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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Chapter I - Toxoplasmosis is a zoonosis caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii, which infects a range of hosts, including about one-third of the world\'s human population. One of the most severe manifestations of this infection in humans corresponds to congenital toxoplasmosis, which occurs when there is placental transmission of the parasite to the fetus in cases of primary maternal infection during pregnancy. Congenital infection may cause abortions or fetal losses, as well as severe ocular and/or cerebral sequelae in newborns. The serological screening of pregnant women and newborns is mainly based on the detection of IgG and IgM antibodies to T. gondii and constitutes an important measure to be adopted in programs to control this infection, despite the limitations in the antibody detection and interpretation of results. Chapter II - A total of 173 pairs of serum samples from mothers with suspected primary toxoplasmosis during pregnancy and their newborns, obtained from the Department of Pediatrics and Neonatology of Clinical Hospital of the Federal University of Uberlândia (HC-UFU) from 2006 to June 2014, was analyzed by ELISA for the detection of IgG, IgM and IgA anti-T. gondii, and the results were correlated with clinical data obtained from research in the clinical records of each patient. It was concluded that (i) prenatal serological screening is very important for the identification of pregnant women exposed to toxoplasmosis during pregnancy; (ii) maternal treatment reduces congenital transmission of T. gondii; (iii) neonatal serologic screening, associated with analysis of clinical parameters, allows the identification of vertically infected newborns, mainly through simultaneous detection of IgM and IgA antibodies; and (iv) serological follow-up of newborns is important in clarifying doubtful situations, especially in cases of asymptomatic newborns that present suggestive serology of congenital infection. Chapter III - Different antigenic fractions derived from soluble antigen of tachyzoites of T. gondii (STAg) were obtained from sequential precipitation with increasing concentrations of ammonium sulfate and used in immunoblotting technique to detect IgG antibodies and its subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) present in paired serum samples from mothers with presumptive serology of recent toxoplasmosis during pregnancy and their newborns. It was concluded that the use of antigenic fractions obtained from STAg precipitation in the diagnosis of human toxoplasmosis proved to be interesting to detect IgG and its subclasses, allowing differentiation between positive and negative samples, but it was not a good alternative for the diagnosis of congenital toxoplasmosis, presenting results considered inferior to the STAg, due to the lower frequency of recognized antigenic bands and the absence of differential recognition of antigens by sera of newborns. Chapter IV - The amino acid sequences of sixteen immunodominant antigens of T. gondii were used to perform B cell linear epitope prediction using a software-based approach. A total of 22 epitopes of antigens from surface (SRS), rhoptries (ROP), micronemes (MIC) and dense granules (GRA) of T. gondii were identified, and 15 residues from their amino acid sequences were used to synthesize peptides chemically linked to bovine serum albumin backbone, and the diagnostic performance of these synthetic peptides was evaluated in ELISA to detect specific IgG antibodies in sera of patients with suspected acute toxoplasmosis (G1) or chronic (G2). It was concluded that synthetic peptides designed from B cell linear epitope prediction constitute promising antigens in serological assays to diagnose toxoplasmosis and differentiate acute from chronic phases of toxoplasmosis, representing an alternative to the use of native or recombinant antigens. Capítulo I - Toxoplasmose é uma zoonose causada pelo parasita intracelular Toxoplasma gondii, que infecta diferentes hospedeiros, incluindo cerca de um terço da população humana mundial. Uma das manifestações mais graves da infecção por este parasita em humanos corresponde à toxoplasmose congênita, quando há transmissão placentária do parasita para o feto durante infecção materna primária na gestação. A infecção congênita pode causar abortos ou perdas fetais, além de sequelas graves em recém-nascidos (RNs), principalmente oculares e/ou cerebrais. A triagem sorológica de gestantes e RNs, baseada principalmente na detecção de anticorpos IgG e IgM anti-T. gondii constitui-se em importante medida a ser adotada em programas de controle desta infecção, apesar das limitações na detecção dos anticorpos e na interpretação dos resultados. Capítulo II - Um total de 173 pares de amostras de soros de mães com suspeita de toxoplasmose primária na gestação e seus respectivos RNs, provenientes do Setor de Pediatria e Neonatologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU) no período de 2006 a junho de 2014, foi analisado por ELISA para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgA anti-T. gondii, e os resultados obtidos foram correlacionados com dados clínicos obtidos a partir de pesquisa nos prontuários clínicos de cada paciente. Concluiu-se que (i) a triagem sorológica pré-natal é de grande relevância na identificação de gestantes expostas à toxoplasmose durante a gestação; (ii) o tratamento materno reduz a transmissão congênita de T. gondii; (iii) a triagem sorológica neonatal, aliada à análise de parâmetros clínicos permite identificar RNs verticalmente infectados, principalmente por meio da detecção conjunta de anticorpos IgM e IgA; e (iv) o acompanhamento sorológico de RNs é importante no esclarecimento de situações duvidosas, principalmente em casos de RNs assintomáticos, mas com sorologia sugestiva de infecção congênita. Capítulo III - Diferentes frações antigênicas derivadas do antígeno solúvel de taquizoítas de T. gondii (STAg) foram obtidas a partir de precipitação sequencial em concentrações crescentes de sulfato de amônio e utilizadas na técnica de immunoblotting para a detecção de anticorpos IgG total e suas subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) presentes em amostras pareadas de soros de mães com sorologia presuntiva de toxoplasmose recente na gestação e seus respectivos RNs. Concluiu-se que a utilização destas frações antigênicas de STAg no diagnóstico da toxoplasmose humana se mostrou interessante na detecção de anticorpos IgG e suas subclasses, permitindo diferenciação entre amostras positivas e negativas, mas não se mostrou uma boa alternativa no diagnóstico da toxoplasmose congênita, com resultados inferiores aos do STAg, em função da menor frequência de bandas antigênicas reconhecidas e da ausência de reconhecimento diferencial de antígenos pelos soros dos RNs, em relação aos soros maternos. Capítulo IV - As sequências de aminoácidos de 16 antígenos imunodominantes de T. gondii foram usadas para a predição de epítopos lineares de células B usando ferramentas de bioinformática. Um total de 22 epítopos de antígenos de superfície (SRS), roptrias (ROP), micronemas (MIC) e grânulos densos (GRA) de T. gondii foram identificados e utilizados para a síntese de peptídeos com 15 resíduos de aminoácidos, os quais foram quimicamente conjugados ao esqueleto proteico da albumina sérica bovina (BSA), e o desempenho diagnóstico destes peptídeos sintéticos foi avaliado por ELISA para a detecção de anticorpos IgG em soros de pacientes com suspeita de toxoplasmose aguda (G1) ou crônica (G2). Concluiu-se que peptídeos sintéticos obtidos a partir da predição de epítopos lineares de células B constituem antígenos promissores em ensaios sorológicos para o diagnóstico da toxoplasmose e para a diferenciação das fases aguda e crônica da infecção, representando uma alternativa ao uso de antígenos nativos ou recombinantes. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. A hemopressina é um nonapeptídeo derivado da cadeia α-1 de hemoglobina de mamíferos que é conhecido pelos seus efeitos hipotensivo, analgésico e supressor do apetite. Este peptídeo age como um agonista inverso ou antagonista do receptor canabinoide CB1. Disfunções no sistema endocanabinoide, estão associadas com algumas patologias e morbidade, tais como obesidade, dor neuropática, depressão, inflamação, mal de Alzheimer e doença de Parkinson. O presente estudo teve por objetivo produzir a hemopressina nas formas sintética e recombinante, e purificar as moléculas produzidas, visando futura avaliação das suas propriedades biológicas. Para a obtenção do peptídeo recombinante, a sequência nucleotídica que codifica a hemopressina foi inserida no vetor de expressão pGEX-4T-1® (GE Healthcare) fusionada ao tag-GST e expressa em Escherichia coli BL21-CodonPlus. Várias condições de expressão foram testadas para determinar os melhores parâmetros de expressão. A síntese em fase sólida da hemopressina de formas humana e murina foi realizada utilizando a estratégia Fmoc/tButil. As sequências de resíduos de aminoácidos de ambas as formas da hemopressina foram confirmadas por espectrometria de massa MALDI no modo LIFTTM em um equipamento de Autoflex Speed (BrukerDaltonics, Bilerica, EUA). A purificação do peptídeo sintético foi realizada por cromatografia de fase reversa (Shimadzu LC-20AT) numa coluna C18 semi-preparativa (Jupiter 5 μm 300 Å). Análises por espectrometria de massa das hemopressinas humana e murina mostraram peptídeos sintéticos com massa molecular de 1.053,6 Da e 1.087,6 Da, respectivamente. A massa molecular da hemopressina recombinante de murino fusionada à GST foi de aproximadamente 31 kDa, obtida por meio de análise de SDSPAGE e confirmada por Western Blotting. O rendimento da expressão foi avaliado por densitometria, que constatou a produção de 147,8 mg/L da proteína recombinante. Hemopressin is a nonapeptide derived from the α-1 chain of mammalian hemoglobin known for its hypotensive, analgesic and appetite suppressive effects. This peptide acts as a CB1 cannabinoid receptor inverse agonist or antagonist. Dysfunctions in the endocannabinoid system are associated with some pathologies and morbidity, such as obesity, neuropathic pain, depression, inflammation, Alzheimer and Parkinson diseases. This study was focused on the production and purification of synthetic and recombinant hemopressin, aiming future evaluation of their biological properties. To obtain the recombinant peptide, the nucleotide sequence encoding hemopressin was inserted into the expression vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare) fused to the tag-GST and expressed in Escherichia coli BL21-CodonPlus. Several expression conditions were tested to determine the best expression parameters. Solid-phase synthesis of human and murine hemopressin was performed using the Fmoc/t-butyl strategy. The amino acid sequences of both forms of hemopressin was confirmed by MALDI mass spectrometry in the LIFTTM mode at an Autoflex speed equipment (BrukerDaltonics, Bilerica, USA). Purification of the synthetic peptide was performed by reversed-phase chromatography (Shimadzu LC-20AT) on a C18 semi-preparative column (Jupiter 5 μm 300 Å). Mass spectrometric analysis of human and murine hemopressins showed synthetic peptides with a molecular mass of 1,053.6 Da and 1,087.6 Da, respectively. The molecular mass of murine recombinant hemopressin fused to GST was approximately 31 kDa, a value that was obtained by SDS-PAGE analysis and confirmed by Western Blotting. The expression yield was evaluated by densitometry, which showed an equivalent expression yield of 147,8 mg/L of the recombinant protein.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:13Z : No. of bitstreams: 1 000825954_20160327.pdf: 381173 bytes, checksum: 1f527327352e8d939bbd93c0c5f312a4 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-28T13:37:45Z: 000825954_20160327.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-28T13:38:49Z : No. of bitstreams: 1 000825954.pdf: 2204290 bytes, checksum: 6ac547658b82ffdb90ca01093a7eb969 (MD5) Versões diméricas dos peptídeos antimicrobianos (PAMs) Aureína 1.2 (AU) e Magainina 2 (MG2) foram sintetizadas e avaliadas em relação à influência da dimerização e da posição do linker (N- ou C- terminal) na estrutura e atividade biológica. Em solução aquosa, o peptídeo AU não apresentou estrutura secundária definida. Por sua vez, os dímeros (AU)2K e E(AU)2 apresentaram uma estrutura helicoidal. Em presença de miméticos de membrana, os três peptídeos adquiriram uma estrutura tipo α-hélice. Estudos preliminares de atividade hemolítica e vazamento de carboxifluoresceína mostraram que a atividade do peptídeo AU é dependente da concentração. No entanto, para as versões diméricas este efeito foi menos pronunciado. Isto sugeriu que a dimerização muda o mecanismo de ação, o que logo foi confirmado por diferentes técnicas biofísicas (microscopia de contraste, calorimetria de titulação isotérmica, dicroísmo circular e vazamento de carboxifluoresceína). Em relação à atividade antimicrobiana, as versões diméricas tiveram uma diminuição da atividade contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Càndida albicans quando comparadas com o monômero. Entretanto, os dímeros apresentaram a capacidade de agregar células de C. albicans. Empregando técnicas espectroscópicas (dicroísmo circular e fluorescência), foi evidenciado que o dímero (AU)2K interage com mananos, o principal componente da parede celular de C. albicans. Esta interação não foi observada para o monômero. Em função destes resultados, foi proposto um modelo pelo qual o dímero interage com os mananos, levando à agregação das células de levedura. Em um segundo bloco o peptídeo MG2 foi estudado. Em solução aquosa, o peptídeo MG2 e as duas versões diméricas não apresentaram estrutura secundária definida. Por sua vez, em presença de miméticos de membrana, os três peptídeos adquiriram... Dimeric versions of the antimicrobial peptides (AMPs) Aurein 1.2 (AU) and Magainin 2 (MG2) were synthesized and evaluated for the influence of dimerization and the position of the linker (N- or C-terminal) in the structure and biological activity. In aqueous solution, AU showed no defined secondary structure. On the other hand, the dimers (AU)2K and E(AU)2 showed a helical structure. In the presence of membrane mimetics, the three peptides acquired a α-helix structure. Preliminary studies of hemolytic activity and leakage of carboxyfluorescein showed that the activity of AU is concentration dependent. However, this effect was less pronounced for the dimeric versions. This suggested that dimerization would change the mechanism of action, a fact that was confirmed by different biophysical techniques (contrast microscopy, isothermal titration calorimetry, circular dichroism and leakage of carboxyfluorescein). Regarding antimicrobial activity, dimeric versions had a marked decrease in activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Càndida albicans when compared to the monomer. However, dimers showed the ability to aggregate cells of Candida albicans. Using spectroscopic techniques (circular dichroism and fluorescence), it was shown that (AU)2K interacts with mannans molecules, the main component of the cell wall of C. albicans. This interaction was not observed for the monomer. Based on these results, a model has been proposed by which the dimer interacts with mannans, leading to aggregation of the yeast cells. In a second part, MG2 was studied. In aqueous solution MG2 and the two dimeric versions showed no defined secondary structure. However, in the presence of membrane mimetics, all three peptides have acquired helical structure. The results showed that the N-terminal dimerization did not affect the biological activity of the peptide MG2. On the other hand, the peptide (MG2)2K showed...

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:39Z : No. of bitstreams: 1 000825911_20160226.pdf: 355265 bytes, checksum: 547f484aecd3612ad60abee5af1a27e3 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:55Z: 000825911_20160226.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:49Z : No. of bitstreams: 1 000825911.pdf: 1735726 bytes, checksum: ac1e06d8b87ef7b2876cb9e6bf68776f (MD5) A celulose bacteriana (CB) apresenta ampla diversidade de aplicações. Neste trabalho o enfoque foi desenvolver um curativo temporário ou suporte para regeneração tecidual de pele, a partir da funcionalização de CB com peptídeo RGD, caracterizá-lo quanto às propriedades físico-químicas e avaliar in vitro a capacidade de estimular a adesão e a proliferação de fibroblastos, a citotoxicidade e a resposta imune. A finalidade do material desenvolvido consiste em promover a reparação tecidual de pele, visto que diversos fatores sistêmicos tais como diabetes, tabagismo e carência nutricional, podem dificultar o processo de cura. O uso de biomateriais como suporte de medicamentos ou curativos temporários, auxiliando ou acelerando o processo de reparação e cura, é uma necessidade nestes casos. A sequência peptídica RGD (Arginina-Glicina-Ácido Aspártico), encontrada em diversas proteínas da matriz extracelular (MEC), é frequentemente utilizada para promover a adesão celular, mediada por integrinas, em biomateriais. O peptídeo sintetizado foi escolhido por meio de estudo computacional. Foram sintetizados dois tipos de membranas, a CB-RGDAds, na qual o peptídeo RGD encontra-se adsorvido, e a CBRGDImz, na qual o peptídeo encontra-se ligado covalentemente à membrana, e, portanto, imobilizado. Estes materiais, juntamente com a membrana de CB pura, foram caracterizados a partir de análises de ângulo de contato, difratometria de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de absorção na região de infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR), termogravimetria (TG) e calorimetria diferencial exploratória (DSC). Posteriormente, as amostras foram submetidas a ensaios in vitro de viabilidade celular e morfologia celular utilizando a linhagem de fibroblastos L929; adicionalmente análises de determinação de citocinas TNF-α, IFN-γ e produção de óxido... Bacterial cellulose (BC) exhibits a broad diversity of applications. The aim of this study was to develop a scaffold or temporary dressing for skin tissue repair, whereof the BC would be functionalized with an RGD peptide. The synthesized materials were physicochemically characterized and submitted to in vitro analyses to assess their capacity of stimulating fibroblasts adhesion, proliferation and immune response. The developed materials would be applied in skin tissue repair that may be hampered by a series of sistemic factors, such as diabetes, smoking and nutritional deficiency. In theses cases, the usage of biomaterials as a drug delivery system or wound dressing, aiding or accelerating the repair and healing processes, becomes a necessity. The RGD peptide sequence (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) is found in many extracellular matrix (ECM) proteins, and it is frequently used to promote cell adhesion, mediated by integrins, in biomaterials. The synthesized peptide sequence was chosen by means of computational analysis. Two types of membrane were synthesized, the BC-RGDAds in which the RGD peptide was adsorbed, and the BC-RGDImz in which the peptide was covalently bonded to the membrane, therefore, immobilized. These materials, together with the pure BC membrane, were characterized by contact angle analysis, x-ray diffractometry (XRD), scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC). Subsequently, the samples were submitted to in vitro assays of cellular viability and cellular morphology, using the fibroblast lineage L929; moreover, to evaluate the immune and inflammatory response, the nitric oxide production assay as well as TNF-α and IFN-γ cytokines determination assays were performed using Balb/c mice cells. The results indicate that the BC-RGDAds and the BC-RGDImz membranes...

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:16Z : No. of bitstreams: 1 000841508_20160426.pdf: 1577360 bytes, checksum: f910ad7dfc28e389bbc2cb39d7f2de0f (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:26Z: 000841508_20160426.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:30Z : No. of bitstreams: 1 000841508.pdf: 3356205 bytes, checksum: 3b5f5a833cae5f299c4dce5b2edae0de (MD5) YacG é uma pequena proteína membro da família dos zinc-fingers, descoberta em E. coli. Sua função biológica está ligada a inibição da atividade de DNA girase e ao metabolismo do stress em procariotos. YacG atua na inibição da atividade de DNA girase por um mecanismo bipartido, a região do domínio zinc-finger atua impedindo a ligação do DNA à subunidade B e a região c-terminal liga-se a subunidade A. Embora a literatura cite YacG como sendo um inibidor de DNA girase, nada foi observado a respeito da atividade de inibição de YacG de E.coli e de outras linhagens de micro-organismos frente a outras DNA topoisomerases e não foi realizado nenhum trabalho envolvendo fragmentos peptídicos desta proteína, e tampouco ensaios de inibição do crescimento celular por estes. Sendo assim YacG de Klebsiella pneumoniae foi obtida por expressão heteróloga e uma série de peptídeos derivados desta foram sintetizados pelo método de fase sólida. Os peptídeo sintéticos foram projetados de forma a manter a região zinc-finger nativa (YacGAG1), substituídos os resíduos de cisteína por serina (YacGAG4), alanina (YacGAG5), histidina (YacGAG6 e YacGAG8) e também sintetizada a sua região c-terminal (YacGAG7). Os ensaios de inibição da atividade de DNA girase pelos peptídeos sintéticos e proteína, mostraram que YacG, YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 conseguem inibir a atividade desta enzima, ao contrario do fragmento nativo YacGAG1. Por outro lado YacGAG1 conseguiu inibir a atividade de Topoisomerase IIα humana juntamente com os demais peptídeos YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 e proteína YacG. Os ensaios aqui apresentados corroboram com os dados apresentados na literatura onde a região c-terminal por si só é capaz de inibir a atividade de DNA girase. Os ensaios de anisotropia de fluorescência demonstraram que a interação dos peptídicos sintéticos com DNA girase se dá pela interação destes com... YacG belongs to zinc-finger's protein family discovered in E. coli. Its biological function is connected to the catalytic inhibition of DNA gyrase and stress metabolism in prokaryotes. This protein inhibits DNA gyrase (gyrase) through a bipartite mechanism where the zinc-finger domain prevents the DNA ligation to the B subunit (GyrB) and the C-terminal bindings to the A subunit (GyrA). Although it is classified as a gyrase inhibitor neither the inhibition activity of YacG from E. coli and other microorganisms against other DNA topoisomerases nor the biological activity of fragments in cellular assays has been evaluated until present. In this study, YacG from Klebsiella pneumoniae was obtained by heterologous expression and derivative peptides from this protein were synthesized by the solid-phase method. The synthetic peptides were designed to keep the native region of zinc-finger (YacGAG1), to substitute cysteines to serines (YacGAG4), to alanine (YacGAG5), to histidine (YacGAG6 and YacGAG8) and also having only the C-terminal region (YacGAG7). The inhibition assays of gyrase by the peptides and the native protein revealed that YacG, YacGAG4, YacGAG4 e YacGAG7 inhibited this enzyme and the human topoisomerase IIα (htopoIIα). However, the same was not observed for the native fragment YacGAG1, which inhibited only the htopoIIα. The results are in agreement with literature showing that solely the C-terminal region is able to inhibit the gyrase. The assays of fluorescence anisotropy indicated that these synthetic peptides interact with GyrA. Besides inhibiting the gyrase and the htopoIIα, these peptides also revealed bacteriostatic activity against gram-negative and gram-positive bacteria. A computational study by applying a molecular dynamics protocol highlighted the importance of residues I47, R46 and W40 from YacG in the process of molecular recognition and interaction with GyrB. The results...

O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. Recentemente, foi demonstrado que moléculas análogas ao peptídeo PR-11(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma humano 20S, inibindo a atividade quimotripsina-símile em concentrações namolares (nM). Os peptídeos dessa classe desempenham importantes atividades anti-inflamatórias e angiogênicas. Novas moléculas envolvendo substituições conservativas de aminoácidos e sínteses de peptídeos cíclicos podem ser derivadas dessas estruturas, com o intuito de se encontrar melhores inibidores. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese do peptídeo PR-11 e análogos para a realização de ensaios de atividade peptidásica in vitro, visando verificar o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados em frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os peptídeos foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. As frações com proteassoma 20S foram obtidas a partir de cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400, as quais permitiram preparar satisfatoriamente enriquecidos de proteassoma livres de proteases de baixa massa molecular. Todos os análogos foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile in vitro do proteassoma 20S das três espécies estudadas, utilizando a concentração final de 1μM de peptídeo. De um modo geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito. The proteasome has been considered a potential pharmacologic target due to its participation in various processes related to intracellular protein turnover. It was recently demonstrated that analogues of the PR-11 peptide (RRRPRPPYLPR), which corresponds to the first 11 amino acids of the PR-39 molecule, exhibit a potent inhibition over the human 20S proteasome. At the tissue level, these peptides display anti-inflammatory and angiogenic properties. Therefore, new molecules containing conservative amino acid substitutions as well as cyclic analogues could be designed towards the production of more suitable inhibitors. The present work aimed the synthesis of the PR-11 peptide and its various analogues followed by their use in peptidasic assays containing 20S proteasome enriched fractions obtained from mice liver, human erythrocytes and Schistosoma mansoni adult worms. Peptides were synthesized through the Fmoc strategy in solid phase, purified by HPLC and identified by mass spectrometry. Proteasome containing fractions were recovered after gel filtration in Sephacryl-S400. This resulted in fractions free of contaminating low molecular mass proteases. All PR-11 analogues were able to inhibit at 1μM the 20S proteasome chymotrypsin-like activities from the three investigated species. Overall the intensities of inhibitory activities were similar to 20S proteasomes from mice and human and comparatively lower for the S. mansoni complex. The cyclic analogues C8C15 and C9C15 exhibited decreased inhibitory activity over the human 20S proteasome compared to PR-11, however, a significant inhibition towards the parasite´s proteasome was observed. Altogether, our data suggest that cyclic PR-11 analogues represent interesting alternatives for the development of more selective proteasome inhibitors.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-24Bitstream added on 2014-06-13T19:49:43Z : No. of bitstreams: 1 pigossi_ft_me_araiq.pdf: 1126356 bytes, checksum: 760162fd7a380d3e6dcbce0c956356a5 (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A Stichodactyla helianthus é uma anêmona relativamente abundante nos mares de Cuba apresentando grande potencialidade como fonte de peptídeos biologicamente ativos. Dentre estes peptídeos, estão duas citolisinas: as esticolisinas I (St I) e II (St II). Essas duas toxinas possuem como principal característica a capacidade de formação de poros em eritrócitos, ou seja, alta atividade hemolítica (AH), no entanto a St II é mais hemolítica que a St I. Tendo em vista que as principais alterações que diferenciam estas citolisinas (St I e St II) estão na região amino-terminal (primeiros 30 resíduos), este trabalho teve como um dos objetivos sintetizar e comparar fragmentos amino-terminais destes polipeptídeos, visando entender a diferença de atividade hemolítica. Os resultados obtidos mostraram que os peptídeos St I 12-31 e St II 11-30 possuem a mesma atividade hemolítica. Esse dado mostra que a alteração de Glu por Gly e de Gln por Glu não afeta a atividade hemolítica dos mesmos. Já os peptídeos St I 1-31 e St II 1-30, respectivamente, mostraram diferenças em suas atividades hemolíticas, estas diferenças de atividade podem estar relacionadas à região dos resíduos de 1 a 10 da seqüência peptídica. Outro resultado interessante foi que o peptídeo St I 2-31 (sem o resíduo de serina N-terminal) apresentou AH intermediária entre os St I 1-31 e St II 1-30, mostrando que a adição da serina à St I é responsável por parte da perda da atividade desta citolisina. Outro objetivo deste trabalho foi avaliar a importância da polaridade da extremidade amino-terminal da esticolisina II. Para isto, fragmentos peptídicos contendo a região amino-terminal da St II, marcado com Trp na posição 2, foi sintetizado alterando-se a carga desta extremidade (acetilado, acrescido de Ser, Asp ou Lys) Stichodactyla helianthus is a relatively abundant sea anemone found in the seas of Cuba, presenting a largely potent source of biologically active peptides. Among these peptides, are two citolysins: the sticholysins I (St I) and II (St II). These two toxins possess as main characteristic the capacity of forming pores in erythrocytes, in other words, high hemolytic activity (HA), however, the St II is more hemolytic than the St I. As far as we know that the main alterations that differentiate the proteins St I and St II are in the region amino-terminal (first 30 residues), this study has as one of the objectives the synthesizing and comparing of amino-terminal fragments of those polypeptides aiming to understand the difference of hemolytic activities. The results obtained had shown that the peptides St I 12-31 and St II 11-30 possess the same hemolytic activity. This data sample shows that the alteration of Glu for Gly and Gln for Glu does not affect the hemolytic degree of the same ones. Even then the peptides St I 1-31 and St II 1-30, respectively, had sample differences in its hemolytic activity, indicating that the different activities can be related within the region of 1 the 10 of the sequence. Another interesting result was that the peptides St I 2-31 (without the serine residue N-terminal) presented intermediary AH between St I 1-31 and St II 1-30, showing that the addition of the serine to St I is responsible for part of the losing activity in this citolysin. Another objective of this study is to evaluate the importance of polarity of the extremity amino-terminal of sticholysin II. To do this, the peptides containing the region amino-terminal of St II, marked with Trp in position 2, was synthesized changing the load of this extremity (acetylated, increased of Ser, Asp or Lys)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:10:35Z : No. of bitstreams: 1 cruscajunior_e_me_araiq.pdf: 1168682 bytes, checksum: e68054a6af1b3d4f9d9235d07ed0ef75 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Este trabalho descreve a sintese, a relacao estrutura-funcao, a interacao com membranas e a atividade biologica de um peptideo proveniente da regiao amino-terminal da proteina Esticolisina II (St II). Esta proteina e uma citolisina pertencente a familia das actinoporinas, obtida da anemona marinha Stichodactyla heliantus. Estudos estruturais e biologicos da proteina nativa indicam que a regiao amino-terminal da St II participa do processo de formacao de poros em membranas. Deste modo, visando compreender o comportamento e a importancia dessa regiao para a atividade biologica da St II, 3 analogos contendo os 30 primeiros residuos que compoem a extremidade amino-terminal da St II foram sintetizados e analisados. Os peptideos foram obtidos mediante sintese em fase solida modificando-se um residuo de leucina ou isoleucina por triptofano nas posicoes 2, 7 ou 24. Os estudos conformacionais foram realizados atraves das tecnicas de fluorescencia e dicroismo circular. Para avaliar o comportamento estrutural dos peptideos em solucao, foram realizados estudos de variacao de pH, forca ionica e titulacao com um agente indutor de estrutura, o trifluoroetanol (TFE). Na interacao com mimeticos de membranas, os peptideos foram titulados por tres tipos de detergentes: dodecil-sulfato de sodio (SDS), HPS (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano-sulfonato) e LPC (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3- fosfocolina). Complementando o estudo acima, tambem foram realizados experimentos utilizando acrilamida como agente supressor de fluorescencia. Os resultados obtidos demonstram que a estrategia de sintese de peptideos em fase solida atraves do protocolo Fmoc/tBu, utilizada na sintese dos peptideos deste trabalho, foi viavel. O processo de purificacao dos peptideos atraves de HPLC tambem se mostrou eficiente e viabilizou a obtencao do material com alto indice de pureza. In this study, we describe the synthesis, the relation function-structure, the interaction with membranes and the biological activity of the N-terminus region of the protein Sticholysin II (St II). This protein is a citolisin, which belongs to the family of the actinoporins, purified from the sea anemone Stichodactyla heliantus. According to biological and structural studies of the native protein, the N-terminus region of St II is involved on the pore formation process in membranes. In order to elucidate the function and the importance of this region to the biological activity of St II, three analogs containing the first 30 residues of the N-terminus region of St II were synthesized and analyzed. The peptides were obtained by solid phase synthesis and altered through the substitution of a leucine or isoleucine for a tryptophan on the positions 2, 7 and 24. Circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence studies have been carried out to investigate conformational properties of the peptides. In order to evaluate the structural modification on aqueous solution, studies were performed in order to evaluate the pH, ionic strength and addition of the secondary structural-inducing solvent TFE. The interaction studies with micelles were performed using three different surfactants: sodium dodecil-sulfate (SDS), N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammoniumpropanesulfonate (HPS) and lysophosphatidylcholine (LPC), and using acrylamide as a fluorescence suppression agent. We have demonstrated that on solid phase peptides synthesis using the Fmoc/tBu strategy is a success. The purification process of peptides through HPLC, has also revealed to be efficient, once the material was obtained with high purity level above 95%. The experiments of hemolytic activity showed that the three peptides have activities in æM concentration, this results reinforce the idea that the 30 residues of the N-terminus region have an important role on pore formation in membranes.