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La patulina es un metabolito secundario tóxico producido por diferentes hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium y Xylaria. Su presencia en la cadena alimentaria se debe a la contaminación de una gran variedad de alimentos con hongos productores, entre los cuales P. expansum, que infecta fundamentalmente manzanas, es considerado el principal hongo productor de patulina. A raíz de su reactividad con compuestos nucleofílicos a nivel celular y sus efectos tóxicos agudos reportados en riñones, intestino y el sistema inmunitario de vertebrados, la patulina se encuentra en la corta lista de micotoxinas vigiladas y reguladas mundialmente. Los límites máximos para patulina establecidos por la UE son 50 µg/kg para zumos, 25 µg/kg para productos sólidos y 10 µg/kg para alimentos destinados al consumo infantil. De modo similar a otros contaminantes relevantes, son muchos los procedimientos analíticos desarrollados para la detección de patulina en alimentos. No obstante, dichas metodologías se basan principalmente en técnicas cromatográficas, no existiendo métodos inmunoanalíticos que permitan su determinación fiable. El enfoque principal de esta tesis doctoral se ha basado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de patulina y su aplicación para el desarrollo de inmunoensayos que permitan detectar la micotoxina de modo cuantitativo en diferentes matrices alimentarias. En una primera aproximación, los análogos estructurales, denominados haptenos, fueron sintetizados introduciendo un brazo espaciador que permitiera su acoplamiento posterior a proteínas portadoras, manteniendo lo más intacto posible el esqueleto original de la toxina. Con este propósito, se prepararon tres haptenos convencionales, los cuales fueron finalmente empleados para la preparación de bioconjugados tras su caracterización mediante técnicas espectroscópicas. Empleando estrategias previamente descritas en la bibliografía, se sintetizaron los haptenos C4 y C7, mientras que el hapteno C6 se obtuvo mediante una aproximación novedosa. Una vez preparados y caracterizados los conjugados, se llevó a cabo evaluación de la respuesta inmunitaria generada por cada hapteno mediante la inmunización de conejos. Ante la ausencia de una adecuada respuesta inmunitaria y por tanto de anticuerpos con suficiente afinidad hacia la patulina, se decidió evaluar la viabilidad de un método de derivatización de la micotoxina que permitiera producir anticuerpos frente a un derivado estable. Para ello, se desarrollaron dos estrategias de derivatización aprovechando la reactividad de patulina con grupos nucleofílicos. El uso de diferentes compuestos aromáticos monotiolados como reactivos para la derivatización permitió obtener seis aductos, y la funcionalidad de esta aproximación se estimó mediante la inmunización con el conjugado BSA–V y su análogo, el conjugado BSA–V4. La obtención de anticuerpos anti–V impulsó el desarrollo del segundo método de derivatización, el cual estuvo basado en la formación de derivados de patulina empleando compuestos aril-1,2-ditiol. Como resultado, se produjeron y caracterizaron un total de 5 aductos, empleando finalmente derivados proteicos de los aductos VII, VIII y XI para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales. Los haptenos VIIa, VIIIa, XIa y XIb permitieron la obtención de un grupo amplio de anticuerpos, los cuales fueron exhaustivamente caracterizados y empleados exitosamente para el desarrollo de inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y de tiras inmunocromatográficas. Por último, la aplicación de ambas técnicas a muestras reales permitió demostrar su utilidad para el análisis de patulina a niveles legislativamente relevantes. En definitiva, esta tesis doctoral ha permitido el desarrollo de los primeros métodos rápidos basados en anticuerpos para la determinación de patulina, la única micotoxina regulada para la que no existían aproximaciones analíticas de este tipo.

Orientadores: Pilar Rodriguez de Massaguer, Amauri Rosenthal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A patulina é uma micotoxina produzida por fungos pertencentes aos gêneros Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys. Penicillium expansum se destaca por ser potencial produtor de patulina nas maçãs, enquanto Byssochlamys nivea e B.fulva se destacam pela potencial produção desta micotoxina em sucos de maçãs pasteurizados. À patulina tem sido atribuídos diversos efeitos agudos e crônicos adversos à saúde humana. No presente estudo determinou-se quantitativamente o risco dos níveis de patulina no suco de maçã ultrapassar o limite de 50ppb estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e a probabilidade de produção da patulina por bolores termoresistentes sobreviventes à pasteurização do produto. Para isto, i) avaliou-se a ocorrência de bolores termoresistentes e patulina em amostras pertencentes à 5 diferentes lotes de suco de maçã provenientes de uma unidade produtora localizada no sudeste do Brasil; ii) avaliou-se a capacidade de produção da patulina por cepas de B.fulva (IOC 4518) e B.nivea (ATCC 24008 e FRR 4421) em suco de maçã armazenado à 21ºC e à 30ºC (consideradas temperaturas médias anuais das regiões tropicais e subtropicais do Brasil); iii) determinou-se a cepa Byssochlamys produtora de patulina mais termoresistente dentre as três estudadas, em suco de maçã; iv) determinou-se a resistência térmica através do método dos tubos TDT (thermal death tubes) da cepa mais termoresistente; v) Estabeleceu-se o efeito da pasteurização em sistema contínuo (UHT), simulando as condições industriais, sobre a cepa de Byssochlamys spp mais termoresistente produtora de patulina; vi) determinou-se a probabilidade de produção de patulina pela cepa mais termoresistente produtora de patulina em suco clarificado de maçã variando-se a temperatura de estocagem (21ºC e 30ºC), com carga remanescente pós-processo de 10º e 101 esporos / 100 mL e vii) determinou-se quantitativamente o risco da patulina em suco clarificado de maçã a partir de 15 cenários que relacionados a diferentes cargas de esporos sobreviventes e temperatura de estocagem do suco pós-pasteurização, utilizando-se a modelagem de Monte Carlo, feita através do software @RISK versão 4.5 for students com 1 simulação e 10000 iterações. Os resultados revelaram que a ocorrência de bolores termoresistentes nas amostras de suco de maçã é baixa (

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica, Micotoxinas são metabolitos fúngicos secundários que podem ser tóxicos para humanos, animais e plantas. Algumas das micotoxinas mais observadas são ocratoxina A (OTA), aflatoxinas, fumonisinas e patulina (PAT), que representam uma preocupação para a saúde humana e pecuária. Membros dos três géneros de fungos: Aspergillus, Fusarium e Penicillium são os principais produtores de micotoxinas, sendo Penicillium expansum o principal produtor de PAT. As culturas podem ser infetadas antes ou depois da colheita, resultando na contaminação da cadeia alimentar. Existem alguns efeitos adversos das micotoxinas para a saúde, como a toxicidade aguda, resultando na deterioração das funções hepáticas ou renais e imunodeficiência. Deste modo, o potencial das micotoxinas em prejudicar a saúde através da exposição às mesmas, conduziu ao desenvolvimento de métodos que detetam fungos produtores de micotoxinas. Os métodos tradicionais são baseados em técnicas de cultura que consomem muito tempo e que requerem grandes quantidades de meios e reagentes. Devido a estas limitações, há um interesse crescente em métodos mais rápidos e sensíveis para a deteção dos principais contaminantes dos alimentos. Neste sentido, técnicas moleculares de DNA têm sido utilizadas como um método alternativo devido ao menor tempo de análise e maior sensibilidade. Alguns exemplos são a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), o PCR em Tempo Real (qPCR) e a Amplificação da Polimerase de Recombinação (RPA). A RPA é uma técnica de amplificação isotérmica que apresenta grandes vantagens como a sensibilidade, o baixo custo de operação, temperatura baixa constante e não requer instrumentos complexos. Uma forma de detetar os produtos de amplificação da reação de RPA são as Fitas de Fluxo Lateral (LFS) – dispositivos simples para a deteção de analitos onde os resultados podem ser observados diretamente a olho nu dentro de 5 a 15 minutos. O analito de interesse é capaz de se mover por ação capilar através das várias secções da fita, onde estão ligadas moléculas que podem interagir com o analito. Na presente tese foi desenvolvida uma combinação do método RPA com o LFS para a deteção a olho nu de fungos produtores de PAT, utilizando um conjunto de primers e uma sonda que têm como alvo o gene isoepoxydon dehydrogenase (idh). Esta combinação foi bem-sucedida para todas as estirpes de P. expansum., Mycotoxins are secondary fungal metabolites that can be toxic to humans, animals and plants. Some of the most commonly observed mycotoxins are ochratoxin A (OTA), aflatoxins, fumonisins and patulin (PAT), which present a concern to human health and livestock. Members of three fungal genera: Aspergillus, Fusarium and Penicillium are the mainly producers of mycotoxins, where Penicillium expansum is the main producer of PAT. Crops can be infected before or after harvesting, resulting in contamination in the food chain. There are some adverse health effects of mycotoxins, such as acute toxicity, resulting in deterioration of the liver or kidney function and immunodeficiency. Thereby, the potential of mycotoxins to cause harm health through exposure has led to the development of methods that detect mycotoxins producing fungi. Traditional methods are culture-based techniques which are time consuming and require huge amounts of media and reagents. Because of these limitations, there is an increasing interest in faster and more sensitive methods for the detection of major food contaminants. In these sense, DNA molecular techniques have been used as an alternative method owing to their lower analysis time and higher sensitivity. Some examples are Polymerase Chain Reaction (PCR), Real-time PCR (qPCR) and Recombinase Polymerase Amplification (RPA). RPA is an isothermal amplification technique that has great advantages such as its sensitivity, its operation low cost, constant low temperature and it does not require complex instruments. A way to detect the amplification products of the RPA reactions is the Lateral Flow Strips (LFS) – simple devices for the detection of analytes where the results can be directly observable by naked-eye within 5 to 15 minutes. The analyte of interest is able to move by capillary action through the various sections of the strip, where attached molecules can interact with the analyte. In the present thesis it was developed a combination of the RPA method with the LFS for the naked-eye detection of PAT producing molds, using a set of primers and probe that target the isoepoxydon dehydrogenase (idh) gene. This combination was successful for all the P. expansum strains.

Patulin (PAT) is a mycotoxin produced by certain fungal species which is frequently found contaminating apples and derived products, especially juice. Several fungal pathogens, in particular Penicillium species, have been identified as causative agents of diseases in apples. PAT contamination may occur due to reasons as geographic differences, climatic conditions, agricultural practices, cultivars and postharvest environment, which may affect fruit composition. This toxic contaminant is associated with mutagenic, immunosuppressive and neurotoxic effects in humans and animals. In Brazil and in the world effective control of PAT contamination depends on reliable analytical methods. This study developed and validated a technique for the analysis of PAT in samples of industrialized apple juice based on liquid-liquid extraction, using acetonitrile as the extraction solvent. Detection via mass spectrometry was performed after Atmospher Pressure Chemical Ionization (APCI). Mean recoveries of 97.5, 92.49 and 96.92% were reached for 4, 8 and 20 μg/L of PAT, respectively. The mean recovery of the method was 95.64%. The reproducibility of the presented methodology was confirmed when the results of a FAPAS proficiency test, showing a 95.9% recovery, in addition to presenting a good selectivity. The method uncertainty was estimated on three different days for three concentrations 4, 8 and 20 μg / L in replicates of 7 times each concentration, obtaining 0.37%, 6.62%The analyte was monitored with an APCI source in negative ion mode to identify its fragments. The 24 analyzed samples presented PAT levels below the limit of quantification. A patulina (PAT) é uma micotoxina causada por certas espécies de fungos que, com certa frequência, contamina maçãs e produtos derivados, particularmente o suco. Esse contaminante tóxico é associado a efeitos mutagênicos, imunossupressivos e neurotóxicos em humanos e animais. No Brasil e no mundo o controle eficaz da contaminação por PAT depende de métodos analíticos confiáveis. Para um adequado monitoramento dos níveis de PAT em maçãs, é imprescindível utilizar processos que garantam um preparo adequado da amostra para a realização de uma análise cromatográfica correta. Este trabalho desenvolveu e validou uma técnica de análise de PAT em amostras de suco de maçã industrializado fundamentada na extração líquido-líquido, utilizando a acetonitrila como solvente extrator. A detecção por espectrometria de massas foi realizada após ionização química à pressão atmosférica (APCI). As recuperações médias alcançadas para as concentrações de 4, 8 e 20 μg/L de PAT foram de 97,5%, 92,49% e 96,92 %, respectivamente. A recuperação média do método foi de 95,64%. A reprodutibilidade da metodologia apresentada foi confirmada quando os resultados de um teste de proficiência de FAPAS, apresentando uma recuperação de 95,9%, além de apresentar uma boa seletividade. A incerteza do método foi estimada em três dias diferentes para três concentrações 4, 8 and 20 μg/L em replicatas de 7 vezes cada concentração, obtendo 0,37 %, 6,62 %. O analito foi monitorado por APCI no modo negativo para identificação de seus fragmentos. As 24 amostras de sucos de maçã analisadas apresentaram níveis de PAT abaixo do limite de quantificação.

Patulin (PAT) is a mycotoxin produced in fruits by several Penicillium and Aspergillus species, especially Penicillium expansum. Its occurrence as a natural contaminant of fruit juices is an indicative of fruit quality in production [1]. The maximum content of patulin has been established by the EU by the Directive (CE) Nº 1881/2006 in 50 μg·kg-1 for fruit juices. In this work, dispersive liquid–liquid microextraction (DLLME) has been proposed for the extraction and preconcentration of PAT in apple juice samples, followed by its determination by micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with diode-array detection. DLLME is a novel environmentally friendly sample preparation technique, showing important advantages because it is fast, inexpensive, easy to operate with a high enrichment factor and consumes low volume of organic solvents. This method is based on a ternary component solvent system in which the extraction solvent and disperser solvent are rapidly injected into the aqueous sample containing the analyte, using a syringe. The mixture is then gently shaken and a cloudy solution (water/disperser solvent/extraction solvent) is formed in the test tube. After centrifugation, the fine particles of extraction solvent are sedimented in the bottom of a conical test tube and the analyte can be directly analyzed or this phase can be evaporated and reconstituted in the appropriate solvent before analysis [2]. In this work PAT has been analyzed in the presence of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) (main interference in apple juice PAT analysis) using an extended light path fused-silica capillary (64.5 cm × 75 μm I.D., 56 cm effective length) and an electrophoretic buffer consisting of borate/HCl 35 mM at pH 9.0, sodium dodecyl sulphate (SDS) 65 mM and acetonitrile 5%. Samples were introduced by hydrodynamic injection (50 mbar, 17 s), dissolved in water at pH 4.0, acidified with an aqueous acetic acid solution [3]. Variables affecting DLLME efficiency were optimized, selecting: 5 mL of sample solution, 1000 μL of chloroform as extraction solvent, 1000 μL of 2-propanol as disperser solvent and 20% (w/v) of NaCl. The sedimented phase was evaporated to near dryness using a stream of nitrogen and reconstituted with 0.5 mL of water at pH 4. The solution was filtered and injected into the electrophoretic system. Under these conditions, a very clean extract was obtained. Following this treatment, sample throughput was approximately 10 samples per hour, obtaining a preconcentration factor of 10. Calibration curve was established for PAT in apple juice samples, applying the DLLME-MECK procedure. LOD (obtained as 3xS/N) was 0.64 μg·L-1 and LOQ (obtained as 10xS/N) was 2.14 μg·L-1. The precision of the method was evaluated in terms of repeatability and intermediate precision and the result was acceptable (RSD < 10%). Recoveries obtained for spiked apple juice samples at four different concentration levels (5, 20, 50 and 75 μg·L-1), were above 75% with RSD lower than 9%. From the results, DLLME has shown to be a very easy, fast, efficient and green extraction procedure, in comparison with conventional alternatives for PAT analysis. Combined with the advantages of capillary electrophoresis, it could provide a very useful method for the analysis of PAT in fruit juices in routine laboratories. [1] E. M.S.M. Gaspar, A. F.F. Lucena. Food Chem. 114 (2009) 1576-1582 [2] C. Bosch Ojeda, F. Sánchez Rojas. Food Control 18 (2007) 530–534. [3] M. Murillo, E. González-Peñas, S. Amézqueta, Food Chem. Toxicol. 46 (2008) 57–64., Calidad en química analítica alimentaria, ambiental y clínica (FQM-302); Proyecto de excelencia de la Junta de Andalucía P07-AGR- 03178, Trabajo fin de Máster Univ. Granada, Dpto. de Química Analítica, Máster en Química. Leído en septiembre de 2011

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar apresentada à Faculdade de Farmácia A patulina é um metabolito secundário produzido por um conjunto de espécies fúngicas dos géneros Aspergillus, Byssochlamys, Penicillium e Paecilomyces dos quais Penicillium expansum é a espécie mais importante. É uma micotoxina encontrada frequentemente em maçãs e produtos à base de maçã, e por isso, a sua presença é um indicador da qualidade da fruta utilizada na produção.Estudos de toxicidade demostram que esta micotoxina é classificada como mutagénica, genotóxica, imunossupressora e neurotóxica. A patulina é uma micotoxina com particular interesse na área da alimentação infantil, dado que ocorre sobretudo em produtos à base de maçã, amplamente consumidos por este grupo populacional. Tendo esta premissa como referência, a Comissão Europeia estabeleceu, no Regulamento (CE) no 1881/2006, limite máximo de 10 μg/kg para a patulina em alimentos destinados a crianças.Os objetivos do presente estudo foram determinar a ocorrência de patulina em alimentos destinados à alimentação infantil e avaliar a exposição humana decorrente do seu consumo. Foram analisadas 40 amostras de puré de fruta à base de maçã comercializadas em Portugal por método de ELISA competitivo. Todas as amostras estavam contaminadas com um teor de patulina superior ao LOD (1 μg/kg). Os teores das amostras variaram entre 1,43 e 23,28 μg/kg, com um valor médio de 5,78 ± 5,09 μg/kg.A exposição de lactentes e crianças jovens foi estimada para o pior, médio e melhor cenário, tendo sido obtido valores de EDI entre 0,0028 e 0,3582 μg/kg de p.c./dia. Para o pior cenário, correspondente ao consumo, por um lactente, de um boião (100g) com o teor máximo determinado, a EDI representa cerca de 89,55 % da DDAMP de patulina estabelecida pela JECFA (0,4 μg/kg de p.c./dia).Apesar de não ser estatisticamente significativo, as amostras de origem biológica, apresentam teores de contaminação superiores às amostras de origem convencional, conforme verificado em estudos anteriores realizados em produtos à base de maçã.Os resultados do presente estudo confirmam a necessidade de continuar a monitorização da exposição da população a esta micotoxina e implementar medidas que visem a diminuição da incidência da patulina e a consequente exposição das crianças. Patulin is a secondary metabolite produced by a set of fungal species of the genera Aspergillus, Byssochlamys, Penicillium and Paecilomyces of which Penicillium expansum is the most important species. It is a mycotoxin often found in apples and apple-based products, and therefore, its presence is indicative of the quality of the fruit used in production. Toxicity studies show that this mycotoxin is classified as mutagenic, genotoxic, immunosuppressive and neurotoxic.Patulin is a mycotoxin with particular interest in the field of children, given that it occurs mainly in apple-based products, widely consumed by this population group. With this premise as a reference, the European Commission collected, in Regulation (EC) No. 1881/2006, a maximum limit of 10 μg/kg for patulin in foodstuffs for children.The objectives of the present study were to determine the occurrence of patulin in foods intended for infant feeding and to assess human exposure resulting from its consumption. Forty samples of apple-based fruit puree marketed in Portugal were analyzed using a competitive ELISA method. All samples were contaminated with a patulin content higher than LOD (1 μg/kg). The contents of the samples varied between 1.43 and 23.28 μg / kg, with an average value of 5,78 ± 5,09 μg/kg.The exposure of infants and young children was estimated for the worst, medium and best scenario, with EDI values between 0,0028 and 0,3582 μg/kg bw/day being obtained. For the worst scenario, corresponding to the consumption, by an infant, of a jar (100g) with the maximum content determined, the EDI represents about 89,55% of the DDAMP of patulin established by JECFA (0.4 μg/kg bw/day).The results of the present study confirm the need to continue monitoring the population's exposure to this mycotoxin and to implement measures aimed at reducing the incidence of patulin and the consequent exposure of children.

Many food commodities are prone to fungal infection and to mycotoxin contamination. Fungi can infect crops in the field and maintain their activity during storage. Some of these fungi produce mycotoxins, that may resist food processing and persist in food products. Existing decontamination strategies are still very inefficient, and that is why research in this area is continuously evolving. Recent advances in the study and use of nanoscale materials allow the development of novel electrospun nanofibrous affinity membranes with tailored and stable selectivities, combining high separation performance and capacity to remove selected food contaminants from fluid food commodities, involving simple filtration steps and avoiding loss of nutritive and/or organoleptic attributes. As proof of concept, novel membranes were evaluated for the selective removal of patulin from juices. Patulin is a mycotoxin produced by several fungi, being Penicillium expansum one of the most common causes of patulin contamination in apples, cherries, pears and other fruits. Besides some acute symptoms caused in humans such as gastritis and nausea, patulin also has diverse toxic effects, including neurotoxicity, immunosuppression and genotoxicity. Major issues for food safety are related to the occurrence of patulin in unfermented apple juice and apple-derived baby foods. Many countries, including the European Union, have established maximum tolerable levels of patulin contamination for fruit-derived products. Novel nano-/microfibrous membranes with a poly(ethylene-co-vinyl alcohol) backbone as a support to other bioactive polymers, cell components or whole cells were prepared. These membranes were tested for their mechanical and physical properties, and for their behaviour regarding patulin adsorption. The most common adsorption models were adjusted to the experimental data for the chemical characterization of membranes behaviour. The future application of these membranes for the selective removal of patulin from juices is discussed., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Submitted by halves@ufp.pt (halves@ufp.pt) on 2020-02-11T09:57:19Z No. of bitstreams: 1 DM_Tatiane Basso.pdf: 1114926 bytes, checksum: 3919917bdbd0c6a550000d04985939b0 (MD5) Approved for entry into archive by halves@ufp.pt (halves@ufp.pt) on 2020-02-11T09:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DM_Tatiane Basso.pdf: 1114926 bytes, checksum: 3919917bdbd0c6a550000d04985939b0 (MD5) Made available in DSpace on 2020-02-11T09:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DM_Tatiane Basso.pdf: 1114926 bytes, checksum: 3919917bdbd0c6a550000d04985939b0 (MD5) Previous issue date: 2019-12-02

La presencia de los hongos toxicogénicos y sus metabolitos tóxicos en los productos de interés agroalimentario es uno de los principales problemas sanitarios y económicos en Argentina. El uso indiscriminado de fungicidas de origen sintético para la prevención de la contaminación ha derivado en el desarrollo de poblaciones resistentes, lo que demanda el uso de dosis más elevadas y sustancias más agresivas para su control, con el consecuente aumento de residuos tóxicos en los productos agroalimentarios. Es por ello que, en los últimos años, se ha incrementado la búsqueda de productos naturales como agentes antifúngicos para su empleo en cultivos agrícolas, que no contaminen el medio ambiente y no dejen residuos tóxicos en los productos tratados. Entre estas alternativas, se encuentra el quitosano, un polisacárido derivado de la quitina, buen formador de biopelículas, de amplio espectro antimicrobiano, no tóxico, biocompatible y biodegradable. Se utilizó quitosano de alto grado de pureza, grado de desacetilación >85% y peso molecular medio-bajo (5-80 kDa). Se evaluó la capacidad de distintos ácidos orgánicos para aumentar la solubilidad del quitosano en soluciones acuosas, encontrándose que el ácido acético permitió solubilizarlo a menores concentraciones que los otros ácidos, por lo que se seleccionó como disolvente. Se realizaron pruebas de estabilidad de soluciones de quitosano 3% en ácido acético 1% esterilizadas por calor y posteriormente almacenadas a temperatura ambiente (25ºC) y de refrigeración (4ºC). Los resultados mostraron que las soluciones esterilizadas por calor fueron estables durante 12 semanas a ambas temperaturas de almacenamiento. Se utilizaron dos cepas de Alternaria spp. y dos de Penicillium expansun que fueron seleccionadas por su agresividad y capacidad de colonización de los alimentos y de producción de micotoxinas. Se evaluó el efecto in vitro de diferentes concentraciones de soluciones de quitosano 3% en ácido acético 1% sobre el desarrollo de las mismas en Agar Papa Dextrosa (APD). El tratamiento inhibió completamente el desarrollo de ambas cepas de Penicillium expansum a una dosis de 4 mg/ml y de A. arborescens y A. tenuissima a la dosis de 2 mg/ml. Las soluciones de quitosano que causaron la inhibición completa del desarrollo de P. expansum y Alternaria spp. en el ensayo in vitro, fueron utilizadas para evaluar el efecto in vivo de soluciones de quitosano sobre el crecimiento de los hongos en manzanas y frutos de tomate, respectivamente. La aplicación de solución de quitosano al 3% en ácido acético 1% sobre manzanas inoculadas con P. expansum presentó un efecto fungistático sobre el hongo, causando una máxima reducción del desarrollo del 46%. Sobre tomates inoculados con Alternaria spp. mostró una reducción promedio del 93% para ambas especies. A partir de las placas de APD utilizadas en el ensayo in vitro se cuantificó la producción de toxinas de P. expansum y Alternaria spp. La producción in vitro de PAT por P. expansum y de TA por A. arborescens y A. tenuissima se incrementó cuando se utilizaron dosis intermedias (efecto fungistático) de soluciones ácidas de quitosano. Sin embargo, estas soluciones redujeron la acumulación de AME y AOH por A. arborescens y A. tenuissima in vitro. Se evaluó la concentración de micotoxinas producidas por ambos géneros fúngicos en el ensayo in vivo. La presencia de soluciones de quitosano no tuvo un efecto significativo sobre la producción de PAT en manzanas por cepas de P. expansum. La aplicación de la solución de quitosano al 3% en ácido acético 1% a una dosis de 2 mg/ml inhibió la síntesis de TA por ambas cepas de Alternaria spp. sobre frutos de tomate. No se observó un efecto significativo sobre la producción de AME por ambas especies de Alternaria. La solución de quitosano en ácido acético inhibió completamente la síntesis de AOH por A. arborescens en tomates a una dosis de 2 mg/ml, pero no por A. tenuissima, que fue capaz de sintetizarlo en bajos niveles. The presence of toxicogenic fungi and their toxic metabolites in agri-food products is one of the main health and economic problems in Argentina. The indiscriminate use of fungicides of synthetic origin for the prevention of contamination has led to the development of resistant populations, which demands the use of higher doses and more aggressive substances for their control, with the consequent increase of toxic residues in food products. In recent years, the search for natural products as antifungal agents for use in agricultural crops, which do not pollute the environment and leave no toxic waste in the treated products, has increased. One of these alternatives is chitosan, a polysaccharide derived from chitin, a good biofilm-forming agent, with broad antimicrobial spectrum, non-toxic, biocompatible and biodegradable. High degree of purity chitosan, degree of deacetylation> 85% and medium-low molecular weight (5-80 kDa) was used. The capacity of different organic acids was evaluated to increase its solubility in aqueous solutions. As acetic acid solubilized it at lower concentrations than other acids, it was selected as solvent. Stability tests were performed on heat-sterilized 3% chitosan solutions in acetic acid 1%, which were stored at room temperature (25ºC) and refrigeration (4ºC). The results showed that the solutions were stable for 12 weeks at both storage temperatures. Two strains of Alternaria spp. and two of Penicillium expansun, selected for their aggressiveness and ability to colonize food and produce mycotoxins were used. The in vitro effect of increasing concentrations of 3 % chitosan solutions in 1% acetic acid on their growth on Potato Dextrose Agar (PDA) was evaluated. The treatment completely inhibited the development of both strains of P. expansum in vitro at a dose of 4 mg/ml and of A. arborescens and A. tenuissima at 2 mg/ml. The chitosan solutions that caused the complete inhibition of in vitro development of P. expansum and Alternaria spp were used to evaluate the in vivo effect of chitosan solutions on fungal growth on apples and tomato fruit, respectively. The application of 3% chitosan solution in acetic acid 1% on apples inoculated with P. expansum showed a fungistatic effect on the fungus, causing a maximum development reduction of 46%. On Alternaria spp. inoculated tomato fruit, an average reduction of 93% was achieved for both species. From the PDA plates used in the in vitro assay, the production of P. expansum and Alternaria toxins was quantified. The in vitro production of PAT by P. expansum and of TA by A. arborescens and A. tenuissima increased when intermediate doses (fungistatic effect) of acidic chitosan solutions were used. However, these solutions reduced the accumulation of AME and AOH by A. arborescens and A. tenuissima in vitro. The concentration of mycotoxins produced by both fungal geenra in vivo was evaluated. The presence of chitosan solutions did not have a significant effect on the production of PAT in apples by strains of P. expansum. The application of 3% chitosan solution in 1% acetic acid inhibited TA biosynthesis by both Alternaria spp on tomato fruit. No significant effect was observed on AME production by both Alternaria species. The chitosan solution in acetic acid completely inhibited the synthesis of AOH by A. arborescens in tomatoes at a dose of 2 mg/ml, but not by A. tenuissima, which was able to synthesize it at low levels. Fil: Garzón Puertas, Dennis Syomara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2019-03-20T15:27:19Z No. of bitstreams: 1 ulfc124882_tm_André_Lopes.pdf: 3530551 bytes, checksum: 5d91cd940a999c82a8fcd46fa288541a (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-20T15:27:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc124882_tm_André_Lopes.pdf: 3530551 bytes, checksum: 5d91cd940a999c82a8fcd46fa288541a (MD5) Previous issue date: 2018

Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018 Os alimentos podem ser contaminados com compostos químicos como as micotoxinas. Estes metabolitos secundários são produzidos por fungos e podem provocar problemas de saúde graves se não forem monitorizados. A patulina é uma micotoxina com efeitos imunossupressores, genotóxicos, mutagênicos e nefrotóxicos, e está presente principalmente em maçãs e alimentos à base de maçã, incluíndo aqueles que são frequentemente consumidos por crianças, como purés ou sumos de frutas. Uma vez que a via mais frequente de exposição a contaminantes dos alimentos é a ingestão, será importante caracterizar o impacto do processo de digestão sobre a disponibilidade e absorção destes compostos. O presente estudo teve como objetivo determinar a variação de bioacessibilidade (fração de um composto que é libertado a partir da matriz alimentar, no trato gastrointestinal, durante a digestão) da patulina em sumos de fruta à base de maçã (turvos e límpidos) ao longo das diferentes fases do processo digestivo, utilizando para isso o método harmonizado de digestão in vitro. Este método apresenta como principal vantagem, relativamente aos descritos na literatura, o facto de ser harmonizado e de incluir um processo prévio de determinação das atividades das enzimas utilizadas durante a digestão in vitro. Neste estudo foram avaliados os valores médios de bioacessibilidade em 4 amostras de sumo de fruta à base de maçã, nas fases oral, gástrica e intestinal. Para avaliar o impacto do processo de digestão sobre a bioacessibilidade da patulina, utilizaram-se sumos de maçã artificialmente contaminados com esta micotoxina. A identificação e quantificação de patulina nas amostras foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por ultravioleta e extração em fase sólida (SPE- HPLC-UV). Segundo o conhecimento do autor, este é o primeiro estudo que descreve resultados de bioacessibilidade de patulina em sumos à base de maçã, ao longo das três fases do processo de digestão, aplicando o método harmonizado de digestão in vitro. Os resultados de bioacessibilidade de patulina revelaram valores que variaram entre os 56,8% e 94,1% na fase oral, 62,2% e 98,0% na fase gástrica, e 5,4% e 51,2% na fase intestinal. A fase gástrica é a que apresenta valores médios de bioacessibilidade mais elevados (79,3 ± 9,6), próximos dos determinados na fase oral (77,8 ± 11,8%). A fase intestinal apresenta, por outro lado, valores médios de bioacessibilidade mais reduzidos (21,6 ± 16,2%). Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores médios de bioacessibildade das fases oral e gástrica (p value = 0,828). Contudo, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as fases oral e gástrica em relação à fase intestinal (p value < 0,05), sugerindo assim que a maior redução de bioacessibilidade ao longo do processo digestivo da patulina ocorre durante a fase intestinal. p valuep valueA comparação entre diferentes matrizes alimentares, turvas e límpidas, revelaram valores de bioacessibilidade semelhantes nas duas primeiras fases do processo digestivo, ou seja, na fase oral (límpido: 77,2 ± 18,0 %; turvo: 78,4 ± 9,7 %) e gástrica (límpido: 79,9 ± 16,3 %; turvo: 78,6 ± 3,3 %). Já na fase intestinal, os resultados obtidos revelam diferenças entre os sumos de matriz límpida (18,0 ± 4,7%) e os sumos de matriz turva (25,6 ± 26,8). Não se verificam, contudo, diferenças significativas na comparação entre matrizes, considerando cada fase do processo digestivo (p values obtidos nas diferentes fases - Oral: 0,939; Gástrico: 0,821; Intestinal: 1). Face aos resultados obtidos neste estudo que revelaram valores elevados de bioacessibilidade de patulina na fase gástrica, e porque as crianças são consumidoras frequentes de alimentos à base de maçã, considera-se de extrema importância avaliar o risco associado à exposição das crianças a estes produtos. No futuro, sugere-se aumentar o número de estudos de bioacessibilidade de patulina usando o método harmonizado de digestão in vitro, em produtos à base de maçã e outros frutos consumidos por crianças. Deverá ser ainda avaliada a possibilidade de aplicar novos métodos de digestão in vitro que permitam simular a digestão infantil, dado que este processo apresenta diferenças da digestão num adulto. Food can be contaminated with chemical compounds as mycotoxins. These secondary metabolites produced by fungi can produce serious health problems if not adequately controlled. Patulin, a mycotoxin that can promote health problems such as immunosuppressive, genotoxic, mutageneic and nephrotoxic effects, is present mainly in apples and apple-based foods, including those commonly consumed by children, such as baby purees or fruit juices. Since the most frequent exposure route for food contaminants is ingestion, the impact of the digestion process on the availability and absorption of these compounds should be well characterized. The present study aimed to determine the patulin bioaccessibility, fraction…. variation throughout the different stages of the digestive process of apple-based fruit suices, using the harmonized in vitro digestion method. This method differs from other digestion methods because it is based on harmonized conditions and it includes a previous step for the determination of enzymatic activities. The mean bioaccessibility values were evaluated in 4 samples of apple juice in the oral, gastric and intestinal phases. To evaluate the impact of the digestion process on the bioaccessibility of patulin, artificially contaminated apple were used. The identification and quantification of patulin were performed by liquid chromatography with ultraviolet detection and solid phase extraction (SPE-HPLC-UV). According to the author's knowledge, this is the first study describing the bioaccessibility of patulin in apple based juices, during the three phases of the digestion process, applying the harmonized in vitro digestion method. The bioacessibility results of patulin revealed values ranging from 56.8% to 94.1 in the oral phase, 62.2% and 98.0% in the gastric phase, and 5.4% and 51.2% in the intestinal phase. The gastric phase shows the highest average bioaccessibility values (79.3 ± 9.6), close to those determined in the oral phase (77, 8 ± 11.8%). On the other hand, intestinal phase, presents the lowest average bioaccessibility values determined (21.6 ± 16.2%). There were no statistically significant differences between mean values of bioaccessibility from oral and gastric phases (p value = 0.828). However, statistically significant differences were found between the oral - gastric and intestinal phases (p value

As micotoxinas são contaminantes identificados com frequência em diversos géneros alimentícios incluindo fruta e produtos derivados. A exposição a estes metabolitos secundários produzidos por fungos pode provocar efeitos tóxicos para a saúde humana e animal. A patulina é uma micotoxina que ocorre sobretudo em maçãs e alimentos à base de maçã, incluindo os que são consumidos por crianças, tais como purés ou sumos de fruta. A ingestão de alimentos contaminados é considerada a principal via de exposição à patulina pelo que se considera relevante estudar a influência do processo digestivo na potencial toxicidade desta micotoxina. Para o efeito, neste estudo foram determinados os valores de bioacessibilidade da patulina nas fases oral (O), gástrica (G) e intestinal (I) quando presente em sumos de fruta à base de maçã, contaminados artificialmente, aplicando-se, pela primeira vez, o método harmonizado de digestão in vitro. Os valores de bioacessibilidade obtidos (O: 77,8%; G: 79,3%; I: 21,6%) sugerem uma redução dos teores de patulina que ocorre maioritariamente durante a fase intestinal, revelando também a existência de elevada bioacessibilidade nas fases oral e gástrica (superior a 75%). Os resultados indicam a necessidade de um estudo mais detalhado sobre os efeitos da patulina na fase gástrica atendendo ao potencial impacto na saúde humana, em especial em populações mais vulneráveis como as crianças. Mycotoxins are contaminants usually found in foodstuf fs including fruit and products thereof. These secondary metabolites produced by fungi can cause serious human and animal health problems. Patulin is a mycotoxin that occurs primarily in apples and products thereof, including those consumed by children, such as apple purées or fruit juices. The ingestion of contaminated food is the main route of exposure to patulin therefore, it is impor tant to clarify the influence of the digestive process on the potential toxicity of this mycotoxin. The patulin’s bioaccessibility values in the oral (O), gastric (G) and intestinal (I) phases were determined in this study, considering ar tificially contaminated apple-based juices and applying, for the first time, the harmonized in vitro digestion method. The bioaccessibility values obtained (O: 77.8%, G: 79.3%, I: 21.6%) suggest that the reduction of patulin occurs mostly during the intestinal phase, also revealing the existence of high bioaccessibility during the oral and gastric phase (above 75%). These results point the need for fur ther studies on the potential toxic ef fects of patulin at gastric phase par ticularly for vulnerable population groups as children. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

This study reports for the first time in Serbia the occurrence of patulin in apple-based food and the risk assessment associated with patulin intake by infants and preschool children. In total, 214 samples of infant fruit juices (48), infant purée (66), and juices for children (small package with straw, 100) were collected over 3 years (2013–15) and analysed using HPLC with ultraviolet detection. Patulin was found in 43.8% of infant juices and 16.7% of infant purée, with all values below the legal limit of 10 μg kg−1 (maximum 8.3 and 7.7 μg kg−1, respectively). The proportion of contaminated samples among fruit juices for children was 43.0%, with the highest patulin concentration at 30.2 μg kg−1, not exceeding the maximum allowed level of 50 μg kg−1. Risk assessment of patulin intake by Serbian infants and preschool children, conducted by deterministic and probabilistic approaches, revealed a hazard quotient well below 1, indicating a tolerable exposure level and no health concern. This research was performed under financial support to CESAM by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) (UID/AMB/50017/2013), through national funds, and the co-funding by the FEDER (POCI-01-0145-FEDER-00763), within the PT2020 Partnership Agreement and Compete 2020. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

A patulina é uma micotoxina produzida por fungos dos géneros Aspergillus e Penicillium. Esta toxina pode contaminar diversos tipos de fruta, nomeadamente maçãs e produtos derivados podendo estar associada à ocorrência de efeitos mutagénicos, genotóxicos, imunossupressores, imunotóxicos, neurotóxicos, e eventualmente carcinogénicos. Por essa razão é fundamental o controlo da ocorrência de patulina nos géneros alimentícios mais suscetíveis. Com o objetivo de avaliar a presença de patulina em amostras de fruta e polpa ao longo das várias etapas do processamento industrial, foram analisados os teores desta micotoxina em 50 amostras (ameixa, pêssego, pera e maçã), colhidas nas diversas fases de processamento. As amostras de pera e maçã apresentaram os teores de contaminação mais elevados, detetados na fase de descarga da fruta (18 μg.Kg-1) e na fase de enchimento (40 μg.Kg-1), respetivamente. Estes resultados são inferiores ao limite máximo legislado (50 μg.Kg-1) para sumos de frutos, sumos de frutos concentrados reconstituídos e néctares de frutos, por não existem valores limite para a fruta e polpa. Os dados do presente estudo alertam para a necessidade de monitorizar a ocorrência de contaminantes ao longo das várias etapas de processamento industrial como forma de obter alimentos seguros, protegendo assim a saúde dos consumidores. Estes foram os primeiros estudos efetuados em Portugal sobre a ocorrência de patulina em diferentes frutas colhidas ao longo do processamento industrial. Patulin is a mycotoxin produced by fungi of the genera Aspergillus and Penicillium. This toxin can contaminate several fruits, including apples and by-products, and may be associated with the occurrence of mutagenic, genotoxic, immunosuppressant, immunotoxic, neurotoxic, and possibly carcinogenic effects. Thus, it is fundamental to monitor the occurrence of patulin in more susceptible foodstuffs as fruits. This study aimed to determine the contents of patulin in 50 fruit and pulp samples (plum, peach, pear and apple), collected throughout different industrial processing stages. Pear and apple samples showed the highest contamination levels, detected in fruit discharge phase (18 μg.Kg-1) and the filling stage (40 μg.Kg-1), respectively. These results are lower than the legislated maximum allowed limits (50 μg.Kg-1) for fruit juices, concentrated fruit reconstituted and fruit nectars juices; however, there are no limits for fruit and pulp samples. The results of this study point out the need to monitor the occurrence of contaminants throughout the various stages of industrial processing, as a way to get safer food to attain a higher protection of the consumer’s health. This was the first study performed in Portugal on the occurrence of patulin in fruit samples collected on the various stages of industrial processing. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

A mucosa intestinal é a primeira barreira biológica encontrada pelas micotoxinas presentes nos alimentos, sendo a patulina, uma micotoxina produzida por fungos do género Penicillium spp., uma preocupação particular atendendo a que a exposição humana a esta micotoxina pode conduzir a efeitos imunológicos, neurológicos e gastrointestinais. Considerando estes efeitos para a saúde, o presente estudo tem como objetivos a avaliação do efeito tóxico da exposição intestinal a patulina, bem como a determinação do potencial efeito protetor da coadministração de patulina e cisteína na membrana intestinal, utilizando para o efeito células Caco-2. A integridade da membrana intestinal foi determinada pela medição da resistência elétrica transepitelial (TEER). Os resultados evidenciaram um decréscimo acentuado nos valores de TEER após 24 horas de exposição celular a 95 μM de patulina. Para as concentrações mais reduzidas verificou-se uma redução máxima inferior a 25% após 24 horas de exposição. A coadministração de patulina (95 μM) e cisteína (40 μM) revelou um decréscimo nos valores de TEER. O tratamento com cisteína em concentrações superiores ( 400 μM) revelou efeito protetor da membrana intestinal, tendo em conta os valores de TEER. Estes resultados contribuem para uma avaliação do risco mais precisa associada à exposição a contaminantes alimentares. The intestinal mucosa is the first biological barrier encountered by mycotoxins potentially present in foods. Patulin, a mycotoxin produced by fungi of genera Penicillium, constitutes an especial concern considering the immunological, neurological and gastrointestinal effects resulting from human exposure. The present work aims to evaluate the intestinal membrane toxic effects occurring after exposure to patulin and the potential protective effects of co-administration of cysteine, using Caco-2 cells. The membrane integrity was determined by evaluation of transepithelial electrical resistance (TEER). Results showed a marked decrease of TEER values after 24 hours of exposure to 95 μM of patulin. For lower concentrations, a TEER reduction below 25% after 24 hours of exposure was verified. Co-administration of patulin (95 μM) and cysteine (40 μM) revealed a TEER decrease. For higher cysteine concentrations ( 400 μM), a protective effect of the intestinal membrane was verified. These results contribute to a more accurate food contaminants risk assessment. Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto "MycoMix" (PTDC/DTP-FTO/0417/2012) e CESAM: UID/AMB/50017/2013, ambos financiados pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT).

The intestinal mucosa is the first biological barrier encountered by natural toxins, and could possibly be exposed to high amounts of dietary mycotoxins. Patulin (PAT), a mycotoxin produced by Penicillium spp. during fruit spoilage, is one of the best known enteropathogenic mycotoxins able to alter functions of the intestine (Maresca et al., 2008). This study evaluated the effects of PAT on barrier function of the gut mucosa utilizing the intestinal epithelial cell model Caco-2, and scrutinized immunomodulatory effects using human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and human blood monocyte-derived dendritic cells (moDCs) as test systems. PAT exposure reduced Caco-2 cell viability at concentrations above 12 mM. As expected, the integrity of a polarized Caco-2 monolayer was affected by PAT exposure, as demonstrated by a decrease in TER values, becoming more pronounced at 50 mM. No effects were detected on the expression levels of the tight junction proteins occludin, claudin-1 and claudin-3 at 50 mM. However, the expression of zonula occludens-1 (ZO-1) and myosin light chain 2 (MLC2) declined. Also, levels of phospho-MLC2 (p-MLC2) increased after 24 h of exposure to 50 mM of PAT. T cell proliferation was highly sensitive to PAT with major effects for concentrations above 10 nM of PAT. The same conditions did not affect the maturation of moDC. PAT causes a reduction in Caco-2 barrier function mainly by perturbation of ZO-1 levels and the phosphorylation of MLC. Low doses of PAT strongly inhibited T cell proliferation induced by a polyclonal activator, but had no effect on the maturation of moDC. These results provide new information that strengthens the concept that the epithelium and immune cells of the intestinal mucosa are important targets for the toxic effects of food contaminants like mycotoxins This research was developed on behalf of a Short Term Scientific Mission within the Infogest COST action and supported by the project Mycomix (PTDC/DTP-FTO/0417/2012) and through CESAM (UID/AMB/50017/2013) both funded by the Fundação para a Ciência e Tecnologia, (Portugal) and the Department of Chemistry, Biotechnology and Food Science of the Norwegian University of Life Sciences.

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2017-01-06T16:13:14Z No. of bitstreams: 1 ulfc120706_tm_Joana_Torrejais.pdf: 3515433 bytes, checksum: 662904d632b35943106f910368e9f696 (MD5) Made available in DSpace on 2017-01-06T16:13:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc120706_tm_Joana_Torrejais.pdf: 3515433 bytes, checksum: 662904d632b35943106f910368e9f696 (MD5) Previous issue date: 2016

Apple juices and purees represent categories widely consumed by whole population and above all children. Patulin (PAT) is a mycotoxin known for its acute and chronic effects in animals. Several studies indicate there is a risk associated to the PAT intake, through the consumption of purees and apple juices. In this study, apple juice and puree were prepared and artificially contaminated with PAT at 50 μg/kg and submitted to a thermal treatment simulating pasteurization to evaluate PAT’s reduction. In a second phase of the work, apple products samples ( n = 7) included juices, nectars and purees belonging to different commercial brands were collected, artificially contaminated with PAT at 50 μg/L (limit established for PAT in juices) and 25 μg/kg (limit established for PAT in purees), digested with an in vitro gastrointestinal protocol and bioaccessibility values (%) were calculated. After thermal treatment, the PAT’s loss evidenced in purees and juices was of 1.41 ± 0.52% and 62.62 ± 2.53% respectively. Related to the bioaccessibility data, two juices with pulp showed values of 70.89 ± 4.93 and 67.30 ± 10.76%; two purees showed levels of 58.15 ± 5.50 and 55.69 ± 4.73%, whereas nectar and two clarified juice showed percentages of 38.88 ± 2.42, 28.59 ± 0.46 and 25.28 ± 0.61%, respectively.

A part of apples destined to juice production is generally of poor quality. Apples from cold storage or recently harvest (ground harvested or low quality apples) are stored under ambient conditions until they are processed. Since Penicillium expansum and P. griseofulvum are the principal fungal species isolated from stored apples in Brazil, the objective of this study was to investigate the ability of these strains to produce patulin in apples and report the consequences of this type of storage in loss of quality. The toxin was quantified using thin layer chromatography and charge-coupled device camera (TLC-CCD). The rate and quantities that P. expansum and P. griseofulvum can grow and produce patulin are highly dependent on the fungal strain and time. Lesion diameter resulted to be independent of the strain considered. The maximum period of time which apples were kept at cold storage (4 ºC) without patulin accumulation was 27 days. When these apples were kept at 25 ºC during 3 days, both factors lesion diameter and patulin production increased significantly. These results confirm that time in which apples are taken out from cold storage room before juice production is critical in order to prevent patulin accumulation.

The goal of this work was to develop a simple and rapid preparation method for patulin analysis in apple juice without previous clean-up. This method combined sonication and liquid extraction techniques and was used for determination of patulin in 37 commercial apple juices available on the market in the South of Brazil. The method performance characteristics were determined using a sample obtained in a local market fortified at five concentration levels of patulin and done in triplicates. The coefficient of variation for repeatability at the fortification level of 20.70µg.L-1 was 3.53 % and the recovery 94.63 %, respectively. The correlation coefficient was 0.9996 and agrees with the requirements for a linear analytical method value. The detection limit was 0.21µg.L-1 and the quantification limit 0.70 µg.L-1. Only three of the analyzed samples were upper the allowed level of 50.00 µg.L-1 recommended for the World Health Organization.O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método simples e rápido para preparação de amostras para análise de patulina em sucos de maçã sem "clean-up" prévio. Este método combina os métodos de extração líquida com o ultrassom e foi utilizado para a determinação de patulina em 37 amostras de suco de maçã disponíveis no mercado do sul do Brasil. Os parâmetros estatísticos para validação do método foram obtidos através de fortificação de suco de maçã, obtido no mercado local, em cinco níveis de concentração de patulina e realizadas em triplicatas. O coeficiente de variação para a repetibilidade no nível de fortificação de 20,70 µg.L-1 foi de 3,53 % e a recuperação de 94,63 %. O coeficiente de correlação foi de 0,9996 e este valor está de acordo com os requisitos de linearidade de um método analítico. O limite de detecção obtido foi de 0,21 µg.L-1 e o limite de quantificação de 0,7 µg.L-1. Somente três das amostras analisadas tiveram valores superiores ao limite de 50,00 µg.L-1 recomendado pela Organização Mundial da Saúde.

The aim of this work was to optimize and validate, by intralaboratorial procedures, a method for the determination of patulin in grapes by thin-layer chromatography. The steps of extraction, cleanup, detection and quantification were optimized. For the validation of the method, recovery assays with standard solutions and artificially contaminated samples were carried out. The mean recovery and the variation coefficient were 65.4% and 7.58%, respectively. The optimized conditions were: 50 mL of grape juice, three extraction stages (with 100 mL of ethyl acetate in the first stage and 50 mL in second and third stages), and 100 µL of ethanol to solubilize the extract. The solvent-system used was toluene - ethyl acetate - formic acid (6:3:1), and 0.5% MBTH in 5% formic acid was sprayed on the plates to intensify the fluorescence. The visual detection and quantification limits were 7.44 ng and 15.87 µg.kg-1, respectively. The optimized and validated method demonstrated sufficient efficiency for adoption in the monitoring of patulin in grape.O objetivo deste trabalho foi otimizar e validar, por procedimentos intralaboratoriais, um método de determinação de patulina em uva por cromatografia em camada delgada. Foram realizados testes de otimização das etapas de extração, limpeza, detecção e quantificação. Para validação do método foram realizados ensaios de recuperação com soluções padrões e amostras artificialmente contaminadas. A recuperação e o coeficiente de variação foram 65,4% e 7,58%, respectivamente. As condições otimizadas foram: 50 mL do suco da uva; três etapas de extração, 100 mL de acetato de etila na primeira etapa e 50 mL na segunda e terceira etapas; 100 µL de etanol para solubilizar o extrato; a fase móvel tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (6:3:1) e o revelador o MBTH 0,5% em ácido fórmico 5%. O limite de detecção visual foi de 7,44 ng e o de quantificação de 15,87 µg/kg. O método otimizado e validado apresentou eficiência para ser adotado em atividades de monitoramento de patulina em uva.

O presente estudo pretende determinar a bioacessibilidade da PAT em sumos de fruta, utilizando para o efeito um modelo de digestão in vitro, bem como estudar a influência da composição e natureza do sumo. Considerando que habitualmente os sumos podem ser ingeridos simultaneamente com refeições sólidas, será ainda avaliado o efeito da adição de uma refeição à base de carne. Este trabalho foi realizado no âmbito do projeto "MycoMix" (PTDC/DTPFTO/ 0417/2012), financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia.

La patulina è una micotossina prodotta dal patogeno fungino Penicillium expansum responsabile del marciume verde-azzurro delle mele durante la conservazione postraccolta. La patulina è tossica per un’ampia gamma di organismi, uomo, animali, funghi e batteri. Gli agenti di lotta biologica (BCA) rappresentano un’alternativa o un’integrazione ai mezzi chimici per il controllo delle malattie. A tal riguardo numerose ricerche hanno dimostrato che l’uso di lieviti epifiti rappresenta un’interessante strategia per il controllo delle malattie. Le specie di lieviti sono un’enorme fonte di biodiversità genetica e biotecnologica. In questo lavoro sono stati studiati i lieviti rosa isolati dalla fillosfera e dalla carposfera di piante in sei differenti zone del centro-sud Italia. Sono stati purificati, catalogati e classificati utilizzando il metodo di analisi Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) delle sequenze di rDNA delle regioni ITS (Internal Transcribed Spacer). I risultati hanno mostrato l’esistenza di almeno dieci diversi profili RFLP (dieci diversi cluster) tra gli isolati. Il confronto delle sequenze nucleotidiche ottenute dall’amplificazione delle regioni ITS con quelle presenti nei database hanno portato ad una prima probabile identificazione tassonomica dei lieviti rosa studiati in questo lavoro. I generi Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, Rhodosporidium spp., che in letteratura scientifica sono noti per le loro caratteristiche funzionali all’attività antagonistica e/o degradativa di metaboliti tossici, risultano maggiormente rappresentati tra gli isolati della collezione rispetto agli altri generi Erythrobasidium Sporidiobolus e Aureobasidium spp., meno rappresentati. Gli isolati sono stati esaminati per la loro crescita in vitro in presenza di patulina e per la loro capacità di ridurre la concentrazione della micotossina nel mezzo colturale in condizioni aerobiche. Tra questi, quarantotto sono sopravvissuti in presenza della tossina. Analisi Thin-layer chromatography (TLC) hanno mostrato la comparsa di due spot principali, con Rf di 0.46 e di 0.25, ciò suggerisce la possibile metabolizzazione della micotossina. I risultati di questo studio potranno essere utili per future ricerche nella prevenzione o nella detossificazione della contaminazione da patulina nei prodotti derivati da pomacee. The mycotoxin patulin is produced by the blue mould pathogen Penicillium expansum in rotting apples during postharvest storage. Patulin is toxic to a wide range of organisms, including humans, animals, fungi and bacteria. Biocontrol agents (BCAs) are an alternative or a supplement to chemical means of disease control. In this regard numerous studies have demonstrated that the use of epiphytic yeasts is an interesting strategy in disease control. Yeast species represent an enormous source of genetic and biotechnological biodiversity. Pink yeasts isolated from phyllosphere and carposphere of plants in six different locations in southern-central Italy were studied in this work. They were purified, cataloged and classified making use of the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method on the rDNA sequence of the Internal Transcribed Spacer (ITS) regions. The results have shown at least ten different RFLP profiles (ten different clusters) among isolates. The comparison of the nucleotide sequences obtained by amplifying the ITS regions with those present in the databases have led to a first probable taxonomic identification of the pink yeasts studied in this work. Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, Rhodosporidium spp., that in the scientific literature are known for their functional characteristics in antagonistic activity and or in degrading toxic metabolites were the most represented genera among isolates of the collection compared to the genera Erythrobasidium, Sporidiobolus, e Aureobasidium spp. which were less represented. Isolates were examined for their in vitro growth in the presence of patulin and for their capacity to reduce the concentration of the mycotoxin in the medium in aerobic conditions. Forty-eight of them survived in the presence of the toxin. Thin-layer chromatography (TLC) analysis showed the appearance of two major spots, with Rf of 0.46 and 0.25, suggesting a possible metabolization of the mycotoxin. The results of this study may be useful for future research for the prevention or the detoxification of patulin contamination in pome fruit-based products. Dottorato di ricerca in Difesa e qualità delle produzioni agro-alimentari e forestali (XXV ciclo)

People, animals and the environment can be exposed to multiple chemicals at once from a variety of sources, but current risk assessment is usually carried out on one chemical substance at a time. Mycotoxins are fungal natural contaminants commonly found in a variety of foods including baby foods and have been found in cereal and fruit based baby foods. In human health risk assessment, ingestion of food is considered a major route of exposure to many contaminants including mycotoxins, although the total amount of an ingested contaminant (external dose) does not always reflect the amount that is available to the body (internal dose). The amount of mycotoxin resisting to the digestion process and potentially absorbable by the systemic circulation is only a smaller part of that ingested. In vitro digestion models become useful for evaluating mycotoxins bioaccessibility during the intestinal transit and can be intended as a valuable tool for the assessment of mycotoxin bioavailability in food. Trichothecenes, Ochratoxin A (OTA) and Patulin (PAT) are the best known enteropathogenic mycotoxins able to alter functions of the intestine. OTA and PAT were previously detected in cereal and fruit based baby food. This study aimed to evaluate the bioaccessibility of the mycotoxins OTA and PAT in cereal and fruit based baby food and the possible interactions that could happen when these mycotoxins co-occur. A standardized static in vitro digestion method was used to assess the bioaccessibility of OTA and PAT in three different cereal and fruit based baby foods, previously checked not to be contaminated with these mycotoxins and artificially contaminated to 1 µg/kg of OTA and 20 µg/kg of PAT. Mycotoxins quantification was performed by HPLC-FLD for OTA and HPLC-UV for PAT. Preliminary results showed that PAT presented bioaccessibility values ranging from 42 % to 65 %. Bioaccessibility assays for OTA and the mixture of OTA and PAT are under process. This study will provide new information related with the bioaccessibility of mycotoxins in baby foods and the results will offer a more comprehensive picture of what occurs during the digestion of food contaminants in the gastrointestinal tract and subsequently contributes to provide a more accurate risk assessment of single and multiple food contaminants. Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015 Made available in DSpace on 2017-03-07T10:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 3 MICF_Maria_Mariano.pdf: 846611 bytes, checksum: 13b49075076175c65b36813652a7869b (MD5) license.txt: 1195 bytes, checksum: 25733b0b84e8845b1d09ead22e7c5a2c (MD5) MICF_Maria_Mariano.pdf: 846611 bytes, checksum: 13b49075076175c65b36813652a7869b (MD5) Previous issue date: 2015

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The mycotoxin patulin causes gastroinstestinal distress, neurotoxic and immunotoxic effects in animals. It can be produced by several species of Penicillium, Aspergillus and Byssochlamys and it has been found in fruits, vegetables and cereals. Verruculogen is a toxin produced mainly by Penicillium and Aspergillus spp. and causes severe tremors in affected animals. Tomatoes are especially susceptible to fungi invasion and their products need to be investigated for possible mycotoxin contamination. A method for the determination of patulin and verruculogen in tomato products was developed involving an extraction with ethyl acetate, a cleanup by silica gel column and determination and confirmation by high performance liquid chromatography with diode array detector. The quantification limits of the method, defined as the minimum amount that allowed quantification and confirmation by the DAD detector, were 10 ng/g and 20 ng/g. The average recovery for patulin at five levels of addition (from 20 to 200 ng/g) was 75% and at the single level of 100 ng/g was 90 % .The average recovery for verruculogen at five levels of addition (from 50 to 300 ng/g) was 54% and at the single level of 100 ng/g was 52%. The processing of two tomato plants was followed during 1996, 1997, and 1998. Eighty-four samples of tomato pulp were analyzed for patulin and verruculogen. The toxins were not detected in any of the samples.A micotoxina patulina causa distúrbios gastrointestinais e efeitos neurotóxicos e imunotóxicos em animais. Pode ser produzida por várias espécies de Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys e tem sido encontrada em frutas, verduras e cereais. Verruculogeno é uma toxina produzida principalmente por espécies de Penicillium e Aspergillus e causa fortes tremores em animais afetados. Tomates são especialmente susceptíveis a invasão fúngica e seus produtos precisam ser investigados com relação a possíveis contaminações por micotoxinas. Um método para determinação de patulina e verruculogeno em produtos de tomate foi desenvolvido envolvendo uma extração com acetato de etila, uma limpeza em coluna de sílica gel e determinação e confirmação por cromatografia de alta eficiência com detector de arranjo de diodos. Os limites de quantificação foram de 10 ng/g e 20 ng/g e as recuperações medias foram de 89% e 65% para patulina e verruculogeno, respectivamente. O processamento de duas fábricas de produtos de tomate foi amostrado durante 1996, 1997 e 1998. Oitenta e quatro amostras de polpa de tomate foram analisadas para patulina e verruculogeno. As toxinas não foram detectadas em nenhuma das amostras.

A maçã (Malus domestica Borkhausen) é uma excelente fonte nutricional e de interesse econômico, sendo que a Região Sul do Brasil contribue com 90% da produção Nacional deste fruto com destaque aos cultivares Gala e Fuji. O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de patulina nestes cultivares inoculados com Penicillium expansum NRRL 1172 e Penicillium variabile toxigênico, isolado de maçãs regionais. As frutas contaminadas foram mantidas em condições de tempo de armazenamento e temperatura que variaram respectivamente de 15 a 90 dias e de 0 a 25°C. A produção de patulina ocorreu em todas as combinações de armazenagem e temperaturas empregadas para o ensaio, independentemente dos cultivares. A produção de patulina foi negativa no 30º dia nas maçãs estocadas a 0°C inoculadas com P.expansum, mas o aumento de temperatura para 4°C restringiu a margem de segurança, causando positividade na produção da toxina para ambos os cultivares inoculados com as duas linhagens fúngicas, no mesmo período. Nas maçãs inoculadas com P. variabile ocorreu maior concentração de patulina (F=68,05) do que as contaminadas com P. expansum NRRL 1172 (F=26,0). O risco freqüente de produção de patulina nas temperaturas de refrigeração, indicaram a necessidade de melhor controle nos estágios de colheita e armazenagem de maçãs, a fim de evitar constante ingestão de toxina.The apple (Malus domestica Borkhausen) is an excellent nutritional source of economical interest, with emphasis to the Brazilian Southern Region which comprises 90% of national apple production, mainly Gala and Fuji cultivars.The aim of this research was to evaluate patulin production in both cultivars, inoculated with Penicillium expansum NRRL 1172 and a toxigenic P. variabile strain isolated from commercialized apples. Samples for analysis were taken from apples stored under combined conditions of time and temperature, which ranged from 15 to 90 days period and 0 to 25°C, respectively. Patulin was produced throughout the storage temperatures assayed with both Penicillium strains. The patulin production was negative until 30th day in apples stored at 0°C, but increase of temperature to 4°C restricted the safety threshold. P. variabile produced higher concentration of patulin in inoculated apples (F=68,05) more than P. expansum NRRL1172 (F=26,0). The frequent occurrence of patulin even at refrigerated temperature indicated the importance of quality control at harvest and storage stage of fruits, to avoid constant risk of toxin ingestion.

FACEPE O Brasil é o país com a maior diversidade biológica, abrigando entre 15% e 20% do número total de espécies do planeta, sendo por isso considerado megadiverso. Dentre os biomas encontrados nesse país, estão a Mata Atlântica e a Caatinga. Dos fungos comumente isolados de solos destacam-se as espécies de Penicillium. A taxonomia desse gênero é bastante complexa e a dificuldade encontrada na identificação morfológica das espécies de Penicillium torna necessária a busca de novas ferramentas, tais como a microscopia eletrônica de varredura e a biologia molecular, que venham a complementar e validar a taxonomia clássica. Essas espécies possuem um largo potencial biotecnológico para a produção de enzimas de interesse industrial, como é o caso da tanase, que apresenta aplicação principalmente na produção de bebidas e fármacos. A produção industrial de tanase pode ser realizada através de Fermentação em Estado Sólido (FES) pela utilização de resíduos de frutos ricos em taninos, como o cajá, a manga e o umbu-cajá, visando minimizar os custos da produção. Apesar de excelentes produtores de enzimas de interesse biotecnológico, algumas linhagens de Penicillium produzem micotoxinas que podem apresentar ação carcinogênica, teratogênica, nefrotóxica, entre outras. Assim, torna-se necessária a avaliação da produção de tais metabólitos por linhagens de espécies de Penicillium que apresentem potencial para aplicação em processos biotecnológicos, principalmente nas indústrias farmacêutica e alimentícia. Os objetivos desta tese foram 1) isolar e avaliar a diversidade de espécies de Penicillium em solos das áreas da Caatinga e da Mata Atlântica no Estado de Pernambuco (Brasil), 2) determinar qualitativa e quantitativamente a produção de tanase por espécies de Penicillium atrravés da FES, utilizando resíduos de cajá, de manga e de umbu-cajá e 3) a caracterização desses isolados quanto aos seus perfis micotoxigênicos. Um total de 815 culturas de Penicillium foram isoladas, sendo 370 do solo da Caatinga e 445 do solo de Mata Atlântica. Trinta e uma espécies foram identificadas morfologicamente, sendo 23 provenientes da Caatinga e 17 da Mata Atlântica. Três isolados do solo da Caatinga foram identificados morfologicamente apenas ao nível de gênero. Destes, um foi posteriormente identificado através de análises morfológicas e filogenéticas como uma espécie nova, denominada Talaromyces pernambucanus. Um grupo de 3 isolados foi identificado como Penicillium bilaiae, porém apresentando um diferencial, a produção de esclerócios, sendo proposta a epitipificação dessa espécie.Todas as linhagens testadas foram produtoras de tanase, sendo que o isolado P. rolfssi URM 6216 o melhor produtor em resíduos de manga, com 96,22 U mL-l. Algumas linhagens de Penicillium avaliadas nesta tese, são possíveis produtoras das micotoxinas ocratoxina A e patulina. Contudo, nenhuma das micotoxinas avaliadas neste estudo foi observada para a maioria dos melhores produtores de tanase. O presente estudo revelou que os solos de Caatinga e Mata Atlântica apresentam alta diversidade de espécies de Penicillium, com a Caatinga apresentando espécies raras e uma espécie nova para a ciência. Tais linhagens apresentam um elevado potencial biotecnológico para a produção de tanase através da FES utilizando resíduos de cajá, de manga e de umbu-cajá como substratos.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2013-12-18T17:13:22Z No. of bitstreams: 1 ulfc103168_tm_catarina_pereira.pdf: 1180354 bytes, checksum: b710fc59e1661d0f0fd30ef55201c486 (MD5) Made available in DSpace on 2013-12-18T17:13:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc103168_tm_catarina_pereira.pdf: 1180354 bytes, checksum: b710fc59e1661d0f0fd30ef55201c486 (MD5) Previous issue date: 2013

Dissertação de Mestrado em Bioloigia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2013. Orientadora Elsa Vasco (Departamento de Alimentação e Nutrição, INSA, IP) [PT] As crianças constituem um grupo populacional vulnerável em virtude das suas características fisiológicas e metabólicas. Uma alimentação pouco segura pode provocar danos irreversíveis na sua saúde pelo que é importante desenvolver estudos de avaliação da exposição das crianças portuguesas a contaminantes presentes nos alimentos. As micotoxinas constituem um grupo de contaminantes químicos com impacto na saúde humana devido às suas propriedades cancerígenas, genotóxicas e mutagénicas. A patulina é uma micotoxina com particular interesse na área da alimentação infantil, dado que ocorre sobretudo em produtos à base de maçã, amplamente consumidos por este grupo populacional. Face ao exposto, esta dissertação teve como objetivo a realização de um estudo piloto sobre a avaliação da exposição à patulina de um grupo de crianças, com idades até aos 36 meses, através do consumo de alimentos infantis à base de maçã. Para este estudo foi otimizada e adaptada para a língua portuguesa e para a Tabela da Composição dos Alimentos Portuguesa uma plataforma informática online desenvolvida e aplicada na Eslovénia, designada por OPEN. A sua aplicação como diário alimentar, durante três dias, permitiu obter dados pela primeira vez, sobre o consumo de produtos à base de maçã em 12 crianças portuguesas, registando-se um valor de ingestão média destes produtos de 86 g e 49 g, para sumos e purés à base de maçã, respetivamente. A combinação dos dados de consumo com os teores de patulina em 14 produtos à base de maçã (dez sumos e quatro purés), com uma contaminação média de 2,13 μg/kg e 0,33 μg/kg respetivamente, permitiu obter os primeiros valores de avaliação da exposição à patulina de crianças portuguesas com idades compreendidas entre 0 e 36 meses. A ingestão diária de patulina estimada num pior caso de exposição possível foi de 0,0441 μg patulina/Kg peso corporal/dia, encontrando-se, no entanto, muito abaixo da dose diária admissível máxima provisória (DDAMP) que é de 0,43 μg patulina/Kg peso corporal/dia.Face à ausência de referências bibliográficas, considera-se que, até à data, o presente estudo foi o primeiro realizado em Portugal relativamente à avaliação de exposição a patulina de crianças portuguesas através do consumo de alimentos infantis à base de maçã. O estudo efetuado embora não tenha valor estatístico permitiu criar todas as ferramentas necessárias a estudos de avaliação da exposição. [ENG] Children are a particularly vulnerable population group because of their metabolic and physiological characteristics. An unsafe food may cause irreversible damage to their health, reason why is so important to develop studies to determine Portuguese children's exposure to food contaminants. Mycotoxins (secondary metabolites produced by fungi) are a group of chemical contaminants with major impact on human health due to their carcinogenic, mutagenic and genotoxic effect. Patulin is a mycotoxin with particular interest in infant feeding studies, as occurs particularly in apple-based products widely consumed by this population group. In view of the above, this dissertation aims to carry out a pilot study on the exposure assessment of patulin in a children's group, aged between 0 and 36 months, through the consumption of infant food containing apple. An online platform developed and applied in Slovenia called OPEN was optimized and adapted to Portuguese, including the introduction of the Food Composition Database from Portugal. The new online platform, called OPEN Portugal, presents nutritional intake data in a functional form and allows the data storage, production and export of the food diaries in a standardized and sophisticated approach. Its application as a food diary (during three days) allowed the data acquisition, for the first time, on the consumption of apple-based products in 12 Portuguese children, registering an average intake value of 86 g of juices and 49 g of purees. The combination of the consumption data with the patulin occurrence verified on 14 applebased products (ten juices and four purees) with an average contamination of 2.13 μg/kg and 0.33 μg/kg respectively, has provided the first evaluation data on exposure to patulin in Portuguese children aged between 0 and 36 months. The estimated daily intake of patulin in a worst exposure scenario was 0.0441 μg patulin/Kg bw/day. However, this value is below the provisional maximum tolerable daily intake (PMTDI) of 0.43 μg patulin/Kg bw/day. In the absence of references, it is considered that the present study was the first held in Portugal in relation to the exposure assessment to patulin in Portuguese children through consumption of infant food containing apple. Although the study carried out does not have statistical value, it allowed to create all the necessary tools to exposure assessment studies.

The aim of the present study was to assess patulin content in traditional cheeses, purchased from the retail trade. Samples for analysis were taken from both the inner part of the cheese and the rind. Only one out of 25 inner cheese samples contained patulin, while eight out of 25 rind samples were positive. The level of patulin in the inner part of the cheese was 26.6 ppb. In the rind, the contamination level ranged between 15.4 ppb and 460.8 ppb. Even though the rind is not considered edible, many consumers eat it. In addition, one cannot dismiss the possible migration of toxinogenic molds from the rind to the inner part of the cheese caused by blowing or other defects. For this reason, careful control of all ripening conditions is recommended.

O presente estudo teve como objetivo caracterizar a termorresistência dos fungos mais termorresistentes, isolados de néctares de maracujá e abacaxi comerciais pasteurizados, bem como verificar a produção de patulina por esses fungos, quando inoculados em tais néctares. Os fungos mais termorresistentes isolados foram o Byssochlamys fulva em néctar de maracujá e o Byssochlamys nivea em néctar de abacaxi. O B. nivea, em néctar de abacaxi, mostrou-se mais termorresistente, com base nos valores de D98°C e Z, os quais resultaram em 27 min e 5,4 °C, respectivamente, em comparação com 13,6 min e 5,5 °C encontrados para B. fulva, em néctar de maracujá. A pasteurização comumente aplicada pela indústria não se mostrou suficiente para inativação dos fungos isolados. Não houve produção de patulina quando se inocularam os fungos diretamente nos néctares estudados. This study aimed at selecting and characterising the thermal resistance of thermally resistant moulds isolated from commercial pasteurised passion fruit and pineapple nectars. It also aimed to verify patulin production by such moulds following their inoculation into the products. The most thermally resistant moulds isolated from passion fruit and pineapple nectars were Byssochlamys fulva and Byssochlamys nivea, repectively. B. nivea showed the highest thermal resistance in pineapple nectar based on the D98 °C and Z-values of 27.0 min and 5.4 °C, respectively, as compared to the same parameters found for B. fulva in passion fruit nectar of 13.6 min and 5.5 °C. The pasteurisation commonly applied by industry was shown to be inadequate to inactivate the isolated moulds. No patulin production was found when the isolated moulds were inoculated directly into the nectars.

La Patulina è una micotossina prodotta dal patogeno postraccolta Penicillium expansum. Contamina frutti di pomacee e prodotti derivati rappresentando un rischio per la salute dei consumatori. L’agente di biocontrollo Rhodosporidium kratochvilovae LS11 (lievito basidiomicete precedentemente classificato come Rhodotorula glutinis) è in grado di prevenire le infezioni di P. expansum e di metabolizzare in vitro, in condizioni di aerobiosi, la patulina. Il processo di degradazione porta alla formazione di acido desossipatulinico (DPA), composto caratterizzato da tossicità molto inferiore a quella della micotossina. Allo scopo di identificare i geni coinvolti nella degradazione della patulina, sono stati prodotti dei putativi mutanti inserzionali di R. kratochvilovae LS11 mediante trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT). Tuttavia, le analisi genetico-molecolari condotte dimostrano la mancata trasformazione di questo lievito. Perciò, mediante AMT sono stati prodotti putativi mutanti inserzionali del ceppo di riferimento del genere Sporobolomyces, Sporobolomyces sp. IAM 13481. Questo lievito utilizza lo stesso pathway degradativo di LS11, formando DPA come prodotto finale della degradazione della patulina. La generazione di mutanti inserzionali di Sporobolomyces sp. IAM 13481 è stata condotta utilizzando un sistema di selezione basato sull’auxotrofia per l’uracile sviluppato in questo studio. 3200 trasformanti sono stati esaminati per la loro capacità di degradare la patulina mediante un biosaggio ad alta efficienza basato sulla differente tossicità di patulina e DPA nei confronti di Escherichia coli DH5α. Le successive analisi cromatografiche hanno mostrato che 15 trasformanti degradano la micotossina più lentamente del ceppo wild type Sporobolomyces sp. IAM 13481, e sono perciò stati denominati slower patulin degraders. Il ruolo dei geni disattivati dalle inserzioni di T-DNA nella degradazione della patulina è stato individuato correlando i meccanismi della tossicità della micotossina e la risposta fenotipica dei mutanti inserzionali slower patulin degraders. Il fenotipo slower patulin degrader appare dovuto alla disattivazione di geni coinvolti nella resistenza alla patulina, come nel caso di geni implicati più o meno direttamente nella resistenza allo stress ossidativo e nel mantenimento dell’integrità della membrana plasmatica e/o della parete cellulare (CYB5, YCK2, PAC2, ECM38, gene che codifica per la proteina con ID 28891, CDC24, GYP7, VPS8, SSO1 e MCM1). I dati ottenuti suggeriscono che, oltre ai geni codificanti per enzimi che catalizzano gli step del pathway degradativo della patulina e hanno perciò un ruolo diretto nella sua degradazione, altri geni, come quelli identificati in questo studio, esplicano un ruolo indiretto che permette alle cellule di Sporobolomyces sp. IAM 13481 di resistere inizialmente all’azione tossica della micotossina, presumibilmente propedeutico al processo degradativo. Per confermare il fenotipo ottenuto in seguito all’inattivazione di VPS8 causata dall’inserzione del T-DNA, sono stati creati, mediante mutagenesi mirata (gene replacement), mutanti delezionali di questo gene. Diversamente da quanto atteso, i due mutanti vps8 generati con mutagenesi inserzionale random (AMT) e mutagenesi mirata mostrano una risposta fenotipica differente. Questo potrebbe essere dovuto a riarrangiamenti del T-DNA che interferiscono anche con l’espressione di altri geni. Il pathway di degradazione della patulina è stato recentemente caratterizzato. Il primo step della degradazione consiste nell’idrolisi enzimatica dell’anello lattonico della micotossina. Quindi sono stati condotti esperimenti di gene replacement a carico dei geni DLH e rDLH di Sporobolomyces sp. 13481 che codificano per due diverse diene lattone idrolasi. I dati preliminari ottenuti suggeriscono un diretto coinvolgimento di questi geni nel processo di degradazione. Penicillium expansum is an aggressive postharvest pathogen of apples and is responsible for patulin contamination in stored pome fruits an derived products. The biocontrol agent Rhodosporidium kratochvilovae LS11 (basidiomycetous yeast previously classified as Rhodotorula glutinis) is able to prevent the attack of P. expansum on apples and to degrade in vitro the mycotoxin patulin under aerobic condition. The final product of patulin degradation is desoxypatulinic acid (DPA) that is much less toxic than patulin. In order to identify the genes responsible for patulin degradation in R. kratochvilovae LS11, putative insertion mutants of LS11 have been randomly generated through Agrobacterium-mediated transformation (AMT). Unfortunately, molecular analyses showed that transformation of this yeast was not successful. The strain Sporobolomyces sp. IAM 13481, whose genome has been sequenced, degrades patulin according to the same pathway of LS11 and forms DPA as the final degradation.Therefore, we used Sporobolomyces sp. IAM 13481 to produce insertion mutants through AMT for identifying the genes involved in patulin degradation. At this aim, a selection system based on the recovery of uracil prototrophy was developed, by using an uracil auxotroph derived from Sporobolomyces sp. IAM. 3200 transformants were tested for their ability to degrade patulin, by using an high throughput bioassay based on the extreme sensitivity of Escherichia coli DH5α to patulin and on its insensitivity to DPA. Chromatographic analyses showed that 15 transformants degrade patulin more slowly than the wild type strain Sporobolomyces sp. IAM 13481, and therefore these insertional mutants were named slower patulin degraders. The role in patulin degradation of genes inactivated by AMT was defined by correlating the mechanisms of patulin toxicity and some phenotype traits of the slower patulin degraders. The slower patulin degrader phenotype is apparently due to inactivation of genes involved in patulin resistance, like genes that are more or less directly involved in resistance to oxidative stress and in preserving the integrity of the plasma membrane and/or the cell wall (CYB5, YCK2, PAC2, ECM38, the gene encoding the protein ID 28891, CDC24, GYP7, VPS8, SSO1 and MCM1). This data suggest that, in addition to genes encoding for enzymes directly involved in patulin degradation, other genes, like those identified in this study, play an indirect role in Sporobolomyces sp. IAM 13481, by enabling the yeast cells to initially resist to patulin toxicity. To confirm the phenotype showed by a T-DNA insertion mutant in VPS8, this gene was targeted for creating a deletion mutant by specific homologous replacement. Unexpected, the two vps8 mutants generated by means of AMT and target gene replacement show a different phenotype. This might be due to T-DNA rearrangements that interfere also with the expression of other genes. The patulin degradation pathway has been recently elucidated. The first degradation step is the enzymatic hydrolysis of the patulin lactone ring. Therefore, the genes DLH and rDLH of Sporobolomyces sp. IAM 13481 encoding different dienelactone hydrolases has been targeted for creating the respective deletion mutants. Preliminary results suggest that these genes might be directly involved in patulin degradation. Dottorato di ricerca in Difesa e qualità delle produzioni agro-alimentari e forestali (XXIII ciclo)