Search

Fitoplazme su prokariotski organizmi bez stanične stjenke. Parazitiraju intracelularano u floemu biljaka i raznim tkivim kukaca koji ih prenose. Uzrokuju bolesti više stotina biljnih vrsta širom svijeta, od kojih su mnoge gospodarski bitne. U Hrvatskoj se sustavno istražuju fitoplazme uzročnici žutica vinove loze (grapevine yellows, GY) koje nanose velike štete vinogradarima. Fitoplazme nije moguće uzgojiti na umjetnim podlogama in vitro, pa se istraživanja i klasifikacija ovih patogena temelje na molekularnim metodama. Osnovne metode koje se koriste u detekciji i identifikaciji fitoplazmi su lančana reakcija polimerazom (Polymerase Chain Reaction, PCR) i polimorfizam duljina restrikcijskih fragmenata (Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP). Kao i ostali prokarioti, fitoplazme su klasificirane prema nukleotidnom slijedu gena za 16S rRNA. Zato za detekciju i identifkaciju fitoplazmi postoje specifične početnice za umnažanje dijelova toga gena. Tako umnoženi fragmenti analiziraju se za precizniju klasifikaciju metodom RFLP. Kako ova metoda ima nedostataka, u ovom radu željelo se utvrditi mogućnosti jedne druge metode, konformacijskog polimorfizma jednolančanih molekula DNA (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP), za rutinsku identifikaciju različitih sojeva fitoplazmi. Budući da za ovu metodu ne postoji standardni protokol, za svaku skupinu uzoraka potrebno je pronaći optimalne uvjete mijenjanjem niza parametara. U ovom radu određeni su optimalni uvjeti pod kojima je moguće razlikovati različite sojeve fitoplazmi metodom SSCP. Ova metoda pokazala se kao ne samo jednostavnija i jeftinija od metode RFLP, već i kao brza screening metoda za uzorke s terena. Također se željelo utvrditi je li moguće ovom metodom razlikovati fitoplazme koje nije moguće razlikovati metodom RFLP. Analizirani su uzorci stolbur-fitoplazmi, glavnog uzročnika žutica vinove loze u Hrvatskoj, s različitih vinorodnih lokaliteta u Hrvatskoj, te dva uzorka iste fitoplazme iz Makedonije. Pokazalo se da je metodom SSCP moguće detektirati razlike u nukleotidnom slijedu između blisko srodnih fitoplazmi, koje nije moguće detektirati metodom RFLP. SSCP se, dakle, može koristiti kao početna analiza za odabiranje uzoraka za sekvenciranje, čime se izbjegava skupo sekvenciranje svih uzoraka. Uzorci s različith područja pokazivali su različite SSCP-profile, a sekvenciranje je potvrdilo postojanje razlika u nukleotidnom slijedu.