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Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade Ciências Biológicas e Biomédicas The pig industry will face new challenges due to the increase demand for pork, concerning the negative environmental impact and the low content in the beneficial n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) of pork. Microalgae exhibit a well-balanced nutritional composition, including in n-3 PUFA, and its production has a low environmental impact. Thus, microalgae could be a suitable alternative to traditional feedstuffs of pig industry. Arthrospira platensis and Chlorella vulgaris are the two most studied microalgae, also with the highest commercial expression. However, these microalgae are endowed by recalcitrant cell walls, which impairs the bioavailability of their compounds for pigs. In line with this, in the first part of this study, we developed a two-Carbohydrate-Active Enzyme (CAZYme) and a four-CAZYme mixtures with the ability to disrupt A. platensis and C. vulgaris cell walls, respectively. This process was performed via a high-throughput (HTP) approach, where the enzyme mixtures were selected from a 178 CAZymes and 22 sulfatases library, according to its ability to disrupt the microalgae cell wall, which was evaluated through the release of cell wall sugars, decrease of fluorescence intensity and the release of several microalgae compounds. We verified that this two CAZYme formulations are able to degrade these cell walls and may constitute a good approach to improve the bioavailability of these microalgae nutrients for pig diets. In the second part of this study, we assessed for the first time the effect of a high dietary incorporation level of the selected microalga (5% of C. vulgaris) supplemented or not with the respetive CAZYme mixture, the four-CAZYme mixture developed in the first part, and the commercially available Rovabio® Excel AP, on productive performance, meat quality and composition, health status and liver composition of finishing pigs. We observed that C. vulgaris diets had no effect on productive performance, meat quality traits and pork oxidative stability, but promoted an increase in pork carotenoids content and in n-3 PUFA composition of pork and liver. The action of the four-CAZYme mixture was preponderant for the decrease of blood lipemia. The C. vulgaris diets also promoted the decrease of plasma immunoglobulins content. It is concluded that the use of C. vulgaris in finishing pig diets, at this high incorporation level, improves the nutritional value of pork fat without compromising pig performance and health status of pigs, except the immunosuppressive effect promoted by the microalga, which deserves further investigation RESUMO - Melhoramento do valor nutricional das microalgas na alimentação de suínos através do uso de novas enzimas - Prevê-se que a suinicultura irá enfretar em breve novos desafios, como consequência do aumento da procura por carne de porco, devido ao impacto ambiental negativo que esta acarreta e ao baixo teor dos benéficos ácidos gordos polinsaturados (AGPI) n-3 na carne. As microalgas apresentam uma composição nutricional equilibrada, inclusive em AGPI n-3, e a sua produção tem baixo impacto ambiental. Assim, as microalgas podem ser uma alternativa adequada aos alimentos correntemente utilizados na suinicultura. Arthrospira platensis e Chlorella vulgaris são as duas microalgas mais estudadas e com maior expressão comercial. Contudo, estas apresentam paredes celulares recalcitrantes, diminuindo a biodisponibilidade dos seus nutrientes para os suínos. Portanto, na primeira parte deste estudo, desenvolvemos uma mistura de duas- “Carbohydrate-Active Enzymes” (CAZymes) e outra de quatro-CAZymes com capacidade de romper as paredes celulares da A. platensis e C. vulgaris, respetivamente. Este processo foi realizado através de uma metodologia de alto rendimento, onde as misturas enzimáticas foram selecionadas a partir de uma biblioteca de 178 CAZymes e 22 sulfatases, de acordo com sua aptidão para romper a parede celular das microalgas, avaliada através da libertação de açúcares da parede celular, diminuição da intensidade de fluorescência e libertação de compostos das microalgas. Verificamos que estas misturas de CAZYmes têm capacidade de romper as paredes celulares, podendo integrar uma metodologia para melhorar a biodisponibilidade dos nutrientes de microalgas em dietas de suínos. Na segunda parte deste estudo avaliamos pela primeira vez o efeito de um alto nível de incorporação na dieta de C. vulgaris (5%) suplementada ou não com duas misturas de CAZymes, a mistura de quatro CAZYmes desenvolvida na primeira parte e a mistura comercial Rovabio® Excel AP, na performance produtiva, qualidade e composição da carne, estado de saúde e composição do fígado de suínos em acabamento. Apuramos que as dietas com C. vulgaris não afetaram a performance produtiva, os parâmetros de qualidade da carne e a sua estabilidade oxidativa, mas promoveram um aumento no teor de carotenoides da carne e no teor de AGPI n-3 da carne e fígado. A mistura de quatro CAZymes foi fundamental para a diminuição da lipemia sanguínea. As dietas com C. vulgaris também promoveram a diminuição do conteúdo de imunoglobulinas plasmáticas. Conclui-se que a incorporação de um alto nível de C. vulgaris melhora o valor nutricional da gordura sem comprometer o desempenho produtivo e o estado de saúde dos suínos, excetuando o efeito imunossupressor promovido pela microalga, que necessita de mais investigação. N/A

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da incorporação da microalga Spirulina (Arthrospira platensis), com ou sem suplementação enzimática no desempenho produtivo de frangos e na composição em ácidos gordos, Vitamina E, carotenoides da carne. Neste estudo realizou-se um ensaio de crescimento onde 120 pintos do dia, machos, da estirpe Ross 308, foram distribuídos por 40 gaiolas e alimentados nos primeiros 21 dias com uma dieta de iniciação comum. Ao vigésimo primeiro dia as gaiolas foram aleatoriamente alocadas a um de quatro tratamentos em que a dieta controlo (CONT), à base de milho e bagaço de soja, foi adicionalmente suplementada com 15% Spirulina sem adição de enzimas (MA), com 15% Spirulina e 0.05% de Rovabio® (MAR) e com 15% Spirulina e 0.1% de lisozima (MAL). Os frangos foram abatidos ao 35º dia, e a coxa e o peito de um frango por gaiola foi utilizado para a análise de lípidos totais, ácidos gordos, vitamina E, carotenos, colesterol e oxidação lipídica pelo método do ácido tiobarbitúrico (TBA). Os resultados indicam que a inclusão de 15% de Spirulina suplementada com lisozima (MAL) durante os últimos 15 dias de vida dos frangos reduziu o crescimento em relação ao controlo e que a inclusão de Spirulina (MA) ou Spirulina com Rovabio® (MAR) apresentaram crescimentos intermédios entre o controlo e MAL. A inclusão de Spirulina nas dietas, com ou sem adição de enzimas, aumentou a proporção do somatório de ácidos gordos saturados (SFA), reduziu o somatório dos ácidos gordos polinsaturados da família ómega-3 (n-3 PUFA) e o teor de α- e -tocoferol na carne de peito e da coxa, afetando negativamente as razões de n-6/n-3 PUFA e de PUFA/SFA. O teor de carotenoides e de TBA não foram afetados pelos tratamentos. Concluindo, a incorporação de 15% de Spirulina, com ou sem adição de enzimas exógenas, na dieta de acabamento de frangos de carne não melhorou o desempenho produtivo e afetou negativamente a qualidade nutricional da carne. ABSTRACT - The objective of the present study was to evaluate the effect of incorporation of the Spirulina microalgae (Arthrospira platensis) with or without enzymatic supplementation on the productive performance of broilers and meat fatty acid composition, Vitamin E, and carotenoids. In this study, a growth assay was performed where 120 male chicks of the Ross 308 strain were distributed over 40 cages and fed in the first 21 days on a standard starter diet. On the twenty-first day, the cages were randomly assigned to one of the four treatments in which the control (CONT) diet based on corn and soybean meal was additionally supplemented with 15% Spirulina without addition of enzymes (MA), with 15% Spirulina and 0.05% Rovabio® (MAR), and with 15% Spirulina and 0.1% lysozyme (MAL). The broilers were slaughtered on the 35th day and the thigh and chest of a chicken per cage was used for the analysis of total lipids, fatty acids, vitamin E, carotenoids, cholesterol and lipid oxidation. The results indicate that the inclusion of 15% Spirulina supplemented with lysozyme (MAL) during the last 15 days of broiler life reduced growth over control and that the inclusion of Spirulina (MA) or Spirulina with Rovabio® (MAR) showed intermediate growths between the Control and MAL. The inclusion of Spirulina in diets, such as or without addition of enzymes, increased the proportion of saturated fatty acids (SFA), reduced the sum of the polyunsaturated fatty acids of the omega-3 family (n-3 PUFA) and the α and γ-tocopherol contents in meat breast and thigh, negatively affecting the n-6 / n-3 PUFA and PUFA / SFA ratios. The carotenoid contents and TBA values were not affected by the dietary treatments. In conclusion, the incorporation of 15% Spirulina, with or without the addition of exogenous enzymes, in the broiler finishing diet did not improve the productive performance and negatively affected the nutritional quality of meat. N/A

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade de Segurança Alimentar Nos tempos que correm estamos cada vez menos disponíveis para a preparação de uma refeição, não existindo, na maioria das vezes, a preocupação de como a processamos e as alterações ocorridas em termos de composição nutricional. Tal como é sabido desde há longa data, a carência de determinados nutrientes pode conduzir a graves problemas de saúde, sendo deste modo imprescíndivel o conhecimento dos fatores que contribuem para minimizar a perda de nutrientes dos alimentos. Considerando que a maioria dos alimentos de origem animal antes de serem consumidos são submetidos a um método de confeção, utilizando-se uma fonte de calor, considerou-se importante avaliar a forma como três métodos de confeção de uso vulgar a nível doméstico (forno micro-ondas, água fervente e grelhagem) poderiam influenciar a composição nutricional das carnes de vitela Barrosã e de novilho Mertolengo (Denominação de Origem Protegida). Assim, no presente estudo, verificou-se que a aplicação dos vários métodos de confeção estudados altera a composição nutricional da carne, não sendo possível identificar no global qual o método de confeção que minimiza as perdas de nutrientes. De acordo com os dados obtidos, verificou-se que em ambas as carnes, os nutrientes que apresentam retenções mais elevadas são as proteínas totais, os aminoácidos, os lípidos totais, os isómeros conjugados do ácido linoleico, o colesterol total, o ferro, o magnésio e o zinco. Em contrapartida, os nutrientes da carne que são mais afetados pela ação dos métodos de confeção são a humidade, os ácidos gordos polinsaturados, o potássio e o α-tocoferol. Por conseguinte, verificou-se que a retenção dos nutrientes da carne varia em função do método de confeção aplicado. Observou-se também um efeito significativo do músculo em alguns dos nutrientes determinados em ambas as carnes estudadas. Os métodos de confeção afetaram negativamente a qualidade nutricional dos lípidos, uma vez que em ambas as carnes se verificou um aumento do índice de aterogenicidade e uma diminuição dos índices hipocolesterolémico/hipercolesterolémico e ácidos gordos polinsaturados/ácidos gordos saturados, comparativamente ao teor obtido na carne crua. ABSTRACT - The effect of different cooking methods on the nutritional value of veal - experimental study on Barrosã and Mertolenga-PDO - Nowadays we often feel short of time when it comes to the preparation of a meal, and most of the time give no consideration as how we process it and the modifications which occur in terms of nutritional composition. It has been known for a long time that the lack of certain nutrients can lead to serious health problems; therefore it is fundamental to acknowledge the factors that contribute to minimizing the loss of food nutrients. Whereas most food of animal origin is subjected to a cooking method using a heat source before consumption, it was considered important to assess how three common household cooking methods (microwave, boiling and grilling) could influence the nutritional composition of Barrosã and Mertolengo veal (Protected Designation of Origin). Thus, in the present study, it was found that the application of the various cooking methods studied modifies the nutritional composition of the meat, without it being possible to identify globally which cooking method minimizes the loss of nutrients. According to the data obtained, it was established that in both meats, nutrients that showed higher retentions are total proteins, amino acids, total lipids, the conjugated isomers of linoleic acid, total cholesterol, iron, magnesium and zinc. In contrast, the meat nutrients that are most affected by the action of cooking methods are moisture, polyunsaturated fatty acids, potassium and α-tocopherol. The results established that the retention of meat nutrients varies depending on the confection method applied. A significant effect of muscle in certain nutrients in both meats studied was also observed. The cooking methods adversely affected the nutritional quality of lipids, since in both meats there was an increase in the atherogenicity index and a decrease in hypocholesterolemic / hypercholesterolemic ratios and polyunsaturated/saturated fatty acids ratios when compared to the level obtained in raw meat.

Mestrado em Engenharia Alimentar - Instituto Superior de Agronomia This study evaluates the nutritional effect of using the tomato pomace associated with two types of fat in food intake and biochemical parameters of pigs as well as in the color, cholesterol, vitamin E, lycopene, β-carotene, fatty acid profile and lipid oxidation of meat. 40 pigs were used across four dietary treatments with different fiber and fat sources: wheat bran or tomato pomace and lard or soybean oil in a factorial 2x2. Tomato pomace supplementation didn’t significantly improve the color content of fatty acids, cholesterol and lipid oxidation and didn’t allow the incorporation of lycopene and β-carotene in meat. However, an increased content of α-tocopherol in muscle, liver and blood plasma and food intake in ad libitum phase of pigs. The type of fat influenced the fatty acid profile which soybean oil increased MUFA and PUFA and decreases the SFA. In sum, it was not possible to prove the effectiveness of the addition of 5% tomato pomace on nutritional parameters of pork meat. But there was a nutritional improvement on the lipids meat with soybean oil comparing to the lard.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Produção Animal During the finishing phase, bovines deposit large amounts of subcutaneous and visceral fats resulting in production inefficiencies affecting, in particular, meat quality. Intramuscular fat composition of ruminant meats influences the quality of the final product, which explains the importance of assessing meat fatty acid profile using different breeds and feeding strategies. On the other hand, both genetic background and finishing system may alter fat deposition, indicating their influence on adipogenic and lipogenic factors. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying fat deposition and fatty acid composition in beef cattle are not fully understood. The present study aimed to assess the effect of breed and diet on carcass composition, the cellularity of two fat depots (subcutaneous and mesenteric adipose tissues) and their implications on the fatty acid profile and the expression levels of adipogenic and lipogenic key factors and enzymes. Forty bulls from two genetically diverse Portuguese bovine breeds, Alentejana and Barrosã, were selected. The animals were fed isoenergetic and isonitrogenous diets, which were either low or high in silage percentage, until 18 months of age. Under these experimental conditions, it was shown that the genetic background is a major determinant of carcass composition and meat quality, and that the dietary differences studied had a limited effect on carcass composition. Data revealed that the subcutaneous adipose tissue has larger adipocytes than the mesenteric adipose tissue. Overall, the results showed that the fat depots’ fatty acid composition is mostly dependent on the genetic background. Dietary silage level impacted on muscle lipid metabolism to a greater extent than on that of subcutaneous adipose tissue, as evaluated by levels of gene expression of adipogenic and lipogenic factors. Moreover, hepatic desaturation and elongation of polyunsaturated fatty acids was shown to be influenced by diet composition, possibly through the expression of genes encoding for enzymes associated with desaturation/elongation pathways. In sum, these findings highlight the importance of taking into account the genetic background while devising feeding strategies to manipulate the fatty acid composition of beef cattle tissues. RESUMO - Regulação genética e metabólica da deposição de ácidos gordos em raças bovinas autóctones com fundo genético distinto - Durante a fase de acabamento, os bovinos depositam quantidades apreciáveis de gordura subcutânea e visceral, o que prejudica o desempenho produtivo e tem um impacto significativo na qualidade da carne. A composição da gordura intramuscular das carnes de ruminantes influencia a qualidade do produto final, o que explica aimportância de determinar o perfil em ácidos gordos da carne usando diferentes raças e estratégias alimentares. Por outro lado, os ácidos gordos provenientes da dieta, para além de serem biohidrogenados no rúmen, são metabolizados em vários tecidos envolvidos no metabolism lipídico, nomeadamente o tecido hepático. Deste modo, tanto o fundo genético como o sistema de acabamento podem alterar a deposição lipídica, sugerindo assim a sua influência sobre os factores adipogénicos e lipogénicos. O presente estudo visou determinar o efeito da raça e da dieta na composição da carcaça, na celularidade de dois depósitos de tecido adiposo (subcutâneo e mesentérico), bem como as suas implicações no perfil de ácidos gordos e nos níveis de expressão génica de fatores de transcrição e enzimas do metabolismo lipídico. Foram usados quarenta bovinos de duas raças bovinas Portuguesas, a Alentejana e a Barrosã. Os animais foram alimentados com dietas isoenergéticas e isoproteicas, com baixa ou elevada proporção de silagem, até aos 18 meses de idade. Os resultados aqui apresentados sugerem que a raça é o principal determinante da composição da carcaça e qualidade da carne. A localização do depósito de tecido adiposo determinou a area e número dos adipócitos, sendo que no tecido adiposo subcutâneo os adipócitos apresentavam uma área total superior à do tecido adiposo mesentérico. De um modo geral, os resultados demonstram que a composição em ácidos gordos dos depósitos adiposos depende maioritariamente da raça. No entanto, o nível de silagem da dieta teve maior influência no metabolismo lipídico do músculo que no do tecido adiposo subcutâneo, de acordo com os níveis de expressão de genes adipogénicos e lipogénicos. Verifica-se ainda que a dieta influencia a dessaturação e elongação dos ácidos gordos polinsaturados a nível hepático, possivelmente através da expressão de genes que codificam para enzimas associadas a vias de dessaturação/elongação. Estes aspectos salientam que a raça é um factor a ter em conta ao delinear estratégias nutricionais para manipular a partição de tecido adiposo e que têm por base a dieta.

Dissertação de Mestrado em Engenharia Zootécnica/Produção Animal Atualmente, a carne de bovinos tem recebido particular atenção decorrente da sua gordura apresentar uma composição rica em ácidos gordos saturados e trans e ser pobre em gorduras polinsaturadas, tendo sido identificada como fator de risco de várias doenças importantes tais como doenças vasculares, obesidade, diabetes tipo 2 e inúmeros cancros. De modo a atender às recomendações nutricionais que recomendam limites para a ingestão de ácidos gordos saturados e trans tem-se procurado desenvolver estratégias produtivas para melhorar a composição de ácidos gordos (AG) na carne. O objetivo deste trabalho consiste em explorar a possibilidade de prever AG da carne através dos AG dos eritrócitos, abrindo assim perspetivas para monitorização ante-mortem das estratégias nutricionais que visam melhorar o valor nutricional da fração lipídica da carne. As estratégias de produção e controlo de qualidade destes produtos ganharia muito com o desenvolvimento de métodos não invasivos de previsão ante-mortem da composição em AG da carne como o CLA e 18:1 trans-11, 18:3 n-3 e total de n-3 PUFA. Os resultados demonstram o potencial de prever a composição de alguns ácidos gordos da carne, como o CLA 18:1 trans-11, 18:3 n-3 e total de n-3 PUFA, a partir da informação dos ácidos gordos dos eritrócitos. Verificamos que a inclusão da informação detalhada dos isómeros de CLA obtida por HPLC melhora substancialmente as equações de regressão linear múltipla obtidas na previsão da composição do perfil de AG do músculo. ABSTRACT - UTILITY OF THE FATTY ACID OF ERYTHROCYTES AS BIOMARKERS MUSCLE FATTY ACID COMPOSITION IN BEEF - Beef is getting increasing negative attention due its high content on saturated fatty acids (SFA) and trans fatty acids (TFA) and its low content of polyunsaturated fat. were identified as a possible cause of many types of important diseases. Actual human nutritional recommendations establish a limit to saturated fatty acids and trans fatty acids intake. Thus, animal production studies are being developed to try to find production strategies to improve meat’s fatty acids profile. The main goal of the present work is to explore the possibility of forecasting meat’s fatty acids compositions based on fatty acid composition of erythrocytes, enabling ante-mortem monitorisation of target production objectives. Blood and meat samples of 40 male young bull were used to study the fatty acid profile of erythrocytes and muscle lipid fractions. Fatty acids were analysed by gas chromatography and liquid chromatography. Multiple regressions analysis were used to explore the prediction potential of this approach. The results showed that it is possible to forecast some fatty acids composition, such as CLA, 18:1 trans-11, 18:3 n-3 and total de n-3 PUFA, from the information gathered from fatty acids of erythrocytes, particularly when detailed information about the CLA isomeric profile in erythrocytes were used.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on earth, providing an extraordinary supply of energy for various microorganisms. The energetic constrains posed by anaerobic ecosystems lead to the evolution of highly efficient multi-enzymatic complexes, termed cellulosomes, which orchestrate the deconstruction of structural carbohydrates. Clostridium thermocellum cellulosome has been extensively studied as the bacterium exhibits one of the highest growth rates on cellulose. Cellulosomes are assembled by a large non-catalytic multi-modular scaffoldin which contains repeated type I cohesins. Type I dockerin modules, usually located at the C-terminus of enzymes, bind tenaciously to type I cohesins. Scaffoldins may contain a type II dockerin which specifically recognizes type II cohesins located at the cell envelope, allowing the cell surface attachment of cellulosomes. Here a combination of methodologies was applied to study the structure and function relationships of novel cellulosomal enzymes and cohesin-dockerin complexes. Innovative molecular biology and biochemical protocols that can be applied to crystallize and solve the structure of cohesin-dockerin complexes are described in chapter 2. In addition, the crystal structures of two novel type I cohesin-dockerin complexes (CtCohOlpC-Doc124A and CtCohOlpA-Doc918) are described here. They revealed that the two dockerins are unusual since they lack the structural symmetry that supports the dual binding mode typical of type I modules. Thus, these dockerins present a single binding mode and seem to bind preferentially to cohesins located at the bacterium cell surface and not to cellulosomes (chapter 3). Doc124A is the dockerin of CtCel124A, an endoacting cellulase with a superhelical fold that acts in synergy with the major cellulosomal exo-cellulase, Cel48S, during cellulose hydrolysis. The crystal structure of CtCel124A in complex with two cellotriose molecules suggests that the enzyme may target the interface between crystalline and amorphous cellulose (chapter 5). In addition, the structure of a novel type II cohesin-dockerin complex (CtCohScaC2-XDocCipB) was solved. The functional importance of specific dockerin residues was determined. Type II dockerins are suggested to present two different cohesin-binding faces that express different specificities (chapter 4). Finally, the crystal structure of a penta-modular cellulosomal protein (CtXyl5A), previously of unknown function, was assessed (chapter 6). This protein is one of the largest cellulosomal components and comprises a GH5, two CBMs from families 6 and 13, a fibronectin type III-like module, a CBM from family 62 and a type I dockerin. CtGH5 has a canonical (α/β)8-barrel fold and displays specificity for arabinoxylans and as such, is defined as an arabinoxylanase. CtCBM6 adopts a β-sandwich fold and displays affinity for the reaction products generated by CtGH5 and for undecorated xylooligosaccharides. In addition, the penta-modular structure revealed a great flexibility for the CtCBM62 domain. RESUMO - Estrutura e função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina - A parede celular vegetal constitui uma das principais fontes de carbono do planeta, sendo por isso um extraordinário recurso energético para muitos microrganismos. As limitações energéticas características dos ecossistemas anaeróbios conduziram à evolução de complexos multi-enzimáticos de elevada eficiência, denominados celulossomas, os quais coordenam a degradação dos hidratos de carbono da parede celular vegetal. O Clostridium thermocellum produz um celulossoma relativamente bem caracterizado já que a bactéria apresenta uma das maiores taxas de crescimento em celulose. A organização do celulossoma é efectuada por uma proteína não-catalítica multi-modular. Esta proteína de integração possui uma série de módulos repetidos, denominadas coesinas do tipo I. Na extremidade C-terminal das enzimas celulosomais existem módulos doquerina do tipo I, os quais se ligam fortemente às coesinas do tipo I. As proteínas de integração celulossomal podem conter ainda uma doquerina do tipo II que reconhece especificamente coesinas do tipo II localizadas no envelope celular permitindo, assim, a fixação dos celulossomas à superfície da bactéria. No presente trabalho foram desenvolvidas várias metodologias inovadoras com o intuito de determinar a estrutura e a função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina. Os protocolos de biologia molecular e bioquímicos aqui descritos (capítulo 2) permitem ultrapassar as dificuldades inerentes à cristalização e, por conseguinte, à resolução da estrutura de complexos coesina-doquerina. Com base nestas metodologias, foram elucidadas as estruturas tridimensionais de dois novos complexos coesina-doquerina do tipo I (CtCohOlpCDoc124A e CtCohOlpA-Doc918). A análise destas estruturas revelou que as suas doquerinas são atípicas, uma vez que não possuem a simetria estrutural característica dos módulos doquerina do tipo I que lhes confere um modo de ligação duplo. Com efeito, estas novas doquerinas apresentam um modo de ligação simples e parecem ligar-se preferencialmente a coesinas localizadas na superfície da bactéria (capítulo 3). A Doc124A é a doquerina da CtCel124A, uma endo-celulase que possui um enrolamento super-helicoidal e que atua em sinergia com a principal exo-celulase celulossomal, a Cel48S, na hidrólise da celulose. A estrutura tridimensional da CtCel124A em complexo com duas moléculas de celotriose sugere que a enzima pode ter como substrato alvo a interface entre as formas cristalina e amorfa da celulose (capítulo 5). Para além da elucidação destas estruturas, foi também resolvida a estrutura de um novo complexo coesina-doquerina do tipo II (CtCohScaC2-XDocCipB). Os resultados sugerem que as doquerinas do tipo II apresentam duas interfaces de ligação a coesinas que expressam diferentes especificidades (capítulo 4). Por último, é apresentada a estrutura tridimensional de uma proteína celulossomal penta-modular (CtXyl5A) e é elucidada a sua função (capítulo 6). Esta proteína é um dos componentes celulossomais de maiores dimensões e compreende uma GH5, dois módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) das famílias 6 e 13, um módulo de fibronectina do tipo III, um CBM da família 62 e ainda uma doquerina do tipo I. A GH5 apresenta um enrolamento canónico em barril (α/β)8 e possui especificidade para os arabinoxilanos, tendo sido por isso definida como uma arabinoxilanase. O CBM6 apresenta um enrolamento em β-sanduiche e possui afinidade para os produtos de reação gerados pela GH5 e para xilo-oligossacáridos nãodecorados. A estrutura penta-modular desta proteína revelou uma grande flexibilidade no domínio CBM62.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade de Segurança Alimentar The aim of this study was to determine the influence of slaughter season and muscle type on nutritional quality of intramuscular fat (IMF) in Mirandesa-PDO (Protected Designation of Origin) veal, Charneca-PDO beef and organic beef, assessing to the quality and status that may contribute to market differentiation. The results suggest that the IMF content of PDO veal, PDO beef and organic beef was slightly affected by the slaughter season but markedly changed by the muscle type. The meat analysed had a high nutritional value, with favourable ratios of n-6/n-3 and contents of n-3 PUFA and α-tocopherol. Some studies indicate that increasing the stearoyl-CoA desaturase (SCD) expression and activity may significantly improve the nutritional quality of meat by decreasing the SFA content, while increasing rumenic acid content. This can be achieved by the administration of gluconeogenesis precursors, such as propylene glycol, which induces elevated propionate in the rumen and higher levels of blood insulin and glucose, resulting in the SCD activity elevation. Thus, the influence of dietary gluconeogenesis precursors (propylene glycol and calcium propionate mix; PP) and linseed oil on intramuscular fatty acid composition of lambs was assessed. Results suggest that gluconeogenesis precursors modify the biohydrogenation pathway and reduce the rumenic acid concentration. Linseed oil supplementation increased meat concentration of α-linolenic acid, as well as most of the C18 biohydrogenation intermediates, including vaccenic acid and rumenic acids. In conclusion, regarding the lipid composition of IMF, the studied PDO and organic meats have a high nutritional value, contributing to the consumer`s confidence on these products. The fatty acid profile of lamb’s IMF was slightly affected by PP, without clear effects on insulinaemia and delta-9 desaturation, demanding future research on this subject. RESUMO - Influência da sazonalidade, do tipo de músculo e de precursores da neoglucogénese na qualidade da gordura intramuscular de carne de ruminantes - Neste trabalho estudou-se o efeito da sazonalidade do abate e do tipo de músculo na qualidade da gordura intramuscular das carnes Mirandesa-DOP (Denominação de Origem Protegida) e Charneca-DOP, e da carne biológica, de modo a avaliar a qualidade e reputação alegada como fator diferenciador no mercado. Os resultados sugerem que a composição de ácidos gordos da gordura intramuscular das carnes analisadas foi influenciada ligeiramente pela sazonalidade do abate mas fortemente pelo tipo de músculo. Apesar desta variação, todas as carnes analisadas têm um elevado valor nutricional apresentando um índice favorável n-6/n-3 e teores elevados de n-3 PUFA e α-tocoferol. Alguns estudos indicam que o aumento da atividade da Δ-9 dessaturase pode melhorar a qualidade nutricional da carne, através da diminuição dos ácidos gordos saturados e do aumento do teor de ácido ruménico. Isto pode ser possível pela administração de precursores neoglucogénicos, tais como o propilenoglicol que induz o aumento do propionato no rúmen e aumenta os níveis sanguíneos de insulina e glucose, resultando no aumento da atividade da Δ-9 dessaturase. Assim foi avaliado o efeito da suplementação da dieta com propilenoglicol e propionato de cálcio, bem como óleo de linho, na composição lipídica da gordura intramuscular da carne de borrego. Os resultados sugerem que os precursores neoglucogénicos alteram a biohidrogenação ruminal e diminui o teor de ácido ruménico. A suplementação com óleo de linho aumenta o teor de ácido α-linolénico da carne, bem como a maioria dos C18 intermediários da biohidrogenação, incluindo os ácidos vacénico e ruménico. Em conclusão, a composição lipídica da gordura intramuscular das carnes de bovino DOP estudadas e da carne biológica apresenta um elevado valor nutricional, contribuindo para confiança do consumidor sobre estes produtos O perfil dos ácidos gordos da gordura intramuscular da carne de borrego é ligeiramente influenciado pelos precursores, sem efeitos claros na insulinemia e na Δ-9 dessaturase, exigindo-se estudos futuros sobre este assunto. FCT - SFRH/PROTEC/2009/50138 and Co-financed by the grant PTDV/CVT/2006/66114

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Produção Animal Beef is a nutritionally rich product with a high economic value. However in the last decades beef has been target of negative publicity by the media, mainly due to the high content of cholesterol as well as saturated and trans fatty acids (FA). The increasing number of food scares across the Europe over the last years has increased even more consumers’ concerns about beef quality and safety. Despite the health concerns beef sensory properties still remain the main purchasing and repeat purchasing criteria for the consumers. Tenderness has been considered the major palatability characteristic of beef and defines its commercial value. However, tenderness variability has been considered a major problem to the beef industry. In this context, the aim of this proposal was to ascertain the organoleptic properties and lipid nutritional value of beef and to relate them with the Portuguese consumer` preferences. The experimental work was divided in two trials. In the first trial, the meat quality and lipid nutritional value from “Vitela Tradicional do Montado”-PGI veal, Mertolenga-PDO veal and Mertolenga-PDO beef were studied. The results suggested that the three products are not very different, but the two veal types are more alike, which means that age had a more powerful effect than the crossbred or gender. Nevertheless, despite the similarity in FA profile and of the production systems of the animals sampled, it was possible to discriminate the meat types. Moreover, the PGI veal seems to have higher variability than the other two meat types studied. In the second trial, three beef types from the Portuguese market place, Carnalentejana-PDO, imported from Brazil and national undifferentiated beef, were studied and compared to characterise nutritional value and variability of beef lipids as well as the organoleptic properties and their variability. We also intended to relate the sensory attributes with instrumental measurements in order to realise if it is possible to predict sensory evaluation through instrumental measurements. Brazilian beef had the highest lipid nutritional value and lipid stability as this beef presented higher contents of α-tocopherol, β-carotene, CLA and PUFA. The data indicated that all beef types seem to have α-tocopherol values high enough to inhibit lipid oxidation and discoloration. Energy intake was calculated for the main FA and compared with the recommended daily intake. All beef types seem to have low cholesterol and SFA contents. Concerning the relation between the sensory attributes and the instrumental measurement, sensory tenderness was correlated with WBSF but not with TPA hardness. Nevertheless, TPA chewiness was well correlated with sensory tenderness indicating TPA usefulness to give addicional information of beef texture. Off-flavour was the ix main determinant of overall acceptability and Brazilian beef presented the highest and lowest values, respectively. Brazilian beef also had the lowest juiciness score, indicating that this beef type despite having the best lipid nutritional value can be rejected due to it sensory attributes. All beef types were considered slightly to moderately tender regarding WBSF and sensory tenderness mean values. National undifferentiated beef seem to have higher variability in the colour measurements, whilst Carnalentejana-PDO seems to depicted higher tenderness variability. Despite having mean values in the aforementioned attributes that indicates a consumer high acceptability, the high variability in both cases can be detrimental in the moment of sale. RESUMO - Relação entre as preferências do consumidor português e a textura, composição química e valor nutricional da carne de bovino - A carne bovina é um produto nutricionalmente rico e de elevado valor económico. No entanto, nos últimos anos tem sido alvo de publicidade negativa por parte da comunicação social devido ao seu conteúdo em colesterol e em ácidos gordos saturados e trans. O crescente número de surtos alimentares na Europa aumentou a preocupação dos consumidores quanto à segurança e qualidade alimentar. No entanto, apesar das referidas preocupações, os atributos sensoriais ainda permanecem a principal razão que leva os consumidores a comprar e a repetir a compra de carne de bovino. A tenrura tem sido considerada o atributo mais importante da carne bovina e define o seu valor comercial, mas a sua variabilidade tem representado um problema para a indústria. Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi determinar as propriedades organolépticas e o valor nutricional da fracção lipídica da carne bovina e relacioná-las com as preferências dos consumidores. O trabalho experimental consistiu em dois ensaios. No primeiro ensaio foram estudados a qualidade organoléptica e o valor nutricional da fracção lipídica da carne de vitela “Vitela Tradicional do Montado”-IGP e Mertolenga-DOP e do novilho Mertolenga-DOP. Os resultados sugerem que as duas vitelas têm composições similares, o que pode significar que o efeito da idade foi maior do que o efeito da raça ou género. Apesar das semelhanças do sistema de produção e no perfil lipídico as três carnes foram bem discriminadas. No segundo ensaio foram estudados a qualidade organoléptica e o valor nutricional dos lípidos das carnes de bovino Carnalentejana-DOP, importada do Brasil e nacional indiferenciada. Também aqui se pretendeu prever a qualidade sensorial das carnes com base nas medições instrumentais. Todos os tipos de carne apresentaram baixo teor em colesterol, e teor em α-tocoferol suficiente para inibir a oxidação lipídica e a descoloração. A carne Brasileira apresentou o melhor valor nutricional do perfil lipídico e potencial anti-oxidante, visto ter apresentado conteúdos superiores em α-tocoferol, β-caroteno, CLA e ácidos gordos poliinsaturados. A ingestão de energia foi calculada para os ácidos gordos mais importantes e comparada com as recomendações de ingestão diárias. Todos os tipos de carne apresentaram baixo conteúdo em colesterol e ácidos gordos saturados. Os atributos sensoriais apresentaram correlações baixas com os parâmetros instrumentais, e apenas a força de corte se correlacionou com a tenrura sensorial. No entanto, a tenrura sensorial correlacionou-se com a mastigabilidade indicando que o TPA pode ser útil, dando informação adicional sobre a textura da carne. O off-flavour foi o principal determinante da xi aceitabilidade da carne, apresentando a carne Brasileira os valores mais e menos elevados, respectivamente. A carne Brasileira foi também a menos suculenta, indicando que apesar de apresentar o melhor valor lipídico pode, no entanto, ser rejeitada pelas suas características sensoriais. Todas as carnes foram consideradas ligeira a moderadamente tenras, tendo em conta os seus valores de força de corte e de tenrura sensorial avaliada pelo painel de provadores. As carnes nacionais apresentaram heterogeneidade da sua composição química, a Carnalentejana-DOP na tenrura e a nacional indiferenciada na cor, o que é indesejável e pode condicionar a sua comercialização, pelo que este aspecto deve ser melhorado.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas. The importance of carbohydrate-binding modules (CBMs) and the use of novel enzymes with specific catalytic activities to improve the nutritive value of barley based diets for broilers and the effectiveness of a lipidic supplementation to improve the levels of benefic fatty acids in broilers meat remain to be investigated. In this work we studied the importance of a β-glucan binding domain (CBM11) when appended to three different enzymes (GH26GH5 and GH16, belonging to Clostridium thermocellum, and GH5, belonging to Celvibrio mixtus) to improve the nutritional quality of barley-based diets for broilers. In addition, the crystal structure and biochemical properties of a family 42 carbohydrate binding module (CBM) from Clostridium thermocellum, termed CtCBM42A, were investigated. Data presented here revealed that CBM11 has an important target effect in directing the appended catalytic modules to their target substrates, resulting in an improvement in broiler performance. However, this effect seems to be dependent on the level of supplementation. In addition, barley composition, namely its endogenous β-glucanase activity, influences the response to enzyme supplementation. Thus, exogenous enzymes were shown to be ineffective when used to supplement barleys expressing high endogenous β- glucanase activity. CtCBM42A revealed to be a type C CBM with three subdomains (α, β and γ), with affinity for arabinoxylan (arabinose side chains) and arabinan. The γ subdomain seems to dominate ligand recognition for arabinoxylan while the β and γ subdomains cooperate in arabinan recognition. Thus, CtCBM42A is potentially a good candidate for strategies aimed at improving the nutritive value of wheat-based diets for broilers. In order to improve the fatty acid profile of poultry meat, two different lipidic sources, extruded linseed and a subproduct of a marine alga (DHA goldTM), were used to supplement broiler diets. This experiment allowed the evaluation of the metabolic rates of the biosynthetic pathway of long-chain ómega 3 polyunsaturated fatty acids (LC n-3 PUFA).The supplementation of broiler diets with DHA goldTM and extruded linseed showed that conversion of linolenic acid in LC n-3 PUFA is not effective and, consequently, direct supplementation with LC n-3 PUFA seems to be the best option to enrich and improve LC n-3 PUFA in broilers meat. However, higher incorporation dosages of DHA goldTM could affect meat quality. RESUMO - Efeito da suplementação enzimática e lipídica de dietas para frangos no desempenho produtivo e na qualidade da carne - Uma melhor adequação da qualidade dos produtos animais, em concreto da carne de frango, às necessidades nutricionais dos consumidores, associada a uma maior eficiência de transformação dos alimentos para animais em produtos edíveis, são aspectos da maior importância prática na avicultura moderna e suscitam uma análise científica detalhada. Neste trabalho estudou-se a aplicação de um módulo de ligação ao β-glucano (CBM11), acoplado a três enzimas diferentes (GH26GH5 e GH16, ambas pertencentes ao Clostridium thermocellum, e a GH5, pertencente ao Celvibrio mixtus) na melhoria do valor nutritivo de dietas à base de cevada para frangos de carne. Foram também determinadas as propriedades bioquímicas e a estrutura cristalográfica do CBM da família 42 do Clostridium thermocellum, CtCBM42A. Os resultados demonstraram que o CBM11 tem um efeito importante no direccionamento do módulo catalítico das enzimas ao substrato, que resulta num aumento da performance zootécnica dos frangos de carne. No entanto, esse efeito parece estar dependente da dose enzimática aplicada. Demonstrou-se também que a composição das cevadas, principalmente a actividade endo-β-glucanásica, influencia o efeito da suplementação enzimática. Em cevadas com actividade endo-β-glucanásica alta a suplementação enzimática tem um efeito redundante não se obtendo melhoria da performance dos frangos de carne. O estudo do CBM42 revelou que se trata dum CBM do tipo C, com três subdomínios (α, β e γ), com afinidade para o arabinoxilano (nas suas cadeias laterais de arabinose) e arabinano. O subdomínio γ parece ser o responsável pela afinidade ao arabinoxilano enquanto o subdomínio β juntamente com o γ parecem interagir pela afinidade ao arabinano, revelando-se como um módulo potencialmente interessante para uma futura utilização na suplementação enzimática de dietas à base de trigo para frangos. Foram efectuados ensaios com frangos de carne cujas dietas foram suplementadas com semente de linho extrudida e um subproduto de algas marinhas (DHA goldTM) para estudar os seus efeitos no perfil dos ácidos gordos da carne e na qualidade da carne. Também se avaliou a extensão da bioconversão dos percursores ácidos linoleico (LA) e linolénico (LNA) nos seus homólogos de cadeia longa. Os resultados mostraram que a conversão dos ácidos gordos não é eficiente e por isso a suplementação directa com uma fonte de ácidos gordos de cadeia longa parece ser a melhor opção para melhorar o conteúdo de ácidos gordos ómega-3 de cadeia longa. No entanto, a qualidade da carne pode estar afectada negativamente em doses de incorporação elevadas de DHA goldTM. This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia, grant SFRH/BD/32321/2006, and co-funded by POCI 2010 and FSE from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar A sociedade ocidental actual tem uma dieta com uma razão n-6/n-3 elevada, 15-20:1. Vários estudos confirmam a necessidade de alterar essa razão para 1-2:1, devido às patologias associadas a este tipo de dieta. A alteração dessa razão n-6/n-3 pode ser conseguida através da introdução, nas dietas da sociedade ocidental, de alimentos funcionais ricos em DHA e EPA. Estes AG têm evidenciado ter uma acção importante na prevenção de doenças cardiovasculares e de doenças neuro-degenerativas. O licopeno, antioxidante maioritário do tomate, tem revelado em muitos estudos um poder antioxidante tal que pode conferir capacidades cardioprotectoras, anti-inflamatórias, antimutagénicas e anticarcinogénicas. Este estudo demonstrou que a incorporação de AG no cérebro de ratos wistar é influenciada pela interação da sardinha, peixe gordo, com elevadas concentrações de DHA (22:6n-3) e EPA (20:5n-3), com o tomate, vegetal com altas concentrações de licopeno. Verificou-se também que dietas com concentrações crescentes de DHA aumentam a concentração, deste AG, no tecido muscular e eritrócitos, ao contrário do tecido cerebral, em que o aumento parece ser diminuto e com um “plateau” nos 13% de DHA (w/w). Utilizando o índice n-3, proposto por William S. Harris e Clemen von Schacky, duas latas de sardinha por dia conferem um nível desejável de protecção contra doenças cardiovasculares em humanos. ABSTRACT - Title: Fatty Acids Profile of the muscle and brain of Wistar rats feed with diets containing graded levels of canned sardines - The current occidental population has a diet with a high n-6/n-3 ratio, 15-20:1. Several studies confirm the need of changing such ratio to 1-2:1, due to the pathologies connected with such kind of diets. The change of the ratio n-6/n-3 may be reached through the insertion of functional food with DHA and EPA. These fatty acids (FA) have proved an important role in preventing cardiovascular (CVD) and neurodegenerative diseases. Lycopene, tomato majority antioxidant, has evidenced in several studies to have an antioxidant which may provide protection to the cardiovascular system, as well as antiinflammatory, anti-mutagenic and anti-carcinogenic properties. This study revealed that fatty acids incorporation on Wistar rats brains is influenced by the interaction of sardine, fat fish rich in DHA (22:6n-3) and EPA (20:5n-3), and with tomato, with high lycopene concentration. Diets with graded concentration of DHA leads to the increase of such FA on muscle and red blood cells, contrarily to brain tissue, where such increase seems to be low and with a plateau on 13% of DHA (w/w). Using the n-3 index proposed by William S. Harris and Clemen von Schacky, two canned sardines on a daily basis provides a desirable level of CVD protection in human.

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal Cellulosomes are one of nature’s most elaborate and highly efficient nanomachines. These cell bound multi-enzyme complexes orchestrate the deconstruction of cellulose and hemicellulose, two of the most abundant polymers on earth, thus playing a major role in carbon turnover. Integration of cellulosomal components occurs via highly ordered protein:protein interactions between cohesins and dockerins, whose specificities allow the precise incorporation of cellulases and hemicellulases onto a molecular scaffold. Clostridium thermocellum and C. cellulolyticum cellulosomes have been extensively characterized and constitute the paradigm for the organization of cellulases and hemicellulases in multi-enzyme complexes by thermophilic and mesophilic anaerobic bacteria, respectively. The recent sequencing of C. thermocellum and C. cellulolyticum genomes allowed the identification of the complete set of cohesins, dockerins and cellulosomal domains encoded by these bacteria. Here, several unresolved issues concerning cohesin-dockerin specificity, cellulosome assembly and the role of cellulosomal catalytic components in plant cell wall hydrolysis will be explored. The ligand specificities of some newly identified C. thermocellum cohesin and dockerin domains were described (Chapter 2). A novel cell-bound protein, termed OlpC, which contains a type I cohesin domain was discovered in C. thermocellum. A restricted set of dockerins were shown to interact, primarily, with OlpC. All the remaining dockerin containing polypeptides expressed by C. thermocellum are directed to cellulosomes. Significantly, the structure of two C. cellulolyticum cohesin-dockerin complexes revealed that, as it was previously reported for C. thermocellum, mesophilic dockerins also express a dual binding mode for cohesins (Chapter 3). Initial crystallization studies with the two N-terminal domains of C. thermocellum cellulosomal xylanase Xyn10B anticipate the elucidation of its 3D structure, which may provide insightful data concerning the function of this enzyme in plant cell wall hydrolysis (Chapter 4). Finally, a cellulosomal family 2 CE (CtCE2), which grafts a second discrete non-catalytic binding functionality into its active site, was characterized (Chapter 5). CtCE2 provides a rare example of “gene sharing” where the introduction of a second functionality into the active site of an enzyme does not compromise the original activity of the biocatalyst. RESUMO - Nova perspectiva no mecanismo de integração do celulossoma e na degradação da parede celular vegetal por bactérias anaeróbias - Os celulossomas são um dos mais intricados e eficientes complexos multi-enzimáticos existentes na Natureza. Estes complexos, que se encontram ligados à parede celular bacteriana, desempenham um papel importante na degradação da celulose e da hemicelulose, dois dos mais abundantes polímeros na terra. A integração dos componentes celulossomais ocorre através de interacções proteína-proteína, muito ordenadas, estabelecidas entre coesinas e doquerinas, cuja especificidade permite a incorporação precisa de celulases e hemicelulases numa proteína de integração celulossomal. Os celulossomas dos organismos Clostridium thermocellum e C. cellulolyticum têm sido extensivamente caracterizados e constituem o paradigma para a organização de celulases e hemicelulases em complexos multienzimáticos de bactérias anaeróbias, tanto termófilas como mesófilas, respectivamente. A recente sequenciação dos genomas do C. thermocellum e do C. cellulolyticum permitiu a identificação de um conjunto completo de coesinas, doquerinas e domínios celulossomais codificados por estas bactérias. Neste trabalho, várias questões relativas à especificidade coesina-doquerina, à formação do celulossoma e ao papel dos componentes celulossomais catalíticos serão investigadas. A especificidade de doquerinas e coesinas do C. thermocellum recentemente identificados foi descrita (Capítulo 2). Uma nova proteína da parede celular, designada como OlpC, que contém um domínio doquerina, foi descoberta no C. thermocellum. Demonstrou-se que um conjunto restrito de doquerinas reage preferencialmente com a OlpC. Os restantes polipéptidos expressos pela bactéria C. thermocellum, contendo também doquerinas, ligam-se ao celulossoma. A estrutura de dois complexos coesina-doquerina do C. cellulolyticum revelou, como previamente comunicado para a bactéria C.thermocellum, que as doquerinas de organismos mesófilos também apresentam uma dupla ligação para com as coesinas (Capítulo 3). Estudos preliminares de cristalização dos dois domínios Nterminais da xilanase celulossomal Xyn10B antecipam a futura elucidação da sua estrutura 3D, o que poderá esclarecer a função deste enzima na hidrólise da parede celular vegetal (Capítulo 4). Finalmente, foi descrita uma esterase de hidratos de carbono da família 2 (CtCE2), que apresenta uma funcionalidade discreta, não-catalítica de ligação a glúcidos no seu centro catalítico. A CtCE2 fornece um raro exemplo de “gene sharing”, onde a introdução de uma segunda funcionalidade no centro catalítico de uma enzima não compromete a actividade original do biocatalisador. This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia, grant SFRH/BD/25439/2005 Co-funded by POCTI/BIA-PRO/59118/2004 and PPCDT/BIA-PRO/59118/2004 from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal The daily intake of conjugated linoleic acid (CLA) isomers by humans, through diet and supplementation, and the controversial effects of these compounds in human health, were the main motivation for the elaboration of this thesis. Firstly, the present work intended to estimate the daily CLA ingestion by the Portuguese population. Secondly, the biological effects of CLA were exploited using two distinct animal models, normal-weight (Wistar rat) and genetically fat (obese Zucker rat), in combination with saturated fat based diets. The estimative of total CLA intake for the Portuguese population was 73.70 mg/day. The cis(c)9,trans(t)11 and t7,c9 were the most prevalent CLA isomers, with, respectively, 76.10 and 12.56% of the total CLA intake value. Concerning the animal trials, CLA in conjugation with saturated fats revealed beneficial but also deleterious biological effects. In the normal-weight Wistar rat fed a palm oil based diet, the administration of c9,t11 CLA isomer increased the serum triacylglycerols and the size of adipocytes from epididymal and retroperitoneal fat depots. In addition, a CLA mixture of c9,t11 and t10,c12 isomers increased the glycerol membrane permeability of kidney proximal tubules, which may indicate an improvement of glycerol reabsorption pathway. In the obese Zucker rat, CLA (as a mixture) induced changes in fatty acid profile of liver, muscle and adipose depots. CLA supplemented with a vegetable saturated fat diet seemed to promote a more beneficial adipokine serum profile and an alleviation of hepatic steatosis. In contrast, adverse effects of CLA were observed with hypercholesterolaemia promotion. Regardless CLA, the ovine fat diets worsened the insulin resistance and increased the pro-inflammatory serum cytokines. In the liver, different levels of cell death and apoptotic pathways were modulated by CLA, depending on the type of saturated fat present in the diet. The most striking result of this study was that CLA was not able to promote fat loss in both experimental models. Moreover, new mechanisms of CLA action were disclosed in this work, which reinforce the need to further investigate this compound. RESUMO - Efeitos biológicos do ácido linoleico conjugado e de gorduras saturadas na composição da gordura corporal, na obesidade e patologias associadas: estudos experimentais em ratos Wistar e Zucker obesos - A ingestão diária de isómeros do ácido linoleico conjugado (CLA), através da dieta e da sua suplementação, bem como, os efeitos controversos destes compostos na saúde humana, constituíram a principal motivação para a elaboração desta tese. Numa primeira fase, o trabalho pretendeu estimar a ingestão diária de CLA pela população Portuguesa. Posteriormente, foram avaliados os efeitos biológicos do CLA quando suplementado a dietas à base de gordura saturada. Para tal, recorreu-se a dois modelos animais distintos, o rato Wistar e o rato Zucker (geneticamente obeso). A ingestão média total de CLA pela população Portuguesa foi estimada em 73.70 mg/dia. Os isómeros do CLA mais representativos foram o cis(c)9,trans(t)11 e o t7,c9, correspondendo, respectivamente, a 76.10 e 12.56% do total de CLA ingerido. Quanto aos estudos in vivo, o CLA revelou efeitos biológicos tanto benéficos como prejudiciais. No modelo Wistar alimentado com dieta à base de óleo de palma, a administração do isómero do CLA c9,t11 elevou os níveis de triacilgliceróis no soro, bem como, o tamanho dos adipócitos das gorduras epididimal e retroperitoneal. Adicionalmente, a mistura de isómeros do CLA (c9,t11 e t10,c12) aumentou a permeabilidade membranar ao glicerol no túbulo proximal do rim, sugerindo uma melhoria no processo de reabsorção desta molécula. No modelo Zucker, o CLA (como mistura de isómeros) induziu alterações no perfil dos ácidos gordos do fígado, músculo e gorduras epididimal e retroperitoneal. O CLA administrado com óleo de palma promoveu um perfil de adipocinas no soro mais benéfico e melhorou a esteatose hepática. Em contraste, a suplementação com CLA apresentou um efeito hipercolesterolémico. Independentemente do CLA, a dieta rica em gordura de ovinos agravou a resistência à insulina e aumentou as adipocinas pró-inflamatórias no soro. No fígado, diferentes níveis de morte celular e vias apoptóticas foram modeladas pelo CLA em função do tipo de gordura presente na dieta. É de salientar que não se observaram efeitos anti-adipogénicos do CLA em nenhum dos dois modelos animais. Por último, esta tese contribuiu para a descoberta de novos mecanismos de acção dos isómeros do CLA, reforçando a necessidade de continuar a estudar estes compostos. This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) through the individual fellowship SFRH/BD/22566/2006 and co-financed by the grant POCTI/44750/2002

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal Plant cell wall polysaccharides offer an extraordinary source of carbon and energy that can be used by various microorganisms, thus constituting a central component of the carbon cycle. The anaerobic thermophilic bacterium Clostridium thermocellum is one of the most prolific degraders of plant cell wall polysaccharides. It produces a multi-enzyme extra-cellular complex of cellulases and hemicellulases, the cellulosome, and these enzymes were shown to have a remarkable biotechnological potential. Based on the recently determined genome sequence of Clostridium thermocellum, we aimed to address several unresolved questions concerning the mechanism of plant cell wall hydrolysis by microbial multi-enzyme complexes.The crystal structure and biochemical properties of the N-terminal carbohydrate esterase domain of Clostridium thermocellum CtCes3-1 were determined (chapter 2). The enzyme is a thermostable acetyl-specific esterase that exhibits a strong preference for acetylated xylan. In adition, we report, in Chapter 3, the characterization of four carbohydrate-binding modules (CBMs) of family 35 that display specificity for Δ4,5-anhydrogalacturonic acid (Δ4,5-GalA), although two of the proteins also interact with glucuronic acid (GlcA). X-ray crystallographic data revealed that the ligand binding site is highly conserved in the four CBM35s. In chapter 4, biochemical properties of a CBM6 (CBM6-1) from Cellvibrio mixtus CmCel5A are presented. The data revealed that CBM6-1 recognizes specifically β1,3-glucans through a previous unknown ligand binding plataform. These studies reveal the different mechanisms by which a highly conserved protein platform (CBM6) can recognise a common ligand. Finally, we identified a novel CBM within the large C. thermocellum cellulosomal protein Cthe_2193 (CtCBM55), which is the founder member of a new CBM family. CtCBM55, in contrast to the previously characterized cellulosomal CBMs, binds to D-galactose and L-arabinose in either anomeric configuration in complex polysaccharides. Ligand specificity is conferred through numerous interactions with the axial O4 of the target sugars, a feature that distinguishes galactose and arabinose from the other major sugars located into plant cell walls. RESUMO - Perspectivas Estruturais e funcionais do papel das carbohidrato esterases e dos modulos de ligação a hidratos de carbono na hidrólise da parede cellular vegetal. - Os polissacáridos da parede celular vegetal constituem uma fonte de carbono e energia que pode ser utilizada por diversos microorganismos desempenhando assim um papel de relevo no ciclo do carbono. A bactéria termofílica anaeróbia Clostridium thermocellum é muito eficaz na degradação dos polissacáridos da parede celular das plantas. Esta produz um complexo multi-enzimático extra-celular de celulases e hemicelulases, denominado celulossoma, demonstrando estas enzimas um extraordinário potencial biotecnológico. Neste trabalho foram determinadas as propriedades bioquímicas e a estrutura cristalográfica do domínio catalítico N-terminal da enzima CtCes3 (CtCes3-1) do Clostridium thermocellum (Capítulo 2). Esta enzima é uma esterase termostável específica para grupos acetilo e que demonstra uma forte preferência por xilano acetilado. É também feita, no Capitulo 3, a caracterização de quatro módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) da familia 35 que demonstram afinidade para o ácido Δ4,5-anidrogalacturónico (Δ4,5-GalA), apesar de duas das proteínas também interagirem com o acido glucurónico (GlcA). Os dados cristalográficos demonstram que o local de ligação é altamente conservado nos quatro CBM35s. No Capítulo 4, são reveladas as propriedades bioquímicas de um CBM6 da enzima CmCel5A (CBM6-1) do Cellvibrio mixtus. Os dados revelaram que o CBM6-1 reconhece especificamente β1,3-glucanos através de uma plataforma de ligação previamente desconhecida. Estes estudos demonstram os diferentes mecanismos pelos quais uma plataforma proteíca altamente conservada (CBM6) pode reconhecer o mesmo ligando. Finalmente, identificámos um novo CBM da enzima Cthe_2193 (CtCBM55), pertencente ao celulossoma do C. thermocellum, estabelecendo-se assim uma nova família de CBMs. O CtCBM55, ao contrário de outros CBMs do celulossoma, liga-se à D-galactose e à L-arabinose em qualquer configuração anomérica em polissacáridos complexos. A sua especificidade é conferida por varias interacções com o O4 axial dos açucares alvo, uma característica que distingue a galactose e a arabinose dos outros hidratos de carbono que compoêm a parede celular vegetal. This work was funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia through individual fellowship SFRH/BD/23784/2005. Co-funded by POCTI/CVT/2004/61162, POCTI/BIA-PRO/2004/59118 and FSE from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior.

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal Contribuição para o estudo da composição lipídica e do valor nutricional da gordura intramuscular na carne de ruminantes - A composição em ácidos gordos e o ácido linoleico conjugado (CLA) são temas actuais de grande interesse, com particular relevância para a qualidade da carne e saúde humana. As carnes de ruminantes têm sido consideradas alimentos pouco saudáveis, principalmente devido à sua fracção lipídica com elevada concentração em ácidos gordos saturados. Contudo, as gorduras edíveis dos ruminantes são a principal fonte natural de isómeros CLA, sendo os isómeros bioactivos (c9,t11 e t10,c12) associados a propriedades potencialmente benéficas para a saúde humana. Em Portugal, a informação científica disponível para apoiar a qualidade e a reputação da carne bovina de raças autóctones criadas segundo as especificações de Denominação de Origem Protegida (DOP) continua restrita. Para além disso, os dados disponíveis não permitem ter uma percepção global de como distintos factores influenciam a composição da carne, desde a sua produção até ao consumo. Neste contexto, a nossa investigação foi desenvolvida estudando o efeito dos regimes alimentares dos animais (pastagem×concentrado), processamento tecnológico da carne após o abate (irradiação) e tratamentos térmicos (fervura, microondas e grelhagem), no perfil lipídico, especialmente nos isómeros do CLA, e no valor nutricional de carne de ruminantes. Foram seleccionadas e caracterizadas 4 carnes tradicionais DOP (Carnalentejana, Mertolenga, Barrosã e Arouquesa). Os resultados sugerem que a gordura intramuscular das carnes de novilho relativamente às de vitela, apresentam menor valor nutricional ao longo do ano, devido ao sistema de produção semi-extensivo utilizado nos novilhos. Por sua vez, a Carnalentejana-DOP apresenta uma qualidade nutricional superior comparativamente à carne de vaca de produção intensiva. No sentido de avaliar em detalhe o efeito de diferentes regimes alimentares no valor nutricional dos lípidos da carne, bem como a sua utilidade como discriminantes químicos da origem da carne, realizou-se um ensaio controlado. Os dados obtidos reforçam os resultados anteriores que sugeriam que a carne de animais de pastoreio apresenta melhor qualidade nutricional (teores mais elevados de n-3 PUFA e CLA) do que a carne de animais alimentados a concentrado. Este facto traduz os efeitos benéficos da pastagem no perfil de ácidos gordos da carne. Relativamente às alterações na composição da gordura intramuscular, resultantes do efeito de processamentos seguintes ao abate, a irradiação, uma tecnologia prospectiva para a conservação das carnes, não promoveu modificações significativas. Os tratamentos térmicos, frequentemente utilizados em culinária, induziram um impacto moderado no perfil dos ácidos gordos, como consequência das perdas de humidade e concentração da gordura. Em resumo, a composição lipídica da gordura intramuscular das carnes de bovino DOP estudadas apresenta um valor nutricional acrescentado para os consumidores, considerando os valores de n-3 PUFA, CLA (total e do isómero c9,t11) e da razão n-6/n-3, contribuindo para a sua diferenciação no mercado. RESUMO - Contribuição para o estudo da composição lipídica e do valor nutricional da gordura intramuscular na carne de ruminantes - A composição em ácidos gordos e o ácido linoleico conjugado (CLA) são temas actuais de grande interesse, com particular relevância para a qualidade da carne e saúde humana. As carnes de ruminantes têm sido consideradas alimentos pouco saudáveis, principalmente devido à sua fracção lipídica com elevada concentração em ácidos gordos saturados. Contudo, as gorduras edíveis dos ruminantes são a principal fonte natural de isómeros CLA, sendo os isómeros bioactivos (c9,t11 e t10,c12) associados a propriedades potencialmente benéficas para a saúde humana. Em Portugal, a informação científica disponível para apoiar a qualidade e a reputação da carne bovina de raças autóctones criadas segundo as especificações de Denominação de Origem Protegida (DOP) continua restrita. Para além disso, os dados disponíveis não permitem ter uma percepção global de como distintos factores influenciam a composição da carne, desde a sua produção até ao consumo. Neste contexto, a nossa investigação foi desenvolvida estudando o efeito dos regimes alimentares dos animais (pastagem×concentrado), processamento tecnológico da carne após o abate (irradiação) e tratamentos térmicos (fervura, microondas e grelhagem), no perfil lipídico, especialmente nos isómeros do CLA, e no valor nutricional de carne de ruminantes. Foram seleccionadas e caracterizadas 4 carnes tradicionais DOP (Carnalentejana, Mertolenga, Barrosã e Arouquesa). Os resultados sugerem que a gordura intramuscular das carnes de novilho relativamente às de vitela, apresentam menor valor nutricional ao longo do ano, devido ao sistema de produção semi-extensivo utilizado nos novilhos. Por sua vez, a Carnalentejana-DOP apresenta uma qualidade nutricional superior comparativamente à carne de vaca de produção intensiva. No sentido de avaliar em detalhe o efeito de diferentes regimes alimentares no valor nutricional dos lípidos da carne, bem como a sua utilidade como discriminantes químicos da origem da carne, realizou-se um ensaio controlado. Os dados obtidos reforçam os resultados anteriores que sugeriam que a carne de animais de pastoreio apresenta melhor qualidade nutricional (teores mais elevados de n-3 PUFA e CLA) do que a carne de animais alimentados a concentrado. Este facto traduz os efeitos benéficos da pastagem no perfil de ácidos gordos da carne. Relativamente às alterações na composição da gordura intramuscular, resultantes do efeito de processamentos seguintes ao abate, a irradiação, uma tecnologia prospectiva para a conservação das carnes, não promoveu modificações significativas. Os tratamentos térmicos, frequentemente utilizados em culinária, induziram um impacto moderado no perfil dos ácidos gordos, como consequência das perdas de humidade e concentração da gordura. Em resumo, a composição lipídica da gordura intramuscular das carnes de bovino DOP estudadas apresenta um valor nutricional acrescentado para os consumidores, considerando os valores de n-3 PUFA, CLA (total e do isómero c9,t11) e da razão n-6/n-3, contribuindo para a sua diferenciação no mercado. This work was co-financed by Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (Project CIISA/52.Carne-Bioactivos) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa and Fundação para a Ciência e a Tecnologia (POCTI/CVT/2002/44750) and Ministério da Agricultura (AGRO/2003/512).

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal Os efeitos da ingestão de pastagem no desempenho produtivo e na qualidade da carne de frangos em crescimento, bem como o potencial interesse da suplementação das dietas destes animais com celulases e hemicelulases na produção de frangos ao ar livre continuam por avaliar. Os resultados obtidos neste trabalho revelam que a ingestão de pastagem incrementa o desempenho produtivo e contribui para a melhoria dos atributos sensoriais da carne de frango. No entanto, a ingestão de pastagem foi baixa em aves com acesso ad libitum ao alimento composto. A restrição da ingestão do alimento à base de cereais originou um aumento no consumo relativo de pastagem de leguminosas, promovendo o desempenho produtivo das aves. Por outro lado, a suplementação da dieta com celulases e hemicelulases não afectou o crescimento de frangos com acesso a pastagens à base de leguminosas. Os resultados sugerem que em aves de estirpes de crescimento lento criados em sistemas de produção ao ar livre, B-glucanases de origem desconhecida podem afectar a eficiência de enzimas exógenas adicionadas a dietas à base de cevada. A baixa ingestão de pastagem resultou num efeito moderado no perfil de ácidos gordos e homólogos da vitamina E na carne de aves provenientes de sistemas de produção ao ar livre. No entanto, a restrição de alimento composto promoveu uma maior ingestão de pastagem à base de leguminosas, o que influenciou significativamente o perfil de ácidos gordos da carne. Apesar da ingestão de pastagem não influenciar os níveis de ácido linoleico (LA), os teores de n-3 ácidos gordos poli insaturados (PUFA) na carne de frango foram significativamente mais elevados em animais com acesso a pastagem. Igualmente, o consumo de forragem desidratada por frangos produzidos convencionalmente não afectou os teores de vitaminas antioxidantes e de colesterol na carne de frango, tendo influenciado o perfil de ácidos gordos da carne. A ingestão de forragem não afectou os teores de LA e ácido linolénico (ALA). No entanto verificaram-se níveis de n-3 PUFA de cadeia longa de carne de frango mais elevados em animais que consumiram forragem desidratada, o que sugere uma importante deposição de ALA no músculo e a sua conversão nos seus derivados de cadeia longa em aves que consumiram forragens, frescas ou desidratadas, à base de leguminosas. ABSTRACT : The effects of forage intake in both broiler performance and poultry meat quality remain to be established. In addition, the potential interest of exogenous cellulases and hemicellulases to improve the nutritive efficacy of free-range chicken remains to be evaluated. Data presented here reveal that pasture consumption promotes bird performance, while contributing for the production of broiler meat with preferred sensory attributes. However, low levels of pasture intake were recorded in birds receiving ad libitum a concentrate feed. The restriction of the cereal-based feed intake increased the relative levels of leguminous pasture intake, leading to an overall negative influence in bird performance. In addition, cellulase and hemicellulase supplementation had no impact on the performance of birds foraging in legume-based pastures. The results suggest that in older birds of slow-growing genotypes subjected to free-range production systems, previously unknown sources of beta-glucanases can affect the effectiveness of exogenous enzymes added to the feed. The low levels of pasture intake had a low impact on the fatty acid and vitamin E homologue profiles of free-range poultry meat. When cereal-based feed was restricted, the higher consumption of the leguminous pasture significantly affected meat fatty acid profile. Although pasture intake did not influence the contents in linoleic acid (LA) of poultry meat, the levels of n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) in breast meat were significantly higher in animals consuming leguminous biomass. Dehydrated forage consumption by conventionally reared broilers had no impact on antioxidant vitamins and cholesterol contents of broiler meats but had a significant effect on meat fatty acid composition. Forage intake did not affect the LA and linolenic acid (ALA) contents in poultry meat, but the levels of n-3 long-chain PUFA in breast meat were higher in animals consuming leguminous biomass. The data suggest an important deposition of ALA in the muscle and the conversion of ALA to its long-chain derivatives in broilers consuming fresh or dehydrated leguminous based forages. This work was funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia trough grant SFRH/BD/17969/2004 Co-funded by POCTI/CVT/61162/2004 (FCT) and Agro 57 (Instituto Nacional de Investigação Agrária)

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal Submitted by Maria São José Lalanda Ribeiro (mlalanda@fmv.utl.pt) on 2008-12-17T15:36:04Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutoramento_ Patrícia Ponte.pdf: 7128565 bytes, checksum: c4f0573f477da01a65d55ddb35abe64a (MD5) Made available in DSpace on 2008-12-17T15:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Doutoramento_ Patrícia Ponte.pdf: 7128565 bytes, checksum: c4f0573f477da01a65d55ddb35abe64a (MD5) Previous issue date: 2008-06-02 This work was funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia trough grant SFRH/BD/17969/2004 Co-funded by POCTI/CVT/61162/2004 (FCT) and Agro 57 (Instituto Nacional de Investigação Agrária)

Tese de mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2007 Nível de preservação: critical, Criado em: 2008-02-29 18:21:55, Criado por: creator:DIGITOOL, Alterado em: 2009-08-03 17:17:05, Modificado por: super:MARTA Made available in DSpace on 2010-06-16T09:46:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 3597_Tese_Ze%20Pestana.pdf: 1473391 bytes, checksum: fb1b89bf8fc3023f29d074b8a23f1f5d (MD5) 3597.xml: 5727 bytes, checksum: 50764121e725bb213f867c82526aa55a (MD5) Previous issue date: 2007

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar Diante do crescente consumo de carne, além da carne vermelha, vem aumetando a preocupação quanto ao desenvolvimento agropecuário para o abastecimento da população mundial. Desse modo, diversas estratégias e estudos têm visado a introdução de alguns aditivos e nutrientes na alimentação de frangos de corte, com a finalidade de melhorar o desempenho zootécnico das aves, agregando substâncias benéficas ao animal e ao consumidor. O uso de enzimas exógenas, como a lisozima e o complexo multienzimático Rovabio®, é um alternativa para a melhoria da digestibilidade de polissacarídeos não amiláceos presentes em cereais. A microalga Spirulina é considerada uma ótima fonte de aminoácidos essenciais, proteínas, vitaminas, sais minerais e lipídios, e tais caracterísicas motivam sua utilização na composição de dietas para animais. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi preparar e caracterizar dietas contendo a microalga Spirulina, juntamente com as enzimas lisozima e Rovabio®, para a avaliação da influência desses componentes na performance zootécnica de frangos, além da qualidade nutricional e sensorial da carne. No ensaio experimental, cinco dietas à base de milho e soja (iniciação, dieta controlo, dieta com microalga Spirulina (15%); dieta com Spirulina (15%) e Rovabio® (0,005%) e dieta com Spirulina (15%) e lisozima (0,01%) foram aplicadas em 120 frangos machos (estirpe Ross 308) durante seus 35 dias iniciais de vida. Foram avaliados os efeitos das dietas no desempenho zootécnico dos frangos, coloração e pH da carne, força de corte, perda de água por cozimento e na análise sensorial. Na análise do desempenho zootécnico dos animais, observou-se que, em geral, a dieta com lisozima apresentou resultados inferiores no peso final dos animais e no índice de conversão alimentar. Em relação à análise dos órgãos do sistema digestivo, a dieta contendo Spirulina foi responsável pelo aumento do comprimento do intestino delgado, enquanto a adição de lisozima influenciou no maior índice de viscosidade. Além disso, as amostras com microalga apresentaram menor suculência e diferenças na coloração em relação ao controlo, com o aumento do parâmetro b*. Esses resultados sugerem a absorção de caroteno e zeaxantina presentes nas dietas com Spirulina e um menor teor de lipídios presentes nas amostras que, possivelmente, podem ser modulados com alterações nas concentrações da microalga. ABSTRACT - Effect of dietary supplementation containing Spirulina with exogenous enzymes on the zootechnical indexes and broiler meat quality - In view of the growing consumption of meat, in addition to red meat, the concern with the agricultural development to supply the world population have been increased. Therefore, several strategies and studies have aimed at the introduction of some additives and nutrients in the feeding of broilers, with the purpose of improving the zootechnical performance of broilers, adding beneficial substances to the animal and the consumer. The use of exogenous enzymes, such as lysozyme and Rovabio® multienzyme complex, is an alternative for improving the digestibility of non-starch polysaccharides present in cereals. The Spirulina microalgae is considered a good source of essential amino acids, proteins, vitamins, minerals and lipids, and such characteristics motivate their use in the composition of animal diets. In this context, the objective of the present study was to prepare and characterize diets containing the Spirulina microalgae, together with the enzyme lysozyme and Rovabio®, to evaluate the influence of these components on the zootechnical performance of chickens, besides the nutritional and sensorial quality of the meat. In the experimental trial, five diets based on corn and soybean (initiation, control diet, diet with Spirulina microalgae (15%), diet with Spirulina and Rovabio® (0.005%) and diet with Spirulina (15%) and lysozyme (0.01%) were applied to 120 male broilers (Ross 308 strain) during their initial 35 days of life. The effects of the diets on broiler performance, meat color and pH, cutting force, water loss per cooking and sensorial analysis were evaluated. In the analysis of the zootechnical performance of the animals, it was observed that, in general, the diet with lysozyme presented lower results in the final weight of the animals and in the feed conversion index. In relation to the analysis of the organs of the digestive system, the diet containing Spirulina was responsible for the increase in the length of the small intestine, while the addition of lysozyme influenced the higher viscosity index. In addition, the samples with microalgae presented lower succulence and differences in coloration in relation to control, with the increase of parameter b*. These results suggest the absorption of carotene and zeaxanthin present in the diets with Spirulina and a lower content of lipids present in the samples that, possibly, can be modulated with changes in the concentrations of the microalgae. N/A

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Produção Animal. Modern commercial pig breeds usually produce very lean meat with poor eating quality. Thus, strategies to increase intramuscular fat (IMF) content and consequently to improve sensorial meat quality are needed. In view of this, our investigation explores the potential of feeding strategies based on reduction of dietary protein to improve intramuscular fat and carcass fat partitioning in pigs and to study the associated genetic mechanisms. In a first experiment, three diets differing in dietary protein and lysine levels (control diet with 17.5% crude protein, reduced protein diet – RPD with 13% of crude protein, and reduced protein diet adjusted with lysine – RPDL) were applied to two genetic divergent pig genotypes (30 Alentejano purebred, fatty and 30 commercial crossbred pigs, lean). In a second experiment, six diets differing in dietary protein (16 vs. 13% of crude protein) and arginine and/or leucine supplementation were applied on 54 commercial crossbred pigs. The effects of these diets on growth performance, carcass traits, IMF content, meat quality, subcutaneous adipose tissue (SAT) deposition, fatty acid composition and mRNA levels of genes controlling lipid metabolism were evaluated. The results from the first experiment showed that RPD increase IMF but decrease the productive performance in commercial crossbred pigs but not on Alentejano pigs, suggesting that lysine restriction mediates the effect of RPD on muscular lipid deposition. The effect of RPD on IMF of crossbred pigs was accompanied by an increased stearoyl-CoA desaturase (SCD) and PPARγ mRNA levels. The backfat thickness did not change with RPD, but total fatty acid content increased in both genotypes. In addition, this result reflects a tendency for higher sensory scores in crossbred pigs. The Alentejano pigs showed higher sensory scores than crossbred pigs, although RPD increased the juiciness of crossbred pigs. In the second experiment, reduced protein diet increased both IMF and backfat thickness. However, the observed increase in IMF was also accompanied by increased SCD expression but did not improved meat sensory traits. Neither arginine nor leucine dietary supplementation increased IMF content. Nevertheless, arginine introduced an off-flavour of meat. The only relevant effect of arginine was increasing the fat content of adipose tissue (and consistent up-regulation of fatty acid synthase (FASN) and SCD genes) and a slightly decrease in 20:5n-3 and of total n-3 PUFA in muscle. Leucine supplementation resulted on up-regulation of muscle SCD and FASN reflected in higher 18:1c9 and 16:0 proportions and lower PUFA proportions. The results suggested that fat partitioning can be modulated and pork quality improved with reduced protein diets without lysine adjustment. RESUMO - Estratégias alimentares para melhorar a partição da gordura corporal e a qualidade da carne em suínos - As raças modernas de suínos comerciais normalmente produzem carne muito magra com baixa qualidade sensorial. Deste modo, são necessárias estratégias para aumentar o teor gordura intramuscular (GIM) e consequentemente melhorar a qualidade sensorial da carne. Neste sentido, a nossa investigação explora o potencial de estratégias alimentares baseadas na redução de proteína na dieta para melhorar a GIM e a partição da gordura na carcaça em suínos e também estudar os mecanismos genéticos associados. No primeiro ensaio experimental, três dietas com níveis de proteína e lisina diferentes (dieta controlo, com 17.5% de proteína bruta, dieta reduzida em proteína – RPD com 13% de proteína bruta e uma dieta reduzida em proteína ajustada com lisina – RPDL) foram aplicadas a suínos de dois genótipos diferentes (30 Alentejanos puros e 30 comerciais cruzados). Num segundo ensaio, seis dietas com níveis de proteína diferentes (16 vs. 13%) e suplementação de arginina e/ou leucina foram aplicadas a 54 suínos comerciais cruzados. Foram avaliados os efeitos destas dietas na performance de crescimento, nas características da carcaça, no teor de GIM, na qualidade da carne, na deposição do tecido adiposo subcutâneo, na composição em ácidos gordos e nos níveis de mRNA dos genes que controlam o metabolismo lipídico. Os resultados do primeiro ensaio mostraram que a RPD aumentou a GIM mas diminuiu a performance produtiva nos suínos comerciais cruzados, mas não nos Alentejanos, o que sugere que a restrição em lisina medeia o efeito da RPD na deposição lipídica no músculo. O efeito da RPD na GIM nos suínos cruzados foi acompanhado pelo aumento dos níveis de mRNA da delta 9 desaturase (SCD) e PPARγ. A espessura do toucinho não alterou com a RPD, mas aumentaram os ácidos gordos totais nos dois genótipos. Além disso, este resultado reflecte uma tendência para maiores scores sensoriais nos suínos cruzados. Os suínos Alentejanos mostraram maiores scores sensoriais do que os suínos cruzados, apesar da dieta RPD ter aumentado a suculência nos suínos cruzados. No segundo ensaio experimental, a dieta reduzida em proteína aumentou a GIM e a espessura do toucinho. Contudo, o aumento da GIM foi também acompanhado com o aumento da expressão da SCD, mas não melhorou as características sensoriais da carne. Nem a suplementação da dieta com arginina nem com leucina aumentaram o teor de GIM. Porém, a arginina introduziu off-flavor na carne. O único efeito relevante da arginina foi o aumento do teor de gordura no tecido adiposo subcutâneo (consistente com o aumento da expressão dos genes da sintese de ácidos gordos (FASN e SCD) e um pequeno decréscimo do 20:5n-3 e do total de n-3 PUFA no músculo. A suplementação com leucina resultou no aumento de expressão da SCD e FASN no músculo, reflectida num aumento das proporções de 18:1c9 e 16:0 e da diminuição dos teores de PUFA. Os resultados sugerem que a partição da gordura pode ser modulada e a qualidade sensorial da carne de suíno melhorada com dietas com teor de proteína reduzido sem ajustamento da lisina.