chamada TIPRL, é uma proteína ainda pouco caracterizada. Este trabalho teve como objetivo analisar a função das proteínas a4 e TIPRL humanas e esclarecer seu papel na regulação de fosfatases 2A. A caracterização estrutural de a4 e Tap42, usando dados de SAXS, dicroísmo circular e proteólise limitada, mostrou que essas proteínas apresentam um domínio N-terminal compacto formado por a-hélices e um domínio C-terminal desestruturado. Em uma triagem de interações com a proteína TIPRL humana, identificamos as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c como seus parceiros de interação, assim como os fatores de transcrição MafB e TAF10. Ao contrário do esperado a partir do modelo de levedura, a4 e TIPRL não interagem diretamente, mas formam um complexo ternário com PP2Ac. Uma triagem de substratos de fosfatases 2A regulador por TIPRL identificou os fatores de splicing SF2/ASF e SF2p32. Nossos resultados sugerem um modelo estrutural para a regulação das fosfatases 2A por a4 e mostram que TIPRL é um novo regulador comum dessas fosfatases com funções na regulação da expressão gênica. Abstract: Cells respond constantly to a variety of stimuli, which are interpreted and integrated through signaling networks, giving rise to biological responses. Defects in this circuitry are a cause of many diseases, including cancer. Protein phosphatases are enzymes which remove phosphate groups from kinase substrates, relying mainly on regulatory subunits for their substrate specificity. Type 2A phosphatases belong to the PPP subfamily, which is formed by PP2A, PP4 and PP6. PP2A is the major soluble serine/threonine phosphatase in animal cells and is found predominantly as a heterotrimer composed of a catalytic (C), a regulatory (B, B', B'' or B''') and a scaffold (PR65/A) subunit. Type 2A phosphatases play a major role in the yeast TOR signaling pathway through their interaction with the essential protein Tap42. Tip41 was identified as a Tap42 interacting protein and regulator of the TOR pathway. a4, the mammalian orthologue of Tap42, regulates many cellular processes such as differentiation, development, cell migration and apoptosis as a conserved type 2A phosphatase regulator. TIPRL, the mammalian orthologue of Tip41, is still poorly characterized. The objective of the present work was to analyse the function of a4 and TIPRL and improve the understanding of their role as type 2A phosphatase regulators. The structural characterization of a4 using SAXS analyses, circular dichroism and limited proteolysis, showed that these proteins are formed by an a-helical N-terminal domain and an unfolded C-terminal domain. A screen for TIPRL interacting proteins identified PP2Ac, PP4c and PP6c and also the transcription factors MafB and TAF10. Unlike their yeast conterparts, a4 and TIPRL do not interact directly, but rather form a ternary complex with PP2A. A search for type 2A phosphatase substrates regulated by TIPRL identified the splicing factor SF2/ASF and its regulatory protein SF2p32. Our results suggest a structural model for the regulation of type 2A phosphatases by a4 and show that TIPRL is a novel common regulator of these phosphatases which functions in regulation of gene expression. Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2021. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O interesse na utilização de Bacillus thuringiensis (Bt) como biopesticida, ao invés de produtos químicos, e seu espectro de toxicidade restrito ao alvo contribuíram para o estabelecimento de diversas coleções de estirpes de Bt ao redor do mundo. Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva aeróbica, que pode ser isolada de diversos locais tais como água, solo, teias de aranha e insetos mortos, sendo a bactéria entomopatogênica mais utilizada como biopesticida mundialmente. O uso em grande escala se deve aos cristais proteicos citoplasmáticos formados durante a esporulação, denominados δ-endotoxinas (Cry e Cyt), além de proteínas secretadas durante a fase vegetativa (Vip e Sip). Para a caracterização de novos isolados de Bt vários métodos são utilizados, incluindo métodos moleculares como a reacao em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR). A qPCR é capaz de monitorar a reação enquanto ela progride (em tempo real) e os dados são coletados ao longo da PCR. Tendo em vista a importância da caracterização das estirpes de Bt para o desenvolvimento de novos bioinseticidas ou eventos transgênicos, para prospecção de novos genes cry, cyt, vip e sip com potencial entomocida, para identificação de novos genes nas estirpes de Bt e auxilio no entendimento da distribuição e diversidade das estirpes e genes de Bt, esse trabalho teve como objetivo criar um sistema de identificação de genes baseado em reações de qPCR com base nos genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry7, cry8, cry9, cry10, vip1, vip2, vip3, cyt1, cyt2 e sip para caracterização de 257 estirpes de Bacillus spp. da Coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, analisando o grau de correlação entre a distribuição dessas estirpes com a origem do substrato de onde a estirpe foi isolada e entre a sua distribuição e condições geoclimáticas. Foi possível observar que os genes cry1, cry2 e vip3a/b ocorrem de maneira homogênea no território brasileiro e alguns genes são encontrados em regiões especificas. O maior reservatório de variabilidade está dentro das estirpes de Bt em cada região, e sugere-se que tanto as condições geoclimáticas, quanto os cultivos regionais, interferem na diversidade genética que as estirpes de Bt apresentam, e que estirpes de Bt podem trocar constantemente informações genética. The interest in the use of Bt as a biopesticide, instead of chemicals, and its toxicity spectrum restricted to the target contributed to the establishment of several collections of Bt strains around the world. Bacillus thuringiensis (Bt) is a gram-positive aerobic bacterium, which can be isolated from several places, such as water, soil, spider webs and dead insects, being the most used entomopathogenic bacterium as a biopesticide worldwide. The large-scale use is due to the cytoplasmic protein crystals formed during sporulation called δ-endotoxins (Cry and Cyt), in addition to proteins secreted during the vegetative phase (Vip and Sip). For the characterization of new Bt isolates several methods are used including molecular methods such as the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). qPCR is able to monitor the reaction as it progresses and data is collected over the course of the PCR. Owing the importance of the characterization of Bt strains to the development of new bioinsecticides or transgenic events, for the prospection of new cry, cyt, vip and sip genes with potential entomocide, for the identification of new genes in the Bt strains and aid in understanding distribution and diversity of Bt strains and genes, this work aimed to create a gene identification system based on qPCR reactions based on the genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry7, cry8, cry9, cry10, cry11a, vip1, vip2, vip3, cyt1, cyt2 and sip for characterization of 257 strains of Bacillus spp. of the Ivertebrate Bacteria Collection of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, analyzing the degree of correlation between the distribution of these strains and the origin of the substrate from which the strain was isolated and between its distribution and geoclimatic conditions. It was possible to observe that the genes cry1, cry2 and vip3a/b occur homogeneously in the Brazilian territory and some genes are found in specific regions. The biggest reservoir of variability is within the Bt strains in each region, and it is suggested that both geoclimatic conditions and regional crops interfere with the genetic diversity that the Bt strains present, and that Bt strains can constantly exchange genetics information.

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Coorientador: Dr. Claudemir de Souza Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 31/03/2021 Inclui referências: p. 81-95 Resumo: Os estudos de qualidade de água são um grande desafio para a manutenção dos ambientes naturais e da biodiversidade, e as buscas por novas ferramentas são necessárias para atender a essa demanda ambiental. As proteínas metalotioneína (MT) e vitelogenina (VTG) são dois importantes biomarcadores de exposição a poluentes, expressas em peixes quando expostos a metais tóxicos e substâncias estrogênicas, respectivamente. Para investigar se alterações nos parâmetros físicos e químicos interferem na expressão dessas proteínas, e validar sua posterior utilização em biomonitoramento ambiental, exemplares adultos de Danio rerio foram mantidos em laboratório sob diferentes temperaturas e pHs, por 4d, 10d, 15d e 20d. Após a exposição, os espécimes foram eutanasiados e preservados a -80oC, homogeneizados e o extrato centrifugado e preservado para análises posteriores. A concentração de proteínas totais foi estimada por espectofotometria, a 280nm. Frações solúveis resultantes do homogenato foram analisadas pelo ensaio de ELISA quantitativo. Análises de expressão gênica foram realizadas por rt-qPCR, utilizando oligonucleotídeos iniciadores gerados com base na sequência nucleotídica das proteínas MT e VTG de D. rerio, obtidas no GenBank. A expressão dos genes endógenos Fator de Alongamento e Carreador de Soluto 25? foram utilizadas para normalizar os dados, através do método delta-delta Ct. Os resultados foram analisados estatisticamente para determinar se esses fatores físicos e químicos interferem nesses biomarcadores, permitindo uma melhor interpretação de avaliações da qualidade da água com base em seu uso. Nos ensaios de ELISA, não foram constatadas diferenças significativas na concentração de VTG em nenhum dos tratamentos; em relação à proteína MT também não foram observadas diferenças significativas em relação às diferentes temperaturas testadas. Entretanto, os grupos submetidos a pH extremos (9,0 e 5,0) mostraram diferenças significativas no conteúdo de MT em relação ao grupo controle nos dias 10 e 15 de exposição, recuperando os valores no 20º dia de exposição. A expressão gênica de ambas as proteínas também não mostrou diferenças significativas entre os tratamentos para machos e fêmeas (exceto machos submetidos aos pHs ao 20º dia, que diminuíram sua expressão de MT). Já entre machos e fêmeas, os únicos grupos que se mostraram diferentes foram as fêmeas submetidas à 25ºC e a pH 5,0, para VTG, em relação aos machos controle destes tratamentos. Através destes resultados pode-se concluir que essas proteínas constituem biomarcadores confiáveis em D. rerio, uma vez que não aumentam sua expressão gênica ou proteica com a variação da temperatura e pH testados. Palavras Chaves: biomarcadores, imunodetecção, parâmetros físicos e químicos, bioensaios, peixe-zebra. Abstract: Water quality studies are a major challenge for the maintenance of natural environments and biodiversity, and searches for new tools are needed to attend this environmental demand. The proteins metallothionein (MT) and vitellogenin (VTG) are two important biomarkers of exposure to pollutants, expressed in fish when exposed to toxic metals and estrogenic substances, respectively. To investigate whether changes in physical and chemical parameters interfere with the expression of these proteins, and validate its subsequent use in environmental biomonitoring, adult specimens of Danio rerio were kept in the laboratory under different temperatures and pHs, for 4d, 10d, 15d and 20d. After exposure, the specimens were euthanized and preserved at -80ºC, homogenized and the extract was centrifuged and preserved for further analysis. The concentration of total proteins was estimated by spectrophotometry, at 280nm. Soluble fractions resulting from the homogenate were analyzed by the quantitative ELISA assay. Gene expression analysis were performed by rt-qPCR, using primers generated based on the nucleotide sequence of the MT and VTG proteins of D. rerio, obtained from GenBank. The expression of the endogenous Stretching Factor and Solute Carrier 25? genes were used to normalize the data, using the delta-delta Ct method. The results were analyzed statistically to determine whether these physical and chemical factors interfere with these biomarkers, allowing a better interpretation of water quality assessments based on their use. In the ELISA assays, no significant differences were found in the concentration of VTG in any of the treatments; in relation to the MT protein, no significant differences were also observed in relation to the different temperatures tested. However, the groups submitted to extreme pH 9.0 and 5.0 showed significant differences in the MT content in relation to the control group on days 10 and 15 of exposure, recovering the values on the 20th day of exposure. Gene expression of both proteins also showed no significant differences between treatments for males and females (except males submitted to pHs on the 20th day, which decreased their MT expression). Among males and females, the only groups that were different were females submitted to 25ºC and pH 5.0, about VTG, in relation to the control males of these treatments. Through these results it can be concluded that these proteins are reliable biomarkers in D. rerio, since they do not increase their gene or protein expression with the tested temperature and pH variation. Keywords: biomarkers, immunodetection, physical and chemical parameters, bioassays, zebrafish.

Orientador: Prof. Dr. Leandro dos Santos Coelho Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica. Defesa : Curitiba, 23/11/2021 Inclui referências: p. 107-116 Resumo: O problema de predição de estruturas de proteínas (do inglês Protein Structure Prediction, PSP) refere-se ao processo de determinar a sequência de aminoácidos que compõe uma proteína, sendo essa uma área essencial da medicina e biotecnologia. O PSP pode ser abordado como um problema de otimização que visa a determinação da estrutura estável ou nativa de proteínas com mínimo de energia livre possível, sendo o caso de estrutura nativa o foco nessa dissertação. O PSP ainda continua sendo um desafio na bioinformática, devido à falta de acurácia das funções de energia proteicas existentes, além do fato de que o número de sequências de proteínas cresceu exponencialmente, assim como o número de estruturas de proteínas conhecidas. Os bancos de dados atuais, tais como UniProtKB, contêm 93.000.000 de sequências de proteínas computadas, enquanto o Protein Data Bank (PDB) contém aproximadamente 135.000 estruturas conhecidas. Esta desproporcionalidade dos dados torna essa uma área de intensa exploração de abordagens computacionais. Uma das modelagens desse problema, a ab-initio, baseada na hipótese de Anfisen que tenta encontrar a estrutura da proteína a partir da minimização de sua energia livre, tem sido pouco cultivada no desenvolvimento de algoritmos de otimização e aprendizado de máquina, quando comparada a outras modelagens. Leva-se em consideração que mesmo que essa modelagem possua porcentagem de acurácia equivalente às demais, nota-se mais seu uso na literatura apenas para proteínas consideradas de tamanhos reduzidos. Este documento de dissertação de mestrado apresenta uma revisão da literatura em termos de trabalhos relacionados às técnicas utilizadas para resolver este problema, propõe o desenvolvimento de algoritmos que melhor realize o processo de PSP utilizando a modelagem ab-initio em proteínas de mais de 100 aminoácidos de comprimento. Nesse documento de dissertação, a metaheurística de otimização Jaya, inédita nessa aplicação, assim como duas variantes desta, são testadas e avaliadas para o problema de PSP ab-initio na modelagem AB off-lattice, a qual abstrai a conformação da proteína baseando-se na hidro afinidade de seus aminoácidos. Foram utilizadas sequencias de proteínas tanto reais quando artificiais de diferentes tamanhos retiradas do PDB. Dez sequências de aminoácidos de comprimentos variando de 13 a 143 resíduos foram conformadas pelo algoritmo. Além do mais, experimentos foram realizados com o propósito de avaliar a influência dos hiper parâmetros do algoritmo nos resultados. As conformações finais obtidas mostraram-se como dobramentos bons e coerentes em termos das métricas de análise utilizadas, como o desvio médio quadrático entre os átomos da conformação encontrada e os da proteína original. Abstract: The Protein Structure Prediction Problem (PSP) refers to the process of determining the sequence of amino acids that make up a protein, which is an essential area of medicine and biotechnology. PSP can be approached as an optimization problem that aims to determine the stable or native structure of proteins with as little free energy as possible, and the case of native structure is the focus of this dissertation. PSP still remains a challenge in bioinformatics due to the lack of accuracy of existing protein energy functions, in addition to the fact that the number of protein sequences has grown exponentially, as has the number of known protein structures. Current databases, such as UniProtKB, contain 93,000,000 computed protein sequences, while the Protein Data Bank (PDB) contains approximately 135,000 known structures. This disproportionality of data makes this an area of intense exploration of computational approaches. One of the models of this problem, ab-initio, based on the Anfisen hypothesis that tries to find the protein structure by minimizing its free energy, has been little cultivated in the development of optimization and machine learning algorithms, when compared to other modeling. It is taken into account that even if this modeling has a percentage of accuracy equivalent to the others, its use is more noticeable in the literature only for proteins considered to be of reduced sizes. This master's dissertation document presents a literature review in terms of works related to the techniques used to solve this problem, proposes the development of algorithms that better perform the PSP process using ab-initio modeling in proteins with more than 100 amino acids of length. In this dissertation paper, the Jaya optimization metaheuristic, unprecedented in this application, as well as two variants of it, are tested and evaluated for the PSP ab-initio problem in AB off-lattice modeling, which abstracts the protein conformation based on in the hydro affinity of its amino acids. Both real and artificial protein sequences of different sizes taken from the PDB were used. Ten amino acid sequences of lengths ranging from 13 to 143 residues were conformed by the algorithm. Furthermore, experiments were carried out with the purpose of evaluating the influence of the algorithm's hyper parameters on the results. The final conformations obtained proved to be good and coherent folds in terms of the analysis metrics used, such as the root mean square deviation between the atoms of the found conformation and those of the original protein.

Muitas proteínas reguladoras importantes têm vários sítios de modificação. Na quimiotaxia bacteriana, cada quimiorreceptor possui vários sítios de metilação e a metilação/ desmetilação desses sítios permitem que as células se adaptem a uma amplo fundo de concentração de ligante. No entanto, não está claro como e se a ordem de metilação/ desmetilação, em diferentes sítios de metilação, afeta a adaptação. Aqui, mostramos que a adaptação perfeita ocorre apenas com a metilação/desmetilação estritamente sequencial e a precisão da adaptação diminui à medida que o número de metilação não-sequencial (aleatória) aumenta. Um compromisso (trade-off) entre precisão de adaptação e ganho de sinal é encontrado. Para o esquema de metilação não-sequencial, esse compromisso é insensível ao número de sítios de metilação e, portanto, leva a um menor ganho de sinal ou a uma baixa precisão de adaptação. Para o esquema de metilação sequencial, no entanto, esse compromisso é favorecido significativamente com um aumento no número de sítios de metilação. Nosso estudo mostra que a modificação covalente sequencial representa um mecanismo geral para alcançar uma adaptação precisa sem comprometer o ganho de resposta. Também estudamos o efeito termodinâmico dos diferentes esquemas de modificação. Descobrimos que a modificação sequencial é impulsionada por uma dissipação de energia modestamente mais alta e resulta em um tempo de adaptação mais longo. Comparações dos resultados do nosso modelo com experimentos tanto in vitro quanto in vivo mostram consistentemente que o processo de metilação na E. coli é quase sequencial com um componente aleatório pequeno, mas finito. São feitas previsões para testes adicionais do modelo e elucidações de possíveis mecanismos moleculares para modificação covalente sequencial em quimiorreceptores. Many important regulatory proteins have multiple modification sites. In bacterial chemotaxis, each chemoreceptor has multiple methylation sites and methylation / demethylation of these sites enable the cells to adapt to a broad ligand concentration background. However, it is not clear whether and how the ordering of methylation / demethylation among different methylation sites affects adaptation. In this work, we show that perfect adaptation only occurs with strictly sequential methylation/ demethylation and adaptation accuracy decreases as the degree of nonsequential (random) methylation increases. A trade-off between adaptation accuracy and signal gain is found. For the nonsequential methylation scheme, this compromise is insensitive to the number of methylation sites and thus leads to either a diminished signal gain or a low adaptation accuracy. For the sequential methylation scheme, however, this compromise is significantly favored with an increase in the number of methylation sites. Our study shows that sequential covalent modification represents a general mechanism to achieve accurate adaptation without compromising the response gain. We also study the thermodynamic effect of different modification schemes. We find that sequential modification is driven by a modestly higher energy dissipation and results in a longer adaptation time. Comparisons of our model results with both in vitro and in vivo experiments consistently show that the methylation process in E. coli is almost sequential with a small but finite random component. Predictions are made for further model testing and elucidation of possible molecular mechanisms for sequential covalent modification in chemoreceptors.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2019. O PDGF-BB é a forma homodimérica do fator derivado de plaquetas, é uma proteína responsável pela cascata de coagulação sanguínea, com alto poder mitogênico e angiogênico. Esta proteína pode ser utilizada em terapias de crescimento capilar e reparo de tecidos, devido sua capacidade de atrair, recrutar e proliferar diferentes tipos celulares necessários para o processo de remodelação da matriz proteica. Dentre as possíveis aplicações está o tratamento de neuropatia diabética, uma complicação do diabetes, que consiste na formação de feridas ou úlceras nas regiões periféricas – pés - do paciente e que podem gerar amputações não traumáticas. O tratamento com os fármacos disponíveis no mercado contendo PDGF-BB possuem altos custos, que impossibilita sua disponibilidade aos pacientes e até mesmo sua redistribuição pelo SUS. Neste trabalho, o intuito foi avaliar e acompanhar o crescimento celular de HEK293T superprodutoras de rhPDGF-BB adaptando-as ao crescimento em suspensão aderido à superfícies em microcarreadores em dois aumentos de escala: sistema FibraStage e frasco tipo spinner de 100mL visando o escalonamento da produção da proteína. A avaliação do perfil metabólico dos meios condicionados foi realizado por colorimetria e HPLC. Obteve-se um perfil não linear durante as horas de cultivo em ambos aumentos de escala. Os resultados mostraram que o perfil metabólico das células no FibraStage variou conforme a concentração de glicose no meio e regulou a produção de lactato e glutamina durante a batelada. Para o ensaio em spinner após 5 dias de adaptação celular ao sistema e fase lag de 10 dias, as células atingiram a fase exponencial. Os testes realizados com os microcarreadores mostraram que a medida que as horas de cultivo aumentaram, a integridade física dos carreadores foi comprometida, porém não impediu a proliferação das células em sua superfície. Assim, os resultados mostraram-se promissores para a utilização em um novo aumento de escala e volume de trabalho compatível com biorreator tipo Wave. PDGF-BB is the homodimeric form of the factor derived from platelets, it is a protein responsible for the cascade of blood coagulation, with high mitogenic and angiogenic power. This protein can be used in capillary growth and tissue repair therapies because of its ability to attract, recruit and proliferate different cell types necessary for the process of remodeling the protein matrix. Among the possible applications is the treatment of diabetic neuropathy, a complication of diabetes, which consists of the formation of wounds or ulcers in the peripheral regions - feet - of the patient and that can generate non-traumatic amputations. Treatment with the commercially available drugs containing PDGF-BB has high costs, which makes it impossible for the patients to be available and even for their redistribution through SUS. In this work, the aim was to evaluate and monitor the cell growth of rhPDGF-BB overproducing HEK293Ts adapting them to the growth in suspension adhered to the surfaces in microcarriers in two increases of scale: FibraStage system and spinner bottle aiming at the scale-up of protein production. The evaluation of the metabolic profile of conditioned media was performed by colorimetry and HPLC. A non-linear profile was obtained during the culture hours at both scale increases. The results showed that the metabolic profile of the cells in the FibraStage varied according to the concentration of glucose in the medium and regulated the production of lactate and glutamine during the batch. For the spinner assay after 5 days of cell adaptation to the system and 10 day lag phase, the cells reached the exponential phase. Tests performed with the microcarriers showed that as the growing hours increased, the physical integrity of the carriers was compromised, but did not prevent proliferation of the cells on their surface. Thus, the results were promising for use in a new increase in scale and work volume compatible with Wave type bioreactor.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. Programa de apoio a Núcleos de excelência (PRONEX); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP). A doença de Chagas é causada pelo tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, geralmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através do contato com as fezes do inseto vetor infectado durante o repasto sanguíneo. A lesão vascular ocasionada pela picada do triatomíneo hematófago desencadeia no hospedeiro manifestações que poderiam interferir na alimentação, tais como resposta imune, inflamação e hemostasia. No entanto, os insetos hematófagos são capazes de neutralizar essas defesas através de um complexo repertório de moléculas salivares, fundamentais para a manutenção do fluxo sanguíneo e o sucesso do repasto. No intuito de conhecer a complexidade molecular da saliva dos triatomíneos Rhodnius neglectus e Triatoma dimidiata, esta tese descreve os transcritomas de suas glândulas salivares utilizando sequenciamento de próxima geração. Foram obtidos 5.704 transcritos a partir da biblioteca de cDNA das glândulas salivares de T. dimidiata e 5.705 da biblioteca de R. neglectus, dos quais 662 e 636, respectivamente, codificam proteínas secretadas. A análise revelou a expressão de famílias gênicas já descritas na saliva de outros hematófagos, como lipocalinas, grupo abundante, antígeno-5 e apirases. Além disso, inibidores de proteases do tipo Kazal e proteases também foram encontrados. Adicionalmente, o conteúdo salivar foi submetido à análise proteômica, sendo identificadas 111 e 73 proteínas nos proteomas de T. dimidiata e R. neglectus, respectivamente. Os resultados obtidos validaram alguns transcritos putativamente secretados. Este estudo evidenciou que a saliva dos triatomíneos investigados tem característica multifuncional diretamente relacionada a diferentes atividades anti-inflamatórias, anti-hemostáticas e imunomoduladoras. O estudo dos compostos salivares auxilia a compreensão acerca da biologia dos vetores e transmissão de doenças, da evolução dos hematófagos, além de estimular a busca por novos fármacos. Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi trypanosomatid, usually transmitted to vertebrate host through contact with faeces of infected vector insects during a blood meal. The vascular injury caused by the bite triggers symptoms capable to preventing an association with the host, such as immune response, inflammation and haemostasis. However, hematophagous arthropods are able to neutralize these defenses through a complex repertoire of salivary proteins acting as vasodilators, antiplatelets and anticoagulants. These molecules are essential for the blood flow maintenance and the success of the blood meal. In order to understand the salivary molecular complexity of Rhodnius neglectus and Triatoma dimidiata, this work describes their salivary glands (SG) transcriptome using next-generation sequencing. It was possible to obtain 5,704 transcripts from T. dimidiata and 5,705 from R. neglectus SGs, of which 662 and 636 encoded putatively secreted proteins respectively. The analysis revealed the expression of gene families already described in the saliva of other hematophagous insects, such as lipocalin, abundant protein family, antigen-5 and apyrases. Besides, Kazal type protease inhibitors and proteases were also found. In addition, the salivary content was submitted to proteomic analysis, being possible to identify 111 and 73 proteins in T. dimidiata and R. neglectus proteomes respectively. The results validated some putatively secreted transcripts. This work showed that saliva of the triatomines investigated here possess multi-functional feature directly related to different anti-inflammatory, anti-hemostatic and immunomodulatory activities. Salivary research helps the understanding of vector biology and disease transmission, hematophagous evolution, in addition to stimulating the search for new drugs.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O campo em evolução da medicina personalizada desempenha um papel cada vez mais relevante na prevenção, diagnóstico, prognóstico e terapêutica do câncer. Diversas vias de sinalização celular, que são fundamentais na regulação do metabolismo das células, encontram- se desreguladas no câncer e estão diretamente relacionadas ao desenvolvimento, crescimento, proliferação e metástase tumoral. Dentre elas, a via de sinalização PI3K-AKT-mTOR encontra- se frequentemente alterada em várias malignidades e foi constatado ser a via mais desregulada no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC). Além disso, evidências científicas sugerem que modificações epigenéticas estão frequentemente envolvidas na carcinogênese, progressão tumoral e resistência à terapia de cabeça e pescoço. O objetivo deste estudo foi analisar por meio da técnica de imuno-histoquímica, o perfil de expressão das proteínas da via PI3K-AKT-mTOR em pacientes com HNSCC, e relacionar os níveis de expressão proteica com características clínico-patológicas dos pacientes, bem como avaliar, in vitro, o perfil de expressão dessa via em linhagens celulares de HNSCC. Simultaneamente, realizou-se um estudo de revisão sistemática, a fim de verificar se a via do mTOR está superexpressa em amostras de pacientes com HNSCC, e se a superexpressão está associada a um pior prognóstico dos pacientes. Ademais, objetivou-se investigar pela primeira vez, os efeitos in vitro do Entinostat, um inibidor de histona desacetilase (HDAC), em linhagens celulares de câncer oral. A revisão sistemática constatou que proteínas da via do mTOR estão superexpressas no HNSCC, e que a alta expressão está relacionada à redução da sobrevida total (OS) e da sobrevida livre de doença (DFS) dos pacientes. A análise imuno-histoquímica observou que as proteínas da via PI3K-AKT-mTOR estão superexpressas em pacientes com HNSCC e, inversamente, a proteína PTEN, inibidora da via, foi encontrada em baixa expressão na maioria dos casos. O estudo in vitro também demonstrou alta expressão gênica e proteica da via. Na análise clínico-patológica, observou-se significativa associação entre a expressão de AKT e o gênero, como também entre a expressão de AKT e a expressão de PTEN. O estudo com Entinostat demonstrou que esta droga é citotóxica para as células de câncer oral, por diminuir a proliferação e a viabilidade celular. O Entinostat induziu a interrupção do ciclo celular, o aumento da geração de espécies oxigênio reativas (ROS), reduziu os níveis quantitativos de células- tronco do câncer, inibiu HDAC e aumentou os níveis de expressão de proteínas histonas acetiladas. Foi demonstrado ainda que esta droga levou ao aumento da proteína supressora p21, importante reguladora do ciclo celular. Concluiu-se que a via PI3K-AKT-mTOR apresenta-se superexpressa no HNSCC, consistindo em um importante alvo na terapia desse tipo de câncer. Concluiu-se, também, que o Entinostat é eficaz na redução de células tumorais orais, sugerindo constituir um agente terapêutico promissor no câncer oral. The evolving field of personalized medicine plays an increasingly important role in cancer prevention, diagnosis, prognosis and therapy. Several cell signaling pathways, which are fundamental in regulating cell metabolism, are deregulated in cancer and are directly related to tumor development, growth, proliferation and metastasis. Among them, the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway is frequently altered in several malignancies and was found to be the most unregulated pathway in the head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). In addition, scientific evidence suggests that epigenetic modifications are often involved in carcinogenesis, tumor progression, and resistance to head and neck therapy. The aim of this study was to analyze the protein expression profile of the PI3K-AKT-mTOR pathway by the immunohistochemistry technique in patients with HNSCC, and to relate the levels of protein expression with clinicopathological characteristics of the patients, as well as to evaluate, in vitro, the expression profile of this pathway in HNSCC cell lines. Simultaneously, a systematic review study was performed to verify if the mTOR pathway is overexpressed in samples from HNSCC patients, and whether overexpression is associated with a poorer prognosis of patients. In addition, the objective of this study was to investigate for the first time the in vitro effects of Entinostat, a histone deacetylase inhibitor (HDAC), on oral cancer cell lines. The systematic review found that mTOR pathway proteins are overexpressed in HNSCC, and that high expression is related to the reduction of patients' overall survival (OS) and disease-free survival (DFS). Immunohistochemical analysis observed that PI3K-AKT-mTOR pathway proteins are overexpressed in HNSCC patients and, conversely, the PTEN protein, pathway inhibitor, was found to be poorly expressed in most cases. The in vitro study also demonstrated high gene and protein expression of the pathway. In clinicopathological analysis, a significant association between AKT expression and gender was observed, as well as between AKT expression and PTEN expression. The study with Entinostat has shown that this drug is cytotoxic to oral cancer cells by reducing proliferation and cell viability. Entinostat induced cell cycle disruption, increased generation of reactive oxygen species (ROS), reduced quantitative levels of cancer stem cells, inhibited HDAC, and increased levels of acetylated histone protein expression. It has also been shown that this drug led to the increase of suppressor protein p21, an important regulator of the cell cycle. It was concluded that the PI3K- AKT-mTOR pathway is overexpressed in HNSCC, constituting an important target in the therapy of this type of cancer. It was also concluded that Entinostat is effective in reducing oral tumor cells, suggesting that it is a promising therapeutic agent in oral cancer.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). A doença de Chagas afeta cerca de 8 milhões de pessoas ao redor do mundo e cerca de um terço dessas desenvolve as formas graves da doença, sendo o maior caso de cardiomiopatia causada na América Latina e também está entre o maior causador de mortes dentro das doenças tropicais negligenciadas. Mesmo sendo conhecida há 111 anos, os mecanismos que desenvolvem a patologia continuam um enigma, principalmente se tratando de estudos em humanos. Apesar disso, hoje é indiscutível o papel da resposta imune do hospedeiro frente ao agente etiológico, o Trypanosoma cruzi, no controle da infecção ou na sua disseminação, além dos mecanismos desencadeados na fase inicial da doença serem determinantes para o estabelecimento de uma fase crônica. Uma das primeiras células imunes a interagir com este patógeno são as céluls dendríticas (DCs), as quais são responsáveis por intermediar uma resposta imune não específica para uma específica e que possui uma função determinante dentro da patologia.. Este trabalho então visa uma análise da resposta inicial que é desencadeada em DCs frente ao T. cruzi a partir da validação de genes que foram vistos como diferencialmente expressos no trancriptoma realizado da interação inicial ente DCs e T. cruzi após 12h. Alguns desse genes modulados diferencialmente sob ação do patógeno foram o ligante da superfamília de fator necrose tumoral, membro 18 (TNFSF18), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e peptidase específica de ubiquitina 18 (USP18), que possuíram sua expressão aumentada sob infecção. Essa superexpressão constatada por RNA-seq, foi confirmada neste estudo através de RT-qPCR após um processo de padronização e escolha de critérios rigorosos para garantir a qualidade da interpretação dos dados e poder comparar com veracidade os dados provenientes de duas metodologias distintas. Ficou comprovado então que a expressão gênica dessa interação patógeno-hospedeiro poderia ser atestada por RT-qPCR, viabilizando estudos posteriores de outros genes e também em uma população amostral maior, permitindo assim analisar a resposta inicial de forma mais abrangente. Isso tornará possível garimpar genes que tenham um papel fundamental na infecção e estuda-los com mais profundidade. Também é importante ressaltar que não necessariamente um aumento de expressão de transcrito reflete no nível proteico, como foi aferido neste trabalho ao mensurar algumas citocinas como IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 e IL-12, em que houve aumento de expressão de TNF sob infecção que condiz com seu nível de transcrito detectado, porém IL-10 que também foi supraregulado a nível transcricional, não possuía o mesmo comportamento a nível proteíco, tendo uma regulação importante e decisiva na expressão pelo hospedeiro. Chagas disease affects around 8 million people worldwide and about one-third of them develops severe forms of the disease, being the largest case of cardiomyopathy caused in Latin America and also among the largest cause of death within neglected tropical diseases. Even though it has been known for 111 years, the mechanisms that develop pathology remain an enigma, especially when it comes to studies in humans. Despite this, the role of the host immune response to the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, in the control of the infection or its dissemination is indisputable, besides the mechanisms triggered in the initial phase of the disease are determinant for the establishment of a chronic phase. One of the first immune cells to interact with this pathogen is the dendritic cells (DCs), which are responsible for being a mediator between a less specific immune response to a more specific and that has a determining function within the pathology. This work then aims an analysis of the initial response that is triggered in DCs against T. cruzi from a transcriptome performed from the initial interaction between DCs and T. cruzi after 12h. Some of these genes differentially modulated under the action of the pathogen were the tumor necrosis factor, member 18 (TNFSF18), CXC (CXCL9) motif chemokine ligand 9 and ubiquitin 18 specific peptidase (USP18), which had their expression considerably infection. This overexpression verified by RNA-seq was confirmed in this study through RT-qPCR after a process of standardization and selection of strict criteria to guarantee the quality of data interpretation and to be able to compare data from two different methodologies. It was then proved that the differential gene expression obtained in the transcriptome, a robust but more expensive and inaccessible technique, could be attested by RT-qPCR, allowing further studies of other genes and also in a larger sample population, thus allowing an analysis of the initial response in DCs by the T, I crossed more comprehensively in order to mine genes that have a fundamental role in the infection and study them in more depth. It is also important to note that not necessarily an increase in transcript expression reflects at the protein level, as measured in this work when measuring some cytokines such as IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 and IL-12, in which there was an increase in expression of TNF under infection that matches its detected level of transcript, but IL-10, which was also supraregulated at the transcriptional level, did not have the same behavior at the protein level, having an important and decisive regulation in expression by the host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação de Empreendimentos Científicos e Tecnológicos (FINATEC) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). A Nanociência e a Nanotecnologia possibilitam muitas inovações para a Medicina e para a Ciência Biomédica. Dentre as nanopartículas já existentes, a maghemita associada ao citrato de ródio II (Magh-Rh2(H2cit)4) tem se mostrado promissora, pois reduz os efeitos adversos do fármaco e mantém a citotoxicidade para células tumorais. Porém, estudos revelam que quando as nanopartículas entram em contato com fluidos biológicos (como por exemplo, o plasma sanguíneo) são recobertas imediatamente por proteínas formando a “proteína corona” que é única para cada nanomaterial. Neste estudo, a adsorção de proteínas mais abundantes de ligação à NPs monodispersas foi estudada in vitro após a incubação em soro sanguíneo humano, por uma análise de três etapas: (1) caracterização do fluido magnético (Magh-Rh2(H2cit)4) antes e depois da incubação com soro, (2) identificação de proteínas e análise da influência da “proteína corona” nas características físicas, bioquímicas e (3) no processo de internalização celular dessas NPs em macrófagos humano. O soro sanguíneo humano alterou as características da NP tornando-a monodispersa, maior e com o potencial zeta menos negativo, indicando a formação da proteína corona. Foram identificadas e caracterizadas 68 proteínas: albumina, IgGs, apoliproteínas (APOA1), serpinas, complemento (C5), quinases (AKAP 13), haptoglobina, glicoproteínas e transferrinas. São proteínas que em sua maioria promovem opsonização, fagocitose e endocitose em células do sistema imune. O tratamento de magh-Rh2(H2cit)4 sem soro é instável e demonstrou ser mais citotóxicos em células da linhagem U-937 diferenciadas em macrófagos. Já o tratamento de Magh-Rh2(H2cit)4 com soro não precipita mas, também promove citotoxicidade nas células, porém de forma mais controlada. Essa interação mais estratégica se deve às proteínas adsorvidas na superfície nas NPs. Apesar da Magh-Rh2(H2cit)4 ser promissora para tratamentos tumorais é necessário elucidar todos os parâmetros e mecanismos ao qual está submetida, principalmente no que diz respeito a imunotoxicidade haja vista que, entre os vários tipos de células, a interação de NPs com macrófagos é de interesse significativo por causa do papel crucial na iniciação e na modulação de processos inflamatórios em resposta a uma variedade de estímulos, tais como partículas estranhas, bactérias, o stress oxidativo e citocinas. Nanoscience and Nanotechnology enable many innovations for Medicine and for Biomedical Science. Among the existing nanoparticles, Magh-Rh2(H2cit)4 has been shown to be promising, since it reduces the side effects of the drug and maintains cytotoxicity for tumor cells. However, studies reveal that when NPs come into contact with biological fluids (such as blood plasma) they are immediately coated by proteins forming the "protein corona" that is unique to each nanomaterial. In this study, the adsorption of the most abundant binding proteins was studied in vitro after incubation in human blood serum of monodisperse NPs by a three-step analysis: (1) characterization of the magnetic fluid (Magh-Rh2(H2cit)4) before and after incubation with serum, (2) identification of proteins and analysis of the influence of the "protein crown" on physical, biochemical and (3) the cellular internalization process of these NPs in human macrophages. The human blood serum altered the characteristics of NP making it monodisperse, larger and with less negative zeta potential, indicating the formation of the protein crown. We identified and characterized 68 proteins: albumin, IgGs, apoliproteins (APOA1), serpins, complement (C5), kinases (AKAP 13), haptoglobin, glycoproteins and transferrin. They are proteins that mostly promote opsonization, phagocytosis and endocytosis in cells of the immune system. Treatment of serum-free magh-Rh2 (H2cit) 4 is unstable and has been shown to be more cytotoxic. However, the treatment of Magh-Rh2(H2cit)4 with serum does not precipitate but also promotes cytotoxicity in cells, but in a more controlled way. This more strategic interaction is due to the surface adsorbed proteins in the NPs. Although Magh-Rh2(H2cit)4 is promising for tumor treatments, it is necessary to elucidate all the parameters and mechanisms to which it is subjected, especially with regard to immunotoxicity since, among the various types of cells, the interaction of NPs with macrophages is of significant interest because of the crucial role in initiating and modulating inflammatory processes in response to a variety of stimuli, such as foreign particles, bacteria, oxidative stress, and cytokines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O carcinoma hepatocelular (CHC) é a mais importante complicação tardia de processos degenerativos crônicos do fígado derivados de uma hepatopatia primária. A baixa acurácia dos métodos laboratoriais e radiológicos atualmente preconizados contribuem para o diagnóstico em estágios avançados da doença e consequente limitação das opções de tratamento e expectativa de vida dos pacientes. Nesses casos, o transplante de fígado torna-se a única opção curativa para o CHC, portanto, a caracterização de um painel molecular específico pode contribuir para o prognóstico e monitoramento de estágios patológicos de forma a auxiliar em decisões clínico-terapêuticas. No presente estudo, a espectrometria de massas (MS) sob abordagem translacional-multiômica foi aplicada para avaliação dos perfis globais de proteínas (label-free LC-MS/MS) e lipídeos (MALDI-TOF) em plasma de 9 (nove) pacientes com CHC, submetidos ao transplante de fígado, e 9 (nove) pacientes não patológicos (doadores). Variações de Fold Change (≥ 5) e VIP score (PLS-DA, imp. features p 0.8) revelaram desequilíbrio na síntese glicerofosfolipídeos, com alteração na razão fosfatidilcolina/ fosfatidiletanolamina (PC/PE) na presença da hepatopatia. Os resultados, avaliados individualmente ou em conjunto, demostraram não só perfis proteômico e lipidômico distintos entre as condições patológicas versus controle, como revelaram possíveis candidatos a marcadores diagnósticos em um método não invasivo para o CHC e outras doenças do fígado. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most important late complication of chronic degenerative processes of the liver, derived from a primary liver disease. The low accuracy of the currently recommended laboratory and radiological methods contribute to diagnosis in advanced stages of the disease and consequent limitation of treatment options and life expectancy of patients. In these cases, liver transplantation becomes the only curative option for HCC, therefore featuring a specific molecular panel can contribute to the prognosis and monitoring of pathological stages in order to assist in clinical therapeutic decisions. In this study, mass spectrometry under a translational-multiomic-approach was applied to evaluated plasma global profile of proteins (label-free LC-MS/MS) and lipids (MALDI-TOF) of 9 (nine) patients with HCC, submitted to liver transplant, and 9 (nine) non-pathological patients (donors). Fold Change (≥ 5) and VIP score (PLS-DA imp. features, p 0.8) revealed an imbalance in glycerophospholipid synthesis, with alteration of phosphatidylcholine/ phosphatidylethanolamine (PC / PE) ratio in the presence of liver disease. Results, assessed individually or together, displayed not only distinct proteomic and lipidomic profiles within pathological conditions versus control, as revealed possible candidates for diagnostic markers in a noninvasive method for HCC and other liver diseases.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ), Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Comité Français d'Évaluation de la Coopération Universitaire et Scientifique avec le Brésil (COFECUB). INTRODUÇÃO: Malária ainda é considerada um grande desafio para a saúde pública; e foi responsável por aproximadamente 438.000 mortes em 2015. Plasmodium falciparum transmite a forma mais complicada da malária em humanos, a malária cerebral. O ciclo intraeritrocitário é o responsável pelo crescimento exponencial da infecção no hospedeiro vertebrado e, consequentemente, pelos sintomas clínicos da doença, o que torna essa etapa um interessante alvo para drogas de combate à doença. Calmodulina (CaM) é um sensor de cálcio ubíquo, importante para sinalização celular. A interação entre CaM e suas parceiras (CBPs) podem ser também essenciais para os processos em P. falciparum, o que torna essas interações interessantes alvos terapêuticos. OBJETIVOS: combinar estratégias bioinformáticas e experimentais para estudo da interação entre PfCaM e suas parceiras, para elucidar novos alvos para o combate à malária. MÉTODOS: Foi realizada um screening virtual baseado no princípio de cross-reference species, visando encontrar parceiros de PfCaM ao estudar suas interações em outras espécies. PfCaM foi expressa heterologamente e purificada por cromatografia do tipo IMAC, eluída com 100mM de imidazol. A cultura de P. falciparum foi enriquecida na fase esquizonte para se estudar as interações feitas por PfCaM, e essa amostra foi usada para ensaios de cromatografia de afinidade à calmodulina e BN-PAGE. RESULTADOS: O screening virtual teve como melhor resultado de CBP para posterior análise a proteína Hsp70-x, a sequência contém um peptídeo conservado na família Hsp70 descrito como ligante à CaM. A expressão heteróloga e purificação de PfCaM foi bem-sucedida, e a proteína está apta para posteriores ensaios de PPI. A interação entre PfCaM e Hsp70-x foi encontrada na cromatografia de afinidade; além disso, interações entre PfCaM e importantes moléculas efetoras que foram encontradas na cromatografia de afinidade foram discutidas. A cromatografia de afinidade à calmodulina mostrou-se uma estratégia interessante para se estudar os parceiros de PfCaM, além de colocar PfCaM como potencial regulador de importantes moléculas efetoras envolvidas na invasão de novas hemácias. A abordagem BN-PAGE foi estabelecida para estudar os complexos em P. falciparum. CONCLUSÕES: a combinação de estratégias bioinformáticas e experimentais mostrou-se uma boa estratégia para se elucidar interações entre proteínas em P. falciparum. Espera-se com esse trabalho ter destacado importantes interações com potencial para alvos terapêuticos visando o combate da malária. BACKGROUND: Malaria is still a big challenge for public health; it was responsible for about 438.000 deaths in 2015. Plasmodium falciparum transmits cerebral malaria, the most severe complication related to a Plasmodium spp. infection in humans. The asexual intraerythrocytic cycle is responsible for increasing infection and, consequently, for clinical symptoms of malaria, reason why it is a target for drug development. Calmodulin (CaM) is a ubiquitous calcium sensor, responsible for important cell signaling processes. Since its structure is conserved among eukaryotes, CaM-binding proteins (CBPs) can be also essential for these processes in Plasmodium spp and, for consequence, good drug targets. AIM: to combine bioinformatical and experimental approaches aiming at studying the interaction between PfCaM and its partners, to elucidate new drug targets to fight against malaria. METHODS: a virtual screening based on cross-reference species information was made, to predict CBPs in P. falciparum. PfCaM was heterologously expressed and purified by IMAC chromatography, eluted with 100mM of imidazole. A P. falciparum cellular culture was enriched in schizont phase, and the final sample was used to perform CaM-affinity chromatography and BN-PAGE approaches; RESULTS: The virtual screening has predicted P. falciparum’s HSP70x as a potential CBP; PfHsp70-x sequence contains calmodulin-binding peptides already described in literature. Heterologous PfCaM was successfully expressed and purified and can perform further PPI assays. It was found an indicative of interaction between PfCaM and PfHsp 70-x by CaM-affinity chromatography; besides, interactions between PfCaM and important molecular effectors involved in invasion of new cells were discussed. Chromatography approach has shown to be an interesting methodology to infer P. falciparum calmodulin-binding partners and pointed PfCaM as a potential regulator of important molecular effectors involved in erythrocyte invasion. BN-PAGE approach was established to study P. falciparum protein complexes. CONCLUSIONS: Combined experimental and in silico approaches seem to be a good strategy to evaluate protein-protein interactions. At the end of this work, we aim at having good potential drug targets for further studies in malaria disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2018. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm despontado como uma alternativa promissora aos antibióticos convencionais. Sua forma de ação, baseada em características inerentes à AMPs, permite que sejam ativos contra os mais diferentes patógenos com poucos relatos sobre resistência. Dentre as diversas formas de identificar novas moléculas com atividade antimicrobiana, a pesquisa de sequências encriptadas dentro de proteínas complexas mostra-se uma boa fonte de moléculas bioativas. Considerando as propriedades físico-químicas de AMPs de origem natural como ponto de partida para a síntese de novos peptídeos com atividade antimicrobiana, bem como a possibilidade de encontrar sequencias de AMPs encriptadas dentro de proteínas, esta dissertação busca explorar esses fatos como forma de identificar AMPs intragênicos. Coleções de proteínas de duas espécies, Bos taurus e Gallus gallus, foram pesquisadas como fonte de novos AMPs. A pesquisa é feita com base nas características físico-químicas de AMPs por meio do software Kamal. Após avaliação da possiblidade de agir como agente antimicrobiano, três peptídeos foram selecionados e sintetizados por meio da técnica de síntese de peptídeos em fase sólida. Os peptídeos Bt01, Bt02 e Gg01 foram testados quanto sua interação com membranas modelo usando as técnicas de Dicroísmo Circular e Calorimetria Diferencial de Varredura, além de ter seu potencial antimicrobiano frente a culturas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Todos os três peptídeos sintetizados apresentaram atividade antimicrobiana em concentrações na faixa de 4 – 8 μM. Posteriormente, um peptídeo foi selecionado para co-precipitação em sistemas poliméricos, sendo analisadas sua presença e dispersão no meio por meio de MALDI e espectroscopia de absorção UV-Vis. Por fim, a atividade antimicrobiana do filme sintetizado foi preliminarmente investigada frente a meios de cultura líquido de E. coli, mostrando inibição de crescimento microbiano para todas as concentrações testadas. Antimicrobial peptides have emerged as a good alternative to conventional antibiotics. Their form of action, based on characteristics inherent to AMPs, allows them to be active against the varied pathogens with few reports of resistance. Among the several ways to identify new molecules with antimicrobial activity, the search for encrypted sequences within complex proteins is a good source of bioactive molecules. Based on the assumption that physical-chemical characteristics of naturally occurring AMPs can be used as a starting point for the synthesis of new peptides with antimicrobial activity, as well as the possibility to find AMP sequences encrypted within proteins, this dissertation seeks to explore these facts as ways to identify intragenic AMPs. The genome of two species, Bos taurus and Gallus gallus, was investigated as sources for new AMPs. The research is based on the physical-chemical characteristics of AMPs using the software Kamal. After evaluating the possibility of acting as an antimicrobial agent, three peptides were selected and synthesized by solid phase peptide synthesis. Their interaction with models membranes was evaluated using Circular Dichroism and Differential Scanning Calorimetry and their antimicrobial potential was determined against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Peptides Bt01, Bt02 and Gg01 presented antimicrobial activity in concentrations in the range of 4 – 8 μM. Additionally, one of the synthesized peptides was selected for co-precipitation in polymeric systems, and its presence and distribution in the product was evaluated by MALDI MS and UV-Vis spectroscopy. The antimicrobial potential of the synthetic film was evaluated against E. coli, showing antimicrobial activity at all the investigated concentrations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas. 2015. Introdução e objetivos: O Diabetes Mellitus (DM) é um grupo de doenças metabólicas que frequentemente conduz a um comprometimento de saúde geral, incluindo alterações bucais. A Cromogranina A (CgA) é uma glicoproteína ácida e tem sido considerada um biomarcador da atividade simpática neural. Sua concentração pode estar associada tanto a alterações relacionadas ao DM quanto a algumas manifestações bucais da doença. O presente estudo teve como objetivos avaliar o efeito do DM2 nas funções salivares e nos indicadores clínicos de saúde bucal de acordo com o controle glicêmico dos pacientes e comparar a concentração e o perfil genético da CgA entre indivíduos não-diabéticos e pacientes com DM2. Método: Neste estudo transversal, 110 indivíduos de ambos os sexos foram divididos em três grupos: 36 pacientes com DM2 compensados, 36 com DM2 descompensados e 38 indivíduos nãodiabéticos (grupo controle). Foram avaliados a condição periodontal (profundidade de sondagem, índice de sangramento e perda de inserção clínica), índice de placa bacteriana, status de cárie dentária (índice CPOD), fluxos salivares e capacidade tampão. Amostras de saliva foram coletadas por meio do fluxo salivar total em repouso (STR), fluxo salivar total estimulado (STE) e fluxo salivar não estimulado da mucosa labial superior (SLS). As concentrações de CgA foram determinadas na saliva e no plasma com kits de ELISA, e dois polimorfismos de fragmentos de restrição da CgA (T-415C e Glu264Asp) foram analisados por reação em cadeia da polimerase. Os resultados foram analisados por meio do teste de Shapiro-Wilk, ANOVA a 1 critério com pós teste de Tukey, Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn, testes t de Student, U de Mann-Whitney, qui-quadrado e coeficiente de correlação de Pearson (p

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. A bactéria Gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt) é amplamente conhecida devido à sua grande importância no controle biológico, graças à sua capacidade de produzir inclusões cristalinas formadas por proteínas inseticidas (Cry e Cyt), ativas contra um amplo espectro de insetos. Uma nova atividade foi relatada para cristais sem atividade inseticida, a citotoxicidade contra células cancerosas humanas. Essas proteínas citotóxicas, chamadas de Parasporinas (PS), não são hemolíticas e são estruturalmente diferentes das proteínas Cry e Cyt. Até o momento, seis grupos de PS foram identificadas, com base na homologia das suas sequências de aminoácidos. As Parasporinas apresentam modo de ação diferente entre as famílias, assim como diferente espectro citotóxico e nível de atividade. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia possui uma Coleção de Bacillus spp. que conta com aproximadamente 2500 isolados. Esse trabalho teve como objetivo identificar, entre as estirpes dessa coleção, genes da família de Parasporinas através de diferentes marcadores moleculares, analisar o perfil proteico dessas estirpes, a possível produção de β-exotoxinas, avaliar sua toxicidade para linhagens de células tumorais, analisar a influência dessas proteínas no padrão de migração celular de linhagens de câncer e as possíveis alterações morfológicas causadas pelas toxinas Parasporinas nas células tumorais suscetíveis. Duzentos e sessenta e nove estirpes foram selecionadas aleatoriamente do banco de bactérias e triadas com os iniciadores específicos desenhados para identificação dos diferentes genes de Parasporina. Trinta e cinco estirpes apresentaram padrões de amplificação para esses genes, dentre estes, 30 isolados obtiveram amplificações para o gene parasporina 1, enquanto 5 isolados para o gene parasporina 3. O perfil proteico sugere que as proteínas secretadas por algumas estirpes possuem o tamanho esperado para o grupo de Parasporina (aproximadamente 81 e 88 kDa para as famílias 1 e 3, respectivamente). Nenhuma das estirpes positivas por PCR apresentou produção de β-exotoxinas. As proteínas das estirpes testadas não mostraram toxicidade contra as linhagens tumorais DU-145 e HeLa. A proteína PS1 da estirpe S1338 mostrou toxicidade específica a células tumorais de mama MCF-7, alterando sua morfologia após 24 horas do tratamento com a toxina ativa, sugerindo que o tipo de morte celular envolvendo a Parasporina 1 seja por apoptose. Nenhuma alteração significativa no padrão de migração das células MCF-7 pode ser observada após o tratamento com a toxina. Desta forma, nossos dados sugerem que a Parasporina 1 produzida pela estirpe S1338 possui características únicas e especificidade contra a linhagem MCF-7 de adenocarcinoma de mama. Estudos mais aprofundados sobre o mecanismo de ação desta toxina, bem como sobre o possível receptor nas células suscetíveis, poderão tornar viável a utilização das Parasporinas como terapia alternativa para o tratamento de câncer, ou até mesmo como ferramenta molecular para o diagnóstico dessa doença. The Gram-positive bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) is widely known for its importance on biological control, due to their hability to produce crystalline inclusions formed by insecticide proteins (Cry e Cyt), active against a broad range of insects. A new activity was reported for crystals without insecticide activity, the cytotoxic against human cancer cells. These cytotoxic proteins are known as Parasporins (PS), are not hemolytic and have different structure from the Cry and Cyt proteins. So far, six classes of PS were identified, based on the homology of their aminoacids sequences. The Parasporins have different mode of action among theirs families, as well as different cytotoxic range and level of activity. The Embrapa Genetic Resources and Biotechnology has a collection of Bacillus spp. with approximately 2500 isolates. This work aims to identify, among the strains of this collection, genes of Parasporin families through different molecular markers, analyse the protein profile of strains, the possible production of β-exotoxins, evaluate its toxicity to tumor cells line and the possible morphological changes caused by the toxins Parasporins in susceptible tumor cells. Two hundred and sixty-nine strains were selected randomly on the bacteria bank, and were screened with specific primers to identify the different Parasporin genes. Thirty-five strains showed amplification patterns, of which, 30 isolates showed amplification to the parasporin 1 gene, and other 5 isolates to parasporin 3 gene. The protein profile suggested that the secreted proteins by some strains has the expected size to the group of Parasporin (approximately 81 and 88 kDa for the family 1 and 3, respectively). None of the positive strains identified by PCR showed β-exotoxins production. The protein of the tested strains didn’t show toxicity against tumor lines DU-145 and HeLa. The protein PS1 from the strain S1338 showed specific toxicity against breast cancer cells MCF-7, changing their morphology after 24 hours of treatment with active toxin, suggesting that the type of cell death involving Parasporina 1 is through apoptosis. No significant alteration in the patterns of MCF-7 cell migration could be observed after treatment with the toxin. Therefore, our data suggest that Parasporin 1 from S1338 strain has unique characteristics and specificity against MCF-7 cell line of breast adenocarcinoma. Further studies on the mode of action involving this toxin, and the possible receptor of susceptible cells, can make the use of Parasporin feasible as an alternative therapy in cancer treatment, or even as a molecular tool for the diagnosis of the disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. No Brasil o câncer de pâncreas representa 2% de todos os tipos de câncer, sendo responsável por 4% do total de mortes por essa doença. Seu tratamento raramente se restringe a remoção cirúrgica do tumor devido a elevada agressividade desta doença. Para a maioria dos casos a alternativa terapêutica é a cirurgia e/ou a quimioterapia associada ou não a radioterapia. O câncer de pâncreas é uma doença silenciosa com diagnóstico geralmente tardio, o que dificulta significativamente o tratamento devido a presença de metástases. Este fator também contribui decisivamente para um pobre prognóstico e uma sobrevida após o diagnóstico bastante reduzida, variando de seis a dezoito meses para um grande número de casos. As drogas de primeira escolha para serem utilizadas na quimioterapia desse tipo de câncer, Gencitabina e o 5-fluoracila (5-FU), atuam interferindo com a capacidade celular de sintetizar seu DNA, e assim inibindo a mitose e induzindo a morte celular por apoptose. Em razão dos mecanismos de ação destes fármacos causarem elevada toxicidade para todas as células, o tratamento do câncer de pâncreas está associado a diversos efeitos adversos severos como por exemplo a pancitopenia. Apesar dos avanços terapêuticos para o tratamento do câncer, o câncer de pâncreas persiste como o grande desafio, necessitando urgentemente de alternativas terapêuticas centrais e adjuvantes, que sejam eficientes na eliminação das células tumorais e tumorais com menos toxicidade para às células normais. Com base no acima exposto, nosso grupo passou a avaliar a proteína RAS mutada (KRAS), presente em mais de 40% dos casos de cânceres de pâncreas. Em seguida, nosso grupo sintetizou nove derivados de quinolonas com potencial predito computacionalmente de interferência indireta com a atividade das proteínas RAS. Desta forma, o objeto deste trabalho foi realizar a prova de conceito sobre as propriedades dos derivados das quinolonas atuarem reduzindo ou anulando a atividade anormal de KRAS, na expectativa que este potencial de inibição pudesse contribuir com a redução da taxa de proliferação celular, redução da migração celular e indução da apoptose nestas células tumorais. Embora os agentes aqui avaliados não tenham apresentado resultados promissores para o seu emprego direto, nossos resultados abrem um amplo horizonte para a síntese de outras séries de derivados das quinolonas que com elevado potencial de uso como drogas efetivas no tratamento do câncer de pâncreas. In the Brazil, pancreatic cancer represents 2% of all cancer types. Accounting for 4% of all deaths from this disease. Its treatment is rarely restricted to the surgical removal of the tumor due to the high aggressiveness of this disease. For most cases the alternative therapy is surgery and/or chemotherapy associated or not with radiotherapy. Pancreatic cancer is a silent disease with a generally late diagnosis, which makes treatment difficult because of metastases presence. This factor also contributes decisively to a poor prognosis and a very short life after diagnosis, ranging from six to eighteen months for many the cases. The first choice drugs that are used in chemotherapy of this type of cancer, Gemcitabine and the 5-fluororacil (5-FU), act interfering with the cellular capacity to synthesize its DNA, thus inhibiting the mitosis and inducing the cell death by apoptosis. Because the mechanisms of action of these drugs cause high toxicity to all cells, the treatment of pancreatic cancer is associated with several severe adverse effects such as pancytopenia. Despite therapeutic advances in the treatment of cancer, pancreatic cancer persists as the major challenge, urgently requiring central therapeutic alternatives and adjuvants, which are efficient in eliminating tumor and tumor cells with less toxicity to normal cells. Based on the above, our group went on to evaluate the RAS protein (KRAS), changed in more than 40% of cases of pancreatic cancers. Next, our group synthesized nine quinolone derivatives with computational potential of indirectly interfering with the activity of RAS proteins. Thus, the objective of this work was to carry out the proof of concept on the properties of the quinolones derivatives to reduce or cancel the abnormal activity of KRAS, in the expectation that this potential inhibition could contribute to the reduction of the rate of cell proliferation, reduction of migration Cell and induction of apoptosis in these tumor cells. Although the agents evaluated here have not presented promising results for their direct use, our results open a wide horizon for the synthesis of other series of quinolone derivatives that with high potential of use as effective drugs in the treatment of pancreatic cancer.

O cachorro-do-mato (Cerdocyon thous - Linnaeus, 1766) é um canídeo de médio porte com distribuição ampla na América do Sul e que ocorre em quase todo o Brasil. Dentre as principais ameaças à sua conservação estão os atropelamentos causados principalmente pela perda de habitat. A escassez de dados laboratoriais de cachorro-do-mato prejudica o atendimento médico veterinário dificultando a aplicação de terapias adequadas. Este trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de Proteína C Reativa, Albumina, Pré-albumina, Ceruloplasmina, Haptoglobina e Alfa 1 Glicoproteína Ácida bem como o Indice Prognóstico Inflamatório Nutricional (IPIN) nesta espécie, obtendo portanto uma primeira descrição destes marcadores prognósticos. Foram coletados 1,5 ml de sangue por acesso jugular de oito exemplares de Cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) provenientes do acervo do Laboratório de Ensino e Pesquisa em Animais Selvagens (LAPAS) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia para exames de rotina. As amostras foram coletadas através da veia jugular após contenção física dos animais e tricotomia da região. Após análise estatística, os valores encontrados foram: albumina: entre 2,7 e 3,0 g/dl, alfa 1 glicoproteína ácida: entre 0,19 e 0,21 g/l, proteína C reativa: entre 1,7 e 2,2, pré-albumina: entre 30 e 35 mg/l e haptoglobina: entre 0,078 e 0,156 e IPIN ≤ 0,006 sendo considerado normal e valores ≥ 0,006 considerados altos. Esta prima descrição servirá como base para estudos utilizando animais com doenças específicas e, após as análises, comparadas com os valores encontrados neste trabalho verificando se o comportamento segue a semelhança de cães domésticos. The dog-eating fox (Cerdocyon thous - Linnaeus, 1766) is a medium sized canid widely distributed in South America and occurs in almost all of Brazil. Among the main threats to their conservation are the roadkill mainly caused by habitat loss. The shortage of laboratory bush dogs data affect the veterinary medical care hindering the application of appropriate therapies. This study aimed to evaluate the levels of C-reactive protein, albumin, pre-albumin, ceruloplasmin, haptoglobin and Afla 1 acid glycoprotein and the Prognostic Index Inflammatory Nutritional (IPIN) in this species, thus obtaining a first description of these prognostic markers. They collected 1.5 ml of blood by jugular access 8 of Mato Dogs copies (thous thous) from the Laboratory of collection of Teaching and Research in Wildlife (limpets), Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Uberlândia for exams routine. The samples were collected via the jugular vein after physical restraint of animals and trichotomy of the region. After statistical analysis, the values were: albumin: between 2.7 and 3.0 g / dl, alpha 1-acid glycoprotein: between 0.19 and 0.21 g / l, C-reactive protein: between 1.7 and 2 2, prealbumin between 30 and 35 mg / l haptoglobin: between 0.078 and 0.156 and IPIN ≤ 0.006 being considered normal and values ≥ 0.006 considered high. This press description will serve as a basis for studies where animals may be used with specific diseases and, after analysis, compared with the values found in this study and verified the behavior follows the likeness of domestic dogs. Tese (Doutorado)

Orientador : Prof. Dr. Marcos R. Mafra Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. Defesa : Curitiba, 24/01/2016 Inclui referências : f. 75-81 Resumo: O presente estudo teve como finalidade empregar a calorimetria de titulação isotérmica na avaliação das interações intermoleculares entre proteínas. Para isso foi obtido o segundo coeficiente virial calorimétrico, o qual se relaciona com o segundo coeficiente virial representando o desvio do comportamento ideal das soluções reais. Sabe-se que o segundo coeficiente virial é um instrumento relevante para a compreensão de processos industriais de separação de biomoléculas, como a cristalização e a precipitação. A metodologia utilizada no calorímetro de titulação isotérmica resultou na obtenção do calor de diluição das proteínas albumina de soro bovina e lisozima sob influência de diferentes condições experimentais. A partir deste dado foi obtido o segundo coeficiente virial calorimétrico. Avaliou-se o efeito do pH (pH 4,6, 5,4 e 7,4 para a albumina de soro bovina e pH 4,6 e 7,0 para a lisozima) e da concentração de cloreto de sódio como agente de cristalização (de 0,0 mol L-1 a 0,5 mol L-1 para ambas as proteínas) sobre os valores de segundo coeficiente virial calorimétrico. Observou-se na finalização das análises comparativas a existência de forte influência do pH e da força iônica sobre as interações moleculares. Para a albumina de soro bovina, o efeito do aumento da concentração salina gerou maiores valores do segundo coeficiente virial calorimétrico, conforme esperado pelo fenômeno de salting in, que representa o aumento da solubilidade, de acordo com a adição de sais no meio. Para a lisozima, o efeito do aumento da concentração salina causou redução nos valores de segundo coeficiente virial calorimétrico, indicando o fenômeno de salting out, no qual há redução da solubilidade com o aumento da concentração salina. O efeito do pH para ambas as proteínas foi regido pelo distanciamento do ponto isoelétrico das proteínas, de forma que, em pHs mais próximos ao ponto isoelétrico, o segundo coeficiente virial apresentou menores valores, indicando menor solubilidade. Esta relação indica que o parâmetro obtido neste estudo representa as interações intermoleculares da proteína. Desta forma, foi possível validar a calorimetria de titulação isotérmica como ferramenta para avaliação da solubilidade de proteínas. Palavras-chave: ITC; coeficiente virial; interações intermoleculares; cristalização; BSA; lisozima. Abstract: The current study aimed to apply the isothermal titration calorimetry in the evaluation of intermolecular interactions between proteins. Thus, it was obtained the calorimetric second virial coefficient, which is related to the second virial coefficient, representing the deviation from the ideal behavior of real solutions. It is known that the second virial coefficient is an important tool for the understanding of industrial processes of separation of biomolecules, such as crystallization and precipitation. The methodology applied to the isothermal titration calorimeter resulted in the obtaining of the dilution heat of the proteins bovine serum albumin and lysozyme under the influence of different experimental conditions. From this it was obtained the calorimetric second virial coefficient. The effect of pH (4.6, 5.4 and 7.4 for bovine serum albumin, 4.6 and 7.0 for lysozyme) was evaluated, as well as the concentration of sodium chloride as crystallization agent (0.0 mol L-1 to 0.5 mol L-1 for both proteins) on the values of the calorimetric second virial coefficient. In the final comparative analysis, it was observed the strong influence of pH and ionic strength of the molecular interaction. For bovine serum albumin, the effect of increasing the salt concentration led higher values of calorimetric second virial coefficient, as expected by salting in phenomenon, wherein the solubility is increased according to the addition of salts in the solution. For lysozyme, the effect of increasing the salt concentration caused a reduction in the values of calorimetric second virial coefficient indicating the salting out phenomenon, wherein the solubility is decreased with increasing salt concentration. Regarding the effect of pH for both proteins, it is ruled by the distance from the protein's isoelectric point, so as closer to the isoelectric point, the second virial coefficient adopted the lowest values, indicating decreasing in solubility. This relation indicated that the paramether obtained in this study represents the proteins's intermolecular interactions. Thus, it was possible to validate the isothermal titration calorimetry as a tool for protein solubility evaluation. Keywords: ITC; virial coefficient; intermolecular interaction; crystallization; BSA; lysozyme.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A dengue é a doença mais importante causada por um arbovírus no mundo. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos antigenicamente distintos. São vírus de RNA fita simples, polaridade positiva, com o genoma de aproximadamente 11 Kb que é traduzido em uma poliproteína subdividida em três proteínas estruturais e sete proteínas não- estruturais (que estão relacionadas com a replicação viral, expressão das proteínas virais e virulência dos sorotipos). Nos últimos vinte anos têm sido observado um incremento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica e transmissão contínua dos diferentes sorotipos em áreas onde a doença não era prevalente. Um dos eventos mais alarmantes tem sido o aumento do número de casos da Febre da Dengue Hemorrágica (FDH) nas Américas. Um ponto ainda limitante dos testes diagnósticos que capturam o anticorpo presente no soro de pacientes infectados consiste na dificuldade de obtenção de baixo custo e produção em grande escala dos antígenos. Diante destas considerações objetivou-se expressar a proteína não-estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. O gene da proteína NS1 foi otimizado para a expressão em plantas e clonado no plasmídeo pCAMBIA3301. O vetor de expressão pCAMBIA3301/NS1 foi utilizado para transformação de Arabidopsis thaliana. A terceira geração de plantas transformadas foi selecionada em homozigose dominante. A transformação de Arabidopsis thaliana foi evidenciada pela imunolocalização da proteína NS1 marcada dentro do lúmen do retículo endoplasmático em tecidos foliares. Este sistema será utilizado para obtenção do antígeno NS1 com finalidade de aplicação em testes de diagnóstico da dengue. Dengue fever is the most important disease caused by an arbovirus in the world. The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and has four antigenically distinct serotypes. They are single stranded RNA viruses, positive polarity, with a genome of approximately 11 Kb which is translated into a polyprotein subdivided in three structural proteins and seven non-structural proteins (that are related to viral replication, expression of viral proteins and virulence of serotypes). In the last twenty years, it was observed a significant increase in the epidemic activity, expansion of the geographical distribution and streaming of different serotypes in areas where the disease was not prevalent. One of the most alarming events was the increase in the number of cases of dengue hemorrhagic fever (DHF) in the Americas. A further limiting point of the diagnostic tests that capture antibody present in the serum of infected patients is the difficulty of obtaining low-cost and large-scale production of the antigens. Due to this factor, we aimed to build a system in transgenic Arabidopsis thaliana expressing the nonstructural protein (NS1) of the dengue-2 virus. The gene of the NS1 protein was optimized for expression in plants and cloned into the plasmid pCAMBIA3301. The expression vector pCAMBIA3301/NS1 was used for transformation of Arabidopsis thaliana. The third generation of transformed plants were selected by dominant homozygous. The construction of a transgenic Arabidopsis thaliana system was demonstrated by immunolocalization of the NS1 protein into the lumen of the endoplasmic reticulum in the leaf tissues. This system will be used to obtain the NS1 antigen with application purpose of dengue diagnostic tests.

Made available in DSpace on 2016-01-13T13:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-22. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-13T13:33:18Z : No. of bitstreams: 1 000855558.pdf: 2496353 bytes, checksum: afab1cef7d337a1187a0d63fa17d398d (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Introdução: O cerebelo é suscetível aos efeitos lesivos do etanol em exposições agudas ou crônicas, em diferentes idades, podendo ocasionar alterações motoras, de aprendizado, cognitivas e favorecer a morte celular apoptótica. Nosso objetivo foi avaliar a apoptose nos neurônios de Golgi, Purkinje e células granulares do cerebelo de ratos adultos da variedade UChA. Metodologia: Os ratos foram divididos em dois grupos experimentais (20 ratos por grupo): um grupo controle, composto de animais UChA abstinentes e o grupo experimental, formado por ratos UChA, consumidores voluntários de etanol a 10% (˂ 2g etanol/Kg peso corpóreo/dia). Dos 65 dias aos 120 dias de idade, os animais receberam solução de etanol a 10%. Aos 120 dias, os animais foram anestesiados e preparados para eutanásia. O cerebelo foi então analisado por microscopia eletrônica de transmissão (MET), imunoistoquímica para apoptose, caspase-3 (próapoptótica), XIAP (antiapoptótica) e IGF-1R nos neurônios de Golgi, Purkinje e granulares. Avaliou-se também por RT-PCR os genes reguladores da caspase-3, XIAP e IGF-1R no córtex cerebelar dos grupos estudados. Resultados: Os animais UChA mostraram acúmulo de gotas lipídicas, presença de núcleos eletrodensos nos neurônios granulares e de Purkinje, desorganização do corpo medular do cerebelo com alterações na bainha de mielina no córtex cerebelar. Identificou-se também aumento significativo na imunomarcação de caspase-3 e XIAP nos neurônios de Purkinje e granulares. A fragmentação do DNA foi significativa nas células de Purkinje. O IGF-1R não apresentou alterações. Não houve diferenças significativas na expressão dos genes de caspase-3, XIAP, e o IGF-1R. Conclusão: O etanol induz apoptose nas células de Purkinje e granulares do cerebelo de ratos adultos UChA Introduction: The cerebellum is susceptible to the harmful effects of ethanol in acute or chronic exposures at different ages, which may cause motor, learning and cognitive disorders and promote apoptotic cell death (PCD) as well. Our objective was to evaluate apoptosis in Golgi and Purkinje neurons and in granular cell disease of the cerebellum of adult rats of the type UChA. Methodology: The rats were divided in two experimental groups (20 rats per group): a control group, consisting of abstinent UChA animals and the experimental group, formed by UChA rats, volunteers consumers of 10% ethanol (˂ 2g ethanol / kg weight body / day). From 65 day-age to the 120 day-age, the animals received 10% ethanol solution. After 120 days, the rats were anesthetized and prepared for euthanasia. The cerebellum was then analyzed by transmission electron microscopy (TEM), immunohistochemistry to apoptosis, caspase-3 (pro-apoptotic), XIAP (anti-apoptotic) and IGF-1R in Golgi, Purkinje neurons and granular as well. It was also evaluated by RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) the regulatory genes caspase-3, XIAP and IGF-1R in the cerebellar cortex of groups. Results: The UChA animals showed accumulation of lipid droplets, presence of electron-nuclei in granule neurons and Purkinje, disorganization of the medullary body of the cerebellum with some changes in the myelin sheath of the cortex. It was also identified significant increase in the Immunostaining caspase-3 and XIAP in Purkinje neurons and granular. The DNA fragmentation was significant in Purkinje cells. The IGF-1R didn't have any change though. There were no significant differences in the formulation of caspase-3 genes, XIAP and IGF-1R. Conclusion: Ethanol induces apoptosis in granular and Purkinje cells of the cerebellum of adult UChA rats FAPESP: 2011/50466-0

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:13Z : No. of bitstreams: 1 000837181_20170224.pdf: 91864 bytes, checksum: 0cabb65b5f7a595dc23ad9b64072ddc1 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-24T13:00:35Z: 000837181_20170224.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-24T13:01:25Z : No. of bitstreams: 1 000837181.pdf: 650266 bytes, checksum: 180e6b31b7b339d7e10fa10e9bfd8b92 (MD5) The tibial dyschondroplasia is attributed to an asynchrony in the endochondral ossification process, leading to an accumulation of non-calcified and non-vascularized cartilage in the place where the trabecular bone should be formed. A synchronized action of ectoenzyme nucleotide phosphodiesterase pyrophosphatase (PC-1), alkaline phosphatase and acid phosphatase is required in the biological calcification process, because they act in the regulation of pyrophosphate concentrations, which in high concentrations is an inhibitor of calcification and may lead to the development of tibial dyschondroplasia. The birds were divided into normal and dyschondroplasic, sacrificed, then the tibiae were removed, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. Afterwards, the growth plates were homogenized, submitted to different treatments to make each enzyme extract and then were aliquoted, frozen and stored at -70 °C for posterior enzyme assays and protein dosage. There was no difference between the specific activity of PC-1 extracted from normal birds compared to that obtained from dyschondroplasic birds, on the other hand the specific activity of alkaline phosphatase was lower in birds with tibial dyschondroplasia, when compared with healthy birds, suggesting that dyschondroplasia may be attributed to an increase in the concentration of pyrophosphate, which may cause prejudice to mineralization by binding directly to the hydroxyapatite crystals and preventing their growth and also because there is no production of inorganic phosphate. The acid phosphatase activity decreased in dyschondroplasic birds when compared to the normal ones, suggesting that the growth plate has its remodeling functions affected. Our results suggest that the tibial dyschondroplasia can be attributed to the decrease in alkaline phosphatase activity, which leads to an increase in inorganic pyrophosphate concentration, inhibiting...

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Pós-graduação em Ciências Médicas, 2015. Introdução: O câncer de boca está entre os dez tipos de câncer mais comuns em todo o mundo. Lesões precursoras como leucoplasia e líquen plano em geral precedem o surgimento do tumor invasivo. Nesse contexto, a busca por marcadores biológicos para o diagnóstico e prognóstico dessas lesões é extremamente relevante. Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas P16, BUB3, SOX4 e Ki67 no líquen plano oral (LPO) e comparar os resultados com a expressão dos mesmos anticorpos no líquen plano cutâneo (LPC), na displasia oral (DO) e na hiperplasia fibrosa oral (HFO). Materiais e Métodos: Conduziu-se um estudo retrospectivo, que incluiu 120 blocos de tecido parafinados, distribuídos igualmente em LPO, DO, HFO e LPC. A partir desses blocos foi realizada reação imunoistoquímica com os anticorpos citados em cada um dos grupos. A expressão dos anticorpos foi avaliada por um índice de positividade (IP) determinado após a contagem de 500 células de cada amostra. Resultados: Verificou-se que o IP (mediana) de P16 em LPC foi o mais elevado (86,59), seguido pelo LPO (20,65), HFO (11,8) e DO (7,85) (p

Orientadora : Profª Drª Luciana Igarashi Mafra Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. Defesa: Curitiba, 03/02/2015 Inclui referências Resumo: A quinoa é um pseudocereal originário dos Andes, cultivado e consumido há milhares de anos que vem se popularizando em todo o mundo devido ao seu alto valor nutricional. As proteínas da quinoa apresentam grande quantidade de aminoácidos essenciais fundamentais para a vida humana e são compostas principalmente por globulina 11S e albumina 2S. O objetivo deste trabalho foi obter e caracterizar um isolado proteico de quinoa (IPQ) da variedade BRS Piabiru, e avaliar a sua estabilidade térmica e capacidade geleificante. A composição físico-química do IPQ foi determinada e as proteínas identificadas por meio de eletroforese associada à espectrometria de massas MALDI-ToF. A estabilidade térmica do IPQ foi analisada mediante calorimetria exploratória diferencial (DSC) para concentrações de IPQ de 10% e 15%, nos pHs 3,5 e 7,0 com adição dos sais CaCl2 e MgCl2. A capacidade geleificante foi estudada nas mesmas condições da análise de DSC mediante reologia oscilatória com a obtenção dos valores de G' e G'' durante rampa de aquecimento e resfriamento e a temperatura de geleificação foi encontrada pelo ajuste dos dados a equação sigmoidal de Boltzmann. O IPQ obtido neste trabalho apresentou composição elevada de proteínas (88,53%). As proteínas de quinoa mostraram estabilidade térmica elevada, com temperatura de desnaturação próxima a 80°C, sendo que a adição dos íons divalentes proporcionaram temperaturas de desnaturação mais elevadas. Foi observado que as proteínas de quinoa exibem capacidade geleificante tanto no pH 3,5 quanto no pH 7,0, porém no pH 7,0 estes géis não são estáveis ao resfriamento. Os géis formados em pH 3,5 foram mais fortes do que os obtidos em pH 7,0 ao final dos experimentos de reologia (aquecimento e resfriamento). Os íons Ca2+ e Mg2+ auxiliaram a formação de géis proteicos no pH 3,5 formando soluções de alta viscoelasticidade no início dos experimentos as quais foram menos influenciadas por variações de temperatura. Quando o íon Ca2+ foi adicionado às amostras em pH 3,5 foram formados géis a frio. No pH 7,0 os íons adicionados não auxiliaram na formação de géis proteicos de quinoa. A desnaturação foi essencial no aumento da viscoelasticidade do IPQ durante análise reológica das soluções proteicas em pH 7,0. No pH 3,5 as soluções proteicas apresentaram um aumento da força do gel antes da temperatura de desnaturação, mostrando que não é necessária uma desnaturação completa para a formação de géis neste pH. Palavras chave: desnaturação, análises térmicas, reologia oscilatória, íons divalentes, solubilidade, gel. Abstract: Quinoa is a pseudocereal native from the Andean regions, grown and consumed for thousands of years and has become more popular around the world because of its high nutritional value. The quinoa proteins show a high amount of essential amino acids fundamental for human life and are composed mainly of 11S globulin and 2S albumin. The aim of this work was to obtain and characterize a quinoa protein isolated (QPI) of the variety BRS Piabiru, and evaluate its thermal stability and gelation capacity. The physical and chemical composition of the QPI was determined and the proteins identified by electrophoresis associated with MALDI-ToF mass spectrometry. The thermal stability of IPQ was analyzed by differential scanning calorimetry (DSC) with IPQ concentrations of 10% and 15% at pH 3.5 and 7.0 with addition of CaCl2 and MgCl2. The gelation ability was studied under the same conditions of DSC by dynamic oscillatory measurements to obtain the G' and G'' for heating and cooling ramp and gelling temperatures were obtained by fitting the data to sigmoidal Boltzmann equation. The IPQ obtained in this study showed high composition of proteins (88.53%). The quinoa proteins demonstrate high thermal stability, with a denaturation temperature of around 80°C. The addition of divalent ions promoted higher denaturation temperatures. It was observed that the quinoa proteins exhibit gelation capacity both in pH 3.5 and pH 7.0, but in pH 7.0 gels are not stable to cooling. The gels formed at pH 3.5 were stronger than those obtained at pH 7.0 after rheology experiments (heating and cooling). The Ca2+ and Mg2+ helped protein gelation in pH 3.5 forming high viscoelasticity solutions at the beginning of the experiments which were less influenced by temperature variations. When the Ca2+ was added to the samples at pH 3.5 were formed cold-set gels. At pH 7.0 the ions added did not help in the formation of quinoa protein gels. Denaturation was essential in the increase of IPQ viscoelasticity for protein solutions at pH 7.0. In pH 3.5 the protein solution showed an increase in gel strength before the denaturation temperature, showing that it is not necessary a complete denaturing for the gel formation at this pH. Keywords: denaturation, thermal analysis, rheology, divalent ions, solubility, gel.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciências da Computação, 2014. Identificar funções biológicas das sequências é uma atividade chave em projetos genomas. Esta tarefa é realizada na etapa de anotação, que possui duas fases. Na fase manual, biólogos utilizam seu conhecimento e experiência determinar a função de cada sequência, baseada nos resultados produzidos pela fase automática, onde ferramentas e bancos de dados são utilizados para predizer uma anotação funcional. Esta dissertação propõe BioAgents-Prot, uma ferramenta multiagente baseada em conhecimento, que simula o conhecimento e experiência dos biólogos para anotação de proteínas. BioAgents-Prot foi definido com uma abordagem de agentes cooperativos, onde diferentes agentes especializados trabalham em conjunto na tentativa de sugerir uma anotação manual adequada. A arquitetura proposta em três camadas foi desenvolvida com Java Agent DEvelopment Framework - JADE e Drools, um motor de inferência baseado em regras. Para avaliar o desempenho do BioAgents-Prot, as anotações dos transcritos do fungo Saccharomyces cerevisiae foram comparadas com as anotações sugeridas pelo sistema. Usando regras básicas que representam o raciocínio de anotação, obtemos 95.84% de sensibilidade, 93.22% de especificidade, 98.40% de F1-score e 0.80 de MCC, que demonstram a utilidade do BioAgents-Prot na etapa de anotação em projetos transcritoma. Identifying biological function of sequences is a key activity in genome projects. This task is done in the annotation step, which has two phases. In the manual phase, biologists use their knowledge and experience to determine the function for each sequence, based on the results produced by the automatic phase, where tools and data bases are used to predict functional annotation. This dissertation presents BioAgents-Prot, a knowledge based multiagent tool, which simulates biologists expertise to annotate proteins. BioAgents-Prot is defined with an approach of cooperative agents, where specialized intelligent agents work together to suggest proper manual annotation. The proposed three-layer architecture was implemented with Java Agent DEvelopment Framework-JADE and Drools (a rule-based inference engine). To assess performance, transcript annotations of the Saccharomyces cerevisiae fungus were compared to the annotations suggested by BioAgents-Prot. Using basic rules that represents the annotation reasoning, we obtained 95.84% of sensitivity, 93.22% of specificity, 98.40% of F1-score and 0.80 of MCC, which shows the usefulness of BioAgents-Prot in annotation step of transcriptome projects.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. Trichoderma harzianum tem recebido considerável atenção como potencial agente de controle biológico, agindo como um micoparasita contra diversos fitopatógenos habitantes do solo, incluindo Sclerotinia sclerotiorum. O objetivo deste estudo foi vizualizar por microscopia eletrônica de varredura (MEV), a interação entre T. harzianum e S. sclerotiorum, assim como mapear e identificar as proteínas secretadas por T. harzianum quando cultivado na presença de parede celular, apotécio e escleródio de S. sclerotiorum. Nos testes de interação por MEV, T. harzianum provou ser um potente antagonista de S. sclerotiorum, mostrando que as hifas do antagonista penetraram nas estruturas do fitopatógeno. Posteriomente foram construídos os mapas bidimensionais permitindo a visualização das diferentes proteínas secretadas de T. harzianum quando cultivadas na presença de diferentes etapas da vida de S. sclerotiorum sendo que um total de 139 spots foram analisados, e destes foram identificados 63. Das proteínas identificadas no secretoma 5 são exclusivas quando cultivadas em meio contendo apotécio, 9 em meio contendo escleródio e 4 contendo parede celular sendo 11 proteínas expressas nas 3 condições. A expressão dos genes foi feita usando PCR em tempo real a partir de RNA total de T. harzianum quando cultivadas na presença das três fases do ciclo de vida S. sclerotiorum (micélio, escleródios e apotécio) confirmando as proteínas secretadas. Nossos resultados fornecem um passo para a compreensão do processo de micoparasitismo entre T. harzianum durante sua interação com S.sclerotiorum permitindo a identificação das diferentes proteínas secretadas quando cultivadas com as fases do ciclo de vida desse fitopatógeno. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT Trichoderma harzianum has received considerable attention as a potential biological control agent, acting as a mycoparasite against several soilborne plant pathogens including Sclerotinia sclerotiorum. The objective of this study was to visualize electron microscopy (SEM), the interaction between T. harzianum and S. sclerotiorum as well as map and identify the proteins secreted by T. harzianum when grown in the presence of cell wall, and sclerotia of apothecium S. sclerotiorum. In MEV interaction tests, T. harzianum proved to be a potent antagonist of S. sclerotiorum, showing that antagonist hyphae penetrated pathogen structures. After dimensional maps were constructed allowing the visualization of the different secreted proteins from T. harzianum when cultured in the presence of different stages of the life of S. sclerotiorum with a total of 139 spots were analyzed and identified 63. Of these proteins identified in secretome 5 are unique when grown in medium containing apothecium, 9 in medium containing sclerotia and 4 containing cell wall being 11 proteins expressed in the 3 conditions. Expression of the gene was done using real-time PCR from total RNA of T. harzianum when cultured in the presence of the three phases of the lifecycle S. sclerotiorum (mycelium and sclerotia apothecium) confirming secreted proteins. Our results provide a step towards understanding the mycoparasitism process between T. harzianum during their interaction with S.sclerotiorum allowing the identification of various secreted proteins when grown with the phases of the life of this pathogen cycle.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-25Bitstream added on 2014-08-13T18:00:16Z : No. of bitstreams: 1 000763317.pdf: 14480979 bytes, checksum: 6cbb3669a32a4d5b105d1545ff5a4506 (MD5) BIOprospecTA Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) As aranhas construtoras de teia aérea orbital tornaram-se eficientes produtoras de diferentes tipos de sedas. Essas sedas são caracterizadas pela notável diversidade em sua composição química, estrutura e função, que vai desde a construção da teia orbital até o casulo. A seda produzida pelas aranhas são filamentos proteicos, constituindo uma interessante relação de estrutura-função e propriedades mecânicas, sendo produzida por um conjunto de glândulas abdominais. As fibras produzidas pela glândula ampulada maior são um dos tipos mais importantes de fibras, sendo um material nanoestruturado predominantemente composto por duas proteínas estruturais, espidroína-1 e espidroína-2. Enquanto que as fibras produzidas pela glândula flageliforme são compostas somente por uma proteína, a proteína da seda flageliforme. Apesar do grande interesse pelas propriedades mecânicas da seda das aranhas, visando o seu uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas devido as suas propriedades de resistência, elasticidade e biocompatibilidade, pouco se conhece sobre os detalhes das glândulas produtoras de seda e o processo de fiação que ocorre para a produção das fibras. A seda da teia de aranha tem sido extensivamente estudada através de dados oriundos da engenharia genética e da tecnologia do DNA recombinante. No entanto, informações químicas como as modificações pós-traducionais (PTMs) podem ser perdidas, o que pode inviabilizar a manutenção das propriedades mecânicas e fisico-químicas tão características da seda de aranha. Sendo assim, tanto as espidroínas naturais quanto as suas formas recombinantes foram até então, bioquimica e fisicamente, caracterizados como se apresentassem as mesmas (ou similares) propriedades físico-químicas, sem qualquer consideração sobre a existência de PTMs em suas sequências. Por tanto, no presente estudo adotamos a abordagem proteômica bottom-up com a utilização e... The orb-web spiders became efficient producers of different types of silks. These silks are characterized by diversity in their chemical composition, structure and function, ranging from the construction of the orb-web to the cocoon. Spider web silk proteins (spidroins) have interesting relationships between their 3-D structures and mechanical properties of these protein fibers, which are secreted by specialized abdominal glands. The major ampullate silk fibers, produced by major ampullate gland, are one of the most important types of fibers spun produced by the orb-web spiders of genus Nephila, and are nanostructured composite materials predominantly composed of two structural proteins, designated spidroin-1 and -2. While the fibers produced by the flagelliform gland consist of only a single protein, the flagelliform silk protein. Despite the great interest in the spider silk mechanical properties, targeting its use in biomedical and biotechnological applications due to its properties of strength, elasticity and biocompatibility, the knowledge about the details of the silk-producing glands and the spinning process that occurs for fiber production are limited. The spider silk has been extensively studied using data from genetic engineering and recombinant DNA technology. However, chemical information such as post-translational modifications (PTMs) may be lost, making difficult to explain the mechanical and physico-chemical properties of the spider silks. Thus, both the natural protein and the recombinant spidroins have been biochemically and physically characterized as they would have the same (or similar) physico-chemical properties, without any consideration about the existence of PTMs in their sequences. Therefore, in this study we used a bottom-up proteomic approach combining 2-DE with in-gel protein digestion by different proteolytic enzymes, followed by mass spectrometry analysis (NanoLC-ESI-CID/ETD-MSn) to identify the protein... BIOprospecTA: 2011/51684-1 FAPESP: 10/19051-6

Orientador : Prof. Dr. Marcos R. Mafra Co-orientador : Prof. Dr. Marco Aurélio S. de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. Defesa: Curitiba, 13/06/2014 Inclui referências Resumo: A denominação glúten é dada para o conjunto de proteínas encontradas em diversos cereais, sendo estas responsáveis por conferir à massa a coesão e a retenção de gases durante a fermentação. As principais proteínas que compõem o glúten são a gliadina e a glutenina. Estas são proteínas insolúveis em água, sendo a gliadina solúvel em solução alcoólica e glutenina solúvel em soluções ácidas e alcalinas. Por serem as principais proteínas da farinha de trigo, o estudo do comportamento térmico destas frações proteicas é essencial para o projeto de unidades de processamento desta matéria-prima. Entretanto, o processo de separação e purificação destas proteínas tendem a alterar as propriedades físico-químicas destas frações. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as frações ricas em glutenina obtidas da farinha de trigo (cultivar BRS-Parrudo – Embrapa), separadas por quatro métodos de extração, sendo estes assim denominados: extração padrão, extração com adição de DTT (ditiotreitol), extração por decantação e a extração direta. A quantidade de proteína obtida em cada extração foi quantificada pelo método de Bradford, sendo que as massas molares foram avaliadas por eletroforese em gel desnaturante SDS-PAGE. A temperatura de desnaturação das frações proteicas foi determinada pela calorimetria exploratória diferencial (DSC) e o grau de desnaturação destas frações foi avaliado por dicroísmo circular (CD). Na análise de Bradford, as concentrações de proteínas na extração padrão, extração com adição de DTT e na extração por decantação foram de 0,20 mg/mL, 0,30 mg/mL e 0,16 mg/mL, respectivamente, enquanto que na extração direta foi obtida maior concentração de proteína, 8,87 mg/mL. Na extração direta ocorre uma única etapa de extração, na qual são obtidas diversas frações proteicas, além da fração de interesse. Isto pode explicar o fato da maior concentração de proteína obtida nessa extração. As bandas identificadas na eletroforese para a avaliação das massas molares foram: 86,7 ± 2,9 Kda, para as frações de alta massa molar, e 48,3 ± 0,5 KDa e 39,1 ± 0,45 Kda, para as de baixa massa molar. A análise das frações proteicas por dicroísmo circular, revelou que as mesmas não sofreram desnaturação durante os processos de extração. A análise de DSC para a avaliação das quatro diferentes extrações revelou uma pequena variação da temperatura de desnaturação entre as amostras extraídas. Na extração padrão e extração direta foram obtidas as temperaturas de desnaturação de 64,3 ± 0,62°C e 67,2 ± 0,52°C, respectivamente e os eventos térmicos foram endotérmicos, com variação de entalpia de aproximadamente -3,95 J/g na extração padrão e -10,80 J/g na extração direta. Para a extração com adição de DTT, a temperatura de desnaturação foi de 65,1 ± 1,74°C e a variação de entalpia de -12,68 J/g. Essas amostras passaram pelo processo de diálise no intuito de eliminar interferentes. Foi observado uma pequena variação nas temperaturas de desnaturação, porém os picos obtidos apresentaram uma melhor definição, confirmando a eliminação dos contaminantes. Este trabalho demonstrou que o método de extração empregado pode alterar as propriedades das proteínas do glúten, especificamente a glutenina, sendo a análise de DSC um método robusto, rápido e confiável para avaliação destes extratos. As frações de glutenina extraída da farinha de trigo do cultivar BRS-Parrudo da Embrapa apresentou temperatura de desnaturação intermediária, quando comparada com os valores já encontrados na literatura para outros cultivares. PALAVRAS-CHAVE: Glúten, desnaturação, ditiotreitol (DTT), propriedades físico-químicas Abstract: Gluten is the name given to the group of proteins found in some cereals, which are responsible for conferring cohesion to the mass and retention of gas during fermentation. The major proteins which comprise the gluten are gliadin and glutenin. These proteins are insoluble in water. Gliadin is soluble in alcoholic solution and glutenin is soluble in acidic and alkaline solutions. Because they are the major proteins of wheat flour, the study of the thermal behavior of these protein fractions is essential for the design of processing units of this raw material. However, the process of separation and purification of these proteins tend to alter the physicochemical properties of these fractions. Thus, this study aims to evaluate the fractions ofglutenin obtained from wheat flour (BRS-stout - Embrapa) and separated by four methods, which are named as: standard extraction, extraction with addition of DTT (dithiothreitol ), extraction by decantation and the direct extraction. The amount of protein obtained at each extraction was quantified by the Bradford method, and the molecular weights were analyzed by gel electrophoresis on denaturing SDS-PAGE. The denaturation temperature of the protein fractions was determined by differential scanning calorimetry (DSC) and the degree of denaturation of these fractions was assessed by circular dichroism (CD). The results showed that the protein concentration in standard extraction, extraction by addition of DTT and decantation were 0.20 mg / ml, 0.30 mg / ml and 0.16 mg / ml, respectively. It was observed that direct extraction obtained a higher protein concentration, 8.87 mg / ml. In the direct extraction which consists in a single extraction step, various protein fractions are obtained with the fraction of interest protein. This may explain the fact that the highest concentration of protein was obtained in this extraction. The bands identified in electrophoresis for assessment of molecular weight were 86.7 ± 2.9 kDa for the high molecular weight fractions, and 48.3 ± 0.5 kDa and 39.1 kDa ± 0.45 for the low molecular weight. The analysis of the protein fractions by circular dichroism revealed that they did not undergo denaturation during the extraction process. The DSC analysis for the evaluation of four different extractions revealed a small variation of the denaturing temperature between the samples. In the standard extraction and direct extraction were obtained the denaturation temperatures of 64,3 ± 0,62°C e 67,2 ± 0,52°C, respectively, thermal events were endothermic and the enthalpy obtained was approximately -3.95 J / g in the standard extraction and -10.80 J / g for the direct extraction. For the extraction with the addition of DTT, the denaturation temperature was 65,1 ± 1,74°C and the enthalpy change of -12.68 J / g. These samples passed through the dialysis process in order to eliminate interfering. A small change in denaturation temperature was observed, but peaks obtained showed a better definition, confirming the removal of contaminants. This study demonstrated that the type of extraction method can change the properties of gluten proteins, specifically the glutenin, and the DSC analysis is a robust, fast and reliable method for assessing these statements. The fractions of glutenin extracted from wheat flour of BRS-stout Embrapa showed intermediate denaturation temperature when compared with the values already found in the literature for other cultivars. KEY-WORDS: Gluten, denaturation, dithiothreitol (DTT), physicochemical properties

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. A esquistosomose mansônica é a segunda parasitose mais devastadora segundo a Organização Mundial da Saúde, afligindo mais de 240 milhões de pessoas no mundo. Contudo, apesar do genoma do Schistosoma mansoni ser extensivamente estudado, os mecanismos envolvidos no remodelamento morfológico e adaptação do parasito após instalação no hospedeiro mamífero permanecem desconhecidos. A hipótese deste trabalho é que modificações pós-traducionais dependentes de SUMO e NEDD8 regulam o proteoma de maneira estágio-específica, contribuindo para uma adaptação rápida ao hospedeiro mamífero. Para investigar essa hipótese, inicialmente foi utilizado busca por similaridade, pesquisa de domínio e resíduos conservados, seguido de análises filogenéticas para identificar os genes relacionados com a via de sumorilação e nedilação de proteínas. Nesta etapa, também foram analisados genes do complexo COP9 signalossoma, devido a sua atividade denediladora intrínseca. Os resultados sugerem o envolvimento de 24 genes, sendo 9 com a modificação dependente de SUMO, 7 para a via dependente de NEDD8 e 8 com a montagem do complexo COP9. Em geral, as proteínas preditas apresentam um alto grau de conservação em relação às proteínas ortólogas. Para investigar padrões de expressão gênica diferencial ou estágio-específica nos estágios de cercária, verme adulto e esquistossômulos de 3,5 horas a 7 dias de cultivo in vitro, foi utilizada a técnica de qRT-PCR. Com relação à via de sumorilação, foi verificada uma expressão diferencial das E3 ligases: SmPIAS e SmRanBP2 e das enzimas desumoriladoras: SmSENP1 e SmSENP7. Além disso, a protease SmSENP1 mostrou uma atividade diferencial em verme adulto e em cercária. Já em relação à via de nedilação, foi observada uma correlação positiva entre o perfil de expressão dos constituintes da via de NEDD8 e seus alvos clássicos: culinas 1-5; p53 e p73. Subunidades do complexo COP9 signalossoma também foram avaliadas e mostraram ser mais expressas em cercária do que em verme adulto, o perfil de expressão entre os esquistossômulos foi semelhante. Também foram observadas que ambas as vias de modificação são ativadas em condições de estresse e inibidas na presença de MG132, um inibidor clássico do proteassoma. A continuação desta linha de investigação, utilizando técnicas proteômicas e silenciamento gênico, poderá confirmar a hipótese de que o proteoma de cercária e esquistossômulos jovens são extensivamente modificados por SUMO e NEDD8, sugerindo uma importância dessas vias de modificação para a instalação do parasitismo. Schistosomiasis is the second most devastating parasitic disease according to the World Health Organization, afflicting over 240 million people worldwide. Although the Schistosoma mansoni genome has been extensively studied, the mechanisms involved in morphological remodeling and adaptation of the parasite in the mammalian host remain unknown. Our working hypothesis is that SUMO and NEDD8-dependent post-translational modifications regulate, in a stage - specific manner, the parasite´s proteome, contributing to a rapid adaptation to the mammalian host. To investigate this hypothesis, we initially used, domain and conserved residues similarity searches, followed by phylogenetic analysis to identify genes involved in the SUMOylation and NEDDylation pathways. In this step, the genes related to COP9 signalosome complex were also analyzed, due to their intrinsic deNEDDylating activity. The results suggest the involvement of 24 genes, of which 9 were related to SUMO modification, 7 to NEDD8 pathway and 8 involved in the assembly of the COP9 complex. In general, the predicted proteins showed a high degree of conservation compared to orthologue proteins. To investigate differential gene expression patterns in cercariae, adult worms and in-vitro schistosomula cultured for 3.5 hours and 7 days it was used the qRT-PCR technique. Concerning the SUMOylation pathway, it was observed a differential expression of E3 ligases: SmPIAS and SmRanBP2 and also for deSUMOylating enzymes: SmSENP1 and SmSENP7. Moreover, SmSENP1 protease showed a differential activity in adult worms and cercariae. As for the NEDDylation pathway, a positive correlation was observed comparing the expression profile of the NEDD8 pathway constituents and their classic targets p53 and p73 cullins 1-5. Subunits of the COP9 signalosome complex were also evaluated and showed to be up-regulated in the cercariae compared to adult worms, the expression profiles of such subunits were similar among the cultured schistosomula. It was also observed that both pathways are activated under stress and inhibited in the presence of MG132, a classic proteasome inhibitor. Proteomic techniques and gene silencing may further validate our hypothesis that the cercariae and early-schistosomula proteomes are extensively modified by SUMO and NEDD8, revealing the importance of these pathways for parasite installation and maintenance inside the vertebrate host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi atinge milhões de pessoas em todo mundo, especialmente na América Latina, onde é endêmica. Em seu ciclo de vida, o parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro do hospedeiro mamífero e do inseto triatomíneo. Componentes localizados na superfície do parasito e da célula hospedeira desempenham papéis importantes na invasão, entretanto os mecanismos envolvidos são muito discutidos. Sabe-se que a sinalização mediada por Ca2+ é um aspecto importante na invasão celular e na diferenciação do parasito. A calmodulina (CaM) é uma proteína citoplasmática Ca2+-dependente em eucariotos que regula várias proteínas. A ligação da CaM ao Ca2+ induz uma mudança conformacional que promove a interação desta com diversas proteínas com importantes funções biológicas. A CaM de T.cruzi (TcCaM) tem sido associada à várias funções diferentes como regulação do crescimento, estimulação enzimática, transdução de sinais, além de modular os efeitos do Ca2+. Desta forma, a fim de melhor entender o envolvimento das proteínas ligantes de CaM (CaM-BPs) nos processos de invasão e diferenciação de T. cruzi, foram adotadas nesse trabalho duas abordagens de identificação de proteínas ligantes de Ca2+ e/ou CaM. Primeiramente pela análise bioinformática de proteínas diferencialmente expressas durante a amastigogênese e proteínas presentes na superfície do parasito. Foram preditas 17 proteínas ligantes de Ca2+ dentre as identificadas com expressão regulada durante a amastigogênese e 36 proteínas na superfície de tripomastigota e amastigota. Estas possuem funções enzimática, de armazenamento, transporte dentre outras. A segunda foi uma abordagem experimental onde identificamos 6 proteínas, as quais desempenham funções estruturais, motilidade, adesão ou enzimática. Esta segunda vertente foi realizada experimentalmente por uma abordagem proteômica. As CaM-BPs extraídas da forma epimastigota foram enriquecidas por cromatografia de afinidade e separadas em géis eletroforéticos (1D-PAGE e 2D-PAGE). A identificação por espectrometria de massas foi iniciada e já foram identificados componentes da estrutura celular como α- e β-tubulinas, proteína paraflagellar rod putativa e uma proteína de transdução de sinal intracellular, a HSP70. Esses dados auxiliam no entendimento sobre como o Ca2+, a TcCaM e seus ligantes participam em processos celulares como invasão e diferenciação do T. cruzi. Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, afflicts millions worldwide especially in Latin America where it is endemic. During its life-cycle, the parasite undergoes several differentiation events in order to adapt to a variety of conditions inside both mammalian host and triatomine vector. Components from both parasite and host-cell surfaces play major roles in invasion, however the mechanisms involved are still much discussed. It is known that Ca2+ mediated signaling is an important aspect of host-cell invasion and parasite differentiation. Calmodulin (CaM) is a citoplasmic Ca2+-dependent protein that regulates several proteins in eukaryotes and the binding of Ca2+ to CaM induces conformational changes, which promotes the interaction to a variety of other proteins with important biological functions. T. cruzi CaM (TcCaM) has been linked to several functions such as growth regulation, enzyme stimulation, and signal transduction, besides modulating the effects of Ca2+ concentration. Thus, in order to better understand the involvement of CaM binding proteins (CaM-BPs) in the invasion process and T. cruzi differentiation, was adopted here two approaches to identify Ca2+- and/or CaM- binding proteins. First though bioinformatic prediction of such proteins among those identified as differentially expressed during amastigogenesis and those presented in the parasite cell surface. It was predicted 18 Ca2+-binding proteins with regulated expression level during differentiation and 36 in the surface of trypomastigotes and/or amastigotes. These have enzymatic, storage, transportation and others functions. The second was an experimental approach where we identified 6 proteins, which play structural, motility, adhesion or enzymatic functions. This second part was an experimental proteomic approach, where CaM-BPs from epimastigotes were enriched by affinity chromatography and separated by gel electrophoresis (1D-PAGE and 2D-PAGE). Mass spectrometric identifications were initiated and it already has been identified cell structure components such as α-and β-tubulins, putative paraflagellar rod proteins and a signal transduction protein, the HSP70. This data contribute to the understanding of the involvement of Ca2+, TcCaM and their ligands in the invasion and differentiation processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. Há muito tempo se sabe que estruturas tridimensionais de proteínas são determinadas por suas respectivas sequências de aminoácidos, entretanto as possíveis regras que associam sequências a estruturas continuam em larga medida desconhecidos. A construção de um algoritmo geral para predição ab initio de estruturas proteicas, isto é, uma metodologia que determine computacionalmente a estrutura nativa de qualquer proteína com base em sua sequência de aminoácidos, é possivelmente o maior desafio teórico atual da Biofísica computacional. Esta tese parte da hipótese inovadora de que a única informação dependente de sequência necessária para se determinar a conformação nativa de uma proteína é a distância de cada um de seus átomos até o centro geométrico da estrutura, uma medida que denominamos enterramento atômico. O objetivo principal do trabalho é avaliar a aplicabilidade dessa hipótese através da construção da primeira versão de um método computacional para predição ab initio que utilize os enterramentos como único intermediário informacional entre sequência e estrutura proteica. Nossa metodologia está dividida em duas partes principais: a primeira descreve a construção de um método computacional capaz de realizar predições de enterramentos atômicos a partir de sequências de aminoácidos; a segunda trata de simulações computacionais do enovelamento que utilizam as predições obtidas na primeira parte para obter estruturas terciárias próximas à nativa para algumas proteínas selecionadas. O método computacional que foi desenvolvido neste trabalho para prever os enterramentos atômicos de proteínas a partir de suas sequências de aminoácidos é um algoritmo de aprendizado supervisionado baseado em um modelo oculto de Markov (Hidden Markov Model - HMM). Análises informacionais realizadas sobre os resultados alcançados pelo HMM implementado revelaram que suas predições são ótimas, no sentido de que elas são capazes de extrair praticamente toda a informação sobre enterramentos disponível na sequência, de acordo com o modelo de dados adotado. Na segunda parte do trabalho, um método de dinâmica molecular com um potencial simplificado, que não inclui nenhuma informação derivada da estrutura nativa e utiliza as predições de enterramentos atômicos como base para o único termo dependente de sequência do potencial, foi aplicado a três proteínas pertencentes a diferentes classes estruturais, selecionadas entre os melhores resultados de predição alcançados na etapa anterior. Nos três casos, o algoritmo foi capaz de obter e distinguir a conformação nativa correta em simulações do enovelamento que partiram de conformações completamente estendidas. Os resultados obtidos demonstram que, ao menos para algumas classes de proteínas, os enterramentos atômicos podem de fato atuar como os únicos intermediários informacionais entre sequência e estrutura, fornecendo um novo arcabouço conceitual que esperamos contribuir para a compreensão dos fundamentos do enovelamento proteico e para a investigação do problema da predição estrutural de proteínas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT It has been long known that the three-dimensional structures of proteins are determined by their respective amino acid sequences. The possible rules, however, that associate protein sequences to structures remain at large elusive. The development of an ab initio general algorithm for protein structure prediction, that is, a computational methodology that should be able to determine the native structure of any protein from its amino acid sequence, is possibly the greatest theoretical challenge of current computational biophysics. The premise of this work is based on the innovative hypothesis that the only sequence-dependent information needed to determine the native conformation of a protein is the distance of each of its atoms to the geometric center of the structure, a measure we call atomic burial. Our main objective is to evaluate the applicability of this hypothesis through the development of the first version of a computational method for ab initio prediction that employs burials as the only informational intermediate between protein sequence and structure. Out methodology is divided in two main parts: the first part describes the construction of a computational method to produce atomic burial predictions from amino acid sequences; the second part refers to folding simulations that employ the previously obtained predictions to obtain tertiary structures that are close to the native configuration for selected proteins. The computational method that was developed in this work for atomic burial prediction from amino acid sequences is a supervised learning algorithm based in a Hidden Markov Model (HMM). Informational analyses performed on the HMM results revealed that its predictions are optimal, in the sense that they are capable of extracting almost the totality of the information about burials that is available in amino acid sequences, according to the data model that was adopted. In the second part of this work, a molecular dynamics method with a simplified potential, which does not include any information derived from the native structure and employs atomic burial predictions as its only sequence-dependent term, was applied to three proteins belonging to different structural classes, selected among the best prediction results achieved in the previous step. In all three cases, the algorithm was capable of obtaining and distinguishing the native conformation in folding simulations that started from fully extended conformations. The results achieved in this work demonstrate that, at least for some protein classes, atomic burials are in fact able to act as the sole informational intermediates between sequence and structure, providing a new conceptual framework that we expect to be able to contribute for our knowledge of the fundamentals of protein folding and to the problem of protein structure prediction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. A febre é definida como o aumento da temperatura corporal que ocorre como parte da resposta de fase aguda desencadeada após a invasão de um organismo por agentes estranhos. O LPS (lipopolissacarídeo) é um potente indutor de febre, frequentemente utilizado em estudos sobre respostas inflamatórias e febris. Alguns trabalhos têm sugerido o envolvimento de vias de sinalização dependentes de proteína quinase A (PKA) e proteína quinase C (PKC) no desenvolvimento da febre. Neste estudo, investigamos o efeito de inibidores de PKA (H-89) e PKC (celeritrina) sobre a resposta febril induzida por LPS. Analisamos ainda alterações da expressão e atividade destas quinases em resposta aos diferentes tratamentos, 3 e 6 h após a injeção do estímulo pirogênico. Os resultados demonstraram que celeritrina (3 μg/rato) e H-89 (10 μg/rato) reduziram a resposta febril induzida pela injeção iv de LPS (5 μg/Kg) em 36 % e 33,1 %, respectivamente. A administração conjunta de celeritrina e H-89 também reduziu a resposta febril induzida por LPS; entretanto, o efeito inibitório verificado (31,2 %) não foi maior do que o observado após a administração isolada de cada droga. Após os experimentos farmacológicos, os animais foram eutanasiados e tiveram seus hipotálamos dissecados para as análises de expressão e atividade. A análise por western blotting não foi capaz de detectar alterações da expressão de PKCε 3 h após a injeção do LPS, tampouco de PKA nos dois tempos analisados. A expressão de PKCε 6 h após a injeção do estímulo pirogênico apresentou-se aumentada nos animais tratados com H-89, sugerindo que, na ausência da ativação de PKA, vias dependentes de PKCε sejam ativadas como mecanismo compensatório. A análise da atividade foi realizada por meio de kits comerciais de ELISA para medir a fosforilação de um substrato realizada por quinases. Não foram encontradas mudanças significativas nos padrões de atividade para nenhuma das proteínas testadas, o que pode ser devido à baixa especificidade do método, visto que o substrato utilizado no ensaio pode ser fosforilado por todas as isoformas de PKA e PKC. Os dados desse trabalho sugerem que vias de sinalização dependentes de PKA e PKC estejam envolvidas na resposta febril induzida por LPS, porém, métodos mais específicos para análise destas enzimas são necessários para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT Fever is defined as the increase in body temperature that occurs as a component of the acute phase response triggered after invasion of pathogens in the body. Lipopolysaccharide (LPS) is a potent inducer of fever, often used in studies assessing the inflammatory and febrile responses. Some studies have suggested the involvement of protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC)-dependent signaling pathways in the development of fever. We investigated the effect of PKA and PKC inhibitors, H-89 and celeritrin respectively, on the febrile response induced by LPS. We also analyzed changes in the expression and activity of these kinases in response to different treatments, 3 and 6 h after the pyrogenic stimulus injection. The results showed that celeritrin (3 mg/rat) and H-89 (10 mg/rat) reduced the febrile response induced by LPS (5 mg/kg, iv) in 36% and 33.1%, respectively. Co-administration of celeritrin and H-89 also reduced the LPS-induced febrile response; however, the inhibitory effect observed (31.2%) was not more effective than that observed after administration of each drug separately. After pharmacological experiments, animals were euthanized, and their hypothalami were dissected for kinases expression and activity analyses. Western blot analyses did not exhibit changes in neither PKCε expression 3 h after LPS injection nor PKA levels in both periods investigated. The expression of PKCε 6 h after injection of pyrogenic stimulus was increased in H-89 treated animals, suggesting that PKCε-dependent pathways are activated as a compensatory mechanism in the absence of PKA activation. The enzymatic activity analysis was performed using commercial ELISA kits specific for measuring substrate phosphorylation mediated by kinases. There were no significant changes in the patterns of activity for any tested enzymes, which may be due to low specificity of the method since the substrates employed in the assays can be phosphorylated by all PKC or PKA isoforms. Data from the present study suggest that PKA and PKC-dependent signaling pathways may be involved in the febrile response induced by LPS, although more specific methods are needed to analyze such enzimes in order to elucidate their involvement in fever molecular mechanisms.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. Trichoderma harzianum é um fungo filamentoso capaz de secretar enzimas hidrolíticas ao meio extracelular as quais agem despolimerizando componentes da biomassa vegetal como celulose e hemicelulose. O conjunto de proteínas secretadas por uma célula é denominado de secretoma, uma subpopulação do proteoma total. Amostras correspondentes ao secretoma de T. harzianum foram obtidas por fermentação submersa (SmF) em meio sintético suplementado com 1 %(m/v) de glicose, celulose, xilana ou bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram posteriormente submetidos à análise proteômica seguindo duas abordagens distintas, eletroforese bidimensional (2-DE) seguida de espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF para a identificação de polimorfismos proteicos provenientes do gel, e LC-MS/MS para identificação do total de proteínas presentes em cada amostra. Os secretomas de T. harzianum foram igualmente tratados com a enzima PNGase F a fim de detectar presença de proteínas glicosiladas e mudanças no perfil bidimensional das amostras. O crescimento nas diferentes fontes de carbono resultou na identificação de diversos grupos de proteínas extracelulares que incluíram glicosil hidrolases como celulases, xilanases, pectinases e quitinases, bem como proteínas associadas à parede celular fúngica como hidrofobinas e proteínas elicitoras e um alto número de proteínas putativas, cuja expressão diferencial parece estar regulada pela natureza e complexidade da fonte de carbono utilizada na cultura. Adicionalmente este trabalho apresenta evidência sobre a ocorrência de complexos multienzimáticos no secretoma do fungo após o crescimento por SmF em bagaço de cana, graças à utilização de técnicas eletroforéticas, enzimológicas e espectrométricas como BN-PAGE, zimografia e LC-MS/MS, respectivamente. Os resultados indicam que proteínas secretadas por T. harzianum naturalmente envolvidas na desconstrução de substratos (hemi) celulolíticos e quitinolíticos formam parte de elementos oligoméricos constituídos por subunidades de diferente especificidade catalítica que aparentemente são requeridas para uma conversão eficiente e específica dos polímeros da biomassa. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT Trichoderma harzianum is a filamentous fungus able to secret hydrolytic enzymes to the extracellular medium which act degrading the biopolymeric components of plant biomass such as cellulose and hemicellulose in fermentable sugars. This set of secreted proteins corresponds to the secretome, a subset of the proteome. The samples related to the T. harzianum secretome were obtained by submerged fermentation (SmF) in synthetic medium supplemented with1% (w/v) glucose, cellulose, xylan or sugarcane bagasse as a carbon source. The secretomes were explored by two different proteomic approaches, gel-based proteomics using two-dimensional electrophoresis (2-DE) followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry for the identification of the protein polymorphisms from the gel, and gel-free proteomics using LC-MS/MS for identification of the total of protein present in each sample. The T. harzianum secretomes were also treated with the enzyme PNGase F in order to detect the presence of glycosylated proteins and changes in the dimensional profile of the samples. Growth on different carbon sources resulted in the identification of several groups of extracellular proteins such as glycoside hydrolases including cellulases, xylanases, pectinases, chitinases, as well as cell-wall associated hydrophobins and elicting proteins, and putative proteins whose differential expression appears to be regulated by the nature and complexity of the carbon sources used in the culture. In addition the occurrence of multienzymatic complexes in the secretome after SmF growth in sugarcane bagasse containing medium was demonstrated by means of electrophoretic, spectrometric and enzymologic techniques, such as BN-PAGE, zimography, and LC-MS/MS, respectively. The results indicate that enzymes and proteins secreted by T. harzianum naturally involved in the deconstruction of (hemi) cellulolytic and chitinolytic substrates are part of oligomeric elements composed of subunits with different catalytic specificities apparently required for specific and efficient conversion of biomass polymers.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-08-13T18:01:28Z : No. of bitstreams: 1 000747172.pdf: 1681381 bytes, checksum: 9f87febf4316cf995b9569ba52b73b6b (MD5) A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2013. O sucesso na criação e conservação das araras depende de boas práticas de manejo e da identificação e tratamento de doenças, o que pode ser desafiador, pois as aves tendem a mascarar os sinais de enfermidade. Sendo assim, a utilização de ferramentas diagnósticas como o proteinograma é imperativo, pois são capazes de avaliar de forma abrangente o estado de saúde desses indivíduos. Este estudo teve como objetivo determinar o proteinograma de araras mantidas em cativeiro por meio da eletroforese de proteínas, correlacionando a espécie, sexo e ambiente com possíveis variações no perfil eletroforético, assim como buscou averiguar se infecções por hematozoários hemosporídeos se prestam como modelo de resposta de fase aguda, acarretando modificações no padrão proteico. Ademais, pretendeu avaliar a eletroforese de proteínas como ferramenta diagnóstica. A eletroforese em gel de agarose das proteínas séricas foi realizada em diferentes espécies de araras, fêmeas e machos, positivas e negativas para hemosporidioses e alocadas em três grupos distintos conforme o ambiente de origem no Distrito Federal ou Goiás. Não foram evidenciadas alterações significativas nas frações proteicas entre indivíduos positivos e negativos. O sexo interferiu nas concentrações de pré-albumina, as quais foram inferiores nas fêmeas. O fator ambiente resultou em mudanças nas frações β e γ globulinas. Concluiu-se que a variável ambiente é a maior responsável pelas discrepâncias observadas e atribuiu-se a isto a presença de uma possível enfermidade crônica. Por fim, pode-se afirmar que a eletroforese de proteínas é uma ferramenta diagnóstica muito sensível, porém, inespecífica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Success in breeding and conservation of macaws depends on good management practices and the identification and treatment of diseases, which can be challenging, because the birds tend to mask the signs of illness. Thus, the use of diagnostic tools such as proteinogram is imperative, as they are able to assess widely the health status of these individuals. The aim of this study was to determine the proteinogram of macaws kept in captivity with protein electrophoresis, correlating the species, gender, and environment with possible changes in the electrophoretic profile, and to establish whether infections by blood hemosporidian parasites may be used as a model of acute phase response and modify the protein pattern. In addition, this study intended to evaluate the protein electrophoresis as a diagnostic tool. The agarose gel electrophoresis of serum proteins was carried out in different species of macaws, male and female, positive and negative for hemosporidiosis, and allocated into three distinct groups depending on the original environment in Distrito Federal or Goias. There were no significant changes in protein fractions between positive and negative individuals. Gender has interfered in prealbumin levels, which were lower in females. The environment has led to alterations in β- and γ-globulins fractions. It was concluded that environment is the most responsible for the observed differences and this is probably attributed to the presence of a chronic illness. Finally, the protein electrophoresis is a highly sensitive, but non-specific, diagnostic tool.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. A imunidade inata é o primeiro sistema ativado contra a invasão de microorganismos e partícula ao organismo. Esse sistema compreende a resposta humoral e celular. Os neutrófilos, partícipes da resposta imune celular, são encontrados na circulação sanguínea e se movimentam para o tecido quando são estimulados ou ativados por quimioatraentres. A ativação e/ou estimulação provocam mudanças celulares em prol da movimentação, fagocitose e destruição dos microorganismo. Essa ativação pode ser exacerbada provocando até injúrias teciduais. O processo de ativação pode ser subdividido em três estados fenotípicos distintos: quiescentes, estimulados ou ativados e esses estados podem ser desencadeados por substâncias como PAF e fMLP respectivamente. No presente estudo, tais condições foram comparadas. Ensaios que comprovaram a estimulação e ativação dos neutrófilos por esses agentes foram utilizados, como: explosão respiratória, clivagem da L-selectina e a mobilização da CD11b. Após essa avaliação foram comparados géis bidimensionais entre os três fenótipos (quiescentes, estimulados e ativados), o que resultou em 166 spots apresentando abundância diferencial e dentre eles 87 identificações proteicas. A análise dos termos do gene ontology para essas proteínas detectou que a maioria delas encontra-se no citoplasma e núcleo, e o processo biológico com maior número de proteínas envolvidas foi a transcrição em neutrófilos estimulados e dobramento de proteínas em neutrófilos ativados. Na comparação entre os três fenótipos, 16 spots apresentaram abundância diferencial e 11 proteínas foram identificadas, dentre elas 6 proteínas mais abundantes em neutrófilos quiescentes, envolvidas em processos como transdução de sinal, motilidade celular e modulação da resposta inflamatória. Seis outras proteínas eram mais abundantes em neutrófilos estimulados pelo PAF, relacionadas a adesão celular, transdução de sinal e atividade antimicrobiana. Dentre as proteínas identificadas neste estudo, 17 foram descritas pela primeira vez em neutrófilos e 30 foram associadas pela primeira vez ao estímulo por PAF ou à ativação por fMLP. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT Innate immunity is the first system activated against the invasion of microorganisms and particles in the body. This system includes the humoral and cellular responses. Neutrophils, a participant in the cellular immune response, are found in the bloodstream and move to the tissue when they are stimulated or activated by chemoattractants, known as effector cells of the inflammatory response. The activation and/or stimulation causes changes in this cell favouring movement, phagocytosis and destruction of microorganisms. This activation may be exacerbated by causing tissue injury. The activation process can be subdivided into three distinct phenotypic states: quiescent, stimulated or activated and these states can be triggered by substances as PAF and fMLP respectively. In the present study such conditions were compared. Tests demonstrating stimulation and activation of neutrophils by these agents were used as respiratory burst, cleavage of L-selectin and CD11b mobilization. After this evaluation, were compared two-dimensional gels among the three phenotypes (quiescent, stimulated and activated), which resulted in 166 proteins presenting differential abundance and among them 87 were identified. Analysis of the gene ontology terms for such proteins localized most of them in the cytoplasm and nucleus, and associated them to the biological processes of transcription in stimulated neutrophils and protein folding in activated neutrophils. Comparing among the three phenotypes, 16 proteins showed differential abundance and 11 were identified, among them 6 were more abundant in quiescent neutrophils, involved in processes like signal transduction, cell motility and modulation of the inflammatory response. Six other proteins were more abundant in neutrophils stimulated by PAF, related to cellular adhesion, signal transduction and antimicrobial activity. Among the identified proteins, 17 were described for the first time in neutrophils and 30 were associated for the first time to the stimulation by PAF or activation by fMLP.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-06Bitstream added on 2014-06-13T19:29:22Z : No. of bitstreams: 1 santos_fr_me_arafcf.pdf: 517837 bytes, checksum: 1c8c3fe118a03a4ef52272b2302c512b (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Universidade Estadual Paulista (UNESP) As proteínas são de fundamental importância nos processos biológicos atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros, pois são essenciais sob os aspectos da estrutura e função celular. Tem se tornado cada vez mais relevante o estudo de metodologias para determinar proteínas em várias áreas como em tecnologia e ciência de alimentos, laboratórios de análises clínicas, nutrição animal e humana. Antes de iniciar qualquer tipo de análise de proteínas, o método utilizado deve ser validado, pois a validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica. A validação é um processo dinâmico e constante que começa na fase de seleção, desenvolvimento e otimização do método e na qualificação dos instrumentos, materiais e analistas continuando na fase de experimentos. Um processo de validação bem definido e documentado oferece as agências reguladoras evidências de que o método é adequado. As características investigadas no processo de validação a fim de demonstrar o desempenho do método são: Linearidade, Faixa linear de trabalho, Limite de detecção, Limite de quantificação, Precisão, Exatidão, Precisão intermediária, Robustez, Especificidade, Incerteza de medição e Recuperação. Os métodos mais utilizados para quantificar proteínas são Biureto, Bradford, BCA, Kjeldahl e de Lowry, sendo o método de Lowry o mais utilizado. Devido aos interferentes e a incerteza do método em relação aos parâmetros analisados, este trabalho teve o propósito de realizar a validação do método de Lowry modificado quanto aos parâmetros preconizados pela NATA. A proteína utilizada em todo o experimento foi a albumina bovina sérica – BSA e a metodologia foi a original com algumas modificações... The proteins are of fundamental importance in biological processes acting as enzymes, hormones, neurotransmitters, transporters across membranes among others, as they are essential aspects in the structure and cellular function. It has become increasingly relevant the study of methodologies for determining proteins in various areas such as technology and food science, clinical laboratories, animal and human nutrition. Before starting any type of protein analysis, the method used must be validated because the method validation is a vital aspect of analytical quality assurance. Validation is a constant and dynamic process that begins at the stage of selection, development and optimization of the method and the qualification of tools, materials, analysts and continuing in the experimental phase. A validation process well defined and documented regulatory agencies provides evidence that the method is appropriate. The characteristics investigated in the validation process to demonstrate the performance of the method are: linearity, linear working range, limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, precision intermediate, robustness, specificity, uncertainty of measurement and recovery. The methods used to quantify proteins are Biuret, Bradford, BCA, Kjeldahl, and Lowry, the method of Lowry the most used. Due to interferences and uncertainty regarding the method parameters, this study aimed to perform the validation Lowry´s method modified the parameters recommended by NATA. The protein used throughout the experiment was to bovine serum albumin - BSA and was the original method with some modifications. Despite the existence of many modern techniques, the spectrophotometric method has been shown to be effective, in addition to lower cost and easy handling. The method was developed and validated

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. Polifenismo é a habilidade de um genoma expressar múltiplos fenótipos morfológica e comportamentalmente distintos. Em abelhas Apis mellifera¸ o polifenismo é essencial, uma vez que gera divisão de tarefas na colméia, vital para sua viabilidade. A plasticidade fenotípica das abelhas é mediada nutricionalmente pela geleia real (GR). A major royal jelly protein 1 (MRJP1) é a mais abundante proteína da GR, e é descrita como o principal fator ativo na diferenciação de castas de Apis mellifera. A MRJP1 é uma glicoproteína que se liga fortemente a um peptídeo chamado apisimina (5,5 kDa) e se auto-associa, formando complexos de diferentes tamanhos, podendo se apresentar em diversas formas moleculares numa única solução. O objetivo deste trabalho foi caracterizar associações de MRPJ1 sob diversas condições. MRJP1 foi purificada em um único passo de cromatografia de troca iônica. Por cromatografia de exclusão molecular foi possível observar que a MRJP1 tende a se oligomerizar ou até mesmo a se agregar em tampões ácidos, em amostras aquecidas a 60ºC ou em tampões com alta molaridade de sal (2 M de NaCl) ou de glicina (2 M),. Em tampão PBS pH neutro e tampão carbonato/bicarbonato pH 10,0, a MRJP1 está presente em três formas -pentâmero (290 kDa), dímero (120 kDa) e monômero (55 kDa). Ao se adicionar 0,5 M de glicina em tampão carbonato/bicarbonato pH 10,0, a MRJP1 se dissocia, apresentando-se mais abundante nas formas dimérica e monomérica. A presença dos surfactantes dodecil sulfato de sódio, Tween® 20 e Brij 35 induz um aumento na massa dos complexos de MRJP1, causado provavelmente pela ligação de moléculas do detergente com a proteína, podendo também induzir oligomerização ou agregação. Logo, conclui-se que a liofilização e aquecimento das amostras de MRJP1 induzem oligomerização e agregação da amostra. Não liofilizar o monômero e mantê-lo em baixas temperaturas mantém a amostra nesta forma molcular. O tampão carbonato/bicarbonato, pH 10,0, contendo glicina 0,5 M foi o melhor para se obter menor quantidade de formas de MRJP1 em solução com grande quantidade de monômero. O processo de ultrafiltração impede a purificação de MRJP1 em cromatografia de troca-iônica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Polyphenism is the hability of a genome to express multiple phenotypes with different morphologies and behaviors. In Apis mellifera bees, the polyphenism is essential, once it generates labor division in the hive, vital to its viability. The bee s phenotypic plasticity is nutritionally mediated by royal jelly (GR). The major royal jelly protein 1 (MRJP1) is the most abundant protein in GR, and it is described as the main active factor in differentiating Apis mellifera castes. The MRJP1 is a glycoprotein that binds strongly to a peptide named apsimin (5,5 kDa) and self-associates, forming complexes of various sizes, and may present itself in different molecular forms in one solution. The purpose of this study was to characterize MRJP1 associations under different conditions. MRJP1 was purified in a single step of ionic exchange chromatography. By size exclusion chromatography, it was possible to observe the MRJP1 oligomerization or even aggregation in acid buffers, in samples heated to 60ºC or in buffers with high salt molarity (2 M of NaCl) or glycine (2 M). In PBS buffer at neutral pH and carbonate/bicarbonate pH 10,0 buffer, MRJP1 was present in three forms - pentamer (290 kDa), dimer (120 kDa) or monomer (55 kDa). By adding 0.5 M of glycine in carbonate/bicarbonate pH 10,0 buffer, MRJP1 dissociates, leading to monomer and dimmer as the most abundant forms. The presence of the surfactants sodium dodecyl sulfate, Tween® 20 and Brij 35 induces a mass increase in the MRJP1 complex, probably caused by the binding of detergent molecules to the protein. Detergents may also induce oligomerization or aggregation. Therefore, it is concluded that lyophilization and heating the MRJP1 samples induce oligomerization and aggregation of the sample. To not lyophilize the monomer and keep it at low temperatures maintains the sample in this molecular form. The carbonate/bicarbonate buffer, pH 10.0, containing 0.5 M of glycine was the best for obtaining fewer MRJP1 forms in solution with high amounts of monomer. The ultrafiltration process prevents MRJP1 purification by ion exchange chromatography.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. A cana de açúcar é a segunda cultura mais abundante no país, e tem como resíduo o bagaço de cana, o qual é constituído por células vegetais que possuem uma parede celular composta por celulose, hemicelulose e pectina, além da lignina. A biomassa lignocelulósica armazena grande quantidade de energia química, que pode ser convertida em diversas outras fontes energéticas. Fungos filamentosos são microrganismos capazes de produzir e secretar enzimas variadas para utilizar a parede celular vegetal como fonte de carbono. Nesta dissertação foi analisado o secretoma de Aspergillus oryzae crescido em estado sólido de bagaço de cana como fonte de carbono. Foram testadas duas soluções para a extração do secretoma, a) tampão acetado de sódio 0,25mM, pH 5,0 e b) tampão acNa 0,25mM, pH 5,0, 0,1%Tween 80. As amostras foram submetidas às análises enzimáticas, eletroforéticas e por espectrometria de massas (LC-MS/MS). As análises enzimáticas e eletroforéticas mostraram que não houve diferença entre os dois métodos de extração. Além disso, o detergente Tween 80 aparenta aumentar a extração de proteínas vindas do bagaço de cana, o que não é desejável para a análise por espectrometria de massas. A comparação do secretoma de A. oryzae em estado sólido com o secretoma deste em cultura submersa usando meio contendo bagaço mostrou diferenças significativas, sendo o secretoma em estado sólido mais diversificado enquanto o secretoma em cultura submersa apresentou maior abundância de determinadas proteínas. A análise do secretoma produzido em estado sólido por espectrometria de massas permitiu a identificação de 47 proteínas não redundantes, sendo 19 relacionadas à degradação de biomassa lignocelulósica. O polimorfismo enzimático em A. oryzae pode ter sido a justificativa para o baixo número de identificações. As proteínas intracelulares identificadas podem ter sido consequência do processo de extração, mas podem também ter sido secretadas por vias não convencionais, da mesma forma que ocorre em protozoários. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT The sugarcane crop is the second more abundant crop in Brazil, and has as waste sugarcane bagasse, which is constituted by plant cells with a cell wall composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The lignocellulosic biomass stores a large amount of chemical energy, which can be converted to another sources of energy. Filamentous fungi are a group of organisms that are able to secrete a variety of proteins to disrupt cell wall structure for further carbon assimilation. In this work, Aspergillus oryzae was submitted to solid state-fermentation and it was analyzed two different solutions for extraction of proteins secreted by the fungus as follows: a) 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5; b), 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5, 0.1% Tween 80. The samples were analyzed by enzymatic assays, electrophoretical profile and mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Enzymatic and electrophoretical analysis showed that there were no differences between extraction with sodium acetate buffer and the extraction buffer with Tween 80. Moreover, Tween 80 seems to increase sugarcane bagasse proteins solubilization in the sample, which is not desirable for MS analysis. The comparison between A.oryzae’s secretome in solid-state culture and in submerged culture using sugarcane bagasse as carbon source showed remarkable differences, being the solid-state secretome more complex and the submerged-culture secretome with some more abundant proteins. Mass spectrometry analysis of solid-state secretome allowed the identification of 47 non redundant proteins, and 19 of them were related with biomass degradation. The high degree of enzymatic polymorphisms in A. oryzae might be the reason of few identified proteins. Intracellular proteins may be a consequence of extraction process, but they could be secreted in an unconventional secretion pathway, as those ones observed in protozoan parasites.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. Os fungos filamentosos quando submetidos ao crescimento em meios contendo material lignocelulósico, são capazes de produzir diferentes tipos de enzimas extracelulares responsáveis por catalisar a hidrólise de celulose, hemicelulose e outros polissacarídeos encontrados nas paredes celulares vegetais. Algumas dessas enzimas podem ser aplicadas comercialmente em processos industriais, como nas indústrias alimentícia, têxtil, papeleira e também na produção de bioetanol. O fungo filamentoso mesofílico e de distribuição cosmopolita Aspergillus niger é saprófita e apresenta potencial biotecnológico como produtor de enzimas hidrolíticas O presente trabalho tem como objetivo a purificação de xilanases de A. niger bem como a análise do seu secretoma (conjunto de proteínas secretadas) após seis dias de crescimento em meio sintético suplementado com 1% de bagaço de cana como única fonte de carbono. Uma fração xilanolítica (Xyl) previamente purificada por cromatografia de exclusão molecular revelou ser composta por polipeptídeos distintos apresentando diferentes pIs como demonstrado por eletroforese bidimensional (2-DE). A fim de aperfeiçoar a purificação de Xyl e separar possíveis isoformas, Xyl foi submetido às cromatografias de troca aniônica (CTA) em pH 8,5 e de troca catiônica (CTC) em pH 5,0. A CTA separou uma fração contendo apenas dois polipeptídeos como demonstrado por 2-DE. Um spot foi identificado como sendo uma endo-1,4-β-xilanase e o outro não pôde ser identificado. A xilanase presente na fração purificada exibiu um Km de 6.46 mg/ml e uma Vmax de 1.984 UI.mL-1 para xilana solúvel. A fim de ser submetido à análise proteômica,o secretoma foi primeiramente submetido à digestão tríptica tanto em solução quanto após separação eletroforética em gel de poliacrilamida. Os peptídeos resultantes foram analisados por LC-MS/MS-Orbitrap em modo Data Dependent Acquisition. A abordagem de digestão em gel propiciou a identificação de 55 proteínas comparada à identificação de apenas 14 proteínas utilizando a digestão em solução. A maioria das proteínas identificadas pertence à classe das hidrolases, sendo as xilanases as mais abundantes. Estes resultados correspondem aos ensaios enzimáticos realizados e à composição esperada do secretoma: um arsenal de enzimas capazes de promover a hidrólise do substrato e prover meios para o desenvolvimento e crescimento do fungo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT When submitted to growth in media containing lignocellulosic materials, filamentous fungi are able to produce different kinds of extracellular enzymes, which are responsible to catalyze the hydrolysis of cellulose, hemicellulose and other polysaccharides found on plant cell wall. Some of these enzymes can be commercially applied to industrial processes, such as the ones used on food, paper and textile industry as well as on the production of bioethanol. Aspergillus niger, a mesophilic and saprophytic filamentous fungus, possesses biotechnological potential as a producer of hydrolytic enzymes. The present work aims at purifying xylanases from A. niger and analyzing its secretome (group of secreted proteins) after six days of growth on synthetic medium supplemented with 1% sugarcane bagasse as the only carbon source. A xylanolytic fraction (Xyl) previously purified by molecular exclusion chromatography was shown to be composed of different polypeptides bearing different pIs as demonstrated by two-dimensional electrophoresis (2-DE). In order to improve Xyl purification and to separate possible xylanase isoforms, Xyl was submitted to both Anion Exchange Chromatography (AEC) at pH 8.5 and Cation Exchange chromatography (CEC) at pH 5.0. The AEC approach could successfully isolate a fraction containing two different polypeptides as demonstrated by 2-DE. One spot was identified as an endo-1,4-β-xylanase and the other couldn’t be identified. This xylanase in the purified fraction exhibited a Km of 6.46 mg/ml and a Vmax of 1.984 IU.mL-1 for soluble xylan. For proteomic analysis, the secretome was firstly submitted to In-solution trypsin digestion or alternatively to SDS-PAGE followed by trypsin digestion of gel slices. Resulting peptides were then analyzed by LC-MS/MS-Orbitrap using Data Dependent Acquisition mode. Overall, the In-gel digested samples provided identification of 55 proteins comparing to only 14 identified proteins in In-solution digested samples. Most proteins identified in A. niger secretome belonged to the hydrolase class, being xylanases the most abundant ones. These findings correspond to experimental enzymatic assays and the expected secretome composition: an arsenal of enzymes capable of hydrolyzing the substrate and providing ways for the fungi growth and development.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. Aprendizagem associativa pode ocorrer por condicionamento operante, através do qual o animal consegue antecipar eventos futuros baseado em suas experiências como consequências de seus próprios comportamentos. Trata-se de uma forma de aprendizagem que o homem compartilha com outros animais, incluindo invertebrados. O uso de ratos e abelhas como modelos biológicos em estudos comportamentais tem ajudado na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na aprendizagem por condicionamento operante. O objetivo desse trabalho foi identificar proteínas envolvidas no processo de aprendizagem por meio de análises proteômicas cerebrais de abelha mandaçaia (Melipona quadrifasciata) e rato (Rattus norvegicus). Neste trabalho, foram padronizadas condições para separação de extratos cerebrais de abelhas por meio de eletroforese bidimensional (2DE). Os perfis que apresentaram melhor resolução de spots proteicos foram obtidos com as seguintes condições: concentração de anfólitos a 1,5 %, CHAPS a 1 % e reposição de DTT no cátodo durante a isoeletrofocalização. Proteomas cerebrais de abelhas treinadas por condicionamento operante e controles foram comparados através de DIGE, mas nenhuma diferença de expressão proteica foi observada até o momento. Em relação a ratos, o primeiro mapeamento em grande escala por LC-MS/MS de proteomas de córtex pré-frontal de rato foi realizado, até onde sabemos. Foi possível identificar 923 proteínas, valor seis vezes maior quando comparado a outros estudos presentes na literatura. As proteínas identificadas foram categorizadas de acordo com sua localização e função biológica. A localização subcelular assim se dá: 21 % citosol, 18 % membrana plasmática, 13% mitocôndrias, 10 % núcleo, 8% citoesqueleto, 6 % complexo de Golgi ou retículo endoplasmático, 3 % proteínas extracelulares, 3 % outras organelas e 18 % de proteínas intracelulares. Entre as proteínas identificadas no córtex pré-frontal podemos destacar quatro delas como sendo descritas com envolvimento em processos de aprendizagem : contactin-2, calbindin, subunidade gamma da proteína quinase c (PKCgamma) e gp78. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Associative learning can occur by operant conditioning, when the animal can anticipate future events based on his experiences as a consequence of their own behaviour. That is a form of learning that humans share with others animals, including invertebrates. The use of rats and bees as biological models in behavioural studies have helped in understanding the molecular mechanisms involved in learning by operant conditioning. The aim of this study was to identify proteins related to the learning process through proteomic analysis of brains from "mandacaia" bee (Melipona quadrifasciata) and rat (Rattus norvegicus). In this study, conditions for separation of bee brain extracts by two-dimensional electrophoresis (2DE) were optimized. The profiles showing better protein spots resolution were obtained with the following conditions: 1,5% ampholytes concentration, 1% CHAPS and DTT replacement in the cathode during isoeletric focusing. Brain proteomes of bees trained by operant conditioning and control groups were compared by DIGE, but no difference in protein expression was observed so far. For rats, the first large-scale LC-MS/MS mapping of prefrontal cortex proteomes was achieved to our know ledge. A total of 923 proteins was identified, a value six times higher than other studies in the literature. The identified proteins were categorized according to their location and biological function. The subcellular localizations were 21% cytosol, 18% plasma membrane, 13% mitochondria, 10% nucleus, 8% cytoskeleton, 6% endoplasmic reticulum and Golgi complex, 3% extracellular proteins, 3% other organelles and 18% other intracellular proteins. Among the proteins identified in the prefrontal cortex, four of them can be highelihted as they are described in the literature as involved in learning processes: 2-contactin, calbindin, gamma subunit of protein kinase c (PKCgamma) and gp78.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. O complexo Coesina tem a função essencial de assegurar a correta segregação das cromátides irmãs após replicação do DNA. A Coesina atua tanto na mitose como na meiose e é mais bem descrita em leveduras e mamíferos. O complexo se forma pela interação das subunidades proteicas conhecidas como SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). Existem poucos estudos sobre a Coesina e sua função em tripanossomatídeos, sendo que foi verificada a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Em trabalhos recentes do nosso grupo, foi observado que a subunidade SCC1 do complexo Coesina em T. cruzi está presente nas formas amastigotas com localização nuclear, em menor quantidade em epimastigotas distribuída por toda a célula e ausente em tripomastigotas. Desse modo, essa diferença da presença da proteína TcSCC1 nas diferentes formas do parasita nos levou a estudar nesse trabalho a expressão gênica dessa proteína de T. cruzi e sua regulação. Inicialmente, foi realizada uma quantificação relativa do mRNA da proteína SCC1 nas diferentes formas do T. cruzi por RT-PCR em tempo real. As formas amastigotas e tripomastigotas apresentaram uma quantidade relativa semelhante entre si e equivalente à metade da quantidade das formas epimastigotas, o que diverge do observado para a presença da proteína. Assim, é possível que haja um mecanismo regulatório provavelmente pós-transcricional, já que é descrito que esse tipo de regulação é peça chave na modulação da expressão gênica em T. cruzi. Nos experimentos onde foi inibido a transcrição e a transcrição juntamente com a tradução nas formas epimastigotas e amastigotas, observamos uma estabilidade do mRNA da TcSCC1 mais longa em amastigotas e pouco afetada com a inibição da tradução. Essa observação pode explicar a causa da maior abundância da proteína nas formas amastigotas. Embora em epimastigotas o mRNA também seja relativamente estável, a quantidade relativa decresce mais acentuadamente, sugerindo uma meia vida mais curta em epimastigotas. É provável que a regulação pós-transcricional desse mRNA possa estar modulando a expressão do gene TcSCC1 entre as formas do T. cruzi e essa não é dependente da tradução. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT The cohesin complex has the essential function of ensuring the correct segregation of sister chromatids after DNA replication. The cohesin acts both in mitosis as in meiosis and is best described in yeast and mammals. The complex is formed by the interaction of protein subunits known as SMC (structural maintenance of chromosomes), SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (cohesion of sister chromatids), the SCC1 (also known as Mcd1 or Rad21) and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). There are few studies of the cohesin and its function in trypanosomatids, and it was detected the presence of genes for all subunits of cohesin in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In recent work from our group, we observed that the SCC1 subunit of cohesin complex in T. cruzi amastigotes is present with nuclear localization, in epimastigotes with a lesser amount distributed throughout the cell and absent in trypomastigotes. Thus, this difference of the presence of TcSCC1 protein in the different forms of the parasite led us to study in this work the gene expression of this T. cruzi protein and its regulation. Initially, we performed a relative quantification of TcSCC1 mRNA in the different forms of T. cruzi by real time RT-PCR. The amastigotes and trypomastigotes forms presented a relative similar amount among themselves and as equivalent to half the amount of the epimastigote forms, which differs of that observed for presence of the protein. Thus, there may be a possible post-transcriptional regulatory mechanism, since it is reported that this type of regulation is a key part in the modulation of T. cruzi gene expression. In experiments where transcription was inhibited and transcription along with translation in epimastigotes and amastigotes, we observed longer stability of TcSCC1 mRNA in amastigotes and is not affected by the inhibition of the translation. This observation may explain why the protein is more abundant in amastigotes. Although in epimastigotes the mRNA is also relatively stable, the relative amount decreases more markedly, suggesting shorter half life in epimastigotes. It is likely that post-transcriptional regulation of this mRNA may be modulating the TcSCC1gene expression between the forms of T. cruzi and that is not dependent on translation.

A atividade física e a gordura corporal modulam a lipemia, e esse efeito parece ser influenciado pelo polimorfismo do gene da apolipoproteina-E (APOE). Desse modo, a presente revisão tem como objetivo sintetizar os principais resultados de pesquisas que abarcaram a interação do gene APOE acerca do efeito da atividade física e gordura corporal sobre as concentrações de triglicerídeos, colesterol total e lipoproteína de baixa (LDL) e alta densidade (HDL). Os artigos foram buscados nas bases de dados Scientific Electronic Library Online - SciELO, Web of Science e PubMed. As palavras-chave utilizadas em combinação foram: genótipos APOE, polimorfismo da apoliproteína-E, exercício físico, atividade física, exercício aeróbio, gordura corporal e obesidade. Foram incluídos artigos originais realizados com seres humanos, e excluídos aqueles que envolveram amostras com doenças, exceto obesidade e/ou distúrbios lipêmicos. Os resultados sugerem que os portadores do alelo ε2 são os que mais se beneficiam dos efeitos da atividade física sobre a lipemia. Ademais, a gordura corporal parece agir de forma mais pronunciada sobre a elevação dos triglicerídeos e das LDLs nos portadores do alelo ε2 e ε4, respectivamente. Entretanto, inferências seguras ainda não podem ser feitas acerca da alteração do polimorfismo da APOE, no efeito da atividade física e da gordura corporal sobre a lipemia, haja vista o reduzido número de trabalhos e suas divergências. Assim, se fazem necessárias novas pesquisas que analisem outras populações e um maior número de voluntários por alelo, bem como outras modalidades e intensidades de exercício físico. Physical activity and body fat modify lipemia, and this effect seems to be influenced by apolipoprotein - E (APOE) gene polymorphism. Thus, the purpose of this article was to review main results of studies that have analyzed the relation of APOE gene with physical activity and body fat on triglycerides, total cholesterol and low (LDL) and high density lipoprotein (HDL) concentrations. The Scientific Electronic Library Online - SciELO, Web of Science and PubMed database were used to locate the articles. The keywords used in combination were: apoe genotype, apolipoprotein - E polymorphism, physical exercise, physical activity, aerobic exercise, body fat and obesity. Originals scientific investigations performed with humans were included, and excluded those ones which involved samples with diseases, except obesity and/or lipemic disorders. It was observed a trend, that ε2 allele carriers are the ones with the greater improvements on lipemia from physical exercise. In addition, the body fat impact on the elevation of triglycerides and LDL are stronger in carriers of the ε2 and ε4 allele, respectively. Considering the small number of originals scientific investigations and their divergent results, reliable inferences can not be made about the APOE gene polymorphism influences on physical activity and body fat effect on lipemia. Thus, further studies with others populations and more volunteers for allele, as well as others exercise modalities and intensities, are necessary.

Orientadora : Profa. Dra. Maria Berenice R. Steffens Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 15/02/2012 Bibliografia: 139-164 Resumo: Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma ?-proteobactéria capaz de colonizar de forma endofítica diversas plantas de interesse comercial, sugerindo o seu uso como um potencial biofertilizante. Este trabalho é apresentado em dois blocos que descrevem a caracterização de proteínas de H. seropedicae SmR1 envolvidas no metabolismo do polímero polihidroxibutirato (PHB) e na regulação pós-transcricional da expressão gênica, com o objetivo de explorar os mecanismos regulatórios destas proteínas do ponto de vista molecular e estrutural. O capítulo 1 descreve a caracterização das proteínas PhbF e PhaP1 envolvidas no metabolismo de PHB. A capacidade de produzir este poliéster alifático é um importante fator associado à sobrevivência no ambiente em condições de estresse e competitividade com outras bactérias. Este polímero é estocado no interior das células na forma de grânulos cobertos por uma camada de várias classes de proteínas que regulam desde a produção/degradação do polímero, passando por seu tamanho e chegando a transcrição. PhbF está relacionada com a regulação transcricional e PhaP1 ou fasina está envolvida na regulação da relação volume/superfície dos grânulos. Estas proteínas foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e purificadas com sucesso na forma fusionada a uma cauda de histidinas, utilizando o detergente TritonX-100. Experimentos de gel filtração revelaram PhbF como uma proteína tetramérica e PhaP1 como uma proteína pentamérica, ambas em solução. A proteína PhbF foi capaz de ligar-se a onze prováveis regiões promotoras de genes envolvidos com o metabolismo de PHB em H. seropedicae, confirmando a sua atividade de ligação ao DNA. A análise in silico destas regiões promotoras indicou a sequência consenso 5'-TG[N]TGC[N]3GCAA-3' que foi protegida da ação da DNaseI na região promotora de phbF. Esta proteína foi também capaz de ligar-se ao polímero PHB extraído de H. seropedicae assim como PhaP1. A fasina interagiu fortemente com o PHB e foi capaz de aderir a um filme deste polímero onde foram observadas várias estruturas proteicas individualizadas com dimensão lateral média de 177,8 ± 11,7 Å. Esta dimensão é compatível com a distância máxima de 200 Å calculada para PhaP1 em solução pelo método de SAXS. Esta técnica permitiu também acessar o envelope molecular das proteínas PhbF e PhaP1. Aspectos in vivo relacionados à correlação entre o metabolismo de PHB e a transcrição dos genesphbF e phaP1 foram abordados através de fusões transcricionais ao gene lacZ. PhbF foi capaz de reprimir a sua própria expressão e a do gene phaP1 em E. coli sem a interferência do polímero PHB. Em H. seropedicae, foi possível observar o acoplamento entre a expressão dos genes phbF e phaP1 ao metabolismo de PHB assim como a mobilidade da proteína PhbF entre as formas ligada ao DNA e ligada ao grânulo de PHB. O capítulo 2 descreve a caracterização da chaperona de RNA Hfq de H. seropedicae. Esta é uma proteína homohexamérica, identificada em E. coli como um fator do hospedeiro envolvido na replicação do bacteriófago Q? e como um importante regulador pós-transcricional de vários tipos de RNA afetando uma série de funções bacterianas. A estrutura da proteína Hfq foi determinada por cristalografia de raios-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A estrutura cristalográfica revelou uma topologia do tipo Sm conservada, composta por uma ?-hélice N-terminal seguida de cinco fitas ?, e uma nova interação intra-subunidades do tipo empilhamento ?-? entre dois resíduos de histidinas ausente em outras Hfqs com estrutura resolvida. Além disso, o envelope molecular calculado com base nos dados de SAXS concordou com a estrutura cristalográfica, sugerindo que a proteína tem a mesma Abstract: Herbaspirillum seropedicae SmR1 is an endophitic ?-proteobacterium able to colonize several economically important crops, suggesting its potential use as a biofertilizer. This work is presented in two blocks describing the characterization of proteins related to polyhydroxybutyrate (PHB) metabolism and post-transcriptional regulation in H. seropedicae with the aim to explore the protein regulatory mechanisms at molecular and structural points of view. The chapter 1 describes the characterization of PhbF and PhaP1 proteins related to PHB metabolism. The ability to produce this polyester is an important factor associated with survival under stress conditions and in competitive environments. This polymer is storaged intracellularly as granules wich are covered by several proteins involved in granule synthesis/degradation, size and transcription regulation. PhbF is a transcriptional regulatory protein and PhaP1 or phasin regulates the granule volume/surface ratio. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified using the detergent Triton-X100. The gel filtration assay described PhbF as a tetramer and PhaP1 as a pentamer in solution. PhbF was able to bind to eleven putative promoters of genes involved in PHA metabolism in H. seropedicae confirming its DNA binding property. In silico analysis indicated the consensus sequence 5'-TG[N]TGC[N]3GCAA-3' which was protected in DNA footprinting assay using phbF promoter region. This protein and PhaP1 were able to bind to PHB polymer extract from H. seropedicae. PhaP1 was also able to bind to PHB film as several structures with lateral dimension of 177.8 ± 11.7 Å compatible with Dmáx of 200 Å from SAXS mensurements. This approach also described the PhbF and PhaP1 molecular envelopes. In vivo aspects concern PHB metabolism and phbF/phaP1 transcription were approached by lacZ transcriptional fusions. PhbF was able to repress phaP1 expression as well as its own in E. coli. This system allowed the study of phbF and phaP1 without PHB metabolism interference. The H. seropedicae environment allowed to show that phbF and phaP1 expression are coupled to PHB metabolism and the PhbF mobility between DNA and PHB binding states. The chapter 2 describes the RNA chaperone Hfq from H. seropedicae. This protein is a homohexamer identified in E. coli as a host factor involved in phage Q? replication and also as an important post-transcriptional regulator of several types of RNA, affecting a plethora of bacterial functions. The Hfq protein structure was determined by X-ray crystallography and small angle X-ray scattering (SAXS). The crystal structure revealed a conserved Sm topology, composed of one N-terminal ?-helix followed by five twisted ?-strands, and a novel ?-? stacking intra-subunit interaction of two histidine residues, absent in other Hfq proteins. Moreover, the calculated envelope based on SAXS data agreed with the Hfq crystal structure, suggesting that the protein has the same folding structure in solution.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:57:17Z No. of bitstreams: 1 Barbara Silva do Vale_ME.pdf: 1259290 bytes, checksum: a509222ec7c5c806ea8551c4861d2c32 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbara Silva do Vale_ME.pdf: 1259290 bytes, checksum: a509222ec7c5c806ea8551c4861d2c32 (MD5) Previous issue date: 2010-09-21 It has been well described in the literature the errors inherent to the 24 hours urine collection in free-living individuals. Therefore, the assessment of protein intake in nondialyzed chronic kidney disease (CKD) patients by the urinary urea excretion in the 24 hour urine sample, may lead to important errors related to the method itself. In this regard, assessing surrogate methods is of high relevance. To evaluate the accuracy of the dietary methods to estimate the protein consumption in nondialyzed CKD patients and also to assess the agreement between a biomarker of protein intake and dietary methods. In addition, it was also evaluated the agreement between two dietary methods. One hundred and twenty-two nondialyzed CKD patients, who met the eligibility criteria, were included. All participants underwent to antropometric and laboratory assessments, and had the protein intake estimated by three methods: two methods of dietary intake and one dietary biomarker. The dietary intake comprised 4 days of food records (FRec) and 2 days of 24-hour food recall (24hFRecall). For the biomarker, it was evaluated the urinary urea nitrogen excretion in a 24 hours urine sample, which was used in the equation of the protein equivalent of nitrogen appearance (PNA). The software PC-Side was used to estimate the variability of the protein intake in the FRec and 24hFRecall. In addition, specific equations were used to assess the number of days needed to estimate the protein intake with high accuracy in the individual and collective level. In order to evaluate the agreement between the 3 methods, it was used the concordance correlation coefficient (CCC) and the Bland & Altman plot analysis (1986). In the collective level, 4 days FRec and the 2 days of 24hFRecall described the protein intake with an accuracy close the highest acceptable level, being of respectively 0.85 and 0.73. For the individual level, by accepting an intermediate tolerated error of 20% (accuracy 0.8), 6 days of FR and 5 days of 24hFR were needed for the assessment of protein intake. When assessing the agreement between the PNA and the FRec and 24hFRecall, it was observed reduced CCC (< 0.3). Likewise, when evaluating the individual differences obtained between the PNA and the FRec and 24hFRecall by the Bland & Altman plot analysis, it was observed a wide concordance limit, which is consistent with the low concordance observed between the methods. Moreover, higher values of CCC (> 0.4) were found between the FRec and 24hFRecall. The Bland & Altman plot analysis of these two methods showed more narrows differences, which is consistent with the higher CCC observed. However, this best agreement may be due to an overestimation between the methods. Furthermore, the reduced concordance observed between the PNA and the FRec and 24hFRecall does not mean that the dietary intake methods give biased or unrepresentative measurements of protein intake, nor was that the PNA gave unbiased measurements of protein intake. FRec and 24hFRecall can be used as surrogate methods for the PNA, as an alternative low cost and high applicability method in the clinical routine practice to describe the protein intake. As dificuldades associadas à coleta de urina de 24h e à baixa credibilidade do uso do biomarcador na prática clínica para estimar a ingestão de proteína de pacientes com doença renal crônica (DRC) na fase não-dialítica sinalizam para busca de alternativas acuradas e de ampla acessibilidade para a descrição do consumo de proteína nessa população. Avaliar a acurácia de métodos de inquérito dietético para estimar o consumo de proteína em pacientes de DRC na fase não dialítica e, a concordância desses com o biomarcador de ingestão protéica. Também foi avaliado a concordâncias entre o registro alimentar (RA) e recordatório alimentar de 24 horas (Rec24h). Cento e vinte e dois pacientes com DRC na fase não dialítica, que atenderam aos critérios de elegibilidade, foram submetidos à avaliação antropométrica, laboratorial e, tiveram a ingestão de proteína estimada por três métodos de avaliação do consumo alimentar, sendo estes dois métodos de inquérito dietético e um método de biomarcador. Os métodos de inquéritos alimentares compreenderam 4 dias de RA e 2 dias de Rec24h. Para o biomarcador foi avaliado a excreção de nitrogênio uréico em uma amostra de urina de 24 horas, o qual foi utilizado em equação do equivalente protéico do aparecimento do de nitrogênio uréico (PNA). Na análise estatística dos métodos de inquérito dietético, utilizou-se o PC-Side para estimar a variabilidade da ingestão de proteína, equações para estimar o número de dias necessários para estimativas acuradas da ingestão de proteína em avaliações no nível individual e coletivo. Para avaliar a concordância entre os três métodos de avaliação do consumo de proteína, utilizou-se o Concordance correlation coefficient (CCC) e o gráfico de Bland & Altman. Resultados: Os 4 dias de RA e 2 Rec24h descreveram com acurácia elevada a ingestão de proteína no nível coletivo, sendo respectivamente de 0,85 e 0,73. Para o nível individual, com erro tolerado intermediário de 20% (acurácia de 0,8), foram necessários 6 dias de RA e 5 de Rec24h para avaliação do consumo de proteína. Ao avaliar a concordância entre o PNA com o RA e Rec24h, observou-se CCC reduzido (< 0,3). Da mesma forma, ao avaliar a dispersão individual das diferenças obtidas entre o PNA e RA e Rec24h pelo gráfico de Bland & Altman, notou-se valores amplos de limite de concordância. Por outro lado, valores mais elevados de CCC (>0,4) foram encontrados entre o RA e o Rec24h. O gráfico de Bland & Altman desses dois métodos mostrou menor dispersão. Contudo, essa melhor concordância pode ser decorrente de superestimação da correspondência entre os métodos. Além disso, a concordância reduzida observada entre o PNA e o RA e Rec24h não permitiram afirmar que os métodos de inquéritos dietéticos ofereçam medidas irreais da ingestão de proteína, nem tampouco foi possível afirmar que a medida real é aquela sugerida pelo PNA. Em pacientes com DRC na fase não dialítica, orientada a seguir dieta hipoprotéica, o RA e Rec24h podem ser usados em substituição ao uso PNA como alternativas de baixo custo e de ampla acessibilidade à prática clínica para descrever a ingestão de proteína, desde que sejam definidos o nível da avaliação, o número ideal de dias e a acurácia desejada.

CNPq Este trabalho apresenta um algoritmo genético paralelo (AGP) para o problema de dobramento de proteínas, utilizando o modelo 3DHP-SC. Este modelo tem sido pouco abordado devido ao elevado grau de complexidade envolvido. Foi proposta uma função de fitness baseada na energia livre e na compacidade do dobramento. Operadores genéticos especiais foram desenvolvidos, além de estratégias para auxiliar o algoritmo no processo de busca de conformações de proteínas. Vários experimentos foram realizados para ajustar todos os parâmetros do sistema, incluindo os parâmetros básicos do AG (probabilidades de mutação e crossover, e o tamanho de torneio) e os parâmetros dos operadores especiais e das estratégias. O efeito da matriz de energias para o modelo no desempenho do algoritmo também foi estudado. Uma comparação com outra abordagem de computação evolucionária também foi realizada, a fim de verificar o desempenho do método proposto. Devido a não existir, até então, benchmarks para teste deste modelo, foi proposto um conjunto de 25 sequências baseado em outro modelo mais simplificado. Os resultados obtidos mostraram que o AGP alcançou um bom nível de eficiência e obteve dobramentos biologicamente coerentes, sugerindo a adequabilidade da metodologia proposta. This work presents a parallel genetic algorithm (PGA) for the protein folding problem, using the 3DHP-SC model. This model has been sparsely studied in the literature due to its complexity. A new fitness function was proposed, based on the free-energy and compacity of the folding. Special genetic operators were developed, besides strategies to aid the algorithm in the search of protein conformations. Many experiments were done to adjust all the parameters of the system, including the basic parameters of the GA (mutation and crossover probability, and tournament size) and parameters of the special genetic operators and strategies. The effect of the energy matrix of the model in the performance of the algorithm was also studied. Moreover, a comparison with other evolutionary computation approach was done, to verify the performance of the proposed method. Since there is no benchmark available to date, a set of 25 sequences was used, based on a simpler model. Results show that the PGA achieved a good level of efficiency and obtained biologically coherent results, suggesting its adequacy for the problem.