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Orientador: Andrea Balan Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Tuberculose é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis e considerada um grave problema mundial devido à sua alta incidência na população, características peculiares do patógeno e tratamento de difícil sucesso. Estima-se que atualmente 2 bilhões de pessoas estejam infectadas, valor que abrange cerca de 30% da população global. A poliquimioterapia empregada contra o bacilo de Koch, crescentemente torna-se ineficaz devido à proliferação de cepas multirresistentes. O presente projeto objetiva identificar novos alvos para o desenvolvimento de drogas que sejam mais efetivas no bloqueio deste patógeno. Considerando que os sistemas de transporte do tipo ABC (ATP-Binding Cassette) tem papel fundamental na captação e transporte de diversas substâncias essenciais a sobrevivência dos organismos, e que são pouco caracterizados em Mycobacterium tuberculosis, a elucidação de estruturas e modelos moleculares de ação focando em uma possível inibição da viabilidade do microrganismo, tornam-se prioridade como caminho para obtenção de novos alvos. Neste cenário, o alvo de estudo escolhido foi o sistema ABC envolvido na captação do sulfato (SubICysWTA1) e sua via de assimilação consistindo de 8 proteínas (CysHDNK1K2MA2NirA). Sulfato está envolvido no metabolismo de enxofre, fundamental para a bactéria e cuja importância para infecção e patogênese tem sido demonstrada funcionalmente. No desenvolver do projeto, duas proteínas tornaram-se alvos principais: SubI e CysA2. SubI foi expressa e purificada e teve sua estrutura tri-dimensional resolvida na presença do ânion bem como a biofísica da interação. Adicionalmente, utilizando-se técnicas de deslocamento térmico, fluorescência, termoforese e ressonância magnética, foram identificadas pequenas moléculas capazes de interagir com a proteína para sua inibição. Experimentos de docking foram usados para a caracterização da localização das interações. CysA2 previamente descrita como sulfurtransferase, atua de forma secundária na via de óxido-redução do sulfato no citoplasma celular. Após a caracterização cinética da proteína, foi demonstrada sua capacidade de utilização dos substratos tiossulfato e 2-mercaptopiruvato, até então desconhecidas. Adicionalmente, a proteína foi avaliada com relação ao potencial imunogênico e vacinal. CysA2 apresentou-se como uma proteína altamente imunogênica e um excelente alvo vacinal e de diagnóstico para o tratamento da doença Abstract: Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis and it is considered a serious worldwide problem due to its high incidence in the population, peculiar characteristics of the pathogen and treatment of difficult success. It is estimated that currently 2 billion people are infected, a figure that covers about 30% of the global population. The poli-therapy used against Koch's bacillus is increasingly ineffective due to the proliferation of multi-resistant strains. The present project aims to identify new targets for the development of drugs that are more effective in blocking this pathogen. Considering that ABC transport systems (ATP-Binding Cassette) type importers plays a fundamental role in the uptake and transport of several substances essential to the survival of organisms, which are poorly characterized in Mycobacterium tuberculosis, the elucidation of structures and molecular models of action focusing in a possible inhibition of the viability of the microorganism, become an alternative as a way to obtain new targets. In this scenario, the targets chosen were the ABC system involved in sulfate uptake (SubICysWTA1) and its assimilation pathway consisting of 8 proteins (CysHDNK1K2MA2NirA). Sulfate is involved in sulfur metabolism, fundamental to bacterium and whose importance for infection and pathogenesis has been functionally demonstrated. In developing the design, two proteins became major targets: SubI and CysA2. SubI was expressed and purified and had its three-dimensional structure resolved in the presence of the anion as well as the biophysics of the sulfate interaction. Additionally, using thermalshift, fluorescence, thermophoresis and nuclear magnetic resonance techniques, small molecules capable of interacting with the protein were identified for their inhibition. Docking experiments were used to characterize the location of the interactions. CysA2 previously described as sulfurtransferase, acts secondary in the oxide-reducing pathway of sulfate in the cellular cytoplasm. After the kinetic characterization of the protein, its ability to use previously unknown thiosulphate and 2-mercaptopyruvate substrates was demonstrated. Additionally, the protein was evaluated for immunogenic and vaccine potential. CysA2 has been shown to be a highly immunogenic protein and an excellent vaccinal and diagnostic target for the treatment of the disease Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/20921-6

Orientador: Andrea Balan Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os transportadores ABC (ATP-Binding Cassette) formam uma grande superfamília de complexos de proteínas que promovem o transporte de uma ampla gama de substratos através de membranas biológicas em eucariotos e procariotos. Estruturalmente consistem em dois domínios transmembrana hidrofóbicos (TMDs) e dois domínios citoplasmáticos de ligação ao nucleotídeo (NBDs). No caso dos importadores, uma proteína periplasmática ou domínio de ligação ao substrato (SBP) adicional é responsável pela afinidade e a especificidade do transporte. Os importadores ABC de açúcares são de grande importância na nutrição e sobrevivência de bactérias patogênicas e a identificação e caracterização destes sistemas é um passo para o conhecimento sobre a fisiologia do microrganismo. Este trabalho, teve como objetivo principal o estudo de quatro sistemas ABC relacionados ao transporte de açúcares em M. tuberculosis: LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC e UgpAEBC, por meio de análises comparativas genômicas, filogenéticas e estruturais. Os resultados evidenciaram que os transportadores ABC Rv2038c-41c e UgpAEBC são exclusivos de espécies patogênicas do gênero Mycobacterium e podem estar relacionados à infecção e patogenicidade. A comparação das SBPs, TMDs e NBDs de M. tuberculosis com ortólogos putativos e análises filogenéticas mostraram que os componentes se dividem em quatro grupos de acordo com a função dos transportadores. Análises estruturais associadas às de filogenia, revelaram que os componentes de membrana são os mais diversificados e que as principais diferenças nesses TMDs se encontram na região de interface com a proteína periplasmática. Os NBDs são os mais conservados e as SBPs divergem principalmente na região do sítio de interação com os ligantes. Estudos de modelagem e docagem molecular sugerem que LpqY seja uma proteína ligadora de trealose e Rv2041c de açúcares cíclicos. Adicionalmente, avaliamos a possibilidade de estudar as interações entre TMDs e NBDs dos transportadores ABC utilizando-se peptídeos miméticos às hélices de acoplamento. Para tal, foram usados peptídeos das hélices de acoplamento dos componentes transmembrana MalF e MalG e o componente citoplasmático MalK, do sistema de transporte de maltose MalEFGK2 de Escherichia coli. Ensaios biofísicos de fluorescência (Fluorescência Diferencial de Varredura, DSF; Termoforese em microescala, MST) e estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que MalK se liga aos peptídeos com um Kd entre 47.8 e 20.9 µmol L-1, e que MalK sofre desestabilização térmica na presença de MgCl2 e ATP, e do peptídeo MalFch. As análises de SAXS mostraram que os dois peptídeos desencadeiam mudanças conformacionais na proteína MalK. A análise da fluorescência intrínseca do triptofano mostrou que a fluorescência dos dois únicos triptofanos em MalK não muda na presença de ambos os peptídeos. Este trabalho evidenciou o papel dos transportadores ABC de açúcares em M. tuberculosis, e a partir de uma abordagem multidisciplinar mostrou o papel destes componentes na família de transportadores ABC. O uso de peptídeos codificando as hélices de acoplamentos dos componentes transmembrana, se mostrou como uma alternativa interessante para estudos de interação proteína-proteína nestes transportadores, e essa abordagem pode servir como modelo para o estudo destas interações em outros sistemas de membrana e futuros estudos de inibição destes transportadores em bactérias patogênicas Abstract: ABC (ATP Binding Cassette) transporters form a large superfamily of protein complexes that mediate the transport of a wide range of substrates across biological membranes in eukaryotes and prokaryotes. Structurally, they consist of two hydrophobic transmembrane domains (TMDs) and two cytoplasmic nucleotide-binding domains (NBDs). In the case of importers, an additional periplasmic substrate-binding protein or domain (SBP) is responsible for the affinity and specificity of the transport. Sugar ABC importers are of great importance for the nutrition and survival of pathogenic bacteria and the identification and characterization of these systems is a step towards knowledge about the physiology of the microorganism. This work had as main objective the study of four ABC systems related to sugar transport in M. tuberculosis, LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC and UgpAEBC, through comparative genomic, phylogenetic, and structural analyzes. The results showed that the ABC transporters Rv2038c-41c and UgpAEBC are exclusive to pathogenic species of Mycobacterium genus and may be related to infection and pathogenicity. The comparison of M. tuberculosis SBPs, TMDs and NBDs with putative orthologs and phylogenetic analyzes showed that the components are divided into four groups according to the function of the transporters. Structural analyzes associated with those of phylogeny revealed that the membrane components are the most diversified and the main differences in these TMDs are found in the interface region with the periplasmic protein. NBDs are the most conserved and SBPs differ mainly in the region of the site of interaction with the substrates. Molecular modeling and docking studies suggest that LpqY and Rv2041c are a trehalose-binding protein and a cyclic sugar-binding protein, respectively. Additionally, we evaluated the possibility of studying the interactions between TMDs and NBDs of ABC transporters, using peptides mimetizing to the coupling helices. For this purpose, peptides from the coupling helices of the transmembrane components MalF and MalG and the cytoplasmic component MalK from the MalEFGK2 maltose ABC transport system of Escherichia coli were used. Biophysical fluorescence assays (Differential Scanning Fluorescence, DSF; Microscale thermophoresis, MST), and small angle X-ray scattering (SAXS) studies showed that MalK binds to peptides with a Kd between 47.8 and 20.9 µmol L-1, and that MalK undergoes thermal destabilization in the presence of MgCl2 and ATP, and of the MalFch peptide. SAXS analyzes showed that both peptides trigger conformational changes in the MalK protein. Analysis of the intrinsic fluorescence of tryptophan showed that the fluorescence of the only two tryptophans in MalK does not change in the presence of both peptides. This work highlighted the role of sugar ABC transporters in M. tuberculosis, and from a multidisciplinary approach showed the role of these components in the ABC transporter family. The use of peptides encoding the coupling helix of the transmembrane components, proved to be an interesting alternative for studies of protein-protein interaction in these transporters, and this approach can serve as a model for the study of these interactions in other membrane systems and future transporter inhibition studies in pathogenic bacteria Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 FAPESP 2018/20162-9