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Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Drug discovery is a highly time-consuming, complex, and expensive process with low success rates. Recent estimates point out that an average of $1.8 billion and twelve years of work are required to launch a new drug. This state of affairs is partly due to how high-dimensional the chemical space is, as it has been estimated to include between 10^33 and 10^60 synthetically accessible molecules. Evaluating the entire chemical space is prohibitively expensive, so it is of the utmost importance to find ways of narrowing down the search space. To this goal, artificial intelligence has recently been incorporated into drug discovery in many forms; among them, deep generative models have shown great potential for producing putative drug candidates. Even so, this technology is still in its infancy and possesses some fundamental flaws; for instance, these models hardly ever account for tridimensional molecular information or are validated through life-like methods. This work aims to help this process with the provided molecular docking-based validation system for deep learning generative models, bridging their bountiful potential with drug discovery. The screening methodology was tested through analyses of case studies of four high-interest pharmacologic targets (A2aR, JAK2, KOR, and USP7). It consisted of three stages: crystal structures and docking tools assessment, molecule screening testing and application, and validation through molecular dynamics simulation. In these experiments, Autodock Fr and VINA demonstrated the highest performance on both accurately predicting molecular interaction and cross-docking. In the second stage, the exponential consensus scoring technique was evaluated, compared to other predictive standards, and displayed high acuity, correctly placing over 85% of the positive controls within very strict margins (5%); it was subsequently, applied to sets of molecules produced by deep machine learning for computer-aided drug design. In validation, a clear difference in ligand-receptor stability between the best and worst scoring molecules of the previous stage was demonstrated, indicating the reliability of the proposed methodology.It was also observed that, although the standard setup can be somewhat lengthy, the tests of subsequent generative models can be done in a far reduced time span, as the resulting data of multiple steps can simply be reused. Moreover, this method is non-redundant when compared to other traditional metrics, including logP and drug-likeness, and can be used in conjunction with these for further evaluation. Also, the data generated by this method can be used as feedback for generative models, potentially aiding in their training and increasing the quality of the molecules generated. A descoberta de medicamentos é um processo altamente demorado, complexo e caro, com baixas taxas de sucesso. Estimativas recentes apontam que para lançar um novo medicamento são necessários, em média, US$ 1,8 mil milhões e doze anos de trabalho. Essa situação se deve em parte à alta dimensionalidade do espaço químico, que estima-se incluir entre 10^33 e 10^60 moléculas sinteticamente acessíveis. Avaliar todo o espaço químico é proibitivamente caro, sendo, portanto, de extrema importância encontrar maneiras de restringir o âmbito de busca. Para tal, a inteligência artificial foi recentemente de várias maneiras incorporada na descoberta de medicamentos; dentre elas, modelos generativos profundos têm mostrado grande potencial para produzir possíveis candidatos a fármacos. Apesar disso, esta tecnologia ainda está em sua infância e possui algumas falhas fundamentais; por exemplo, tais modelos dificilmente levam em conta informações sobre configurações tridimensionais moleculares ou são validados por métodos realistas. Este trabalho visa ajudar tal processo com proposto o sistema de validação baseado em docking molecular para modelos generativos de aprendizado profundo, conectando seu vasto potencial à pesquisa de medicamentos. A metodologia de triagem foi testada por meio de análises de estudos de caso de quatro alvos farmacológicos de alto interesse (A2aR, JAK2, KOR e USP7) e consistiu em três etapas: avaliação de estruturas cristalográficas e ferramentas de docking, e teste e aplicação de triagem de moléculas e validação por meio de simulação de dinâmica molecular. Nesses experimentos, Autodock Fr e Vina demonstraram o mais alto desempenho tanto na previsão precisa da interação molecular quanto no cross-docking. Na segunda etapa, a técnica de consenso de pontuação exponencial foi avaliada, comparada a outros padrões preditivos, e apresentou alta acuidade, posicionando corretamente mais de 85% dos controles positivos dentro de margens muito restritas (5%); a metodologia foi posteriormente aplicada a conjuntos de moléculas produzidas por modelos generativos profundos para design de medicamentos. Na validação, foi demonstrada uma clara diferença na estabilidade ligante-receptor entre as moléculas de melhor e pior pontuação da etapa anterior, indicando a confiabilidade da metodologia proposta.Observou-se também que, embora a configuração padrão possa ser um pouco demorada, os testes de modelos generativos subsequentes podem ser feitos em um intervalo de tempo muito reduzido, pois os dados resultantes de várias etapas podem ser simplesmente reutilizados. Além disso, este método não é redundante quando comparado a outras métricas tradicionais, incluindo logP e drug-likeness, e pode ser usado em conjunto com estas para posterior avaliação. Os dados gerados por este método podem também ser usados como feedback para modelos generativos, auxiliando potencialmente em seu treinamento e aumentando a qualidade das moléculas geradas.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Este relatório surge no âmbito do Estágio Curricular em Bioquímica e ocorreu em contexto laboratorial no Controlo de Qualidade (CQ) da Labialfarma, indústria farmacêutica e nutracêutica pertencente ao Ferraz Group.Neste trabalho foram analisadas diferentes matérias-primas por métodos físico-químicos e cromatográficos. Foram escolhidas 8 matérias-primas distintas, das quais 3 são edulcorantes (sacarina sódica, manitol e maltitol), 2 são açúcares (lactose monoidratada e frutose) e as restantes são 3 fórmulas moleculares distintas de glucosamina. Todas elas foram analisadas por métodos físico-químicos, tais como a análise da solubilidade, a determinação do teor de água, a identificação por espectroscopia FTIR, entre outras técnicas que serão esclarecidas em detalhe ao longo do trabalho. O teor de glucosamina das 3 classes moleculares diferentes de glucosamina foi determinado por HPLC, utilizando um padrão de referência para a quantificação e seguindo condições cromatográficas definidas pelo CQ.As matérias-primas são analisadas segundo procedimentos internos do laboratório que são elaborados de acordo com as monografias descritas nas Farmacopeias (europeia, americana ou britânica) para cada matéria-prima e que ditam os intervalos ou limites de aceitação em que se podem encontrar os resultados obtidos.Todas as matérias-primas analisadas se encontraram dentro das especificações estipuladas para cada um dos ensaios realizados e, por isso, todas estavam em conformidade. Isto significa que foram aprovadas pelo CQ e que seguiram para serem usadas na produção de suplementos e/ou medicamentos. This report was written in the scope of the Curricular Internship in Biochemistry and had place in Labialfarma’s Quality Control (QC) laboratory. Labialfarma is a pharmaceutical and nutraceutical company, being a member of Ferraz Group.Different raw materials were analyzed by physicochemical and chromatographic methods. Eight different raw materials were selected, being that 3 were sweeteners (saccharin sodium, mannitol and maltitol), 2 were sugars (lactose monohydrate and fructose) and the other three were distinct molecular forms of glucosamine. All of them were assessed using physicochemical methods like solubility test, water content determination, identification by FTIR spectroscopy, among other techniques that will be discussed in detail along the next chapters.The glucosamine content of the different molecular forms was determined by HPLC following chromatographic conditions established by QC and using a reference standard for the analyte quantification.The laboratory internal procedures that were applied to analyze the raw materials were developed in compliance with the Pharmacopeial monographs that establish the acceptance criteria for the experimental results for each compound.All of the analyzed compounds complied with the established specification for each performed assay and therefore were considered in accordance, meaning that all of the raw materials were approved by the QC and followed its natural course to the production zone where they will be used to manufacture supplements or drugs.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Infecções por bactérias multirresistentes são cada vez mais prováveis e são frequentemente um risco de vida. Uma das potenciais soluções para combater o aparecimento de é a introdução de péptidos antimicrobianos como antibióticos. Contudo, estes compostos têm limitações, como tempo de semi-vida demasiado curto ou efeitos secundários demasiado perigosos. Uma das soluções para os tornar mais eficazes é a sua modificação com polímeros, para alterar a sua farmacocinética e farmacodinâmica.Este trabalho teve por objectivo avaliar a eficácia da conjugação dos péptidos antimicrobianos polimixina B e polifemusina I com o polímero policaprolactona como potencial modificação para melhorar os seus efeitos. A polimixina B é um antibiótico de última linha e a polifemusina I mesmo não tendo uso medico, demonstrou em laboratório ser eficaz contra uma vasta gama de microrganismosProcurou-se verificar que 1) não há impacto no mecanismo de acção, nomeadamente a interacção entre membranas e os conjugados e 2) verificar que as micelas se mantém estáveis em água. Foram realizadas simulações de dinâmica molecular clássica com o campo de forças AMBER e analisada a estrutura e dinâmica dos compostos em água.Neste trabalho, apesar de dificuldades em estabelecer os sistemas para simular, conseguimos com sucesso criar uma micela estável com PCL e polimixina B e criar uma membrana modelo para testar a membrana. Também explicamos os métodos e algum código python que foram utilizados para estabelecer os modelos. Infections by multi-resistant bacteria are rising in frequency and are often life-threatening. One of the proposed solutions is the introduction of antimicrobial peptides as antibiotics. However, these compounds suffer from a short half-life and can display cytotoxic effects, particularly severe haemolytic activity. Polymeric modification of antimicrobial peptides is a strategy that can be used to increase in their effectiveness and therapeutic spectrum, by altering their pharmacokinetics and pharmacodynamics properties.In this work we evaluated the conjugation effectiveness with polycaprolactone as a modification to improve the AMPs, specifically polymyxin B and polyphemusin I. Polymyxin B is one an antibiotic of last resort and polyphemusin I, - while not in medical use has been shown to be effective against a broad spectrum of microorganisms.We intended to 1) verify the mechanism of action, particularly in the interaction between the cell membranes and the conjugates, is not negatively impacted and 2) check if the micelles remain stable in water. We have performed classical Molecular Dynamics simulations with AMBER force field and analysed their structure and dynamics in water.In this work, despite time consuming difficulties establishing the systems to simulate, we succeeded in creating a stable micelle with PCL and polymyxin B and prepared a membrane model to test the micelle. We also explained the metodos and some of the python code that were utilized to establish the models.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O presente relatório tem como objetivo expor o conhecimento adquirido resultante do estágio laboratorial de regime observacional na área da Medicina da Reprodução na clínica Clinimer com a colaboração da Ferticentro, em Coimbra. Durante o período de estágio estabelecido, sendo que só foi possível a sua realização por um período de 2 meses dada a condição pandémica gerada pelo Sars-Cov-2, tive a possibilidade de estabelecer contacto com as práticas laboratoriais aplicadas em Reprodução Humana. Desta forma, este estágio laboratorial permitiu-me adquirir conhecimento das técnicas laboratoriais praticadas num laboratório de Procriação Medicamente Assistida (PMA).Observei desde a preparação de amostras seminais à sua aplicação nas técnicas de Inseminação Intrauterina (IIU), Fertilização in vitro (FIV), Microinjeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI), transferência embrionária e criopreservação e desvitrificação de gâmetas e embriões. Tendo por base este estágio, foi possível desenvolver um estudo retrospetivo para avaliar os efeitos dos poluentes ambientais na função espermática.Há décadas que inúmeros estudos científicos têm vindo a relatar uma diminuição da qualidade espermática de indivíduos expostos a poluentes presentes no meio ambiente, mesmo que em pequenas concentrações, nomeadamente devido ao aumento de emissões de gases poluentes associados ao excessivo tráfego automóvel, que tem impacto direto na reprodução masculina.Com o objetivo de quantificar o impacto resultante do intenso tráfego rodoviário na função espermática, foram selecionadas duas regiões críticas da cidade de Lisboa: Avenida da Liberdade e Entrecampos. Segundo o relatório anual da qualidade do ar na Europa, os poluentes mais nocivos à saúde humana e, claro, na função reprodutiva são o material particulado (MP2,5 e MP10) e o dióxido de nitrogénio (NO2).Em Portugal, a rede de monitorização da qualidade do ar é operada pela Agência Portuguesa do Ambiente (APA), sendo responsável pela validação dos dados registados pelos equipamentos de monitorização dos poluentes ambientais de uma determinada região. Assim, através do acesso à plataforma da APA foram obtidos os dados dos poluentes relevantes, disponibilizados pela base de dados da QualAr. Posteriormente, foram calculadas as concentrações mensais dos respetivos poluentes, durante os 12 meses do ano de 2019.A Diretiva Qualidade do Ar Ambiente (Diretiva QAA da UE, 2008) define normas de qualidade do ar relativas ás concentrações de poluentes presentes no ar ambiente. Desta forma, comparei com os dados obtidos resultantes do cálculo das concentrações mensais dos respetivos poluentes. Posteriormente, através da sustentação de bibliografia disponível, foi possível predizer o impacto na saúde reprodutiva destes indivíduos.Os resultados obtidos mostram que é expectável que se verifique uma diminuição da qualidade espermática dos indivíduos expostos nos meses de maior afluência rodoviária.Tendo em conta estes resultados, há a necessidade de adotar medidas preventivas de modo a não prejudicar a fertilidade dos indivíduos expostos. This report aims to transmit the knowledge acquired resulting from the observational laboratory internship in Reproductive Medicine at the Clinimer clinic with the collaboration of Ferticentro, in Coimbra.During the established internship period, it was only possible to carry it out for a period of 2 months given the pandemic condition generated by Sars-Cov-2, I had the opportunity to establish contact with the laboratory practices applied in Human Reproduction. Thus, this laboratory internship allowed me to acquire knowledge of laboratory techniques practiced in a Medically Assisted Procreation (PMA) laboratory.I observed from the preparation of seminal samples to its application in the techniques of Intrauterine Insemination (IUI), In Vitro Fertilization (IVF), Intracytoplasmic Microinjection (ICSI), embryo transfer and cryopreservation and devitrification of gametes and embryos.Based on this stage, it was possible to develop a retrospective study to assess the effects of environmental pollutants on sperm function.For decades, numerous scientific studies have been reporting the decrease in sperm quality of individuals exposed to pollutants present in the environment, even in small concentrations, namely due to the increase in the emission of pollutant gases associated with excessive car traffic, which has a direct impact on male reproduction.To quantify the impact resulting from intense road traffic on spermatic function, two critical regions of Lisbon were selected: “Avenida da Liberdade” and “Entrecampos”. According to the annual report on air quality in Europe, the pollutants most harmful to human health and, of course, reproductive function are particulate matter (PM2.5 and PM10) and nitrogen dioxide (NO2).In Portugal, the air quality monitoring network is operated by the Portuguese Environment Agency (APA), which is responsible for validating the data recorded by the monitoring equipment for environmental pollutants in each region. Thus, through access to the APA platform, data on relevant pollutants were obtained, made available by the QualAr database. Later the monthly concentrations of the respective pollutants were calculated, for the 12 months of the year 2019.The Ambient Air Quality Directive (EU QAA Directive, 2008) defines air quality standards regarding the concentrations of pollutants present in the environment. In this way I compared with the data obtained from the calculation of monthly concentrations of the respective pollutants.Subsequently, through the support of the available bibliography, it was possible to predict the impact on the reproductive health of these individuals.The results obtained show that a decrease in the sperm quality of exposed individuals is expected in the months of greater traffic flow.Considering these results, there is a need to adopt preventive measures in order to not harm the fertility of exposed individuals.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa, microaerofílica e patogénica. Coloniza o epitélio gástrico, podendo induzir infeção graças a uma série de mecanismos de adaptação que desenvolveu ao coevoluir com os seres humanos. Estima-se que mais de metade da população mundial esteja infetada, com maior incidência nos países em desenvolvimento. A infeção é geralmente adquirida durante a infância e desenvolvida durante a idade adulta, dependendo da relação bactéria-hospedeiro e da patogenicidade dos seus fatores de virulência. Assim, é um fator de risco para o desenvolvimento de patologias gástricas, como a gastrite (atrófica), úlceras pépticas e até mesmo doenças malignas como o linfoma do tipo MALT e o adenocarcinoma gástrico. A infeção é geralmente tratada com um conjunto de antibióticos e medicação supressora de ácido. Contudo, este tipo de terapia tem-se verificado menos eficaz devido ao aumento da resistência bacteriana à ação dos antibióticos. Adicionalmente, tem efeitos secundários adversos associados e nem sempre é acessível, o que cria a necessidade do desenvolvimento de terapias alternativas. Os produtos naturais apresentam-se como uma potencial terapêutica convencional ou adjuvante, devido à sua ampla gama de atividades biológicas e propriedades medicinais. Nas ultimas décadas, têm sido conduzidos vários estudos sobre a ação destes compostos no combate à infeção causada por Helicobacter pylori. Estes elementos podem atuar através de diversos mecanismos de ação, incluindo atividades antioxidantes, anti-inflamatórias e anti-adesivas, efeitos antimicrobianos diretos e imunoestimulantes, ou mesmo inibindo fatores de virulência bacteriana. No presente trabalho, são apresentados alguns exemplos de compostos naturais que foram testados em Helicobacter pylori, os métodos utilizados e os resultados obtidos. Estão incluídos diversos alimentos como vegetais, frutas, uma especiaria, chá, peixe e azeite, um probiótico, uma proteína animal, plantas medicinais, produtos marinhos, um fungo e um produto resultante da atividade animal. Estes compostos revelam resultados promissores ao inibir a bactéria e/ou ao melhorar os efeitos que surgem da infeção. Contudo, mais estudos terão de ser realizados para definir a eficácia e segurança dos produtos naturais na generalidade e permitir o seu uso como terapia contra a infeção causada por Helicobacter pylori. Helicobacter pylori is a Gram-negative, microaerophilic and pathogenic bacterium. It colonizes the gastric epithelium and can induce infection due to a series of adaptation mechanisms that developed when coevolving with humans. It is estimated that more than half of the world population is infected, with a higher incidence in developing countries. The infection is usually acquired during childhood and developed during adulthood, depending on the bacterial-host relationship and the pathogenicity of its virulence factors. Thus, it is a risk factor for the development of gastric pathologies, such as (atrophic) gastritis, peptic ulcers and even malignant diseases such as MALT lymphoma and gastric adenocarcinoma. The infection is usually treated with a set of antibiotics and acid suppressant medication. However, this type of therapy has been found to be less effective due to increased bacterial resistance to the action of antibiotics. In addition, it has associated adverse side effects and is not always accessible, which creates the need of developing alternative therapies. Natural products are a potential conventional or adjuvant therapeutic, due to their wide range of biological activities and medicinal properties. In the last few decades, various studies have been conducted on the action of these compounds in fighting the infection caused by Helicobacter pylori. These elements can act through several mechanisms of action, including antioxidant, anti-inflammatory and anti-adhesive activities, direct antimicrobial and immunostimulating effects, or even inhibiting bacterial virulence factors. In the present work, there are presented some examples of natural compounds that were tested on Helicobacter pylori, the used methods and the obtained results. There are included diverse foodstuffs such as vegetables, fruits, a spice, tea, fish and olive oil, a probiotic, an animal protein, medicinal plants, marine products, a fungus and a resulting product from animal activity. These compounds reveal promising results by inhibiting the bacterium and/or by improving the effects that arise from the infection. However, further studies will have to be conducted, to define the effectiveness and safety of natural products in general and to allow their use as a therapy against Helicobacter pylori infection.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Com o passar dos anos, as doenças cancerígenas tornaram-se um dos maiores e mais letais problemas de saúde em todo o mundo. No entanto, os tratamentos convencionais contra o cancro têm vindo a ser caracterizados como muito invasivos e prejudiciais para os pacientes, devido aos efeitos secundários indesejáveis e à alta toxicidade, uma vez que não apresentam especificidade para células tumorais. Numa tentativa de superar essas limitações, a nano e a biotecnologia surgiram como ferramentas inteligentes para transportar e entregar agentes terapêuticos no tratamento do cancro e torná-los mais eficientes.As nanopartículas mesoporosas de sílica (MSN) são um nanossistema de entrega promissor com propriedades físico-químicas notáveis, que podem oferecer uma abordagem interessante para a atual investigação no tratamento do cancro e para a prática clínica. Assim, este trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar um novo sistema de entrega, baseado em MSN, para uma potencial terapia combinada contra Carcinoma Hepatocelular (CHC), utilizando um Interferon α-2b humano recombinante (IFNα-2b) e Epirrubicina (Epi) como agentes terapêuticos.Durante este projeto, as MSN foram sintetizadas e modificadas com (3-Aminopropil) trietoxisilano (APTES) para serem funcionalizados com ácido hialurónico (HA), o que permite que as partículas se liguem especificamente às células tumorais. As nanopartículas obtidas (MSN-HA) apresentaram uma superfície carregada negativamente e um diâmetro hidrodinâmico médio de 467 nm, determinado pelas leituras de LDV e DLS.O IFNα-2b recombinante foi produzido e purificado com sucesso, resultando num grande stock de proteína para ensaios de carregamento e citotoxicidade. Ambos os agentes terapêuticos foram carregados nas MSN-HA, apresentando resultados de alta eficiência e capacidade de carregamento, quando comparados com estudos anteriores.Finalmente, a biocompatibilidade das nanopartículas e o potencial terapêutico do nanossistema carregado foram avaliados em células HepG2. O resultado final foi bastante promissor, uma vez que o MSN-HA provou ser biocompatível quando descarregado, e as nanopartículas carregadas com Epi e IFNα-2b mostraram um efeito antitumoral sinergístico. Over the years, cancer diseases have become one of the biggest and most lethal health problems worldwide. However, conventional cancer treatments have shown to be too invasive and harmful for patients, due to undesirable side effects and high toxicity since they don’t present specificity for tumour cells. In order to try to overcome these limitations nano and biotechnology emerged as smart tools to transport and deliver therapeutic agents in cancer treatment and making them more efficient. Accordingly to that, mesoporous silica nanoparticles (MSN) are a promising delivery nanosystem with remarkable physicochemical properties that can offer an interesting approach for the current cancer treatment research and clinical practice. Thus, this work aims to develop and characterize a new delivery system, based on MSN’s, to a potential combination therapy against Hepatocellular Carcinoma (HCC), using a recombinant human Interferon α-2b (IFNα-2b) and Epirubicin (Epi) as therapeutic agents.During this project, MSN were synthesized and modified with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to be functionalized with hyaluronic acid (HA), which allowed them to specifically bind to tumour cells. The obtained nanoparticles (MSN-HA) presented a negatively charged surface and an average hydrodynamic diameter of 467 nm, determined by Laser Doppler Velocimetry (LDV) and Dynamic Light Scattering (DLS) readings. Recombinant IFNα-2b was successfully produced and purified resulting in a great protein stock for loading and cytotoxicity assays. Both therapeutic agents were loaded in MSN-HA presenting high loading efficiency and capacity results when compared with previous studies.Finally, nanoparticles’ biocompatibility and the therapeutic potential of the loaded nanosystem were evaluated in HepG2 cells. The outcome was very promising, since MSN-HA were proven to be biocompatible when unloaded, and the loaded nanoparticles with Epi and IFNα-2b have shown a synergistic antitumour effect.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O conhecimento científico é, hoje, essencial para compreender muitos aspetos do mundo que nos rodeia, desempenhando um papel importante na formação da opinião e na tomada de decisão dos cidadãos relativamente a uma série de questões importantes, nomeadamente relacionadas com a saúde. A comunicação de ciência assume-se, assim, fundamental, para que que a ciência passe do plano da investigação e dos cientistas, para a esfera da sociedade e do debate público. A aplicação de células estaminais em terapia celular e medicina regenerativa, como área da ciência e da biomedicina em expansão, é um assunto do interesse dos cidadãos, sobre o qual é pertinente realizar ações de comunicação de ciência. Este trabalho procurou identificar a importância e os desafios da comunicação de ciência, no contexto de uma empresa de biotecnologia, tanto na sua vertente externa como interna. Na vertente de comunicação externa, destacam-se a divulgação de conteúdos científicos nos mass media e as iniciativas dirigidas a estudantes. Na vertente de comunicação interna, o trabalho desenvolvido pretendeu fazer uma análise exploratória da perceção dos colaboradores sobre a importância de comunicar ciência internamente. Os conteúdos de caráter científico produzidos tiveram uma boa aceitação por parte da imprensa, com a geração de aproximadamente 5 notícias por cada comunicado de imprensa divulgado. Adicionalmente, estes conteúdos deram um importante contributo para o total de notícias e interação gerada nas redes sociais da organização. Apesar de o Facebook ter sido a plataforma a alcançar maior número de pessoas, foi no LinkedIn que os utilizadores mais se envolveram com os conteúdos científicos partilhados. As iniciativas de comunicação de ciência dirigidas a estudantes revelaram-se eficazes, com demonstrada aquisição de novos conhecimentos, tendo ainda evidenciado níveis de envolvimento e atitude muito positivos relativamente ao tema das células estaminais. O inquérito realizado aos colaboradores revelou um sólido conhecimento acerca dos temas abordados e grande envolvimento da globalidade da organização com os temas científicos relacionados com terapia celular e medicina regenerativa. Estes resultados reiteram a importância de dar continuidade aos projetos de comunicação de ciência em curso e perspetivam uma boa aceitação de novos projetos que venham a ser implementados. Understanding key-concepts of science and tecnhology is, nowadays, essential to understand the world around us, playing a crucial role in shaping public opinion and decision-making on a number of important issues such as health. In this setting, science communication is key to bringing science closer to the public and open for debate. The application of stem cells in cell therapy and regenerative medicine, as an expanding biomedical field is an increasingly relevant subject, suitable for science communication initiatives. The present work sought to identify the importance and challenges presented to a biotechnology company when communicating science both through outreach and inreach activities. The produced scientific content was well accepted by the press, with the generation of approximately 5 news per press release. Additionally, these contents made an important contribution to the total number of posts and interaction on social media. Although Facebook was able to reach a larger number of users, on LinkedIn the public was more involved with the scientific content. Science communication initiatives aimed at students have proven to be effective, with demonstrated acquisition of new knowledge, and have also shown very positive levels of involvement and attitude towards stem cells. The survey conducted internally revealed a solid scientific knowledge and a healthy involvement of the organization with the science behind cell therapy and regenerative medicine. These results underline the importance of the ongoing science communication projects and encourages the development of new initiatives.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Alfa-sinucleína (a-sin) é uma proteína envolvida em casos esporádicos e alguns familiares da doença de Parkinson (DP), uma doença neurodegenerativa de movimento relacionada com a idade que afeta principalmente os neurónios dopaminérgicos da porção compacta da substância nigra e, progressivamente, todo o córtex. Em sinucleinopatias relacionadas com DP, é perturbada a homeostase de cálcio intracelular, aumentado os níveis de espécies reativas de oxigénio e danificando os sistemas de degradação de proteínas como o sistema da ubiquitina-proteassoma e a via da autofagia-lisossoma. Disfunção mitocondrial já foi amplamente descrita em contexto de PD, incluindo a inibição do complexo I, depleção de energia e aumento dos níveis de espécies reativas de oxigénio mitocondrial, que em conjunto agravam os processos citotóxicos. Adicionalmente, os agregados de a-sin parecem inibir a mitofagia, um processo específico de autofagia que degrada mitocôndrias danificas, fazendo com que estas se mantenham na célula. Tendo em conta que as características da DP podem surgir do acumular de a-sin,WT o principal objetivo deste estudo foi definir a citotoxicidade de eventos ligados à desregulação da degradação de proteínas, principalmente a danificação via da autofagia-lisossoma, e da mitofagia em células de neuroblastoma humano SHSY-5Y com um sistema Tet-Off condicionado. Aqui, é mostrado que a sobre-expressão de a-sin WT causa um aumento nos níveis de espécies reativas de oxigénio e alterações nos níveis de proteínas autofágicas que impede a a-sin WT de ser degradada. Além disso, quando a a-sin WT sobre-expressada colocaliza com a mitocondria, o potencial da membrana mitocondrial é reduzido e a morfologia mitocondrial alterada, o que pode confirmar a degredação seletiva mitocondrial através da via da autofagia-lisssoma/via da mitofagia. Compreender as mudanças na autofagia/macroautofagia e na mitofagia associadas a níveis aumentados de a-sin WT pode ajudar a identificar estratégias neuroprotetoras seletivas destinadas a atenuar a progressão da DP. Alpha-synuclein (a-Syn) is a protein involved in both sporadic and some familial forms of Parkinson’s disease (PD), an age-related neurodegenerative movement disorders that mainly affects dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and progressively the whole cortex. In PD-related synucleopathies, the protein forms oligomers that are toxic to the cell, disrupting intracellular calcium homeostasis, increasing the levels of reactive species of oxygen (ROS) and causing the impairment of proteastase mechanisms, such as the ubiquitin-proteasome system (UPS) and autophagy-lysosome pathway (ALP). Mitochondrial dysfunction has been also largely described in PD, including complex I inhibition, energy depletion and increased mitochondrial ROS levels, which together exacerbate cytotoxic processes. Additionally, a-syn aggregates seem to abrogate mitophagy, a selective autophagy process that degrades damaged mitochondria, thus maintaining damaged mitochondria in cells. Considering that PD features may arise from accumulated levels of WT a-syn, the main goal of this study was to define the cytotoxic events linked to deregulated proteastase, namely dysfunctional ALP, and mitophagy in human neuroblastoma catecholaminergic Tet-Off conditional SH-SY5Y cells. Here we show that WT a-syn overexpression causes increase cellular ROS levels and alterations in autophagic protein levels that preclude WT a-syn from being degraded. Furthermore, when overexpressed WT a-syn colocalizes with mitochondria leading to decreased mitochondrial membrane potential and altered morphology, which may endorse mitochondrial selective degradation through ALS/mitophagy pathways. Understanding the changes in autophagy/macroautophagy and mitophagy linked to increased levels of WT a-syn may help to identify selective neuroprotective strategies aimed to alleviate PD progression.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa com uma etiologia fortemente associada com alterações metabólicas, nomeadamente com disfunção mitocondrial. A disfunção mitocondrial é considerada um dos eventos iniciais do processo neurodegenerativo na DP esporádica. Em condições normais, mitocôndrias disfuncionais são degradadas através da mitofagia, no entanto na DP esta via parece estar também comprometida, impedindo a remoção destes organelos disfuncionais. Uma rede mitocondrial fragmentada permite a exposição de padrões moleculares associados a danos (DAMPS), o que leva a uma ativação da imunidade inata. Neste estudo abordámos o “crosstalk” entre a disfunção mitocondrial e a ativação da imunidade inata em células citoplasmáticas híbridas (cíbridos), derivadas de teratocarcinoma humano (NT2) que contêm ADN mitocondrial de doentes com DP ou de indivíduos controlo. Para este propósito expusemos os cíbridos de controlo e de DP a lipolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas e/ou a leupeptina e cloreto de amónia, um par de compostos que bloqueia a autofagia, e consequentemente a mitofagia. O objetivo foi mostrar que a disfunção mitocondrial pode regular respostas da imunidade inata no contexto de DP. A este respeito, foi observado que cíbridos de DP têm o potencial membranar mitocondrial diminuído, o que se correlaciona com uma rede mitocondrial fragmentada que foi visualizada por microscopia, e a um aumento dos níveis de DRP1 fosforilada. Uma rede mitocondrial fragmentada expõe cardiolipin que funciona como um DAMP ativando a imunidade inata. Observámos que cíbridos de DP têm níveis basais de TLR3, NLRP3 e a sua proteína adaptadora ASC aumentados. No entanto, verificamos que o LPS e a leupeptina e o cloreto de amónia conseguem aumentar as respostas imunes. Resultados similares foram obtidos para a ativação da caspase 1, que está aumentada em condições basais nos cíbridos DP e que aumentou com ambos os tratamentos. Verificamos que os cíbridos de DP também têm um fluxo autofágico de LC3 basal e de p62 comprometido, o que demonstra que a mitofagia também está comprometida. A acumulação de mitocôndrias disfuncionais aumenta as respostas da imunidade inata em cíbridos DP aumentando ainda mais a ativação do inflamossoma NLPR3. Finalmente, investigámos a oligomerização de α-sinucleína (α-sin) nas condições descritas. Detetámos que os cíbridos de DP têm uma acumulação de oligómeros de α-sin basal e que apena o tratamento com leupeptina e cloreto de amónia aumenta a sua acumulação. Em conclusão, nós provamos a disfunção mitocondrial está na base da ativação da imunidade inata em DP. Parkinson Disease (PD) is a neurodegenerative disorder which etiology has been strongly associated with metabolic abnormalities namely mitochondrial dysfunction. Since mitochondria control a wide range of cellular processes the up-stream position of this organelle in the cascade of events leading to neurodegeneration in PD has been recognized. In healthy conditions, dysfunctional mitochondria are degraded through mitophagy however in PD mitochondrial degradation is impaired, preventing the clearance of these dysfunctional organelles. Without this clearance innate immunity responses will be activated, through the exposition of damage associated molecular patterns (DAMPs). In this study we addressed the crosstalk between mitochondrial dysfunction and the activation of innate immunity pathways, through the use of cytoplasmatic hybrids (cybrid) cells, derived from NT2 teratocarcinoma, repopulated with mitochondrial DNA from PD patients or age-matched control subjects. For this purpose, we exposed PD and control cybrids to lipopolysaccharide (LPS) from gram negative bacteria and/or to leupeptin plus ammonium chloride (NH4Cl), a pair of compounds that blocks autophagy, and consequently, mitophagy. The goal was to provide evidence that mitochondrial dysfunction can regulate innate immune responses in a context of PD. In this regard, observed that PD cybrids have decreased mitochondrial membrane potential which correlates with a fragmented mitochondrial network visualized by microscopy and the increased levels of phosphorylated DRP1. Fragmented mitochondrial network exposes cardiolipin that functions as a DAMP activating innate immunity responses. We observed that PD cybrids have basal increased levels of TLR3, NLRP3 and its adaptor protein ASC and can further increment immune responses when exposed to LPS and leupeptin plus ammonium chloride. Similar results were obtained for caspase 1 activity, which is increased in PD cybrids in basal conditions and increase with both treatments. PD cybrids also have basal impaired LC3 autophagic flux and p62 flux, which is specific for mitophagy. This accumulation of dysfunctional mitochondria upholds innate immunity responses in PD cybrids further increasing NLRP3 inflammasome activity. Finally, we investigated the oligomerization of α-synuclein (α-syn) in the described conditions. We detected that PD cybrids have basal accumulation of α-syn oligomers and only leupeptin and ammonium chloride treatment further increases its accumulation. In conclusion we prove that mitochondria are at the base of innate immunity activation in PD. Outro - A dissertação foi realizada com fundos do projeto The role of quality control mechanisms in the loss of proteostasis in age-dependent neurodegenerative disorders. (2018-2021) Project POCI-01-0145-FEDER-030712, financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia A enzima SgrAI pertence às endonucleases de restrição do tipo IIF. É descrita como altamente específica devido não só à sua sequência de reconhecimento de 8 pares de bases, bem como tendo modulação alostérica. Porém, a reação de catálise da SgrAI ainda se encontra muito pouco caracterizada e, apesar de se esperar que esta ocorra da mesma forma que as enzimas que usam o mesmo cofator, dois iões de Mg2+, ainda não há evidências publicadas.Dessa forma, o objetivo deste e trabalho passa por caracterizar em detalhe as ligações entre o complexo enzima/DNA e a especificidade das mesmas através de métodos baseados em dinâmica molecular clássica e métodos de Mecânica Quântica/Mecânica Molecular (QM/MM).Para este estudo foram utilizados quatro modelos da enzima SgrAI, mais concretamente a forma de dímero, dímero com uma mutação num dos pares de bases, em forma de tetrâmero com iões de Ca2+ e na forma de tetrâmero com iões de Mg2+. Tanto para os modelos diméricos como para o modelo tetramétrico com iões de Ca2+ apenas foram realizadas simulações de dinâmica molecular para a estrutura inicial. Para o modelo tetramérico com iões de Mg2+, descrito como sendo a forma mais eficiente da SgrAI, o estudo prosseguiu utilizando métodos QM/MM, com a lisina em diferentes estados de protonação, para caraterizar o mecanismo de catalítico da enzima. Em todas as hipóteses testadas a posição do segundo ião magnésio revelou-se problemática e as barreiras de energia livre associadas foram sempre demasiado elevadas para sistemas biológicos. Este facto leva-nos a propor que o mecanismo para esta enzima poderá ter variações em relação ao mecanismo dos dois iões metálicos. The SgrAI enzyme belongs to the type IIF restriction endonucleases. It is described as being highly specific due not only to its 8 base pair recognition sequence as well as having allosteric modulation. However, the catalysis reaction of SgrAI is still poorly characterized and although it is expected to occur in the same way as the enzymes that use the same cofactor, two Mg2+ ions, there is still no published evidence. Thus, the purpose of the present work is to characterize in detail the interactions between the enzyme/DNA complex and the specificity of the same through Classical molecular dynamics and Quantum Mechanics/Molecular Mechanics (QM/MM) methods.In order to attain that objective four models were used, namely SgrAI in the form of dimer, dimer with a mutation in one of the bases, in the form of tetramer with Ca2+ ions and in the form of tetramer with Mg2 + ions. The initial structures for the dimeric models and the tetrameric model with the Ca2+ ions were subjected to Molecular Dynamics (MD) simulations. The tetrameric model with Mg2+ ions, which is described as the most efficient form of SgrAI, was also studied using QM/MM methods with the lysine in different protonation states. In all tested hypothesis, the position of the second metal ion was problematic and the associated free energy barriers were too high for a biological reaction. This led us to propose that, for this specific case, there could be deviations to the archetypal two-metal ions catalysis mechanism.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Devido à relevância das interações proteicas nas diferentes funções celulares, é importante conseguir detetar a existência das mesmas. Como os métodos computacionais conseguem lidar com um grande número de dados de forma rápida, têm sido muito usados na previsão das interações proteína-proteína. Dessa forma esta tese pretende, com o recurso a novas features, desenvolver um método que melhore a performance da previsão de interações proteicas num dataset aleatório. O resultado destas pesquisas foram três novas abordagens de extração de features sendo elas o recurso a bases de dados de inibidores, o recurso a redes de co-expressão génica e o recurso a módulos de reconhecimento peptídico. Destas três, devido à maior simplicidade e praticabilidade, desenvolveu-se estudos usando a última abordagem enunciada, recorrendo nomeadamente aos domínios SH3, SH2, PDZ, WW e LRR. Para saber se estes domínios são uma boa fonte de features e que podem ser usados utilizando qualquer dataset, analisaram-se os mesmos na deteção de novas interações entre proteínas que não os possuem. Assim no decorrer do trabalho desta tese foram criadas três estratégias, a primeira baseava-se na extração de features pelo software PyDPI (fazendo uso dos descriptors AAC, CTD, Moranauto, QSO, SOCN e CT) e na avaliação da performance dos datasets por descriptor; a segunda estratégia recorreu às mesmas features mas avaliou a performance em datasets com todos os descriptors; a terceira estratégia avaliou a performance como a segunda estratégia mas usando features criadas para o artigo “A Sequence-Based Mesh Classifier for the Prediction of Protein-Protein Interactions". As duas primeiras estratégias foram postas de parte devido a metodologia incorreta e a valores pouco significativos. A terceira estratégia apesar de ter sido efetuada de uma forma bastante controlada também resultou em valores pouco significativos, pelos que se aconselha ao prosseguimento do estudo desta abordagem com novas estratégias e features. Due to the relevance of protein interactions in different cellular functions, it is important to be able to detect their existence. Because computational methods can handle large numbers of data quickly, they have been widely used in predicting protein-protein interactions. Thus, this thesis intends, with the use of new features, to develop a method that improves the predictive performance of protein interactions in a random dataset. The results of these researches were three new approaches of extraction of features, being: the use of databases of inhibitors, the use of gene co-expression networks and the use of peptide recognition modules. Of these three, due to the greater simplicity and practicality, studies were developed using the last approach enunciated, resorting in particular to the SH3, SH2, PDZ, WW and LRR domains. In order to know if these domains are a good source of features and that can be used using any dataset, they were analyzed in the detection of new interactions between proteins that do not possess them. Thus, in the course of the work of this thesis three strategies were created, the first one was based on the extraction of features by the software PyDPI (making use of descriptors AAC, CTD, Moranauto, QSO, SOCN and CT) and in the performance evaluation of datasets by descriptor ; the second strategy resorted to the same features but evaluated the performance in datasets with all descriptors; the third strategy evaluated performance as the second strategy but using features created for the article "The Sequence-Based Mesh Classifier for the Prediction of Protein-Protein Interactions." The first two strategies were set aside due to incorrect methodology and poor values. The third strategy, despite being carried out in a very controlled manner, also resulted in insignificant values, for which it is advisable to continue the study of this approach with new strategies and features.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry (FC) is a technique that has been used for the hematologic neoplasm diagnosis, classification, prognosis and therapy monitoring. In the minimum diagnostic criteria, FC analysis of bone marrow (BM) cells was suggested as a co-criterion for the diagnosis of Myelodysplastic Syndromes (MDS) by the 2016 World Health Organization (WHO) Classification of Myeloid Neoplasms and Acute Leukemia. The molecular and cytogenetic techniques sensitivity and specificity, especially fluorescence in situ hybridization (FISH), used in MDS diagnosis, can be improved by FC mediated cell sorting. Despite its several advantages, FC immunophenotyping still faces several limitations in the contribution to the MDS diagnosis, namely the reduced knowledge about the erythroid maturation in normal MO and the lack of erythroid characterization markers, which makes the study of associated dysplasia less sensitive. The diagnostic panel for B-cell Chronic Lymphoproliferative Disorder (B-CLPD) includes markers whose expression shown to be altered in the erythroid lineage of MDS cases, namely CD43 and CD49d.This work consisted of two major objectives. The first consisted on the separation of the cells from the monocytic, granulocytic (neutrophilic) an erythroid lineages and the (CD34+/-/CD117+) cells from the BM of 55 cases with suspected MDS (71 ± 12 years), corresponding to 21 women and 34 men, in order to increase the FISH technique sensitivity (32 processed cases) and to detect the incidence of the most frequent genetic alterations in this entity, thus contributing to the diagnosis and prognosis. Chromosomal abnormalities were detected in only 17 processed cases, namely del (20q), monosomy 7, del (7q), del (5q), (-Y), and trisomy 8.The second objective was to study the expression pattern of CD43 and CD49d markers, both included in the diagnostic panel of B-CLPD, in the normal BM CD34+ compartment and in the erythroid maturation, being the latter studied in the normal BM and in MDS diagnosed cases. For this, 31 samples of BM aspirates were evaluated, of which 13 samples from normal BM and 18 samples from patients diagnosed with MDS. The MDS group was divided into MDS I (which includes MDS cases with single lineage dysplasia (n=2) and with multilineage dysplasia (n=6)); MDS II (which includes MDS cases with excess blasts 1 (n=3) and excess blasts 2 (n=7). Also, among all MDS cases (n=18), a third group of MDS with erythroid dysplasia demonstrated by morphology (n=7) was defined.In the CD34+ compartment, the expression of CD43 and CD49d shown to be much higher in the hematopoietic precursors compromised with the erythroid lineage compared to the precursors involved with the other lineages. In normal erythroid maturation, there was a decrease in the expression of CD43 across the different stages, with a high expression in stage I and a consequent decrease until the last stage. The expression pattern of CD49d was characterized by an increase in expression levels from stage I to stage II, by maintained expression between stage II and III and by a constant decrease from stage III to the last stage, which presented the lowest expression of this marker. In the MDS group, the expression of CD43 and CD49d showed to follow the same pattern observed in normal BM, however, a statistically significant decrease in mean fluorescence intensity (MFI) values was observed in all maturation stages for both markers, compared to the control group, particularly in MDS II and MDS with morphologic erythroid dysplasia.The results obtained during this study reinforce the contribution of FC in the MDS diagnosis and point to the usefulness of CD43 and CD49d markers in the erythroid maturation characterization, thus contributing to expand the panel of markers used for the study of this lineage, and since both markers are included in the B-CLPD diagnostic panel, could contribute to the concomitant diagnosis of a chronic B cell disorder and a possible MDS. A imunofenotipagem por Citometria de Fluxo multiparamétrica (CF) é uma técnica que tem sido utilizada para o diagnóstico, classificação, prognóstico e monitorização da terapêutica de neoplasias hematológicas. Nos critérios mínimos de diagnóstico, a análise de células da medula óssea (MO) por CF foi sugerida como um co-critério para o diagnóstico de Síndromes Mielodisplásicas (SMD) pela Classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de Neoplasias Mieloides e Leucemia Aguda de 2016. A sensibilidade e especificidade das técnicas moleculares e citogenéticas, principalmente a técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH), utilizada no diagnóstico da SMD, podem ser melhoradas através da separação celular por CF. Apesar das suas várias vantagens, a imunofenotipagem por CF ainda enfrenta várias limitações ao nível da contribuição para o diagnóstico das SMD, nomeadamente o reduzido conhecimento sobre a maturação da linha eritroide, na MO normal e a falta de marcadores para a caracterização desta mesma linha, o que torna o estudo de displasias associadas pouco sensível. O painel de diagnóstico de Doenças Linfoproliferativas Crónicas de células B (DLPC-B) inclui marcadores cuja expressão mostrou ser alterada na linha eritroide em casos de SMD, nomeadamente o CD43 e o CD49d.Este trabalho engloba dois grandes objetivos. O primeiro consistiu na separação das células das linhas granulocítica (neutrófilo), monocítica e eritroide, e das células (CD34+/-/CD117+) da MO de 55 casos com suspeita de SMD (71 ± 12 anos), correspondendo a 21 mulheres e 34 homens, de forma a aumentar a sensibilidade da técnica de FISH (32 casos processados) e detetar a incidência das alterações genéticas mais frequentes nesta entidade, contribuindo desta forma para o diagnóstico e prognóstico. Foram detetadas anormalidades cromossómicas em apenas 17 dos casos processados, nomeadamente a del (20 q), monossomia do 7, del (7q), del (5q), anomalia (-Y), e a trissomia do 8.O segundo objetivo consistiu no estudo do padrão de expressão dos marcadores CD43 e CD49d no compartimento CD34+ da MO normal e na linha eritroide, sendo esta última estudada na MO normal e em casos diagnosticados com SMD. Para isso, foram analisadas 31 amostras de aspirados medulares referentes a 13 amostras de MO normal e 18 amostras de doentes com diagnóstico de SMD. O grupo SMD foi dividido em SMD I (que inclui casos de SMD com displasia unilinha (n=2) e casos com displasia multilinha (n=6)); SMD II (que inclui casos de SMD com excesso de blastos do tipo 1 (n=3) e tipo 2 (n=7)). Ainda, tendo em conta todos os casos de SMD (n=18), foi definido um terceiro grupo de SMD onde se observou displasia eritroide por morfologia (n=7). No compartimento CD34+ normal, a expressão de CD43 e CD49d mostrou ser bastante mais elevada nos percursores hematopoiéticos comprometidos à linha eritroide em comparação com os percursores comprometidos às outras linhas hematopoiéticas. Na linha eritroide normal, observou-se uma diminuição da expressão de CD43 ao longo da maturação, com uma elevada expressão no estádio I e com uma consequente diminuição até ao último estádio. O padrão de expressão de CD49d foi caracterizado por um aumento de expressão do estádio I para o estádio II, por uma expressão mantida entre o estádio II e III e por uma diminuição constante do estádio III até ao último estádio, que apresentou a menor expressão deste marcador. No grupo SMD, a expressão de CD43 e CD49d mostrou seguir o mesmo padrão observado na MO normal, no entanto, observou-se uma diminuição estatisticamente significativa nos valores da média da intensidade de fluorescência (MIF), em todos os estádios maturativos, para ambos os marcadores, em comparação ao grupo de controlo. Esta diminuição mostrou ser mais acentuada, e com significado estatístico, nos grupos SMD II e SMD com displasia eritroide, quando comparado com o grupo controlo, para ambos os marcadores. Os resultados obtidos ao longo do trabalho reforçam o contributo da CF no diagnóstico das SMD e apontam para a utilidade dos marcadores CD43 e CD49d na caracterização da maturação eritroide, contribuindo deste modo para expandir o painel de marcadores utilizados para o estudo desta linha, e uma vez que ambos os marcadores estão incluídos no painel de diagnóstico DLPC-B, poderiam contribuir para o diagnóstico concomitante de uma neoplasia crónica de células B e uma possível SMD.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O cancro de pulmão é a causa mais comum de morte por cancro, em todo o mundo, em ambos os sexos. Cerca de 80% a 85% dos casos de cancro de pulmão são pacientes com cancro de pulmão de não pequenas células (CPNPC), sendo os restantes 15% -20% cancro de pulmão de pequenas células (CPPC). O CPNPC é dividido em três grupos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes. Entre eles, os casos de adenocarcinoma representam cerca de 40 a 50% dos pacientes com CPNPC. O prognóstico para CPNPC é baixo, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos inferior a 20% sendo esta, ainda, pior para o CPPC, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos inferior a 5%.Durante muito tempo, os tratamentos de primeira linha foram a cirurgia, a quimioterapia ou a radioterapia. No entanto, a descoberta de várias mutações drivers da carcinogénese em pacientes com CPNPC, especialmente em casos de adenocarcinoma, permitiu o desenvolvimento de tratamentos personalizados com base nessas alterações moleculares específicas. Deste modo, as mutações no EGFR (Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico) representam até 15% dos adenocarcinomas e ocorrem principalmente no domínio tirosina quinase (TK) do gene. Mais de 80% dessas mutações consistem em deleções in-frame no exão 19 e na mutação pontual L858R no exão 21. Tais mutações induzem uma ativação constitutiva do EGFR, tornando-se um potencial alvo terapêutico. Assim, os pacientes portadores de mutações no EGFR podem beneficiar de um tratamento específico de primeira linha, mais especificamente, de inibidores de TK (TKI) que, de forma competitiva, inibem a fixação da adenosina trifosfato (ATP) ao local de ligação catalítica do domínio TK. Foram, também, propostos outros driver biomarcadores em cancro de pulmão podendo, alguns deles, fornecer informações adicionais para a tomada de decisões clínicas.Desta forma, o objetivo principal deste projeto foi avaliar mutações noutros alvos potencialmente acionáveis - MET e ERBB2 - em pacientes com adenocarcinoma, através da sequenciação de Sanger, e desenvolver um ensaio multiplex de PCR em tempo real, para uma rápida e sensível avaliação do estado mutacional em tecido e em plasma. Este ensaio também dará a oportunidade de monitorizar a evolução do estado mutacional no plasma durante o tratamento, para a predição de recidiva e controlo do aparecimento de clones com mutações de resistência.Do total de 172 amostras, 161 (88,9%) foram classificadas como negativas para alterações nos exões 18, 19, 20 e 21 do EGFR, enquanto 19 (11,1%) foram classificadas como positivas. No total das 19 alterações encontradas no EGFR, 73,7% foram deleções no exão 19 e 21% relataram a mutação Leu858Arg. Um caso de uma alteração T790M foi, também, encontrado num paciente. Numa frequência mais baixa, um caso Leu861Gln também foi relatado. No gene MET, as mesmas 172 amostras foram, igualmente, analisadas. Destas, 9 amostras (5,2%) apresentaram alterações no gene, incluindo 2 variantes intrónicas, 2 mutações indel e 5 mutações pontuais, no exão 14. As alterações no ERBB2 foram analisadas em 69 amostras, tendo sido detetado um caso de inserção de 12 bases no exão 20.Este trabalho permitiu concluir que uma proporção importante de casos apresenta mutações no MET e ERBB2, sendo que tais pacientes poderiam ser tratados com fármacos aprovados para esses alvos. Lung cancer is the most common cause of cancer death around the world, in both sex. About 80%–85% of lung cancer cases are non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients, the remaining 15%–20% are small-cell lung cancer (SCLC). NSCLC is divided into three categories called: adenocarcinoma, squamous-cell carcinoma and large cell carcinoma. Among them, adenocarcinoma cases account for around 40-50% of NSCLC patients. The prognosis for NSCLC is low with a five-year survival rate of less than 20%, and is even worse for SCLC with a five-year survival rate of less than 5%.For a long time, the first-line treatments have been surgery, chemotherapy or radiotherapy. However, the discovery of several oncogenic driver mutations in patients with NSCLC, adenocarcinoma cases in particular, has allowed the development of personalized treatments based on these specific molecular alterations. Therefore, EGFR (epidermal growth factor receptor) mutations account for up to 15% of adenocarcinoma and primarily occurred in the tyrosine kinase (TK) domain of the gene. More than 80% of these mutations consist of in-frame deletions in exon 19 and the L858R point mutation in exon 21. Such mutations induced a constitutive activation of EGFR, making it a potential therapeutic target. Thus, EGFR-mutated patients can benefit from a specific first-line treatment specifically the TK inhibitors (TKI) that competitively inhibits fixation of adenosine triphosphate (ATP) in the catalytic binding site of TK domain. Other driver biomarkers in lung cancer have also been proposed and some of them might provide additional information for clinical decision-making. In this way, the main goal of this project was to evaluate mutations in other potentially actionable targets – MET and ERBB2– in patients with adenocarcinoma by Sanger sequencing and to develop a Real Time PCR multiplex assay for rapid sensitive assessment of mutation profile in tissue and plasma. This assay, will also give the opportunity to monitor the evolution of mutational status in the plasma during the treatment for the prediction of relapse and control the appearance of clones with resistance mutations.Of the total of 172 samples, 161 (88.9%) were classified as negative for alterations in exons 18, 19, 20 and 21 of EGFR, whereas 19 samples (11.1%) were classified as positive. In total of the 19 alterations in EGFR, 73.7% were deletions in exon 19 and 21% was related to Leu858Arg mutation. A case of a T790M alteration was also founded in a patient. At a lower frequency, a case of a Leu861Gln was also reported. In MET gene, the same 172 samples were, also, analyzed. Of these, 9 samples (5.2%) harbored alterations in MET gene, including 2 intronic variants, 2 indel mutations and 5 pontual mutations in exon 14. ERBB2 alterations were analyzed in 69 samples and one case of an insertion of 12 bases in exon 20 were detected.This work allowed us to conclude that an important proportion of cases harbors mutations in MET and ERBB2 and these patients could potentially be treated with approved drugs for these targets.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Gene therapy is believed to have the necessary characteristics to become a frontline treatment in a variety of diseases, including cancer. To reach its full potential it is still necessary to develop suitable vectors for the transport and delivery of genetic material into target cells. Currently, the most used vectors are of viral type. However, non-viral strategies have been emerging in the last decades as promising alternatives, and the most prominent examples are liposomes and cationic polymers. These are advantageous especially due to the fact that they are safe and their properties are easy to manipulate. In spite of these advantages, most of the used non-viral systems still demonstrate low efficiencies in transfection. The objective of this work was to investigate the gene delivery potential of novel non-viral vectors, constituted by different combinations of two polymers, to efficiently transport and delivery DNA into target cancer cells. In order to do so, their transfection activity was measured in different cell lines through luminescence, fluorescence microscopy and flow cytometry. Other parameters like their cytotoxicity, degree of DNA condensation, size and surface charge were also evaluated. The obtained results have demonstrated that our formulations are good candidates for gene delivery, due to their potent transfection efficiencies when compared to a “golden standard” polymeric-based gene delivery system, branched polyethylenimine (bPEI). From the developed combined formulations, CE-based polyplexes, prepared at the 100/1 N/P ratio, were selected as the best formulation, owing to their great transfection activity, even in the presence of serum, that is much higher than that obtained with polyplexes prepared with each one of the two polymers, and to their reduced levels of cytotoxicity. Furthermore, the other experimental studies revealed that the polyplexes designed with this combination of polymers present suitable physicochemical properties for in vivo applications, namely a high level of DNA protection and a reduced mean diameter. A terapia génica é considerada uma estratégia terapêutica com as características necessárias para se tornar um tratamento de primeira linha para uma grande variedade de doenças, incluindo o cancro. Apesar disso, para atingir o seu potencial ainda é necessário desenvolver vectores adequados para o transporte e entrega de material genético às células alvo. Actualmente, a maioria dos vectores utilizados são de tipo viral. No entanto, nas últimas décadas, as estratégias do tipo não-viral têm vindo a impor-se como alternativas promissoras, sendo os mais proeminentes exemplos os lipossomas e os polímeros catiónicos. Estes sistemas são vantajosos especialmente na medida em que são seguros e as suas propriedades são fáceis de manipular. Apesar destas vantagens, a maioria destes vectores ainda demonstra uma baixa eficiência de transfecção. O objectivo deste trabalho foi investigar o potencial de novos vectores não-virais, constituídos por diferentes combinações de dois polímeros, para transportar e entregar o material genético de forma eficiente a células cancerígenas. Para tal, a eficiência de transfecção foi avaliada em diferentes linhas celulares através dos ensaios de luminescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Foram também avaliados outros parâmetros como a sua citotoxicidade, capacidade de condensação do DNA, tamanho e carga superficial. Os resultados obtidos mostraram que as nossas formulações são bons candidatos para entrega de material genético, devido à sua potente eficiência de transfecção quando comparada com a obtida com a referência padrão dos sistemas de base polimérica, polietilenimina ramificada (bPEI). Das formulações desenvolvidas envolvendo a combinação de polímeros, os poliplexos com base na combinação CE preparados na razão N/P de 100/1 foram selecionados como a melhor formulação, devido à sua elevada atividade de transfecção, mesmo na presença de soro, que é muito superior à obtida com os poliplexos preparados com cada um dos dois polímeros individualmente, e aos reduzidos níveis de citotoxicidade. Adicionalmente, os outros ensaios experimentais demonstraram que os poliplexos desenvolvidos com esta combinação de polímeros apresentam propriedades físico-químicas favoráveis à sua aplicação in vivo, nomeadamente elevada proteção de material genético e um diâmetro médio reduzido.

Dissertação de mestrado em Bioquiímica , apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Candida albicans é o microorganismo mais prevalente nos casos de infecções fúngicas em humanos, principalmente entre a população de doentes immunocomprometidos, incluindo doentes com septicémia, nos quais a incidência de infecções por fungos têm vindo a aumentar. Nestas situações, a deficiência imunológica permite ao fungo suprimir os mecanismos de defesa do hospedeiro. A influência do estado de septicémia, que inclui uma resposta inflamatória generalizada e severa, no desfecho da infecção fúngica, é uma área pouco estudada. Nestes casos, a infecção fúngica pode resultar da falta de reconhecimento pelo sistema imunitário ou uma resposta inflamatória aguda. Este trabalho teve como objectivo estudar o efeito de macrófagos pré-activados com lipopolissacárido bacteriano, um agente inflamatório, na resposta do hospedeiro à infecção por C. albicans. Em particular, a viabilidade dos macrófagos, das leveduras internalizadas e a resposta inflamatória mediada pela libertação de citocinas do macrófago. A principal conclusão tirada deste estudo é que uma exposição aguda, embora curta, dos macrófagos à endotoxina de Escherichia coli, não aumenta a resposta imunitária à infecção fúngica. Em primeiro lugar, foi detectado um aumento na produção da citocina TNF-α quando o macrófago é estimulado, durante uma hora, com LPS e seguidamente infectado com C. albicans. Um aumento da viabilidade do número de leveduras internalizadas pelos macrófagos foi observado. Do mesmo modo, o fagolisossoma parece mais activado. Contudo, e muito importante, nestas condições a viabilidade dos macrófagos sofre um ligeiro decréscimo. Compreender os mecanismos biológicos associados a infecções por fungos, aquando de uma resposta inflamatória aguda, seria uma importante contribuição no desenvolvimento de tratamentos mais eficazes destas infecções em doentes com septicémia. Candida albicans is the most prevalent fungal species in human fungal infections, mostly among the immunocompromised population, including patients suffering from severe sepsis, in which the incidence of invasive fungal infection has been increasing. In these situations, the immunological deficiency allows the fungi to overcome the protective host defense mechanisms. However, the influence of sepsis, which induces a severe inflammatory response, in the outcome of C. albicans infection is an interesting field. In these cases does the fungal disease result from a lack of recognition by the innate immune system or overreaction of the inflammatory response? The main goal of this work was to study the effect of macrophages priming by bacterial endotoxin (LPS), the major inflammatory mediator, in the outcome of C. albicans infection. In particular, the viability of infected macrophages and internalized yeast, C. albicans escape mechanisms and the inflammatory response mediated by the macrophages release of cytokine. The main conclusion of this study is that a short, but severe exposure of the macrophages to bacterial endotoxin, does not enhance the immune response to a subsequent C. albicans infection. First, an increase in the proinflammatory cytokine TNF-α was detected when macrophages were stimulated with LPS for one hour and then infected with C. albicans. Then, a slight decrease in the viability of internalized fungi was observed, and cellular phagolysosome activated. However, and most importantly, macrophages viability decreases slightly in this situation. Understanding the biological mechanisms associated with the fungal infection upon a severe inflammatory response, would be a major contribution to the development of efficient treatment of invasive fungal infections among patients with severe sepsis.