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The Laboratório Associado Institute for Biotechnology and Bioengineering (IBB) is a research unit aiming to be a strategic infrastructure for the development of the Portuguese R&D and innovation policies in the areas of Biotechnology, Bioengineering, Biomaterials and Life, Biomedical and Agricultural Sciences. IBB combines its R&D activities with advanced higher education, technology transfer, consulting and services, with the aim of fostering the industrial, health, agriculture and environmental sectors.

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica Comparar, acto tão comum no nosso quotidiano, sempre assumiu uma dimensão primordial na área das ciências da vida, como a biologia e a medicina. O estudo da evolução dos genomas e espécies baseia-se em vários tipos de comparação, desde as morfológicas às paleontológicas, a comparações moleculares das sequências de DNA e RNA, de proteínas ou dos cromossomas. A tese está dividida em seis capítulos, sendo o primeiro o capítulo da introdução. O segundo capítulo desta tese apresenta a análise das histórias evolutivas dos genomas de dois roedores atuais, Cricetus cricetus (Cricetidae, Cricetinae) e Peromyscus eremicus (Cricetidae, Neotominae). Para tal, os dois genomas foram comparados com um genoma referência, um genoma ancestral comum, utilizando três abordagens moleculares conjugadas: “Comparative Chromosome Painting”; sequenciação dos genomas de Mus musculus e de Rattus norvegicus (dados disponíveis na base de dados Ensembl); e análise das regiões de heterocromatina constitutiva nas espécies Cricetus cricetus e Peromyscus eremicus. Verificou-se que: (a) a espécie Peromyscus eremicus apresenta um genoma muito conservado relativamente ao cariótipo ancestral comum, enquanto que o genoma de Cricetus cricetus divergiu significativamente do genoma de referência; (b) os rearranjos cromossómicos evolutivos mais comuns nestas espécies foram fusões, fissões e inversões, associados a alterações no padrão da heterocromatina; e (c) as regiões de quebra evolutivas colocalizam-se preferencialmente com regiões de heterocromatina constitutiva, sugerindo a importância destas regiões na ocorrência dos rearranjos evolutivos. No terceiro capítulo foram estudados os genomas dos roedores Phodopus roborovskii e Phodopus sungorus (Cricetidae, Cricetinae) quanto à localização da heterocromatina constitutiva e de sequências teloméricas intersticiais. Os resultados permitiram relacionar estas regiões/sequências com a evolução dos genomas destas espécies. Há ainda muitas lacunas no conhecimento da constituição das regiões de heterocromatina constitutiva, já que são as regiões genómicas mais difíceis de sequenciar e de analisar com as técnicas disponíveis. Sabe-se que são essencialmente constituídas por sequências repetitivas, sobretudo por sequências de DNA satélite, mas que estas não são as únicas sequências presentes nessas regiões. No quarto capítulo isso ficou demonstrado no genoma de seis espécies de roedores: Tatera gambiana (Muridae, Gerbillinae), Acomys sp. (Muridae, Deomyinae), Cricetomys sp. (Nesomyidae, Cricetomyinae), Microtus arvalis (Cricetidae, Arvicolinae), Phodopus roborovskii e Phodopus sungorus (Cricetidae, Cricetinae). Neste trabalho verificou-se que as sequências repetitivas LINE-1 (L1) se localizam quer em regiões eucromáticas, quer em regiões heterocromáticas. Este estudo também concluiu que a localização das sequências L1 é específica da espécie. As sequências repetitivas mais comuns nas regiões de heterocromatina constitutiva – DNA satélite – são sequências ainda pouco estudadas, e até negligenciadas, persistindo muitas incertezas quanto à sua organização, função e evolução. No trabalho que deu origem ao quinto capítulo, foi isolada pela primeira vez uma família de DNA satélite no genoma de Peromyscus eremicus – PMSat –, tendo-se verificado que se encontra nas regiões pericentroméricas e nos braços curtos heterocromáticos desta espécie. Esta sequência foi analisada em espécies aparentadas, tendo-se verificado a sua presença nessas espécies de roedores. Estes resultados indicam que a família de DNA satélite PMSat já se encontrava num ancestral comum. Este conhecimento possibilitou uma “datação” da sequência PMSat e sugestões quanto à forma como terá decorrido a sua evolução. Em resumo, esta tese focou-se no estudo das regiões de heterocromatina constitutiva, a dois níveis: perceber qual o envolvimento das regiões de heterocromatina constitutiva na evolução dos genomas e conhecer a sua composição molecular, ou seja, quais as sequências que as constituem. O sexto capítulo consiste na discussão geral dos resultados obtidos e no esboço de algumas sugestões para estudos futuros. Comparison is an activity that we frequently perform in our daily lives. It is also an activity that has always had a prime role in life sciences such as biology and medicine. The study of the evolution of species is based on several kinds of comparison: morphological comparison, paleontological comparison and molecular comparison of DNA sequences, RNA sequences, proteins and chromosomes across genomes and ultimately species. The thesis is divided in six chapters, where the first is an introductory chapter. The second chapter of this thesis presents our analysis of the evolutionary histories of the genomes of two current rodent species, Cricetus cricetus (Cricetidae, Cricetinae) and Peromyscus eremicus (Cricetidae, Neotominae). We compared both genomes with a reference genome, a common ancestral genome, and used three molecular approaches in combination: “Comparative Chromosome Painting”; sequencing data of the genomes of Mus musculus and Rattus norvegicus (both available in the Ensembl database); and constitutive heterochromatin analysis performed in Cricetus cricetus and Peromyscus eremicus. It was found that: (a) the Peromyscus eremicus species has a very conserved genome when compared with the common ancestor karyotype, while the Cricetus cricetus genome differs significantly from the reference genome; (b) the most common evolutionary chromosome rearrangements in these species were fusions, fissions and inversions, associated with changes in the pattern of heterochromatin; and (c) the evolutionary breakpoint regions are preferentially collocated with regions of constitutive heterochromatin, suggesting the importance of these regions in the occurrence of evolutionary rearrangements. The third chapter of this thesis describes our study of the genomes of the rodents Phodopus roborovskii and Phodopus sungorus (Cricetidae, Cricetinae) with regard to the location of constitutive heterochromatin and interstitial telomeric sequences. The results allowed us to relate these regions and sequences with the evolution of the genomes of these species. There are still many gaps in our understanding of the establishment of the regions of constitutive heterochromatin, as these regions are some of the most difficult to sequence and analyze with the available techniques. It is known that they consist essentially of repetitive sequences, most of which are satellite DNA sequences, but other types of sequences are present in these regions. The fourth chapter reports the study of transposable elements in the genome of six species of rodents: Tatera gambiana (Muridae, Gerbillinae), Acomys sp. (Muridae, Deomyinae), Cricetomys sp. (Nesomyidae, Cricetomyinae), Microtus arvalis (Cricetidae, Arvicolinae), Phodopus roborovskii and Phodopus sungorus (Cricetidae, Cricetinae). This study showed that LINE-1 (L1) repetitive sequences are located in the euchromatic and heterochromatic regions, and that the location of these sequences is species-specific. In spite of satellite DNA being the most common type of repetitive sequence found in constitutive heterochromatin, its study has been neglected, and many uncertainties remain regarding its organization, function and evolution. Chapter five reports the first isolation ever of the PMSat family of satellite DNA in the genome of the cactus mouse Peromyscus eremicus. We verified that this satellite DNA family is mainly located in the pericentromeric regions and in the heterochromatic p-arms of the cactus mouse genome. This sequence was analyzed and detected in the genome of related rodent species, which indicates that PMSat was already present in a common ancestor. This discovery allowed us to date the PMSat sequence and indicates how its evolution proceeded. In summary, this thesis focused on the study of the regions of constitutive heterochromatin, on two levels: how are they involved in the evolution of genomes and what is their constitution, i.e. which sequences do they harbour. Chapter six consists of a general discussion of the collected results and an outline of a few suggestions for further study. Tese de Doutoramento Financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, “Programa Operacional Potencial Humano - POPH”, co-financiado pelo Fundo Social Europeu (POPH/FSE) e por fundos nacionais (POPH-QREN).

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica A classe Bivalvia é um dos maiores, mais diversificado e importante grupo no reino animal, apresentando um elevado número de espécies marinhas, com grande importância económica e ecológica, que estão sujeitas a sobreexploração e degradação ambiental. A investigação genética em bivalves marinhos, permite obter informações essenciais para estimar a sua biodiversidade, dado indispensável para estabelecimento de medidas de conservação, especialmente relevante no caso de espécies exploradas comercialmente; e igualmente para contribuir para melhorar a classificação taxonómica e relações filogenéticas. O principal objetivo desta tese foi a caracterização de genomas, utilizando técnicas moleculares e citogenéticas, de espécies com importância comercial, pertencentes às famílias: Veneridae (Bivalvia, Heterodonta) e Ostreidae (Bivalvia, Pteriomorphia). O uso de marcadores moleculares, RAPDs, permitiu determinar e analisar a variabilidade genética encontrada em duas populações da espécie Veneridae - Ruditapes decussatus. A diversidade genética intra-populacional estimada em cada uma das populações foi elevada, enquanto a diferenciação genética entre as populações apresentou valores muito baixos. Foi igualmente destacado que esta homogeneidade genética encontrada nas populações é causada por atividades antropogénicas. A caracterização genética de populações de bivalves é importante para o estabelecimento de políticas de gestão dos recursos marinhos, quer para programas de repovoamento quer para efeitos comerciais como aquicultura. No caso das populações estudadas seria a população da Ria Formosa, nas duas espécies, a indicada para ser utilizada em ambos tipos de programa. A introdução de técnicas moleculares mais precisas, como a hibridização in situ por fluorescência (FISH), tem permitido o desenvolvimento dos estudos de citogenética molecular em bivalves, possibilitando, de forma inequívoca a identificação individual dos cromossomas e o mapeamento genético, contribuindo para a clarificação das relações filogenéticas e estudos sobre rearranjos cromossómicos numa grande variedade de organismos. A aplicação de técnicas de citogenética molecular, neste estudo, permitiu caracterizar e mapear sequências repetitivas [genes ribossomais (18S-5.8S-28S e 5S); sequência telomérica ((TTAGGG)n)], no genoma de ostras (O. edulis e O. stentina) e amêijoas (C. gallina). A localização cromossómica das sequências repetitivas permitiu criar padrões de marcação cromossómica característicos de cada uma das espécies estudadas. Este estudo permitiu igualmente o isolamento, caracterização e hibridação de uma nova família de DNA satélite em cromossomas de C. gallina. A sequencia de DNA satélite apresenta um monómero de repetição ~170 bp. A hibridação in situ desta sequência revelou que a sequência esta localizada em alguns cromossomas – distribuída nas regiões terminais, centroméricas e (peri)centromericas – mas também em pelos menos três pares de cromossomas não foi visível qualquer sinal de hibridação. Um dos resultados mais pertinentes deste trabalho foi a contribuição para a clarificação da taxonomia da subfamília Ostreinae (Harry, 1985). Os dados citogenéticos obtidos apoiam, de facto, de forma clara uma reorganização taxonomica na subfamília Ostreinae (Harry, 1985). O trabalho aqui apresentado permitiu um conhecimento mais aprofundado das características (cito)genéticas de espécies de bivalves marinhos de interesse comercial. Os dados obtidos permitiram contribuir para a clarificação taxonómica das famílias estudadas, assim como o estabelecimento de relações filogenéticas entre elas, e em último caso pretende ser o ponto de partida para o estudo da evolução do genoma em bivalves. Os resultados obtidos poderão contribuir igualmente, e de um ponto de vista de aplicação mais pratica e comercial, a programas de monitorização ambiental, apoio ao melhoramento, produção e comercialização destas espécies. The class Bivalvia is one of the largest, most diverse and important groups in the animal kingdom, with a high number of marine species with high economic and ecological importance, which are subject to over exploration and habitat degradation. Genetic research in marine bivalves can provide essential information to access their biodiversity, indispensable to establish conservation measurements, especially in commercially exploited species, but also contribute to improve the taxonomy classification and phylogenetic relationships. The main goal of this thesis was the characterization of the genome of marine bivalves with commercial importance, belonging to the Veneridae (Bivalvia, Heterodonta) and Ostreidae (Bivalvia, Pteriomorphia) families, using molecular and cytogenetic techniques. The use of molecular markers, (like) RAPDs, allowed to determine and analyse the genetic variation of the entire genome of different populations of one Veneridae specie - Ruditapes decussatus. The two populations presented a high degree of genetic variability within populations and low level of genetic differentiation among them, being the genetic homogeneity found in these populations caused by anthropogenic activities. The genetic information allowed the selection of a preferential population, Ria Formosa, to be used as broodstock for aquaculture purposes and for subsequent restocking programs.. Molecular cytogenetic studies in bivalves have greatly increased through the years, mainly due to the introduction of more accurate molecular techniques, like Fluorescent in situ hybridization (FISH). FISH allows the unequivocal identification of chromosomes in a karyotype and gene mapping, allowing the clarification of taxonomic and phylogenetic relationships and studies on chromosome rearrangement in a large variety of organisms. Through the application of FISH, we characterized and mapped repetitive sequences [Major (18S-5.8S-28S) and minor (5S) rDNA genes and telomeric sequence ((TTAGGG)n)], in oysters (O. edulis and O. stentina) and clams (C. gallina) genomes. The chromosomal location of these repetitive sequences has provided chromosomal markers that allow the accurate identification in the studied species, and consequently, the study of chromosome evolution of bivalves. The isolation, characterization and physical location of a new satellite DNA family to chromosomes of C. gallina was also performed. The sequence is composed by repeat monomers with a length ~170 bp. This sequence hybridize in blocks in some chromosome pairs - distribution varied between subterminal, terminal, centromeric and (peri)centromeric regions -, and at least in 3 chromosome pairs no hybridization signals were observed. One of the major results of this work, was the contribution to the clarification of the taxonomic incongruence of the subfamily Ostreinae (Harry, 1985). Our cytogenetic data, strongly supports the taxonomic reorganization of the subfamily Ostreinae (Harry, 1985). The work presented allowed a comprehensive knowledge of the (cyto)genetic characteristics of marine bivalve species of commercial interest. The data obtained allowed to clarify taxonomic incongruences, study phylogenetic relationships and can be considered an important contribution for the study of genome evolution in bivalves. From a more practical and commercial point view, these data can also contribute to more specific applications, in terms of environmental monitoring, production and commercialization of these species. Fundação para a Ciência e a Tecnologia, “Programa Operacional Potencial Humano - POPH”, co-financiado pelo Fundo Social Europeu (POPH/FSE) e por fundos nacionais (POPH-QREN)

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica As causas genéticas do cancro incluem várias alterações genómicas nomeadamente substituições/amplificações/deleções e epigenéticas que normalmente ocorrem em genes críticos de cancro, como o ERBB2 e o TWIST1. Nas lesões mamárias de gato (CML), tal como para o cancro de mama humano (HBC), os marcadores moleculares têm uma importância vital na categorização dos subtipos de lesões. Neste trabalho de doutoramento foram estudados os oncogenes ERBB2 e TWIST1 no gato, no que diz respeito ao DNA, RNA e respetivas proteínas (neste caso, apenas para o ERBB2), os quais podem estar relacionados com o início e progressão de CML. Deste modo, as potenciais correlações entre os resultados obtidos e as características das CML foram também analisadas. Este trabalho de doutoramento começou com a optimização da extracção de DNA genómico (gDNA) de elevada qualidade a partir de tecidos fixados-em-formalina e embebidosem- parafina (FFPET), que resultou num protocolo já publicado. O elevado nível da informação obtida ao longo do trabalho deveu-se à qualidade do gDNA e ao número e tamanho das sequências amplificadas, tanto nas amostras das lesões como das normais, que permitiu a deteção de variantes de sequência nos diferentes fragmentos dos genes ERBB2 e TWIST1. No primeiro estudo conduzido no gene ERBB2 no gato, o fragmento analisado incluiu os exões 17 a 20. A análise genómica revelou que 2/5 das variantes de sequência (SVs) e 2/6 dos haplotipos detetados, são exclusivos das amostras de CML. Uma associação promissora foi ainda identificada entre as variantes de haplotipos e dois fatores de prognóstico de CML: tamanho do tumor primário e número de massas. A análise bioinformática permitiu concluir que 4 das SVs detetadas podem ser responsáveis pela ocorrência de transcriptos alternativos e, consequentemente, de isoformas diferentes da proteína erbB-2. Num segundo passo, foi possível isolar a região entre os exões 10 a 15 do ERBB2 no gato. Neste fragmento foi observada uma categorização clara de haplotipos entre o normal e as CMLs. Foi ainda obtido um modelo de homologia 3D para a proteína erbB-2 do gato. A análise de 3 SVs não-sinónimas correspondentes a 3 alterações de aminoácidos, provavelmente responsáveis por danos na estrutura 3D da erbB-2, podendo ainda interferir na interacção entre a erbB-2 e o anticorpo terapêutico trastuzumab. Foi ainda analisado o status do ERBB2 em gato tendo-se concluído que não se encontra amplificado, apresentando ainda um nível mais baixo de expressão nas lesões mamárias em relação às amostras normais. Os baixos níveis de expressão de RNA do gene ERBB2, bem como da proteína foram já indicados como estando relacionados com malignidade e com mau prognóstico nas CML. Neste trabalho de doutoramento, foi pela primeira vez caracterizado o gene TWIST1 no gato, tendo sido sequenciado um fragmento de DNA com 960 bp em amostras normais. O isolamento e sequenciação de um fragmento de cDNA deste mesmo gene (201 bp) revelam que o TWIST1 é transcrito no gato, tendo-se observado um elevado grau de similaridade das sequências de DNA e cDNA desta espécie com o Homem. Foi ainda realizado o mapeamento físico in silico do gene TWIST1 no ideograma do gato, localizando-se especificamente o gene no cromossoma A2, banda q21.3. Na tentativa de compreender o papel das SVs do TWIST1 no processo tumoral mamário do gato, foram pesquisadas variantes na sequência de DNA do gene, tendo sido detetadas 2 SVs, classificadas como potenciais variantes da linha germinativa, sendo improvável a sua associação com o processo neoplásico. A análise do mRNA do gene TWIST1 no gato por qRTPCR revelou um nível mais baixo de expressão nas lesões malignas em comparação com as benignas. Os nossos resultados sugerem que a função do gene TWIST1 nas CML não está, provavelmente, relacionado com as SVs encontradas, à semelhança do que o ocorre em HBC. De uma forma geral, a importância clínica do nível reduzido e/ou da variação na expressão do TWIST1 durante o processo tumoral, sugere uma maior associação com o “switch” inicial da neoplasia e da progressão para a metastização. Em conclusão, este trabalho representa o primeiro esforço na investigação de variantes de sequência em tecidos normais e em lesões mamárias da espécie Felis catus para ambos os genes ERBB2 e TWIST1. As SVs, os haplotipos, os transcritos e as alterações detetadas na proteína do gene ERBB2 analisado e correlacionados com as características clinicopatológicas das lesões mamárias de gato, revelaram a importância deste gene nas CMLs, tal como ocorre no Homem e realçam a importância destes estudos moleculares, especialmente nos subtipos HER2 negativos. Adicionalmente, vários foram os dados obtidos e publicados ao longo deste trabalho que indicam a utilização dos tumores mamários espontâneos de gata como modelo para o HBC. No que diz respeito à avaliação do gene TWIST1 em CMLs, os níveis baixos de expressão observados nas lesões malignas estão de acordo com evidências recentes em HBC. O comportamento similar do gene nas duas espécies é encorajador para a prossecução da sua investigação, na tentativa de melhor caracterizar os padrões de expressão ao nível do RNA e da proteína em CMLs. Mais uma vez, os resultados apresentados nesta tese reúnem evidências para uma análise comparativa direita entre as lesões mamarias de gato e o cancro de mama humano. The genetic causes of cancer include genomic sequence switches/amplifications/deletions and epigenetic alterations that often occur in cancer critical genes as ERBB2 and TWIST1 oncogenes. In cat mammary lesions (CML), as for human breast cancer (HBC), the molecular markers are greatly important to categorise lesion subtypes that define clinical and therapeutic groups. In this PhD work, cat ERBB2 and TWIST1 oncogenes were studied, concerning DNA, RNA and protein alterations (this last one, only for ERBB2), which may be related with the initiation and progression of CML. Therefore, the potential correlations between the data achieved and CMLs clinicopathological features were also analysed. This PhD work started with the optimization of genomic DNA (gDNA) extraction with high quality from formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPET) that resulted in a published protocol. The high standard in the obtained data was achieved by the gDNA quality and by the number and size of the genomic sequences amplified, from several CMLs and cat disease free samples. The large genomic sequences amplified allowed the detection of several sequence variants from several fragments of ERBB2 and TWIST1 genes. In the first study of cat ERBB2, the total fragment analysed included exons 17 to 20. The genomic analysis revealed that 2/5 of sequence variants (SVs) and 2/6 of the haplotypes detected, were exclusive of CML samples. A promising association was identified between variant haplotypes and two CMLs prognostic factors: primary tumour size and number of masses. Bioinformatics analysis indicated that 4 SVs might be responsible for alternative transcripts and, consequently, for different erbB-2 protein isoforms. In a second step, cat ERBB2 genomic sequence from exons 10 to 15 was completely obtained. Also, for the first time a tri-dimensional homology model for erbB-2 cat protein was accomplished. In ERBB2 DNA fragment, an undoubtedly haplotype categorisation distinguishes the normal from CML samples. The analysis of the 3 non synonymous SVs detected revealed to correspond to 3 amino acid changes, proposed to be probably damaging for cat erbB-2 tri-dimensional structure and may interfere with the interaction between erbB-2 protein and the therapeutic antibody trastuzumab. It was also analysed the expression status of cat ERBB2, showing no DNA amplification and a lower mRNA and protein expression levels in mammary lesions than in normal samples. Additionally, ERBB2 RNA and erbB-2 protein low expression levels were indicated as being correlated with malignity and worse clinical outcome of the mammary lesions. In this PhD work, for the first time, it was characterized the cat TWIST1 gene. A genomic fragment from the cat TWIST1 gene was isolated and sequenced in cat normal samples. The isolation and sequencing of a cat TWIST1 complementary DNA fragment (201 bp), also demonstrated that this is a transcribed gene, showing the cat TWIST1 sequences a high similarity with the human counterpart. In this work it was also in silico physically mapped TWIST1 gene in the cat G-banding ideogram, namely in chromosome A2, band q21.3. In an attempt to understand TWIST1 gene SVs role in cat mammary oncology, we searched for variants in TWIST1 DNA sequence. We detected 2 SVs, classified as potential germline variants, being improbable its association with neoplasia. The cat TWIST1 mRNA analysis by qRT-PCR revealed lower expression levels in malignant than in benign mammary lesions. Our results suggest that the role of TWIST1 gene in CML is probably not related with the observed genomic changes as referred for HBC studies. Generally, the clinical importance of the low and/or variable TWIST1 expression levels during the multistep process, point toward a major association with the initial “switch” to neoplasia and with the final progression toward metastasis. In conclusion, this work represents the first attempt to examine genomic sequence variants in normal tissues and mammary lesions from Felis catus, to both genes, ERBB2 and TWIST1. The SVs, haplotypes, transcripts and the protein changes disclosed in ERBB2 gene, associated to the CML clinicopathological features, revealed the importance of these molecular studies in CML analysis, as it happens in human and highlight the importance of these molecular studies, particularly for HER2 negative subtypes. Additionally, several were the outcomes from this work indicating the use of cat naturally occurring mammary tumours as model for human breast oncology. Considering the TWIST1 evaluation in CML, the lower RNA expression levels observed in malignant lesions are in agreement with the recent evidences for HBC. The similar behaviour of the gene in the two species encourages the development of new investigation, trying to deeper characterize its expression patterns at the level of RNA and Protein in CMLs. Once again, the results shown in this thesis gather evidences for a straightforward comparative analysis between cat mammary tumour lesions and human breast cancer.

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica A tolerância à toxicidade ao aluminio (Al) é um dos maiores desafios para a produção agrícola em solos ácidos. Em Portugal, a cultura do trigo ocupa um lugar especial entre os cereais, ocorrendo a maioria do seu cultivo neste tipo de solos. O objectivo do presente estudo foi o de caracterizar, quer fisiológica quer molecularmente o genótipo Barbela 7/72/92 em relação à tolerância ao Al quando em presença de condições de pH baixo. As técnicas fenotípicas baseadas na ericromocianina R, na hematoxilina e na morina demonstraram que o Barbela 7/72/92 é um genótipo muito resistente ao Al e que o seu mecanismo de tolerância baseia-se principalmente na destoxificação externa deste elemento tóxico. Técnicas baseadas nos reagentes de Schiff e Evans blue também evidenciaram um baixo nível de peroxidação lipídica bem como a quase inexistência de danos físicos nas raízes de Barbela 7/72/92 tratadas com Al. De salientar, que o crescimento de pêlos radiculares presentes no Barbela 7/72/92 quando na presença de Al poderá indicar que este genótipo de trigo mole activa diversos mecanismos de resposta à toxicidade deste elemento. As técnicas histoquímicas utilizadas neste estudo demonstraram claramente que a toxicidade pelo Al induz múltiplos efeitos nas raízes de trigo mole. Na presente investigação, três genes candidatos, para a tolerância ao Al em trigo hexaplóide, foram clonados nomeadamente o TaMATE1 e o TaMATE2 (membros da família MATE) e o TaSTOP1 (membro da família de fatores de transcrição). O mapeamento através do recurso a linhas aneuploides de trigo da cultivar Chinese Spring, revelou que o TaMATE1, o TaMATE2 e o TaSTOP1 estão localizados no braço longo dos cromossomas 4, 1 e 3, respectivamente. No caso do gene TaSTOP1 a localização no cromossoma 3 foi igualmente confirmada por hibridação in situ no genótipo Barbela 7/72/92. A análise da expressão dos genes TaMATE1 e TaALMT1 revelou que ambos os transcriptos existem em maior abundância nas raízes comparativamente aos rebentos, contrariamente ao que foi verificado para o gene TaMATE2. Em relação ao gene TaSTOP1, o gene expressou-se equitativamente em ambos os tecidos (raízes e rebentos). A análise da expressão específica para os genes TaMATE1 e TaSTOP1 revelou claramente a transcrição não uniforme destes genes, em ambos os tecidos de trigo hexaplóide. A expressão do homólogo TaMATE1-4B foi preponderante à expressão do TaMATE1-4D em Barbela 7/72/92. Quanto ao homólogo TaMATE1-4A a sua expressão parece estar silenciada. Para o gene TaSTOP1, os níveis de expressão do homólogo TaSTOP1-A encontraram-se significativamente elevados em relação aos encontrados para TaSTOP1-B e TaSTOP1-D, em ambos os tecidos (raízes e rebentos). Os nossos resultados indicaram igualmente que o gene TaSTOP1-A possui um potencial de trans-activação constitutivo e que pode não depender da ausência/ presença do stress por Al. Em relação ao TaMATE2, não foi possível a quantificação individual de cada um dos homólogos devido à elevada similaridade verificada entre as suas sequências nucleotídicas. A expressão desigual encontrada para os genes TaMATE1 e TaSTOP1, bem como a diferente resposta à toxicidade por Al indica que os homólogos destes genes, em trigo mole, parecem de forma diferencial na presença de Al. A análise dos promotores dos homólogos do gene TaMATE1 revelou que no genótipo Barbela 7/72/92, a 25 bp a jusante, existe um transposão do tipo Sukkula no homólogo TaMATE1-4B. A subsequente análise desta região numa coleção de trigo mole Portugueses revelou uma correlação positiva entre a presença deste transposão e a tolerância ao Al. De igual modo, a sequenciação do promotor do gene TaALMT1, no Barbela 7/72/92 e no Anahuac, revelou a presença dos promotores do Tipo VI e I, respectivamente. O promotor ALMT1 tipo VI foi previamente descrito como tendo uma correlação positiva com a tolerância ao Al em trigo. Estes resultados são suportados pelas análises de expressão de ambos genes, sugerindo que o Barbela 7/72/92 possui novos alelos para os genes referidos permitindo a este genótipo um melhor desempenho quando na presença do stress pelo Al através da sua exclusão. A co-localização do TaMATE1, TaMATE2 e TaSTOP1 com regiões genómicas implicadas na tolerância ao Al nos cromossomas 4 (genoma B), 1 (genomas A e B) e 3 (genoma B), respectivamente, sugerem que estes genes podem ser um potencial alvo para a tolerância ao Al neste cereal. Em conclusão, os estudos fisiológicos e moleculares realizados neste estudo claramente demonstram que o genótipo de trigo mole Português Barbela 7/72/92 é altamente tolerante ao stress pelo Al, o qual desenvolveu diversos mecanismos de forma a adaptar-se aos solos ácidos onde é cultivado. Neste trabalho, demonstramos que o Barbela 7/72/92 possui novos alelos para múltiplos genes para a tolerância ao Al, os quais poderão vir a ser posteriormente utilizados em programas de melhoramento de trigo. Aluminium (Al) toxicity is one of the most challenging features when dealing with crop production on acid soils. In Portugal, wheat holds among the cereals a special place in the sense that the majority of its production occurs on acid soils. The aim of the present research was to characterize the Portuguese bread wheat genotype Barbela 7/72/92 for Al tolerance, in low pH conditions, at the physiological and molecular levels. Through erichrome cynanin R, hematoxylin and morin assays it was possible to demonstrate that Barbela 7/72/92 is a highly Al resistant genotype and its resistance mechanism mainly relies on external Al exclusion. Schiff’s reagent and Evans blue procedures also showed absence of Al induced lipid peroxidation and rare physical injuries in the Al treated roots of Barbela 7/72/92. Furthermore, better root hair growth in Barbela 7/72/92 under Al stress also indicated that this Portuguese bread wheat genotype may acquire several mechanisms of Al tolerance in order to adapt to acidic soil conditions. The histochemical assays herein presented clearly demonstrated that Al toxicity induces multiple stresses in the bread wheat’s root system. In the present investigation, three candidate genes, associated with Al tolerance in bread wheat were cloned, namely TaMATE1 and TaMATE2 (MATE family), and TaSTOP1 (transcription factor family). PCR based mapping of these genes using Chinese Spring aneuploid stocks revealed that TaMATE1, TaMATE2 and TaSTOP1 are located on the long arms of homoeologous group 4, 1 and 3 chromosomes, respectively. Furthermore, the results of TaSTOP1 mapping were also validated with in situ hybridization in Barbela 7/72/92. Tissue specific expression analysis clearly revealed the higher transcript expression of TaMATE1 and TaALMT1 genes in the roots, whereas TaMATE2 showed higher transcript levels in the shoot tissues. Contrarily, TaSTOP1 seemed to be equally express in both wheat root and shoot tissues. Interestingly, homoeologue specific transcript expression clearly revealed the unequal expression of the TaMATE1 and TaSTOP1 homoeologues in bread wheat. Barbela 7/72/92 exhibited the preponderance of TaMATE1-4B transcripts followed by TaMATE1-4D, whereas homoeologue TaMATE1-4A seemed to be silenced. On the other hand, significantly higher transcript expression of TaSTOP1-A was noticed over TaSTOP1-D and TaSTOP1-B homoeologues. In addition our results also indicate that TaSTOP1-A trans-activation potential is constitutive and may not depend on the presence/absence of Al at least in yeast. The individual TaMATE2 homoeologues transcript expression quantification was not possible due to the high similarity among the nucleotide sequences present in the different homologues groups for this gene. However, the unequal transcript expression verified in TaMATE1 and TaSTOP1, and their different response to Al toxicity indicate that homoeologue(s) of these genes, in bread wheat, may differentially contribute to Al tolerance under stress conditions. The promoter analysis of TaMATE1 homoeologues revealed that Al resistant genotype Barbela 7/72/92 has a Sukkula like transposon in 25 bp upstream of TaMATE1-4B homoeologue. Further, TaMATE1-4B promoter analysis in a collection of Portuguese bread wheat genotypes revealed a correlation between the presence of this transposon and Al tolerance. Furthermore, TaALMT1 promoter sequencing also showed that Barbela 7/72/92 had a type VI promoter, whereas type I promoter was observed in Anahuac. Type VI promoter of TaALMT1 was previously reported as being associated to high Al tolerance levels in bread wheat. These results were supported by the transcript expression of both genes, suggesting that Barbela 7/72/92 has novel alleles of TaMATE1 and TaALMT1 genes that may enable it to exclude the Al toxic forms in acid soils in a more efficient way. In addition, the co-localization of TaMATE1, TaMATE2 and TaSTOP1 with previously reported genomic regions implicated with Al tolerance in bread wheat on chromosomes 4 (B genome), 1 (A and B genomes) and 3 (B genome), respectively, suggest that these genes could be potential used to improve Al tolerance in bread wheat. In conclusion, physiological and molecular studies performed in the present investigation clearly exhibited that the Portuguese bread wheat genotype Barbela 7/72/92 is highly resistant to Al stress, having developed several mechanisms to adapt to acid soils. Herein we also demonstrated that Barbela 7/72/92 possesses novel alleles, which could be used in breeding programmes to improve Al tolerance for the development of cultivars suitable for acid soils. On the other hand this study also allowed a better understanding of the molecular mechanisms involved in Al tolerance in bread wheat.