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Glaesserella (G.) parasuis is one of the most important porcine pathogens causing Glaesser’s disease. Neutrophil granulocytes are the major counteracting cell type of the innate immune system, which contribute to the host defense by phagocytosis or the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Recently, NET-formation has been shown to facilitate the survival of bacteria from the Pasteurellaceae family. However, the interaction of NETs and G. parasuis is unclear so far. In this study, we investigated the interplay of three G. parasuis serotypes with porcine neutrophils. The production of reactive oxygen species by neutrophils after G. parasuis infection varied slightly among the serotypes but was generally low and not significantly influenced by the serotypes. Interestingly, we detected that independent of the serotype of G. parasuis, NET formation in neutrophils was induced to a small but significant extent. This phenomenon occurred despite the ability of G. parasuis to release nucleases, which can degrade NETs. Furthermore, the growth of Glaesserella was enhanced by external DNases and degraded NETs. This indicates that Glaesserella takes up degraded NET components, supplying them with nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), as this benefit was diminished by inhibiting the 50 -nucleotidase, which metabolizes NAD. Our results indicate a serotype-independent interaction of Glaesserella with neutrophils by inducing NET-formation and benefiting from DNA degradation. Glaesserella (G.) parasuis es uno de los patógenos porcinos más importantes que causan la enfermedad de Glaesser. Los granulocitos neutrófilos son el principal tipo de célula contrarrestante del sistema inmunitario innato, que contribuyen a la defensa del huésped mediante la fagocitosis o la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Recientemente, se ha demostrado que la formación de NETs facilita la supervivencia de bacterias de de la familia Pasteurellaceae. Sin embargo, hasta ahora no está clara la interacción de las NET con G. parasuis. En este estudio, investigamos la interacción de tres serotipos de G. parasuis con los neutrófilos porcinos. La producción de especies reactivas de oxígeno por parte de los neutrófilos tras la infección por G. parasuis varió ligeramente entre serotipos, pero en general fue baja y no estuvo significativamente influenciada por los serotipos. Curiosamente, detectamos que, independientemente del serotipo de G. parasuis, la formación de NET en los neutrófilos fue nducida en una medida pequeña pero significativa. Este fenómeno se produjo a pesar de la capacidad de G. parasuis de liberar nucleasas, que pueden degradar las NET. Además, el crecimiento de Glaesserella se vio potenciado por las DNasas externas y las NET degradadas. se vio potenciado por las DNasas externas y las NET degradadas. Universidad Nacional, Costa Rica Escuela de Medicina Veterinaria

We thank all the personnel of the Aquatic Animal Virtopsy Lab, Hong Kong and SENASA of Costa Rica, especially to the Central Pacific Region and LANASEVE, Hellen Porras Fernández, Juan Carlos Alvarado, Osvaldo Barrantes Granados, Jacqueline Cubillo Morera, Josimar Estrella Morales, Eunice Viquez Ruiz, and the personnel from Parque Marino del Pacífico for their collaboration with the localization and handling of the stranded animals. Additionally, we want to give a special thanks to Jimmy Vargas Olivares from the Hospital San Vicente de Paul for assisting in the histopathological preparations. We also thank the Municipal Police and Coastguard of Costa Rica, the personnel from the Program of Investigation of Tropical Diseases (PIET) to Nazareth Ruiz Oceans 2022, 3 202 Villalobos, and Karol Roca for their collaboration during necropsies. This work was supported and approved as part of the National Program of Wildlife of SENASA San José, Costa Rica. Cetacean neurobrucellosis is a common cause of strandings in Costa Rica diagnosed by serology, bacteriology, and histopathology. Pathological studies were performed on 18 dolphins. Twelve were scanned by postmortem computed tomography (PMCT) as a complementary tool for describing neurobrucellosis and osteoarticular alterations associated with Brucella ceti infections. The central nervous system (CNS) and the skeleton of five dolphins not infected with B ceti did not reveal alterations by PMCT scanning. Seven Brucella-infected dolphins showed at least bilateral ventriculomegaly associated with hydrocephalus and accumulation in CSF in the lateral ventricles. We performed semiquantitative grading of the inflammatory process in the different areas of the CNS and evaluated the thickness of the cellular infiltrate in the meninges and the perivascular cuffs. The results for the severity grading were graphed to provide an injury profile associated with each area of the CNS. Age is not a decisive factor regarding neurobrucellosis presentation. The severity of ventriculomegaly by PMCT does not directly correlate with the severity of the inflammatory index determined by histopathological parameters of the brain cortex and other CNS regions, suggesting that these processes, although linked, are multifactorial and need further characterization and validation to establish better cutoffs on the PMCT. La neurobrucelosis de los cetáceos es una causa común de varamientos en Costa Rica diagnosticada por serología, bacteriología e histopatología. Se realizaron estudios patológicos en 18 delfines. Doce fueron escaneados mediante tomografía computarizada postmortem (TCPM) como herramienta complementaria para describir la neurobrucelosis y las alteraciones osteoarticulares asociadas a las infecciones por Brucella ceti. El sistema nervioso central (SNC) y el esqueleto de cinco delfines no infectados por B ceti no revelaron no mostraron alteraciones en la TCMP. Siete delfines infectados por Brucella mostraron al menos ventriculomegalia bilateral asociada con hidrocefalia y acumulación de LCR en los ventrículos laterales. Nosotros Se realizó una clasificación semicuantitativa del proceso inflamatorio en las diferentes áreas del SNC y evaluamos el grosor del infiltrado celular en las meninges y en los manguitos perivasculares. Los resultados de Los resultados de la clasificación de la gravedad se graficaron para proporcionar un perfil de lesión asociado a cada área del SNC. La edad no es un factor decisivo en la presentación de la neurobrucelosis. La gravedad de la La gravedad de la ventriculomegalia por PMCT no se correlaciona directamente con la gravedad del índice inflamatorio determinado por los parámetros histopatológicos de la corteza cerebral y otras regiones del SNC, lo que sugiere que estos procesos, aunque vinculados, son multifactoriales y necesitan una mayor caracterización y validación para establecer mejores puntos de corte en la PMCT. Universidad Nacional, Costa Rica Escuela de Medicina Veterinaria

El objetivo del presente estudio fue determinar la efectividad de una autovacuna para papilomas ocasionados por papilomavirus canino (CPV) en la región facial de un perro Gran Danés de tres meses. Se colectó un grupo de papilomas de la cara del paciente y se analizaron mediante técnicas moleculares (amplificación de un segmento del gen que codifica para la proteína L1 mediante PCR y secuenciación). Para el análisis de la secuencia se utilizó el algoritmo BLAST. El estudio histológico se realizó mediante tinción de hematoxilina-eosina del tejido y análisis en microscopio de luz a 20X. Se elaboró una autovacuna a partir de los papilomas escindidos, la cual fue administrada intradérmica en cuatro ocasiones a intervalos de siete días. Se estableció la presencia de CPV genotipo 1 en el papiloma analizado. La histopatología estableció formación de papilas epidérmicas exofíticas soportadas por un corion fibrovascular con hiperqueratosis (ortoqueratotica) e hiperplasia del estrato espinoso y con queratinocitos (coilocitos). Los papilomas desaparecieron después de la tercera aplicación de la autovacuna. Este es el primer reporte de CPV-1 en Costa Rica. La autovacuna mostró ser un tratamiento eficaz en el manejo de papilomatosis facial en el paciente. The aim of this study was to determine the effectiveness of an autovaccine for papilloma caused by canine papillomavirus (CPV) in the facial region in a three-monthold Great Dane dog. A group of papillomas were collected from the patient’s face and analyzed using molecular techniques (amplification of a segment of the gene that codes for the L1 protein by PCR and sequencing). For sequence analysis, the BLAST algorithm was used. The histological study was performed by hematoxylin-eosin staining of the tissue and analysis under a 20X light microscope. An autovaccine was developed from the excised papillomas, which was administered intradermally on four occasions at sevenday intervals. The presence of genotype 1 CPV was established in the papilloma analyzed. Histopathology established the formation of exophytic epidermal papillae supported by a fibrovascular chorion with hyperkeratosis (orthokeratotic) and hyperplasia of the stratum spinosum and with keratinocytes (koilocytes). The papillomas disappeared after the third application of the autovaccine. This is the first CPV-1 report in Costa Rica. The autovaccine proved to be an effective treatment in the management of facial papillomatosis in the patient. Universidad Nacional, Costa Rica Escuela de Medicina Veterinaria

368 p. The rapid development of nanotechnology has led to a growing concern about the entry and possibleimpacts of nanomaterials, such as graphene family nanomaterials (GFNs) in the marine environment.Similarly, plastic pollution has become a global pollution problem and effects of nanoplastics (NPs) andmicroplastics (MPs) are particularly under studied. Further, GFNs and NPs and MPs could cause anadditional threat to marine organisms because they could act as carriers of pollutants such as polycyclicaromatic hydrocarbons (PAHs) to marine organisms, increasing their bioavailability and toxicity throughthe so-called Trojan horse effect. Thus, this PhD thesis aimed to assess the potential hazards for themarine environment posed by GFNs and NPs and MPs and associated PAHs. Overall, this workdemonstrated that GFNs, NPs and MPs can act as carriers of the PAH benzo(a)pyrene (BaP) but the roleof GFNs in reducing the bioaccumulation and toxicity of associated pollutants must be highlighted.Interactions between GFNs, NPs and MPs with sorbed BaP occur, giving rise to different toxicity patternsdepending on the response studied at molecular, cellular, tissue and organism levels. Overall the Trojanhorse effect resulted more complex than previously anticipated and further studies are needed tounderstand the hazards posed by GFNs, NPs and MPs and associated pollutants for marine organisms atboth early developmental and adult stages, especially at long-term.

224 p. El efecto de los factores ecológicos y fisiológicos influyen de manera drástica en las respuestas biológicas medidas en organismos centinela como los mejillones (Mytilus sp.) haciendo que la evaluación de la salud medioambiental usando biomarcadores pueda ser poco fiable, esto se ve más acentuado en lugares con condiciones ambientales extremas. En el presente trabajo se ha seleccionado una batería de biomarcadores de nivel celular y tisular para descifrar los valores base y el efecto de la variabilidad natural (temperatura, disponibilidad de alimento, lesiones histopatológicas, factores relacionados con la latitud) en la capacidad de respuesta de estos biomarcadores ante la contaminación en poblaciones de mejillón en el Océano Atlántico Norte, Océano Ártico y Mar Báltico. La presente tesis doctoral ofrece información clave para entender las respuestas biológicas de los mejillones de las localizaciones estudiadas ante la contaminación y el potencial efecto de los factores naturales suponiendo esto una ventaja considerable a la hora de realizar experimentos toxicológicos y programas de biomonitoring para la contaminación.

La deformación del borde dorsal del cuello coloquialmente llamada “cuello de gato”, “cuello vencido” es definida como un defecto caracterizado por el incremento de tamaño, peso y volumen de la región dorsal del cuello, asociada a la deposición de grasa y su caída lateral derecha o izquierda, es un grave problema que afecta a la industria ecuestre en España, especialmente Andalucía y Extremadura con grandes pérdidas económicas anuales. Esta situación del équido con la deformación del borde dorsal del cuello representa un gran desafío diagnóstico ya que limita su estudio desde su identificación, inspección hasta la toma de muestras para identificar la causa o posibles causas. Por esto se desarrollaron estrategias en la identificación de équidos con esta condición directamente en algunas yeguadas de Pura Raza (Española, Lusitano, Hispano-Árabe), cruzados en explotaciones medianas y grandes, y por último en mataderos industriales de équidos en Andalucía y Extremadura, acompañado de factores ambientales y de manejo. El objetivo fue un estudio multidisciplinar de la deformación del borde dorsal del cuello en équidos en Andalucía y Extremadura. Se estudiaron de manera multidisciplinaria (epidemiológica, clínica, morfológica, patológica citología, biopsia, histopatologica, inmunohistoquimica, morfométrica, necropsia y bromatológica) a un total de 4.651 caballos (Eqqus caballus), en las Comunidades de Andalucía 51 % y Extremadura 49 %. También se evaluaron 853 burros (Eqqus africanus asinus), en Andalucía 45 % y en Extremadura 54 %. En el estudio se consideró la alimentación, tipo de manejo, actividad física y localización geográfica. La deformación del borde dorsal del cuello en caballos presentó una incidencia general del 9 %, una incidencia de 73 % en la Comunidad Autónoma de Andalucía, el 67 % fueron machos y el 33 % hembras 33 %, mientras que en Extremadura una incidencia de 27 %, el 73 % fueron machos y el 27 % hembras. Se observó en orden de relevancia en caballos Pura Raza Española 55 % con una edad media de 10 años, en cruzados 19 %, a partir de los 10 años, en Hispano-Árabe 14 % a partir de los 14 años y Lusitanos 12 % a partir de los 15 años. La raza, la edad y las medidas del cuello, influyen directamente sobre el grado de deformidad del cuello en los caballos estudiados. La deformación del borde dorsal del cuello en burros presentó una incidencia de 40 %, que resultó ser de mayor en burros de raza Andaluza (70 %), raza Miniatura (14 %), en Zamorano-Leonesa (9 %) y en la raza Catalana (7 %). La edad media de presentación de la deformidad del borde dorsal del cuello en burros fue de 16 años. Se observó mayor incidencia en burros en Extremadura (56 %) que en Andalucía (44 %). Las condiciones de manejo pueden influir en la presentación de la deformación del borde dorsal del cuello en burros, se considera como un factor predisponente, con una relación entre la altura de los comederos y el desarrollo de la deformación del cuello. La alimentación a base de pienso (alimento concentrado), influye directamente sobre la presentación del borde dorsal del cuello en el caballo y en burros. La asociación entre la alimentación a base de alimento concentrado (pienso comercial), caballos estabulados durante periodos prolongados, altura de los comederos en los establos (entre 100-160 cm. de altitud) y baja intensidad del ejercicio son determinantes para la deformación del borde dorsal del cuello en caballos y burros de Andalucía y Extremadura. La depreciación del caballo de Pura Raza Española con deformación del borde dorsal del cuello, estimada para un año, es bastante alta y proporcional al costo del caballo por la pérdida total; solo se compensa el valor obtenido por su venta en matadero que representa el 0,01 % de su costo, sin tomar en cuenta el costo de mantenimiento anual. El 28 % de caballos presentó alguna alteración clínica, mientras que un 72 % no presentaron lesiones al examen clínico. La casuística con mayor incidencia fue la clasificada como patologías del sistema locomotor 69 %, las patologías del sistema digestivo representan un 20 %, las patologías endocrinas representaron un 11 % de los casos estudiados. En los caballos estudiados la deformación del cuello no estaba relacionada con alguna de las principales patologías que afectan al caballo en el sistema locomotor, digestivo y endocrino. En burros con deformación del cuello las patologías más frecuentes fueron del sistema locomotor (cojeras, heridas, osteoartrosis, traumatismos, afecciones del casco excluyendo laminitis) con un 60%, seguida de patologías del sistema digestivo 26 % y por último las patologías endocrinas 14 %. La deformidad del borde dorsal del cuello en los burros estudiados estaba relacionada con alguna de las principales patologías del sistema locomotor, digestivo y endocrino (Correlación positiva entre grado de deformidad y patología). La deformación del borde dorsal del cuello en los équidos estudiados es una condición patológica caracterizada por lipomatosis, que requiere un estudio exhaustivo utilizando herramientas de diagnóstico disponibles, seguras y métodos efectivos para el diagnóstico. Este estudio describe los patrones de reconocimiento citológico, histopatológico y morfométricos del équido con deformación del borde dorsal del cuello en Andalucía y Extremadura. Los resultados del estudio histopatológico, tinción especial e inmunohistoquímico indican que el 68% de los burros presentaban deformación del borde dorsal del cuello y obesidad, mientras 66 % de los caballos presentaron deformación del borde dorsal del cuello y el 44 % de caballos maduros Hispano-Árabe, Cruzado, Lusitano, y Raza Pura Española en Andalucía y Extremadura, con sobrepeso, y obesidad, la raza, el género y el ejercicio son factores de riesgo estadísticamente significativos para el desarrollo de la deformación del borde dorsal del cuello y obesidad en caballos maduros. Adicionalmente los niveles de tocoferol (Alfa-tocoferol, Delta-tocoferol y Gammatocoferol), están estrechamente correlacionados con el grado de deformidad y pueden ser útiles como parámetros indicadores de la deformación del borde dorsal del cuello en équidos. La deformación del borde dorsal del cuello, cresta del cuello o “cuello de gato” está asociada a cambios degenerativos caracterizados por infiltración de grasa denominada lipomatosis, que implica subcutis, ligamento nucal, músculo espinal y músculos multífido. La revisión de la literatura sugiere una estrecha relación entre el desarrollo de la deformación del borde dorsal del cuello en el caballo y el síndrome metabólico equino, existe un nivel moderado de heredabilidad, asociada con el sexo, la edad, el color del pelaje y el lugar geográfico en caballos Pura Raza Española. The deformation of the dorsal neck colloquially called "cresty neck", is defined as a defect characterized by the increase in size, weight and volume of the dorsal region of the neck, associated with the deposition of fat and its lateral fall right or left, is a serious problem that affects the equestrian industry in Spain, especially Andalusia and Extremadura with large annual economic losses. This situation of the equines with the deformation of the dorsal edge of the neck represents a great diagnostic challenge since it limits its study from identification, inspection to sampling to identify the cause or possible causes. For this reason, strategies were developed in the identification of equines with this condition directly in some farms of Spanish Pure Breed (Spanish, Lusitano, Hispano-Arab), crossed in medium and large farms, and finally in equine slaughterhouses in Andalusia and Extremadura, accompanied by environmental and management factors. The objective was a multidisciplinary study of the deformation of the dorsal edge of the neck in equines in Andalusia and Extremadura. A total of 4,651 horses (Eqqus caballus), in the Andalusia (51 %) and Extremadura (49 %) were studied in a multidisciplinary (epidemiological, clinical, morphological, pathological, cytological, biopsy, histopathological, immunohistochemical, morphometric, necropsy and bromatological). 853 donkeys (Eqqus africanus asinus) from Andalucía (45 %) and Extremadura (54 %) were also evaluated. The study considered food, type of management, physical activity and geographic location. The deformation of the dorsal neck in horses had an incidence of presented a general incidence of 9%, an incidence of 73 % in the Autonomous Community of Andalucía, 67% were males and 33 % females 33 %, while in Extremadura an incidence of 27 %, 73 % were males and the 27 % females. It was observed in order of relevance in Spanish Pure Breed horses 55 % with an average age of 10 years old, in crusaders 19 %, from the age of 10, in Hispano-Arab 14 % from the age of 14 and Lusitanos 12 % from the age of 15. The race, age and neck measurements directly influence the degree of deformity of the neck in the horses studied. The deformation of the dorsal edge of the neck in donkeys had an incidence of 40 %, which turned out to be of greater in donkeys of Andalucía breed (70 %), miniature breed (14 %), in Zamorano-Leonesa (9 %) and in the Catalan race (7 %). The average age of presentation of the deformity of the dorsal neck in donkeys was 16 years. Highest incidence of donkeys was observed in Extremadura (56%) than in Andalusia (44 %). Driving conditions can influence the presentation of cresty neck deformation in donkeys, it is considered as a risk factor, with a relationship between feeder height and the development of neck deformation. Feed with concentrated food directly influences the presentation of the dorsal neck on the horse and donkeys. The association between concentrated food feed, stable horses for extended periods, height of feeders in stables (between 100-160 cm. altitude) and low intensity of exercise are decisive for the deformation of the dorsal neck in horses and donkeys of Andalucía and Extremadura. The depreciation of the Spanish Pure Breed horse with deformation of the dorsal neck, estimated for one year, is quite high and proportional to the cost of the horse for the total loss; only the value obtained from its slaughterhouse sale representing 0.01 % of its cost is offset, regardless of the annual maintenance cost. 28 % of horses suffering cresty neck had any clinical alterations, while 72 % had no clinical examination injuries. The most common concurrent pathologies are those of the locomotive system 69 %, follow by pathologies of the digestive system (20 %) while the endocrine pathologies accounted for 11 % of the cases studied. In the horses studied the neck deformation was not related to any of the main pathologies that affect the horse in the locomotive, digestive and endocrine system. In donkeys with neck deformation the most common pathologies were those of the locomotive system (limping, wounds, osteoartthritis, trauma, helmet conditions excluding laminitis) with 60%, followed by pathologies of the digestive system 26% and finally endocrine pathologies 14 %. By contrast with horses, the deformity of the dorsal edge of the neck in the donkeys studied was related to some of the main pathologies of the locomotive, digestive and endocrine system (positive correlation between degree of deformity and pathology). The dorsal neck deformation of the neck in the equine studied is a pathological condition characterized by lipomatosis, which requires a thorough study using available diagnostic tools, safe and effective methods for diagnosis. This study describes the patterns of cytological, histopathological and morphometric recognition of equines with deformation of the dorsal edge of the neck in Andalusia and Extremadura. The results of the histopathological, special staining and immunohistochemical study indicate that 68% of donkeys had dorsal neck deformation and obesity, while 66 % of horses had deformation of neck and 44% of mature horses Hispanic-Arab, Crusader, Lusitane, and Spanish Pure Race in Andalucía and Extremadura. Overweight and obese, race, gender and exercise are statistically significant risk factors for the development of dorsal Edge deformation and obesity in mature horses. In addition, the tocopherol levels (Alpha-tocopherol, Delta-tocopherol and Gamma-tocopherol) are closely correlated with the degree of deformity and can be useful as indicator parameters of the deformation of the cresty neck in horses and donkeys. The deformation of the dorsal neck, cresty neck or "cat neck" is associated with degenerative changes characterized by fat infiltration called lipomatosis, which involves subcutis, nuchal ligament, spinal muscle and multifid muscles. The revision of the literature suggests a close relationship between the development of the deformation of the dorsal neck in the horse and equine metabolic syndrome, there is a moderate level of inheritable, associated with sex, age, hair color and geographical place in Spanish Pure Breed horses.

La trichomonosis bovina (TB) es una enfermedad de transmisión sexual causada por el protozoario Tritrichomonas foetus que afecta la productividad de los rodeos, especialmente de cría, al provocar muerte embrionaria, piómetra y abortos esporádicos. En la presente tesis se plantearon dos objetivos generales: caracterizar el perfil patogénico y el perfil molecular de T. foetus aisladas demuestras clínicas de bovinos pertenecientes a diferentes establecimientos agropecuarios de la provincia de Buenos Aires. Para el estudio se constituyó un cepario con 114 aislamientos crio preservados de T. foetus de bovinos. Los aislamientos fueron derivados de diferentes laboratorios de la provincia de Buenos Aires. Del cepario constituido, se seleccionaron 26 aislamientos de diferentes regiones ganaderas de la provincia de Buenos Aires. Los aislamientos seleccionados fueron clonados para estudiarlos como clones o cepas, y confirmados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La puesta a punto de la técnica de clonado nos permitió obtener cepas a partir de primo cultivos y caracterizarlas colonias en medios sólidos observando que todas las cepas en estudio producían la hemólisis de glóbulos rojos bovinos. Los perfiles patogénicos de las cepas de T. foetusse caracterizaron por evaluación de la actividad hemolítica, la producción de absceso subcutáneo en ratones BALB/c, la citoadherencia sobre células vaginales de ratón y células CHO, el efecto citopatogénico (ECP) sobre células CHO y la persistencia de la infección vaginal de ratonas BALB/c. Los resultados de la actividad hemolítica, la citoadherencia y el ECP en línea celular CHO, permitieron categorizar las cepas de T. foetus. La instalación de la infección vaginal en el modelo ratón y la evaluación de su persistencia durante 5 semanas, permitió observar lesiones en el tracto reproductor con persistencia prolongada. Los perfiles moleculares se caracterizaron por determinación del perfil de carbohidratos mediante lectinocito química, determinación del perfil proteico en SDS-PAGE, determinación de la presencia del gen de lacisteín-proteasa 8 (CP8) mediante PCR y utilización de marcadores moleculares para determinar polimorfismo genético entre las cepas. Por SDS-PAGE se observaron perfiles proteicos homogéneos. La presencia del gen de la CP8 se confirmó en la totalidad de las cepas. La posterior secuenciación permitió comprobar la ausencia de polimorfismo tanto en el gen como en su región promotora. La lectinocito química determinó un predominio en las cepas estudiadas de manosa, N-acetil glucosamina y ácido siálico. Los resultados de la caracterización patogénica y molecular presentaron variabilidad entre las cepas de T. foetus estudiadas, sin embargo los marcadores moleculares permitieron identificar dos genotipos definiendo un patrón patogénico vinculado al ECP y la actividad hemolítica. El genotipo BL, al cual pertenecen 21/26 cepas, presentaron marcado ECP y alta actividad hemolítica. El genotipo minoritario B, 5/26 se corresponde con cepas con leve ECP sobre la línea celular CHO y actividad hemolítica baja. Por lo tanto, teniendo en cuenta todos estos resultados, podemos concluir que las cepas de T. foetus obtenidas a partir de muestras clínicas presentan diferencias en las variables en estudio vinculadas con la patogenicidad. Bovine trichomonosis (BT) is a sexually transmitted disease caused by the protozoan Tritrichomonas foetus, which affects herd productivity, particularly in breeding herds, by causing embryonic death, pyometra and sporadic abortions. In this thesis, two general objectives were established: to characterize the pathogenic profile and the molecular profile of T. foetus isolated from clinical samples of cattle belonging to different farming establishments in Buenos Aires province. For the study, a strain collection was established with 114 cryopreserved bovine isolates of T. foetus. The isolates were submitted from different laboratories in Buenos Aires province. From the established strain collection, 26 isolates from different lives tock regions of Buenos Aires province were chosen. The selected isolates were cloned to be studied as clones or strains and they were also confirmed by polymerase chain reaction (PCR). The optimization of the cloning technique allowed us to obtain strains from prime cultures and to characterize the colonies in solid media, observing that all the strains under study produced hemolysis of bovine red blood cells.The pathogenic profiles of T. foetusstrains were characterized by evaluation of the hemolytic activity, the production of subcutaneous abscessesin BALB/c mice, the cyto-adherence tomouse vaginal cells and CHO cells, the cytopathogenic effect (CPE) on CHO cells and the persistence of vaginal infection inBALB/c female mice.The results of hemolytic activity, cyto-adherence and CPEin the CHO cell line, allowed the categorization of T. foetusstrains. The establishmentof the vaginal infection in the mouse model and the evaluation of its persistence for 5 weeks, allowed the observation oflong persisting lesions in the reproductive tract.Molecular profiles were characterized by determination ofthe carbohydrate profile by lectin-cytochemistry, determination of the protein profile bySDS-PAGE, determination of the presence of the cysteine protease 8 (CP8) gene by PCR and determination of thegenetic polymorphism between strains by using molecular markers. Homogeneous protein profiles were observed by SDS-PAGE. The presence of the CP8 gene was confirmed in all the strains. By subsequent sequencing it was possible to verifythe absence of polymorphism both in the gene andin its promoter region. By lectin-cytochemistry it was determined the predominance of mannose, N-acetyl glucosamine and sialic acidin the studied strains. The results of the pathogenic and molecular characterization demonstrated variability between the T. foetuss trains studied. However, the molecular markers allowed the identification of two genotypes, defining a pathogenic pattern linked to CPE and hemolytic activity. The BL genotype, to which 21/26 strains belong, presented marked CPE and high hemolytic activity. The minority genotype B (5/26) corresponds to strains with less evident CPE in CHO cells and low hemolytic activity. Therefore, consideringall these results, we can conclude that the T. foetus strains obtained from clinical samples show differences in the variables linked to pathogenicity analyzed. Fil: Doumecq, María Laura. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Soto, Pedro. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Monteavaro, Cristina Esther. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.

294 p. La paratuberculosis (PTB) es una enteritis granulomatosa crónica causada por Mycobacterium aviumsubsp. paratuberculosis (Map) que afecta principalmente a rumiantes domésticos. A pesar de que existenvacunas contra la PTB con efectividad demostrada, su aplicación en el ganado bovino está prohibidadebido a la interferencia que produce con las pruebas de diagnóstico de la tuberculosis bovina (bTB) quese realizan durante los controles oficiales. En el presente trabajo de Tesis se evaluan las vías intradérmicay oral como alternativas a la subcutánea y varios prototipos de vacunas orales en el modelo de infecciónde Map en conejo. Algunas de las estrategias de vacunación testadas han mostrado eficacia frente a lainfección aparte de no producir interferencias con la prueba de diagnóstico de la bTB. Además de evaluarla protección ejercida por las vacunas, también se ha analizado la modulación de la respuesta inmunitariaasociada a la vacunación mediante el estudio de la polarización de los macrófagos locales del intestino,efectos en la expresión de citoquinas de células mononucleares de sangre periférica, funcionalidad deneutrófilos de sangre periférica y niveles de la respuesta humoral, entre otras. Adicionalmente, se haestudiado la interacción de neutrófilos y macrófagos bovinos ex vivo en su respuesta frente a Map encomparación con otra micobacteria atenuada menos patógena. En conjunto, los resultados de esta tesis revelan que los neutrófilos pueden jugar un papel más importante de lo que se ha pensado hasta ahora en las etapas iniciales de la infección con Map y que la estimulación de estas células inmunitarias mediantela vacunación puede aumentar las posibilidades de éxito del hospedador en su defensa ante la infección Neiker

271 p. La mayoría de los eucariotas son organismos unicelulares (protistas), muchos de ellos pertenecientes a linajes que divergieron temprano en la historia evolutiva de este Dominio de organismos nucleados. Microscópicos, enormemente diversos y fenotípicamente convergentes, su clasificación cladística ha sido históricamente compleja, dejando atrás un extenso registro de taxones y de términos parafiléticos y polifiléticos. Teniendo que investigar atributos estructurales, celulares, biológicos y ecológicos en un mundo de rápidas interacciones y difícilmente accesible a simple vista, la protistología es particularmente dependiente de la sistemática. Ésta permite inferir rasgos de especies crípticas a partir de especies evolutivamente relacionadas.Las moléculas de ADN (y ARN), representan un "registro" preciso de estos eventos de diversificación, que preceden incluso a los más antiguos registros fósiles. En los últimos años, la maduración de los métodos de filogenia molecular, catalizados por una mayor accesibilidad a la secuenciación de próxima generación (NGS), está permitiendo resolver preguntas e hipótesis sobre la evolución y la especiación de estos organismos micro-eucariotas que no se habían podido responder mediante otros métodos. Por una parte, arboles filogenéticos construidos mediante concatenaciones de cientos, incluso miles de genes, están permitiendo rastrear la historia evolutiva de los linajes protistas hasta el último ancestro común de todos los eucariotas (LECA). Concomitantemente, análisis moleculares basados en genes e incluso fragmentos cortos (especialmente 18S rRNA), recuperados principalmente de matrices ambientales u orgánicas (eDNA o ADN ambiental), están revelando una ¿caja de Pandora¿ de diversidad micro-eucariota. Ésta diversidad ¿oculta¿ está transformando nuestra percepción de los protistas en la cadena trófica y la estructura ecológica. En el medio marino, sus papeles como autótrofos, heterótrofos (predadores, saprófitos, parásitos) o mixótrofos crece en importancia día a día. El aumento simultáneo de diversidad e importancia ha sido particularmente pronunciado entre los linajes de parásitos protistas, que adaptados a la vida dentro de un huésped son más inaccesibles y morfológicamente indistinguibles que sus homólogos de vida libre. Muy competitivo como estilo de vida, el parasitismo ha evolucionado de forma independiente varias veces en prácticamente todos los grupos eucariotas, en algunos incluso cientos de veces. De hecho, es posible que el efecto parapátrico que implica una existencia endosimbiótica, haya exacerbado la especiación entre los parásitos, que representan la que posiblemente sea la más común estrategia de consumo entre los organismos vivos. Es más, el número de especies crípticas que están, a día de hoy, siendo descubiertas en la mayoría de los linajes de parásitos protistas sigue aumentando abruptamente o apenas comienza a mostrar una desaceleración. Cabe destacar, que el descubrimiento de esta diversidad oculta, incluidas las especies crípticas, va más allá de la escalada en el número de especies; afecta los estudios sobre biología celular, ciclos biológicos, y ecología. Inexorablemente, esta fuerza mostrada por los métodos de análisis y secuenciación del ADN está abriendo una brecha entre la diversidad genética existente y nuestra comprensión de la morfología, patología, transmisión y posibles hospedadores de los parásitos protistas que la constituyen. Este desequilibrio es particularmente evidente entre los parásitos que infectan linajes de invertebrados, los cuales, salvo algunos taxones con interés comercial, permanecen en gran parte sin analizar, a pesar de constituir un grupo mucho más diverso que los vertebrados. Por una parte, es lógico que los parásitos protistas causantes de infecciones en especies marinas de interés comercial (peces, bivalvos, crustáceos¿) hayan sido priorizadas, pero hay que tener en cuenta que muchos de estos micro-eucariotas tienen ciclos de vida complejos, en los que pequeños invertebrados actúan muchas veces como vectores o reservorios. Descubrir y contextualizar estas asociaciones puede ser determinante a la hora de comprender cuándo y dónde puede variar la presión y capacidad infectiva de algunas de estas infecciones en la comunidad o huéspedes específicos. Al mismo tiempo que su diversidad e importancia aumenta, la inclusión progresiva de parásitos en modelos ecológicos está experimentando variaciones de gran alcance en la dinámica poblacional de las especies animales, vegetales o fúngicas en los ecosistemas. En consecuencia, las asociaciones entre parásitos y hospedadores se investigan cada vez más como una parte importante de la estructura de la comunidad, y no exclusivamente como una "molestia" para el ser humano y sus intereses. Por desgracia la inclusión de parásitos en modelos ecológicos está siendo lastrada por un profundo desconocimiento de estas interacciones. A diferencia de los organismos multicelulares, que han podido ser observados por científicos y aficionados durante siglos, la distribución espaciotemporal de la mayoría de los organismos unicelulares sigue siendo un profundo misterio. No obstante, dadas sus importantes funciones como vectores, huéspedes intermediarios y reservorios, una comprensión mucho más profunda del patobioma (patógenos asociados a un hospedador) y su variabilidad espacio-temporal es de suma importancia para un mayor poder de predicción de los factores de presión causantes de epidemias o zoonosis en el huésped, la población y el medioambiente.En este contexto, la hipótesis de este estudio plantea que especies de invertebrados comunes en la zona inter-mareal de ecosistemas costeros en climas templados son reservorios crípticos de un número significativo de parásitos micro-eucariotas (protistas) de interés para el medio y los recursos marinos. Eldescubrimiento progresivo de estas asociaciones ocultas de parásitos-huéspedes (mediante exámenes combinando técnicas histopatológicas, ultraestructurales y moleculares) permite una mejor comprensión de la morfología, patología, biología celular y ciclo de vida de dichos patógenos, lo que a su vez consiente un seguimiento más estrecho de los factores y presiones que promueven epidemias y zoonosis en una escala espacio-temporal. PIE:Plentziako Itsas Estazioa

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As neoplasias mamárias são comumente encontradas em cães e a metástase pulmonar é considerada a principal causa de morte. A remodelação da matriz extracelular pode influenciar na progressão, invasão e metástases. Objetivou-se caracterizar o carcinoma mamário canino com e sem metástases pulmonares. Foram selecionadas 26 amostras em blocos de parafina de cães com carcinoma mamário nos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da UFV. Foram realizadas fotomicrografias e avaliações dos cortes histológicos em hematoxilina e eosina e Picrossirius red com luz polarizada. Nas análises histopatológicas foram realizadas a contagem mitótica, intensidade da necrose e do infiltrado inflamatório e análises morfométricas do núcleo, proporção das células carcinomatosas, necrose, células inflamatórias e vasos sanguíneos e quantificação do colágeno tipo I e III. A contagem mitótica e a intensidade da necrose foram maiores em carcinomas mamários de grau III. Na análise dos colágenos, a concentração dos colágenos tipo I e tipo III não foram influenciadas pelo grau e ocorrência de metástase. Nos carcinomas em tumor misto houve maior quantidade de colágeno tipo I nas neoplasias de grau I. A mensuração dos núcleos e as proporções de células carcinomatosas, necrose, células inflamatórias e vasos sanguíneos não foram significativas em relação aos graus e os grupos. Nos carcinomas em tumor misto houve uma relação significativa entre os núcleos com diâmetros maiores e a ausência de metástases. Os resultados demonstram que há maior relação entre o grau dos carcinomas mamários com as variáveis avaliadas, independente da presença ou ausência de metástase pulmonar. Estudos futuros com maior quantidade de amostras são recomendados para a avaliação das características do carcinoma mamário canino e sua relação com o microambiente tumoral e a metástase pulmonar. Palavras-chave: Câncer de mama. Metástases. Matriz extracelular. Pulmões. Morfometria. Picrossirius red. Prognóstico. Mammary neoplasms are commonly found in dogs and lung metastasis is considered the main cause of death. Extracellular matrix remodeling can influence progression, invasion and metastases. The objective was to characterize canine mammary carcinoma with and without lung metastases. Twenty-six samples were selected in paraffin blocks from dogs with mammary carcinoma from the archives of the Laboratory of Veterinary Pathology at UFV. Photomicrographs and evaluations of the histological sections were performed in hematoxylin and eosin and Picrossirius red with polarized light. In the histopathological analysis, mitotic count, intensity of necrosis and inflammatory infiltrate and morphometric analysis of the nucleus, proportion of carcinoma cells, necrosis, inflammatory cells and blood vessels and quantification of collagen type I and III were performed. Mitotic count and necrosis intensity were higher in grade III breast carcinomas. In the collagen analysis, the concentration of type I and type III collagens were not influenced by the degree and occurrence of metastasis. In mixed tumor carcinomas, there was a greater amount of type I collagen in grade I neoplasms. The measurement of nuclei and the proportions of carcinoma cells, necrosis, inflammatory cells and blood vessels were not significant in relation to grades and groups. In mixed tumor carcinomas, there was a significant relationship between nuclei with larger diameters and the absence of metastases. The results demonstrate that there is a greater relationship between the grade of breast carcinomas and the variables evaluated, regardless of the presence or absence of lung metastasis. Future studies with more samples are recommended to evaluate the characteristics of canine mammary carcinoma and its relationship with the tumor microenvironment and lung metastasis. Keywords: Breast cancer. Metastases. Lungs. Extracellular matrix. Morphometry. Picrosirius red. Prognosis.

La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad infecto-contagiosa, de curso crónico, que afecta naturalmente al ganado bovino presentando una mayor prevalencia en los rodeos lecheros debido a las prácticas de manejo propias de esta producción. El agente causal de los diferentes desordenes linfoproliferativos asociados a esta enfermedad es un deltaretrovirus denominado virus de la leucosis bovina (BLV), que infecta a los linfocitos B, integrándose a su genoma bajo la forma de provirus. La infección por BLV responde al fenómeno iceberg: sólo un 5 –10% de animales mueren por linfosarcoma luego de un extenso período de latencia, un 30% desarrolla linfocitosis persistente (LP), una expansión policlonal benigna de linfocitos B circulantes en sangre periférica, sin alteraciones morfológicas ni funcionales, que se mantiene durante toda la vida del animal. El resto de los animales, que componen la base del iceberg, permanecen asintomáticos y representan el 70% de la población infectada. Los animales linfocitóticos presentan una alta carga proviral, un elevado título de anticuerpos contra el virus y un alto número de linfocitos infectados, e integran lo que definimos como el perfil de alta carga proviral (ACPV). Del resto de los animales infectados, un 40% se corresponde con el perfil de ACPV y el 60% restante con el perfil de baja carga proviral (BCPV) caracterizado por un escaso número de linfocitos infectados en sangre periférica, lo que se refleja en una carga proviral prácticamente indetectable y muy bajo título de anticuerpos contra el virus. Varias investigaciones han intentado explicar la existencia de estos dos perfiles de infección determinando que existen factores virales, genéticos, epigenéticos, inmunológicos y ambientales que estarían contribuyendo en su desarrollo. En este trabajo de Tesis se abordaron algunos de estos aspectos. Se analizó el polimorfismo genético en la posición -824 de la región promotora del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) bajo la premisa de que este polimorfismo podría influenciar la expresión diferencial de dicho gen y tener consecuencias en el desarrollo de la enfermedad. Se observó una asociación significativa entre la carga proviral y la baja frecuencia del genotipo G/G en esta región entre los animales de BCPV. Este genotipo se asocia a una menor actividad transcripcional del promotor en los animales con linfosarcoma inducido por BLV y a una mayor tendencia a desarrollar ACPV. Nuestros resultados reafirman la participación de factores genéticos en la respuesta inmune de los animales y por consiguiente en la patogénesis viral. Desde el punto de vista estrictamente inmunológico, el TNF-α es una citoquina fundamental en la respuesta de los animales frente a las infecciones virales. Diferentes autores han postulado que esta citoquina y sus receptores, TNFRI y TNFRII, juegan un papel importante en la patogénesis de la LBE. En esta Tesis se cuantificó la expresión del ARNm de dichos mediadores en animales que desarrollan ACPV y BCPV en dos momentos del año (verano y primavera)y se observó una asociación significativa entre la expresión de ARNm de TNF-α, TNFRI y TNFRII y el desarrollo de los diferentes perfiles de infección, y que la expresión de estos mediadores difería según el momento del año evaluado. Los resultados obtenidos en el período de verano demostraron una tendencia a una mayor expresión de ARNm de TNF-α y menor expresión de ARNm de sus receptores en los animales con ACPV respecto a los animales con BCPV. En el período de primavera, se observó que los animales de BCPV mantuvieron un perfil de expresión de ARNm de TNF-α similar al de los animales BLV (-), mientras que los animales de ACPV presentaron una respuesta antiviral exacerbada, particularmente los animales que desarrollaron LP. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que los animales con ACPV presentan un perfil anti-apoptótico y pro-proliferativo mientras que los animales de BCPV pueden ser controladores de la infección/diseminación viral, y que tanto el TNF-α y sus receptores influirían en el desarrollo de estos perfiles de infección. Sobre la base de las diferencias en los resultados obtenidos en ambos períodos se postuló que estas podrían deberse al efecto del estrés por calor que sufrieron los animales en el mes de verano. Para este estudio se seleccionaron animales de establecimientos de nuestra región, que se caracteriza por una diferencia marcada de temperatura entre ambas estaciones del año. El aumento de la temperatura global, del número de vacas lecheras de alta producción y la intensificación de los sistemas productivos obligan a los animales a recurrir a procesos fisiológicos de regulación térmica con efectos negativos sobre su potencial productivo, reproductivo y sobre su sistema inmune. Este estudio es el primero que evalúa el patrón de expresión de ARNm de TNF-α y sus receptores en vacas lecheras expuestas a estrés por calor y su influencia en el sistema inmune de los animales infectados con BLV. Los resultados obtenidos demuestran que el estrés por calor disminuye la expresión del ARNm de los genes estudiados en vacas lecheras de alta producción pero que no influye de la misma manera en los animales que desarrollan los diferentes perfiles de infección asociados al BLV. Por otra parte, se evaluó el efecto de la reactivación viral y de la estimulación con TNF-α recombinante (rTNF-α) en la expresión de ARNm de TNF-α y sus receptores en los PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) provenientes de bovinos BLV (+) con diferentes perfiles de infección. Si bien los resultados obtenidos en ambos ensayos fueron similares, se observó una menor expresión de ARNm de TNF-α en los animales BLV (+), una mayor expresión de ARNm de TNFRI en animales de BCPV, que apoyaría la hipótesis de que los mismos frente a la reactivación viral, presentan un estado pro-apoptótico y anti-proliferativo, y una menor expresión de ARNm de TNFRII en los animales de ACPV. También se evaluó la proliferación espontánea de los PBMCs provenientes de animales BLV (+) y BLV (-) bajo la premisa que la proliferación celular espontánea in vitro podría correlacionarse con la progresión de la enfermedad. Se observó proliferación espontánea de los PBMCs provenientes de animales BLV (+) en condiciones estándar de cultivo lo que podría deberse a la reactivación del virus. También se evaluó la respuesta linfoproliferativa de los animales en estudio frente a dos estímulos exógenos: rTNF-α y rsTNFRII (proteína recombinante desarrollada en este trabajo de Tesis). Se observó que, ante una estimulación exógena, los animales BLV (-) presentan una respuesta proliferativa mayor que los animales BLV (+) lo que indica que la infección por BLV compromete la respuesta inmune de los animales infectados por el mismo. Además, se vio que la respuesta proliferativa de los animales con ACPV y BCPV difería frente a los estímulos exógenos. Así, los animales de ACPV presentaron mayor respuesta proliferativa al ser estimulados con rsTNFRII y una tendencia a un estado anti-apoptótico y pro-proliferativo, sugiriendo un rol activo de este receptor en el desarrollo de este perfil. Lograr entender los mecanismos por los cuales los animales desarrollan diferentes respuestas frente a la infección por BLV es de suma importancia. Esto permitiría adoptar medidas tendientes a disminuir la prevalencia de dicha infección en los rodeos lecheros, así como también las pérdidas económicas relacionadas con esta enfermedad. La alta prevalencia de infección en los tambos de nuestro país hace difícil aplicar las medidas de control adoptadas por otros países con el fin de erradicar el virus. Por esta razón, y por la falta de una vacuna disponible en el mercado, es que proponemos el reemplazo gradual de los animales que desarrollan ACPV por animales con BCPV tomando como premisa que estos últimos logran controlar la diseminación/infección viral, manteniendo un sistema inmune competente lo que se traduce en una menor eficiencia para transmitir el virus. Fil: Lendez, Pamela Anahí. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Ceriani, María Carolina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Dolcini, Guillermina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Enzootic bovine leukemia (EBL) is an infectious-contagious chronic disease, which naturally affects cattle, with a major prevalence among dairy herds, due to managing conditions. The causal agent of the many lymphoproliferative disorders associated to thisdisease is the bovine leukemia virus (BLV), a deltaretrovirus that mostly infects B lymphocytes, integrating into its genome as a provirus. BLV infection follows the typical iceberg infection model, only 5-10% of the infected animals die of lymphosarcoma, after a long latency period, 30% develop persistent lymphocytosis (PL) a benign polyclonal expansion of peripheral blood circulating B lymphocytes, which remains constant for the entire life of the animal, without morphological or functional alterations. The rest of the animals, which integrate the bottom of the iceberg, remain asymptomatic and represent 70% of the infected universe. Lymphocytotic animals carry a high proviralload, high antibody titers against the virus and an elevated number of infected lymphocytes, and they comprise what we call high proviral load profile (HPL). Of the remaining infected animals, 40% are included in the HPL profile, meanwhile the remaining 60% are included in the low proviral load profile (LPL). This profile is characterized by an exiguous number of infected lymphocytes in peripheral blood, which reflects in an undetectable proviral load by conventional methods and a very low antibody titer against the virus. In an attempt to explain the occurrence of these two infection profiles, several researchers have determined that a combination of viral, genetic, epigenetic, immunological and environmental factors could help to its existence. In this thesis, the genetic polymorphism in position -824 of the promoter region of tumor necrosis alpha factor (TNF-α), was analyzed, under the premise that this polymorphism could influence differential expression of the gene, and therefore could have consequences in the disease development. It was observed a significant association between the proviral load and the low frequency of G/G genotype in this region, among the LPL animals. This genotype is associated with a decreased transcriptional activity of the promoter in animals with BLV induced lymphosarcoma, and an increasing trend to develop high proviral load. Our results reassure the genetic factors involvement in the immune response, and hence in viral pathogenesis. Strictly from an immunological point of view, TNF-α is a key cytokine in animal ́s response against viral infections. Several authors have postulated that this cytokine and its receptors, TNFRI and TNFRII, play a fundamental role in EBL pathogenesis. In this thesis mRNA expression of such mediators in HPL and LPL animals in two different times of the year was determined (summer and spring), and a significant association between mRNA expression of TNF-α, TNFRI and TNFRII and the development of the different infection profiles was observed. These mediators expression was influenced or affected by the time of the year the samples were taken. The results show that during the summer, there was a tendency to a higher expression of TNF-α and a lower expression of its receptors in HPL animals compared to LPL animals. During the spring, where temperatures are milder, LPL animals mRNA expression profiles were comparable to non-infected animals, meanwhile HPL animals showed an exacerbated antiviral response, particularly those animals with PL. These observations support the hypothesis that HPL animals have an anti-apoptotic and pro-proliferative profile, whilst the LPL animals might beconsidered as infection/viral dissemination controllers, and that TNF-α and its receptors might influence in the development of these different infection profiles. Relying on the differences found in both seasonal periods, we postulated that these differences could be due to heat stress suffered by the animals during the summer period. Animals belonging to dairy milks near our University were selected. Our institution is located in a geographical region characterized by a marked temperature difference between the two seasons. The raise in global temperature, the permanent increasing number of high performance milky cows and the intensification of productive systems, force the animals to resort to physiological processes of thermic regulation, with negative effects over its productive potential and its immune system. This is the first report that evaluates mRNA expression pattern of TNF-α and its receptors in dairy cows exposed to heat stress, and its influence in BLV infected animals immune system. The obtained results show that heat stress diminishes mRNA expression of the evaluated genes in high performance cows, but its influence varies depending on the infection profile of the animal.On the other hand, the effect of viral reactivation and stimulation with recombinant TNF-α (rTNF-α) and its effect on mRNA expression of TNF-α and its receptors was evaluated in PBMC isolated from BLV infected animals with different infection profiles. The results obtained in both experiments were similar. It was observed a lower expression of TNF-α mRNA in BLV infected animals, a higher expression of TNFRI mRNA in animals included in the LPL group, which supports the hypothesis that these animals, facing viral reactivation, show a pro-apoptotic and anti-proliferative state, and a lower expression of TNFRII mRNA in HPL animals.Spontaneous proliferation of PBMC from BLV (+) and BLV (-) animals was also evaluated, under the premise that this in vitro phenomenoncould correlate with disease progression. Spontaneous proliferation of PBMC from BLV (+) animals was observed in standard culture conditions. Proliferative response was evaluated also after addition of twoexogenous stimuli: rTNF-α(commercial recombinant TNF-α) and rsTNFRII (recombinant protein developed for this thesis). It was observed that when exposed to an exogenous stimulation, BLV (-) animals showed an increased proliferative response compared to BLV (+) animals, which might indicate that BLV infection compromises immune response. Besides, it was shown that the proliferative response between HPL and LPL was different with the different stimuli. So, HPL animals had a greater proliferative response when stimulated with rsTNFRII, and a trend towards an anti-apoptotic and pro-proliferative status, suggesting an active role of this receptor in the development of this profile.Trying to understand the mechanisms by which animals develop either profile after BLV infection is a very important issue. This could allow us to establish measures attempting to diminish the infection prevalence in the dairy herds, and to alleviate the economic losses related to this disease. The high infection prevalence in dairy herds of our country makes unfeasible to apply control measures which were successful in other countries in order to eradicate the virus. For this reason, and until a successful vaccine is available, our proposal is to gradually replace HPV animalsby LPL animals, with the knowledge that these animals are capable of controlling viral dissemination, maintaining a competent immune system, ending up ina lesser efficiency totransmit the virus.

Objective. To identify by molecular techniques the presence of bovine papillomavirus (BPV) in an equine sarcoid, and to carry out its histological characterization. Materials and methods. Using a sarcoid lesion from a Pinto Americano mare, nucleic acid extraction and identification by molecular techniques was performed. A partial region of the gene corresponding to the L1 segment of papillomavirus was amplified by polymerase chain reaction, then it was sequenced and analyzed using BLAST algorithm. Hematoxylin-eosin staining of the tissue was performed and analyzed under a 100X light microscope. Results. BPV-2 was detected in the equine sarcoid lesion, and the lesion was classified as nodular according to its morphological and histological characteristics. Histopathology showed a fibrotic lesion, with exophytic neoplasia and expansion of the spinous layer. Conclusions. The study established for first time the presence of BPV-2 in an equine sarcoid in Costa Rica using molecular techniques and its association with a nodular-type sarcoid., Objetivo: Identificar mediante técnicas moleculares la presencia de papilomavirus bovino (BPV) en un sarcoide equino, y realizar la caracterización histológica de este. Materiales y métodos: A partir de lesiones de sarcoide en una yegua de raza pinto americano se realizó la extracción de ácidos nucleicos para su identificación mediante técnicas moleculares. Se amplificó el gen correspondiente al segmento L1 para papilomavirus a través de reacción en cadena de la polimerasa, se secuenció y luego fue analizado utilizando el algoritmo BLAST. Se realizó tinción de hematoxilina-eosina del tejido y se analizó en microscopio de luz 100X. Resultados: Se detectó BPV-2 en la lesión de sarcoide equino; el sarcoide se clasificó como nodular de acuerdo con sus características morfológicas e histológicas. La histopatología mostró una lesión fibrótica, con neoplasia exofítica y expansión del estrato espinoso. Conclusiones: El estudio demostró por primera vez la presencia de BPV-2 en un sarcoide equino en Costa Rica utilizando técnicas moleculares y su asociación con un sarcoide de tipo nodular.

El objetivo de la presente investigación fue identificar la frecuencia de la enfermedad de disco intervertebral en perros diagnosticados con resonancia magnética, mediante un análisis retrospectivo de acuerdo con la característica de raza, edad, sexo, neurolocalización y tipo de hernia. Se evaluaron 179 informes clínicos pertenecientes a pacientes provenientes de la ciudad de Quito, los cuales fueron remitidos al servicio RADIO VET para estudio de imágenes de columna vertebral durante los últimos 8 años. Para el análisis estadístico se realizaron tablas de frecuencia y contingencia con Ji cuadrado, obteniendo que la mayor frecuencia de hernias discales se presentaron en el año 2018 (33,7 %), de acuerdo con la neurolacalización de las hernias, evidenciando el mayor número de hernias en el segmento toracolumbar (65,4%); con respecto a la característica de raza se obtuvo un mayor número de casos en las condrodistróficas (75,4 %) que en las no condrodistróficas (24,6 %). La edad fue otra característica analizada y se encontró un mayor número de casos en perros adultos con edades que oscilan entre 4 y 7 años (49,7 %). Al considerar el sexo, se determinó que los machos fueron los más afectados (61,5%). Finalmente se analizó la frecuencia de presentación de las hernias discales: Hansen tipo 1 (HI) y 2 (HII) encontrando que los pacientes con hernias discales HI y HI representaron el mayor porcentaje de pacientes considerados en el estudio (47%), seguidos de aquellos que únicamente presentaban hernias discales HII (33%) y HI (19,6%). Al analizar la neurolocalización, se determinó la predisposición de los pacientes machos (p

O sarcoma de aplicação em felino (SAF) é uma neoplasia de origem mesenquimal que surge após a aplicação de vacinas ou medicamentos. Tem caráter agressivo, altas taxas de recorrência podendo gerar metástases. Reações inflamatórias crônicas são consideradas o gatilho para o início da fase maligna. Pacientes com tumores inoperáveis, doença residual, recidivante ou metastática tem poucas opções de tratamento. Isto mostra a importância de pesquisas para avaliar perfis da tumorogênese destas neoplasias e reconhecer alvos para a manipulação terapêutica. A expressão de receptores para estrógeno (RE) e progesterona (RP), no câncer de mama, são conhecidos e consolidados como preditores de bom prognóstico na medicina humana e veterinária. A expressão e o impacto desses receptores no prognóstico dos sarcomas de partes moles vem sendo estudada, principalmente em sarcomas uterinos em humanos, mas a expressividade dos mesmos, nos sarcomas cutâneos em gatos não é conhecida. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por imuno-histoquímica, a expressão de RE e RP em 53 casos de sarcomas de aplicação em felinos, correlacionando-os com aspectos clínicos, histopatológicos e expressão de Ki67. Trata-se de estudo retrospectivo, com blocos de parafina. Características clínicas, histopatológicas e imuno-histoquímicas foram variáveis preditoras e a expressão de RE, RP e tamanho tumoral variáveis dependentes. Mais da metade dos casos, 38 (81%), estavam localizados no tronco. O grau histopatológico III foi observado em 56,6% dos casos. A expressão de RE foi observado na maioria dos casos (64%) tendo associação significativa com número de mitoses (P=0,046) e intensidade de pleomorfismo (P=0,019). Não houve associação significativa entre RP e as variáveis estudadas e, 62% dos casos foram negativos para esse receptor. Houve correlação positiva entre Ki67, pleomorfismo e número de mitoses. Tamanho tumoral se associou com presença de células gigantes (P=0,049). Desta forma, o estrógeno e tamanho tumoral, aparentemente, tem efeito na patogênese desses tumores. Estudos futuros poderão analisar e comparar a expressão de RE com características clínicas prognósticas como recidiva, metástases e sobrevida e explorar uma possível ação dos moduladores dos RE e inibidores de aromatase na patogênese dessa doença, como terapêutica alternativa de baixo custo e com poucos efeitos colaterais. Palavras-chave: Cirurgia veterinária. Estrógeno. Gatos. Imuno-histoquímica. Progesterona. Sarcomas. Vacinas. Feline injection site sarcoma (FISS) is a neoplasm of mesenchymal origin, with an aggressive character, with high recurrence and can lead to metastases. This appears after the application of vaccines or medications. Chronic inflammatory reactions are considered the trigger for the onset of the malignant phase of this disease. Patients with inoperable tumors, residual, recurrent or metastatic disease have few treatment options. This shows the importance of research to evaluate the tumorogenesis profiles of these neoplasms and to recognize targets for therapeutic manipulation. The expression of estrogen (ER) and progesterone receptors (RP), in breast cancer, are known and consolidated as predictors of good prognosis in human and veterinary medicine. The expression and impact of these receptors on the prognosis of soft tissue sarcomas has been studied, mainly in uterine sarcomas in humans, but their expressiveness, in cutaneous sarcomas in cats, needs further studies. The objective of this work was to evaluate, by immunohistochemistry, the expression of ER and PR in 53 cases of FISS and correlating them with clinical, histopathological aspects and Ki67 expression. This is a retrospective study with paraffin blocks. Clinical, histopathological and immunohistochemical characteristics were the predictive variables and the expression of ER, RP and tumor size were the dependent variables. The trunk was the most affected site, with 38 cases (81%). Histopathological grade III was observed in 56.6% of the cases. The expression of ER was observed in most cases (64%) with a significant association with the mitotic index (P=0.046) and pleomorphism (P=0.019). Differences between PR and the clinical, histopathological and other immunohistochemical variables studied were not significant and 62% of cases were negative for this receptor. The Ki-67 antigen was positively correlated with the number of mitoses and pleomorphism. Tumor size was associated with the presence of giant cells (P=0.049). Thus, estrogen and tumor size apparently have an effect on the pathogenesis of these tumors. Future studies will be able to analyze and compare the ER expression with prognostic clinical characteristics such as recurrence, metastasis and survival and explore a possible action of ER modulators and aromatase inhibitors in the pathogenesis of this disease. Keywords: Cats. Estrogen. Immunohistochemistry. Progesterone. Sarcomas. Vaccines. Veterinary surgery.

Las encefalopatías espongiformes trasmisibles afectan tanto a la especie humana como a los animales, y se caracterizan por un largo período de incubación y lesiones neurodegenerativas que conducen a la muerte del individuo. Estas enfermedades están causadas por el acumulo de una proteína anómala (PrPSc), sobre todo en el SNC, que se genera mediante la conversión conformacional de una glicoproteína de superficie celular (PrPC) que está presente en el hospedador de forma natural. La PrPSc es capaz de inducir la transformación de la PrPC en PrPSc, y esta conversión depende de la cadena de aminoácidos que componen la proteína, y por ello de la secuencia nucleotídica del gen que la codifica, el PRNP. De esta manera, la presencia de determinados polimorfismos en el marco de lectura abierto de este gen puede dar lugar a un cambio aminoacídico en dominios críticos de la PrPC, pudiendo influir en la conversión a la PrPSc. Sin embargo, no todos los animales con el mismo genotipo en el gen PRNP son igualmente susceptibles o desarrollan la patología de la misma manera, lo que puede sugerir la participación de otros genes. Debido a la demostrada influencia de los factores genéticos sobre las EET, en esta tesis se realizaron tres estudios con el objetivo común de contribuir a un mejorconocimiento de los aspectos genéticos en las encefalopatías espongiformes transmisibles en rumiantes y por lo tanto de su patogenia. La influencia del gen PRNP se ha estudiado ampliamente en la especie ovina, pero tras el diagnóstico de una cabra infectada de forma natural con EEB, se implementaron los estudios en la especie caprina. De esta manera, un gran número de cabras europeas fueron genotipadas y se encontraron determinados polimorfismos que podrían ser útiles a la hora de elaborar un programa de selección genética similar al del ovino. El análisis de este gen ha dado lugar a la descripción de más de 40 mutaciones que suponen un cambio aminoacídico y de 17 mutaciones silentes en esta especie. Además, diversos estudios realizados en cabras infectadas de forma natural y experimentalmente con el agente del scrapie han demostrado la capacidad de determinados polimorfismos para modular la susceptibilidad o resistencia de sus portadores a padecer la enfermedad. En el caso de la EEB, pocos estudios han abordado la resistencia genética en cabras. Algunos estudios de transmisión oral de EEB a cabras portadoras de las mutaciones R211Q y Q222K, revelan que mientras el primer polimorfismo extiende el período de incubación, solo el alelo K222 parece tener un efecto protector. Este hecho convierte al polimorfismo Q222K en uno de los principales candidatos para establecer un programa de mejora genética para erradicar las EET en cabras. Por ello, se realizó un primer estudio, en el cual se inoculó el agente de la EEB bovina por vía intracerebral a cabras portadoras de diferentes mutaciones en el codón 222, homocigotas glutamina y homocigotas lisina y dos animales inoculados con EEB caprina (segundo pase en cabra), uno Q222Q y otro heterocigoto Q222K, también portadores del polimorfismo G127S. Independientemente del genotipo en el codón 222, la presencia de PrPSc en el sistema nervioso central fue similar en todos los animales, a excepción del inoculado con EEB bovina de genotipo K222K, que no presentó PrPSc en corteza frontal y ganglios basales mediante ELISA y casi insignificante positividad mediante IHQ, lo que sugiere que en este animal el punto de inoculación intracerebral fue distinto al de los otros caprinos. En el sistema linforreticular, el genotipo de los animales tampoco influyó en el depósito de PrPSc, que no se detectó únicamente en un caprino inoculado con EEB caprina. En sistema nervioso periférico, el prion se identificó en las neuronas del plexo mioentérico del intestino así como en el músculo tríceps braquial, en husos neuromusculares y fascículos nerviosos, del animal Q222K/G127S inoculado con EEB caprina. En cuanto a la caracterización del agente causal, la técnica de inmunohistoquímica reveló que posee características similares a las del agente de la EEB bovina, caracterizado por un punteado muy leve, fino y difuso intraneuronal con el anticuerpo P4 y una señal más baja con el mismo anticuerpo, mediante la técnica de Western Blot. Con el objetivo de conocer la frecuencia alélica de los polimorfismos resistentes en la población de cabras autóctonas españolas, se realizó un estudio de genotipado con muestras de 1721 animales de la raza Moncaina. Se observó una alta variabilidad genética y se identificó la presencia de algunos polimorfismos descritos por otros estudios como resistentes a las EET, como los polimorfismos R211Q y Q222K. Sin embargo, las frecuencias de estos haplotipos fueron relativamente bajas, lo que demostró la necesidad de mantener y reproducir los animales para aumentar la frecuencia y consecuente resistencia genética de los rebaños. En la mayor parte de las especies afectadas por las enfermedades priónicas, la susceptibilidad y la patogénesis son moduladas por el gen PRNP. En los animales de las especies ovina y caprina, el control de la enfermedad está ligado de manera compleja a genotipos específicos. Sin embargo, no todos los animales con el mismo genotipo en el gen PRNP son igualmente susceptibles o desarrollan la patología de la misma manera, lo que puede sugerir la participación de otros genes. Por este motivo, en el último estudio se realizó un análisis de los polimorfismos identificados en el gen SPRN en ciervos de la especie ciervo rojo (cervus elaphus) y cabras de la Raza Alpina, y en la región promotora del gen PRNP en muestras de ciervos. No se conoce bien la influencia de los polimorfismos en el gen SPRN en ciervos y de los datos que se desprenden de este estudio se observó una alta variabilidad genética, con la presencia de tres polimorfismos con cambio aminoacídico y siete mutaciones silentes en el marco de lectura abierto y tres mutaciones en el fragmento 3`UTR. En los caprinos se observó cuatro mutaciones silentes en el fragmento ORF y dos en el 3`UTR, incluyendo un polimorfismo indel (602_606ins.CTCCC) anteriormente relacionado con la susceptibilidad al scrapie clásico. En la región promotora del gen PRNP en ciervos también se observó una gran variedad de polimorfismos, nueve de un solo nucleótido y tres de inserción/deleción. Los tres estudios desarrollados en la tesis doctoral cumplieron con los objetivos propuestos, contribuyendo ampliar el conocimiento de los factores genéticos que influyen en las encefalopatías espongiformes transmisibles que afectan a los rumiantes.

Las principales rutas de administración de los fármacos utilizados en medicina veterinaria son la vía oral (PO), la intramuscular(IM), la subcutánea (SC) y la intravenosa (IV). Aun así, la administración tópica cutánea ha adquirido gran aceptación, particularmente para lograr un efecto local en diferentes regiones anatómicas de la piel, lo cual ya es una práctica común en medicina humana y, cada vez más frecuente, en veterinaria. Sin embargo, durante la última década, se han logrado grandes avances en la formulación y en el uso de la administración tópica cutánea (pour-on, spot-on,spray) de diferentes fármacos con el objetivo de lograr una absorción transdermal y, así, un efecto terapéutico sistémico. En este sentido, cabe destacar que cualquier sustancia aplicada sobre la piel tiene la potencialidad de ser absorbida, teniendo siempre en consideración que la capacidad de penetrar y atravesar la barrera cutánea dependerá de factores inherentes a la piel, a la formulación y a los fármacos. El presente trabajo de tesis doctoral es de índole farmacológico, aunque sus resultados tienen una alta relación con aspectos del tratamiento antiparasitario en caninos. Como resultado de la experiencia adquirida en nuestro lugar de trabajo y de la búsqueda bibliográfica realizada, este trabajo de tesis se basa en la postulación de la siguiente hipótesis general de trabajo: La relación entre las características fisiológicas de la piel (fisiología cutánea) y las propiedades físico-químicas del fármaco administrado tópicamente afecta el proceso de absorción percutánea de lactonas macrocíclicas. El desarrollo y la validación de las metodologías para la extracción físico-química e identificación y cuantificación cromatográfica de las moléculas endectocidas bajo estudio en las diferentes matrices fue un aspecto importante para el desarrollo del presente trabajo de tesis. A partir de un método altamente sensible, como es la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), se logró determinar las concentraciones de moxidectin (MXD) y doramectina (DRM) en las matrices estudiadas. Los resultados obtenidos de las validaciones aseguran que los métodos de extracción y de cuantificación por HPLC sean analíticamente adecuados para detectar y cuantificar MXD y DRM en plasma canino y medio receptor (in vitro) desde concentraciones iguales o superiores a 0,1 ng/ml. Con el propósito de caracterizar profundamente el comportamiento de estas moléculas en caninos, se propuso estudiar la farmacocinética de las vías endovenosa, oral y tópica cutánea. Para ello, se utilizaron seis (6) caninos clínicamente sanos, de raza Beagle, cuatro (4) hembras y dos (2) machos, entre 9,8 y 15,5 kg de peso y entre 12 y 36 meses de edad. Los animales se encontraban alojados en la sección caniles de la Facultad de Ciencias Veterinarias de Universidad de Buenos Aires (FCV-UBA) bajo estrictas normas de bienestar animal. Los resultados obtenidos reflejaron el comportamiento esperable para cada una de las vías, pero con algunas características particulares. Tanto el MXD como la DRM fueron administrados de manera endovenosa, con éxito, con el objetivo de eliminar la influencia del proceso de absorción a las disposiciones de los fármacos. Esto permitió caracterizar con mayor certeza el comportamiento de la absorción de las otras vías bajo estudio. En este sentido, para el MXD, observamos que la biodisponibilidad luego de la administración oral fue superior al 100%. Si bien es teóricamente imposible encontrar una biodisponibilidad mayor a la endovenosa (100%), se pueden hipotetizar algunas explicaciones basadas en las características del fármaco. Para la vía tópica en particular, detectamos un tiempo de absorción prolongado, esto puede observarse no sólo por los casi 10 días requeridos para alcanzar la concentración máxima (Tmax),sino también en los casi 13 días de tiempo medio de absorción (TMA), lo que demuestra la presencia de grandes obstáculos, al ser aplicado sobre la piel, para poder alcanzar la circulación sistémica. Con un comportamiento similar, del análisis comparativo de la DRM por las tres vías, puede verse que la fase de absorción tras la administración tópica difiere significativamente de la correspondiente a la administración oral. Estas diferencias están claramente demostradas por los parámetros farmacocinéticos que caracterizan la absorción, donde el TMA obtenido es significativamente mayor para la vía tópica en comparación con la oral (6,3 ± 2,6 y 1,3 ± 1,9 días, respectivamente). Asimismo, también puede observarse que las diferencias entre los valores del Cl de la administración tópica son estadísticamente significativas cuando se comparan con los valores de Cl de las administraciones endovenosa y oral. Cuando comparamos los perfiles entre ambas drogas, puede verse que el MXD presenta una mayor velocidad de absorción que la DRM, tanto por la vía tópica (0,6 ± 0,4 d y 1,1 ± 0,8 d, respectivamente) como por la oral (0,05 ± 0,02 d y 0,06 ± 0,02 d, respectivamente). Para la vía oral se destaca que, mientras que la DRM no logra alcanzar el 85% de absorción de la dosis, el MXD supera ampliamente el 100%. Esto puede explicarse por las magnitudes de los procesos de distribución y de re-distribución que presenta dicho fármaco. La rápida y total absorción de la dosis oral permite que haya en una fracción corta de tiempo una gran cantidad plasmática de fármaco disponible para distribuirse a los tejidos (Vss 8,2 ± 1,3 L y 1,9 ± 0,4 L para el MXD y la DRM, respectivamente). Esta gran distribución, junto, en parte, con una recirculación entero-hepática, en la cual podría tener una importante participación la actividad de la glucoproteína P (Ward et al., 2004a; 2004b; Lespine et al., 2012), determina que, al iniciarse la fase franca de eliminación, ocurra un fenómeno de re-distribución de una gran magnitud. De los resultados obtenidos y de lo expuesto anteriormente, es importante destacar que la vía tópica demuestra ser beneficiosa en muchos aspectos técnicos, pero requiere de un trabajo farmacotécnico mayor (como ocurre en medicina humana) para lograr una mejor permeación a través de los estratos de la piel y, como consecuencia, alcanzar concentraciones más altas en la circulación sistémica y obtener así mayor eficacia clínica. Para ahondar aún más en el estudio de absorción tópica en piel, se trabajó en un modelo in vitro con cámaras de Franz modificadas. La comparación de las permeaciones cutáneas de ambos fármacos arrojó diferencias estadísticamente significativas en la mayoría de los parámetros estudiados. Así, el flujo de la DRM fue significativamente mayor que el del MXD. Lo mismo ocurrió con el coeficiente de permeación aparente y con el porcentaje de fármaco permeado. Tal como se ha visto en experiencias previas en nuestro Laboratorio, el pasaje de fármacos a través de las capas superficiales de la piel es un proceso dificultoso, lo cual se evidencia claramente, en estos estudios, por las bajas cantidades totales acumuladas en el medio receptor en relación a la dosis total aplicada (aproximadamente 0,01%). Más allá de la originalidad de los datos generados, también se tuvo como objetivo la construcción de un modelo predictor utilizando y combinando la información de ambas fases experimentales, in vivo e in vitro. Para ello, se realizó un análisis de correlación in vivo-in vitro (CIVIV). Así, la presente tesis doctoral presenta alternativas que, con los datos propios generados, ha alcanzado un nivel aceptable de predicción del comportamiento de los fármacos estudiados en los animales experimentales. Esta metodología aún requiere mayores estudios y ser desafiada en distintas pruebas en diferentes escenarios en búsqueda de una mayor robustez. Fil: Nejamkin, Pablo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Sallovitz, Juan Manuel. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Albarellos, Gabriela A. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. In veterinary medicine, the main routes of drug administration are orally (PO), intramuscularly (IM), subcutaneously (SC) and intravenously (IV). Even though, skin topical administration has recently gained great acceptance, especially when looking for a local effect in different anatomical regions. This a common practice in human medicine and is becoming more frequent in veterinary medicine. However, during the last decade, great advancements have been achieved in formulating different drugs for their topical administration (pour-on, spot-on, spray) aiming to a systemic therapeutic effect. It is noteworthy that any drug, when administered on the skin, has the potential to be absorbed, depending on its capability of penetrating into and pass through the skin layers. This will depend on many factors related to the skin, the formulation and the drug. In spite of the present thesis work is mainly pharmacological, its results can be related to many aspects of antiparasitic treatment in dogs. As a result of our own experience and works of other authors, this thesis work is based on the following hypothesis: After their topical administration, the interactions between physiological characteristics of canine skin and physico-chemical properties of the antiparasitic macrocyclic lactones effect the cutaneous absorption process. The development and validation of the analytical chromatographic methods for quantification of the endectocides molecules under study were an important feature of the thesis work. This sensitive and reliable method allowed to determine moxidectin (MXD) and doramectin (DRM) concentrations of or higher than 0.1 ng/mL in the different matrices studied (plasma and receptor medium) in vivo and in vitro. In order to thoroughly characterize the pharmacological behavior of these molecules in canines, the pharmacokinetics after their intravenous, oral and topical administration were studied. Six clinically sound Beagle dogs, 4 females and 2 males, of 9.8-15.5 kg of bogy weight and between 12- to 16-month-old were used. Animals were housed at the small animal facilities of the Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Buenos Aires. Animals’ health and welfare were monitored along the whole experimental period. Observed results showed pharmacokinetic profiles as expected; however, there were unexpected own features. Both MXD and DRM were successfully intravenously administered in order to characterize drugs’ disposition avoiding biases due to the absorption process. In turn, the observed pure drug disposition allowed to confidently characterize the absorption processes of each of the other two routes of administration (oral and topical). Hence, MXD showed an oral bioavailability in excess of 100%, that is not possible, since only after the intravenous administration a plasma bioavailability of 100% can be reached. Many causes can be responsible of this, such as artifactual and non-stationary or non-lineal pharmacokinetics. However, a more plausible explanation is the role played by transportermediated elimination and absorption processes, which are a characteristic of the antiparasitic macrocyclic lactones. As to the topical administration, a prolonged absorption time was observed (Tmax = 10 days; MAT = 13 days), which suggests that passage through the skin to reach the systemic circulation is a difficult process. Similarly, when comparing oral and topical absorption of DRM, significant differences can be observed. These differences clearly demonstrated by the pharmacokinetic parameters of absorption (TMA 6.3 ± 2.6 y 1.3 ± 1.9 for the topical and oral administration, respectively). When comparing both drugs, MXD presents a faster absorption compared to DRM both after topical (t½ab 0.6 ± 0.4 days and 1.1 ± 0.8 days, respectively) as well after the oral administration (0.05 ± 0.02 days and 0.06 ± 0.02 days, respectively). The oral availability showed marked differences, hence, while DRM oral bioavailability reached to 85%, MXD largely exceeded 100%. The latter case can be explained by an extremely rapid drug absorption, determining high amounts of drug available for distribution, re-distribution and saturation of transporter-mediated elimination. A higher distribution was observed for MXD compared to DRM (Vss 8.2 ± 1.3 L/kg and 1.9 ± 0.4 L/kg para el MXD y la DRM, respectively). Thus, a large distribution along with a saturated elimination and, possibly, increased reabsorption (entero-hepatic circulation) could have determined that, when elimination begun, a huge re-distribution and/or re-absorption took place at the same time. Albeit the topical administration presents many benefits, it needs more pharmacotechnical work (as done in human medicine) in order to achieve a better and more controlled percutaneous permeation and, hence, achieve more predictable plasma concentration profiles and efficacies. To further characterize topical absorption, an in vitro model was developed by utilizing the Franz diffusion cell technique. As with previous experiences in our laboratory, drug passage through the superficial skin layers (particularly, the stratum corneus) is a difficult process and was evidenced for both drugs by the low percentages of permeation observed (approximately 0.01%). The comparison of the in vitro percutaneous absorption of both drugs showed statistically significant differences. DRM flux was higher than MXD flux, as well as the apparent permeation coefficient and the percentage of drug permeated. Although the low skin permeation observed in the in vitro models, this technique has a great potential for the veterinary pharmaceutical industries in the development and testing of topical formulations. Data generated by the present work are quite original, nevertheless, another objective was the development of a mathematical model by combining both in vitro and in vivo data by the convolution technique to predict in vivo plasma profile from in vitro data. An in vivo-in vitro correlation analysis was performed for both drugs. Even though an acceptable predictive level was achieved, further work is needed and predicted profiles have to be challenged under different scenarios.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico As lesões mais frequentes envolvendo o bulbo ocular são de natureza neoplásica e as melanocíticas são as mais comuns na úvea dos cães e na íris dos gatos. Podem ser classificadas como melanocitomas (benignas) e melanomas (malignas). Para melhor compreensão do comportamento biológico de neoplasias melanocíticas uveais em cães e gatos, foram utilizadas ferramentas histológicas e imuno-histoquímicas em 32 bulbos oculares, 27 de cães e cinco de gatos. As neoplasias dos bulbos oculares destes animais foram classificadas em benignas (19/27 - cães) ou malignas (8/27 - cães; 5/5 - gatos), e a localização das estruturas oculares envolvidas foi descrita. Determinaram-se, também, os tipos celulares destas neoplasias, os quais foram denominados como epitelioides, fusiformes e mistas, bem como tipos especiais, como de células balonosas, células gigantes multinucleadas e células em anel de sinete. Além disso, foram caracterizadas porcentagem de células com melanina, intensidade de melanina nas células, anisocitose e anisocariose, índice mitótico, presença de inflamação e necrose intratumoral, invasão vascular e desenvolvimento de glaucoma secundário à neoplasia. Para a confirmação da origem melanocítica, foi realizada imuno-histoquímica com os anticorpos anti-PNL2 (29/32) e anti-melan-A (3/3). O índice proliferativo foi verificado, utilizando-se o anticorpo anti-Ki-67, que variou de 2,8 a 12% em melanocitomas de cães, com média de 6,45 ± 4,1 e de 15,8 a 70% em melanomas de cães, com média de 38,3 ± 25,21. Os melanomas em gatos tiveram variação do índice proliferativo de 10,8 a 30,4%, com média de 18,96 ± 7,36. Também foi avaliado o índice apoptótico, utilizando o anticorpo anti-caspase-3, que variou de 3,8 a 50% em melanocitomas de cães, com média de 16,62 ± 13,26 e de 30 a 84% em melanomas de cães, com média de 58,04 ± 24,25. Nos gatos, o índice apoptótico variou de 3,6 a 92%, com média de 23,16 ± 38,62. A proteína BAP1, cujo padrão de marcação poderia refletir a agressividade tumoral, similar ao relatado para neoplasias oculares melanocíticas em seres humanos, foi também avaliada, e todas as neoplasias uveais do presente estudo foram imunomarcadas. As características histológicas e imuno-histoquímicas encontradas nas neoplasias melanocíticas uveais em cães e gatos deste estudo ampliaram o conhecimento sobre o uso destas ferramentas como fatores prognósticos; entretanto, recomenda-se mais estudos com acompanhamento da sobrevida do animal após o diagnóstico. The most frequent lesions involving the eye are of neoplastic nature and melanocytic lesions are the most common in the uvea of dogs and in the iris of cats. They can be classified as melanocytomas (benign) and melanomas (malignant). For a better understanding of the biological behavior of uveal melanocytic neoplasms in dogs and cats, histological and immunohistochemical tools were applied to 32 eyes, 27 from dogs and five from cats. The ocular neoplasms of these animals were classified as benign (19/27 - dogs) or malignant (8/27 - dogs; 5/5 - cats), and the location of the involved ocular structures was described. The cell types of these neoplasms were also determined, including epithelioid, spindle and mixed, as well as special types, such as balloon cells, multinucleated giant cells and signet rings cells. In addition, the percentage of cells with melanin, the intensity of melanin within the cells, anisocytosis and anisokaryosis, the mitotic index, the presence of intratumoral inflammation and necrosis, vascular invasion and the development of secondary glaucoma were determined. To confirm the melanocytic origin, immunohistochemistry was performed with anti-PNL2 (29/32) and anti-melan-A (3/3) antibodies. The proliferative index in dogs was verified using the anti-Ki-67 antibody, which varied from 2.8 to 12% in melanocytomas, with an average of 6.45 ± 4.1 and from 15.8 to 70% in melanomas, with an average of 38.3 ± 25.21. The proliferative index for cats varied from 10.8 to 30.4%, with an average of 18.96 ± 7.36. The apoptotic index was also evaluated for both species, using the anti-caspase-3 antibody. For dogs, the apoptotic index varied from 3.8 to 50% in melanocytomas, with an average of 16.62 ± 13.26 and from 30 to 84% in melanomas, with an average of 58.04 ± 24.25. For cats, the apoptotic index ranged from 3.6 to 92%, with an average of 23.16 ± 38.62. The BAP1 protein, the marking pattern of which might influence tumor aggressiveness as reported for melanocytic ocular neoplasms in humans, was also evaluated in all uveal neoplasms in the present study. The histological and immunohistochemical characteristics found in uveal melanocytic neoplasms in dogs and cats in this study expanded the knowledge about the use of these tools as prognostic factors; however, further studies with animal survival follow-up after diagnosis are recommended.

Rhodococcus equi (R. equi) es un cocobacilo gram positivo, inmóvil e intracelular facultativo que produce bronconeumonía en potrillos. La infección por Rhodococcus equi se encuentra distribuida mundialmente y produce un impacto económico-productivo negativo importante en la industria equina. Esta enfermedad se manifiesta principalmente en potrillos menores de 6 meses, produciendo bronconeumonía piogranulomatosa asociada con alta morbilidad como mortalidad. La virulencia de R. equi está determinada por la presencia de un plásmido de entre 85 y 90 kb, que le proporciona la característica de ser intracelular facultativo. La inhalación de aerosoles que contienen cepas virulentas de R. equi desde el ambiente, y la replicación dentro delos macrófagos alveolares, son componentes esenciales de su patogénesis. Debido a que solo el modelo experimental equino reproduce las lesiones pulmonares típicas de esta enfermedad, el mismo ha sido utilizado en estudios para evaluar la implementación de métodos profilácticos y terapéuticos. Las lesiones macroscópicas producidas se caracterizan por consolidación multifocal de tamaño variable con cavitaciones ocupadas con un material purulento. La lesión microscópica que produce es una bronconeumonía piogranulomatosa caracterizada por abundante cantidad de neutrófilos, macrófagos, células gigantes multinucleadas tipo Langhans y una menor cantidad de linfocitos y células plasmáticas. Los objetivos de la presente tesis fueron: I: Demostrar que la dosis de 5x10³ UFC/mL de la cepa 103+ de R. equi es capaz de producir bronconeumonía piogranulomatosa en potrillos menores de 6 meses. II: Diagnosticar de forma precoz la infección pulmonar mediante la interpretación en conjunto de los signos clínicos respiratorios, el aumento de temperatura rectal, la elevación de fibrinógeno sanguíneo y la observación de lesiones pulmonares ultrasonográficas. III: Caracterizar las lesiones pulmonares macroscópicas y microscópicas de los potrillos infectados experimentalmente con una dosis baja de la cepa 103+ de R. equi (5x10³ UFC/mL) y confirmar la respuesta inmune Th-1 característica de esta infección, a través de la utilización del estudio histopatológico y la técnica de inmunohistoquímica para la detección de linfocitos T (CD3) y linfocitos B (CD79). La tesis está dividida en tres capítulos. El capítulo I se basa en el conocimiento reciente de aspectos relevantes de esta enfermedad, tales como los factores de virulencia, epidemiología, patogénesis, mecanismo inmune, patología, diagnóstico clínico, tratamiento y pronóstico. El capítulo II describe la reproducción experimental y aspectos clínicos de la bronconeumonía causada por la cepa 103+ de Rhodococcus equi en potrillos. El capítulo III comprende el estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico de lesiones pulmonares inducidas experimentalmente por la cepa 103+ de Rhodococcus equi en potrillos. Este estudio demostró que la inoculación de la cepa 103+ de R. equi con una dosis baja (5x103 UFC/mL) es capaz de producir exitosamente bronconeumonía en potrillos menores de 6 meses. En cuanto a la detección clínica de la enfermedad, la evaluación conjunta de los signos clínicos respiratorios, temperatura rectal, fibrinógeno sanguíneo y la observación de lesiones piogranulomatosas mediante la ultrasonografía torácica, permitieron la detección de la enfermedad a los 13,5 días -en promedio-, desde la inoculación. La totalidad de los potrillos desafiados presentaron lesiones pulmonares macroscópicas similares, caracterizadas por consolidación pulmonar y/o cavitación severa con áreas de consolidación multifocales a coalescentes en la región cráneoventral y caudodorsal de los pulmones. En cuanto a las lesiones pulmonares microscópicas, el 100% de los potrillos inoculados presentó bronconeumonía piogranulomatosa, el 54% presentó proliferación de neumocitos tipo II (epitelización), el 36% presentó trombosis pulmonar y el 27% presentó fibroplasia pulmonar. Además, se observaron diversas lesiones extrapulmonares, tales como hipopión, hipema, necrosis hepática centrolobulillar y miocarditis multifocal. Este estudio demostró que la inoculación de una dosis baja de la cepa 103+ de R. equi es capaz de producir lesiones pulmonares similares a las producidas por la infección natural. Sin embargo, se debería investigar el efecto de una dosis por debajo de 5x103 UFC/mL, la cual especulamos que podría producir lesiones severas, pero con un intervalo de tiempo mayor entre la inoculación y los signos clínicos respiratorios, asemejándose aun más a una infección natural. Fil: García, Jorge Pablo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Uzal, Francisco Alejandro. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Fumuso, Élida. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Rhodococcus equi is a grampositive, nonmotile, facultative intracellular coccobacillus that produces bronchopneumonia in foals. Rhodococcosis has a worldwide distribution and causes important productive and economic losses in the equine industry. The disease typically occurs in foals less than 6 months of age, causing mainly pyogranulomatous bronchopneumonia associatedwith high morbidity and mortality. The virulence of Rhodococcus equi is associated with an 85-90 kb virulence plasmid that provides the organism with the ability to be afacultative intracellular pathogen. The inhalation of aerosolized virulent R. equi strains from the environment and replication within alveolar macrophages are essential components of the pathogenesis. Due to its importance and to the factthat only the equine experimental model can reproduce the classic pulmonary lesions of this disease, this model has been used in the evaluation of prophylactic and therapeutic methods. The macroscopic lesions are characterized by multifocal consolidation of variable size with cavitations filled withpurulent material. The microscopic lesions consist of piogranulomatous bronchopneumonia, with abundant amount of neutrophils, macrophages, multinucleatedLanghans typegiant cells, and less lymphocytes and plasma cells. The aims of this thesis were: I: To determine if an inoculation dose of 5x103 CFU/mL of the 103+ strain of R. equi is able to produce piogranulomatous broncopneumonia in foals younger than 6 months of age. II: To detect early pulmonary infection by evaluating respiratory clinical signs, rectal temperature, blood fibrinogen and ultrasonographic pulmonary findings. III: Tocharacterize thegross and microscopic pulmonary lesions of foals experimentally infected with 5x10³ CFU of the 103+ strain of R. equi, and to evaluate the immunologic response to this challenge by histopathology and immunohystochemistry. The thesis is divided into three chapters. Chapter I reviews the recent knowledge on relevant aspects of rhodococcosis including etiology, clinical aspects, epidemiology, pathogenesis, immune response, pathology, diagnosis, treatment and prognosis. Chapter II describes the experimental reproduction and clinical aspects of bronchopneumonia caused by Rhodococcus equi strain 103+ in foals. Chapter III describes the gross, microscopic and immunohistochemical evaluation of pulmonary lesions experimentally induced by R. equi train 103+ in foals. This study shows that an inoculum of 5x103 CFU of R. equi strain 103+ is able to produce bronchopneumoniain foals less than 6 months of age. The evaluation of the respiratory clinicalsigns in conjunction with rectal temperature, blood fibrinogen and observation of pulmonary piogranulomatous lesions by means of thoracic ultrasonography, allowed for diagnosis to be made as early as 13.5 days after inoculation. All of the foals challenged in this study had similar gross pulmonary lesions, characterized by severe lung consolidation with multifocal to coalescent pyogranulomas in the cranioventral and caudodorsal regions of the lung. The pulmonary microscopic lesions in all of the inoculated foals consisted of pyogranulomatous bronchopneumonia; 54% of the foals had type II pneumocyte hyperplasia (epithelization), 36% showed thrombosis and 27% exhibited fibroplasia. Extrapulmonary lesions included hypopion (27%), hyphema (9%), centrolobular hepatic necrosis (27%) and multifocal myocarditis (9%). This study shows that the inoculation of a low dose of Rhodococcus equi strain 103+ can produce pulmonary lesions similar to the lesions observed in the natural infection. The effect of a dose lower than 5x10³ CFU should be investigated; we speculate that lower doses of this microorganism could produce severe lesions with a longer incubation period, which migh bear more resemblance to natural infection.

237 p. La presente tesis doctoral enfoca en el estudio del lenguado como especie centinela para los programas de seguimiento de la contaminación marina basados en evaluaciones de efectos biológicos mediante biomarcadores y análisis histopatológicos. La validez del lenguado como especie centinela fue evaluada basado en el análisis de sus respuestas a contaminantes en condiciones tanto de campo como de laboratorio. En el campo, se recolectaron muestras de lenguado salvaje durante 7 años en el estuario de Bilbao, seleccionado como ejemplo de un ecosistema en recuperación cuyos sedimentos siguen moderadamente contaminados después de un largo pasado de contaminación. La combinación de análisis químicos de sedimento con los análisis histopatológicos de lenguados (en hígado, branquias y gónadas) permitió evaluar el estado de salud del ecosistema del estuario de Bilbao y demostró la persistencia de efectos biológicos por la contaminación, principalmente del sedimento. La evaluación en condiciones de laboratorio de respuestas biológicas en el lenguado a contaminantes modelos disueltos en agua (Cd, B(a)P) o a sedimentos contaminados permitió demostrar la sensibilidad de la especie a diferentes escalasbiológicas (celulares y tisulares) basado en el análisis de diferentes biomarcadores (histopatológicos, histoquímicos y bioquímicos). Se confirma la sensibilidad del lenguado a niveles ambientales de contaminantes encontrados en el agua y/o en el sedimento, en relación a la duración y nivel de la exposición. En conclusión, los resultados de la presente tesis doctoral demuestran la validez del lenguado (Solea spp.) como especie centinela para la evaluación de efectos biológicos de contaminación basada en la aplicación de una herramienta de biomarcadores+histopatología, en el contexto de la EU Marine Strategy Framework Directive.

El objetivo de esta investigación de tipo retrospectivo fue la determinación de la frecuencia de presentación de Carcinoma de Células Escamosas (CCE) en muestras de caninos ingresadas a un centro de diagnóstico veterinario ubicado en la ciudad de Quito durante el período 2014 a 2018, y su asociación a factores de riesgo. Se utilizó la información de un total de 1918 casos clínicos reportados con neoplasias en caninos, de las cuales 1848 cumplieron con los criterios de inclusión y formaron parte de la muestra. Para el desarrollo del análisis retrospectivo se consideró la inclusión de casos clínicos relacionados con neoplasias, se clasificaron los casos clínicos en base el tipo de estudio, biopsia o citología, y estirpe de la patología, posteriormente se analizó el grupo de casos relacionados con estirpe epitelial y específicamente CCE y Carcinoma de Células Escamosas Subungueal. El análisis estadístico se dividió en análisis descriptivo en base a cálculos porcentuales por niveles y análisis estadístico inferencial para la determinación de asociación de las variables edad, raza y sexo de los pacientes frente a la presentación de CCE mediante chi-cuadrado a un nivel de confianza del 95%, así como mediante el cálculo del coeficiente de contingencia y para la determinación del nivel de riesgo se calculó Odds Ratios (OR) con Intervalos de Confianza del 95% (IC 95%). Se determinó que el porcentaje de presentación de casos de CCE durante el período 2014 a 2018 fue del 7,14% (132), del total de 1848 de casos clínicos, así mismo se determinó que no existe asociación entre la variable edad frente a la patología, alcanzando un p-valor de 0,650 en la prueba de chi-cuadrado; y un valor de contingencia de 0,018, determinando la baja relación entre variables; por otra parte se determinó asociación de las variables raza y sexo frente a la patología en la prueba de chi-cuadrado (p-valor 0,000) y un coeficiente de contingencia de 0,396 y 0,181 respectivamente, lo cual determina un nivel alto y medio de asociación. Se concluye que no existe asociación o mayor riesgo de CCE por edad, pero si para el caso de los caninos de raza de pelo corto y machos. The aim of this retrospective investigation was the determination of the frequency of presentation of Squamous Cell Carcinoma (SCC) in samples of canines admitted to a veterinary diagnostic center located at Quito city during the period 2014 to 2018, and their association to risk factors. The information of a total of 1918 clinical cases reported with canine malignancies was used, of which 1848 met the inclusion criteria and was part of the sample. For the development of the retrospective analysis, the inclusion of clinical cases related to neoplasms was considered, clinical cases were classified based on type of study, biopsy or cytology, and pathology´s lineage, subsequently the cases group related to epithelial lineage and specifically SCC and Subungual Squamous Cell Carcinoma, was analyzed. The statistical analysis was divided into descriptive analysis based on percentage calculations by levels and inferential statistical analysis to determinate association of variables age, breed and sex of patients against the presentation of SCC by chi-square at a confidence level of 95%, also calculating the contingency coefficient for determining the level of risk by odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (IC 95%). It was determined that the percentage of presentation of SCC cases during the period 2014 to 2018 was 7.14% (132), of 1848 of clinical cases, it was also determined that there is no association between the variable age versus to the pathology, reaching a p-value of 0.650 in the chisquare test; and contingency value of 0.018, determining the low relationship between variables; on the other hand, the association of the breed and sex variables was determined against the pathology in the chi-square test (p-value 0.000) and a contingency coefficient of 0.396 and 0.181 respectively, which determines an high and average level of association. It is concluded that there is no association or greater risk of SCC by age, but in the case of breed with short hair and male canines. Magíster en Medicina Canina y Felina Cuenca

Esta tesis doctoral, que incluye tres publicaciones científicas, tenía como objetivos el desarrollo y validación de técnicas de diagnóstico de la sarna sarcóptica ovina, la estimación de la prevalencia de infección en la población ovina del oeste de la Comunidad Autónoma de Castilla y León y la caracterización de las respuestas clínica e inmune humoral tras infecciones experimentales, 134 p.

El conocimiento, prevención y tratamiento de las patologías existentes es posiblemente el factor más limitante en la actualidad para el engorde del lenguado (Solea senegalensis, Kaup 1858). Sin embargo, no hay evidencia de que ésta sea una especie más susceptible que otras a las infecciones bacterianas. Los actuales sistemas de producción intensiva suponen un estrés para los ejemplares en cultivo, ocasionando una menor eficiencia digestiva, una mayor susceptibilidad frente a patógenos potenciales y pérdidas económicas para la industria. Puesto que la producción en acuicultura depende, en buena medida, del estatus fisiológico de los peces, se hace preciso el empleo de piensos comerciales específicos y adecuados protocolos de cultivo que favorezcan el bienestar animal. La utilización de probióticos a nivel comercial en dieta (células microbianas con un efecto positivo para la salud del hospedador) es ya una herramienta eficaz para la mejora del metabolismo, reducción de deformidades y prevención de patologías en acuicultura de salmónidos, 206 p.

531 p El presente trabajo tiene por objetivo el desarrollo y estandarización de nuevos protocolos y técnicas de analgesia por vía epidural, encaminadas a posibilitar la realización, con el caballo en la estación, de procedimientos obstétricos y quirúrgicos que involucren la mayor área anatómica y con el mayor tiempo de analgesia posibles, preservando la función motora de los miembros pelvianos, para evitar los riesgos asociados a la anestesia general en esta especie

184 p. La tuberculosis y la paratuberculosis son las dos enfermedades producidas por micobacterias de mayor importancia en el ganado bovino en todo el mundo. Teniendo en cuenta la importancia que la inspección post mortem tiene en el diagnóstico de esta enfermedades y especialmente en la confirmación de la infección tuberculosa en los animales positivos en las campañas de saneamiento, en este trabajo se ha llevado a cabo un estudio en animales sacrificados en matadero en el estado de Nayarit (México) tras haberse realizado en ellos la prueba de intradermorreacción simple (IDR) para el diagnóstico de tuberculosis, con el objetivo general de conocer la prevalencia de tuberculosis y paratuberculosis en bovinos sacrificados en matadero y de valorar la eficacia de diferentes técnicas diagnósticas para su detección. En concreto, se plantea evaluar la eficacia del diagnóstico post mortem mediante la evaluación histológica de muestras de tejido definidas, y comparar el comportamiento de diferentes técnicas de diagnóstico inmunológico (ELISA indirecto frente a tuberculosis o paratuberculosis, IDR), de detección de ADN micobacteriano (frente al complejo M. bovis, M. avium paratuberculosis (Map) o M. avium avium (Maa) y la detección de lesiones mediantes técnicas histopatológicas. En este trabajo, se ha demostrado la presencia de Maa asociada a lesiones granulomatosas en vacas de este estudio. Las técnicas de PCR e histopatología indican que ambos métodos cumplen con los requisitos necesarios para proporcionar un diagnóstico eficiente, en tiempo y costo, para ser consideradas como herramientas complementarias de la IDR en las Campañas de control de tuberculosis bovina y para evidenciar infecciones por otras micobacterias durante las mismas. El hecho de que hayan aparecido animales con infecciones por distintas micobacterias debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados de las campañas de saneamiento de tuberculosis

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar los reportes histopatológicos del Servicio de Diagnóstico Anatomopatológico “Histodiagnóstico Veterinario”. Se tomaron en cuenta un total de 1444 casos de neoplasias cutáneas y con diagnóstico específico de mastocitoma cutáneo en perros a través de un análisis retrospectivo comprendido entre los años 2014 y 2018, obteniendo una frecuencia de presentación de mastocitoma cutáneo de 15% (216/1444). Al clasificar histopatológicamente los mastocitomas según la escala de Patnaik se encontró mayor presentación de grado II en hembras (53%), el rango etáreo más afectado está entre los 5.1 a 9 años (43%), la raza más afectada fueron los mestizos (13%), ubicación anatómica más frecuente fue el tronco (32%); y, los márgenes quirúrgicos reportados con mayor ocurrencia son cerca de bordes (73%). Según la escala de Kiupel, se reportó el mastocitoma cutáneo de bajo grado, siendo las hembras las más afectadas (60%), la edad comprendida entre 5.1 a 9 años fue mayormente reportada (42%), los mestizos se diagnosticaron con mayor ocurrencia (17%), localización anatómica más común fue el tronco (36%); y, el margen quirúrgico más observado fue cerca de bordes (69%). Las pacientes hembras tienen mayor riesgo (OR=3,69; 95%IC: 1,81-7,53), pacientes geriátricos (> 9.1 años) se encuentran en mayor riesgo de desarrollar mastocitomas de grado alto en comparación a pacientes jóvenes y adultos (OR < 1); las razas con mayor riesgo de desarrollar neoplasias de grado alto fueron: Bulldog francés (OR=4.35; 95%IC: 0.73-25.6), Shar Pei (OR=4.64; 95%IC: 1.23-17.52), y Golden retriever (OR=5.80; 95%IC: 1.21-27.63). The objective of this study was to evaluate the histopathological reports of the histopathology laboratory "Histodiagnóstico Veterinario ". A total of 1444 cases of cutaneous neoplasms with a specific diagnosis of cutaneous mast cell tumor in dogs were taken into account through a retrospective analysis between 2014 and 2018, obtaining a frequency of presentation of cutaneous mast cell tumor of 15% (216/1444). According to the Patnaik scale when classifying the mast cell tumor, a higher presentation of grade II was found in females (53%), the most affected age range is between 5.1 and 9 years (43%), the most affected breed were the mixed breeds (13 %), the most frequent anatomical location was the trunk (32%); and, the surgical margins reported with the highest occurrence were near the edges (73%). According to the Kiupel scale, the low-grade cutaneous mast cell tumor was reported, with females being the most affected (60%), the age between 5.1 to 9 years was mostly reported (42%), mixed breeds were diagnosed with greater occurrence (17%), the most common anatomical location was the trunk (36%); and the surgical margins were most of the time observed near the edges (69%). Female patients are at greater risk (OR = 3.69; 95% CI: 1.81-7.53), geriatric patients (> 9.1 years) are at a higher risk of developing high-grade mast cell tumor compared to young patients and adults (OR

Toxoplasmosis es una enfermedad parasitaria, cuyo agente etiológico es un protozoo llamado Toxoplasma gondii, este parásito es el responsable de una de las infecciones parasitarias más comunes en humanos y animales de sangre caliente, siendo los felinos los únicos hospedadores definitivos. Varias técnicas de diagnóstico han sido empleadas para detectar T. gondii en todo tipo de muestras, siendo hasta la fecha las técnicas indirectas ELISA y PCR las más confiables, pero así mismo no muy asequibles por el costo que representan. El comportamiento errático del parásito no facilita su detección en todas las etapas de vida del parásito en el organismo del animal, por lo que nos puede arrojar resultados falso negativos, aunque el animal si haya padecido en algún momento de su vida la enfermedad. En el presente trabajo se planteó implementar un ensayo LAMP para detectar material genético de T. gondii en muestras sanguíneas de gatos (Felis catus domesticus) sin distinción de raza, edad o sexo, cuya característica principal era mantener contacto directo con el medio exterior, tener hábitos de caza y no tener acceso a un arenero, factores de riesgo que exponen al animal a adquirir más fácilmente la enfermedad. Se obtuvo ADN total de 100 muestras y se aplicó el método LAMP. Los resultados obtenidos mostraron 1 muestra positiva a T. gondii. Luego con este resultado se hizo una comparación con el estudio de seroprevalencia de T. gondii en la Ciudad de Cuenca utilizando la técnica de Inmunofluorescencia indirecta con 300 muestras sanguíneas de gatos de los cuales hubo 48 muestras seropositivas. Aunque los dos ensayos difieren en la metodología, cantidad de muestras y no pertenecen a los mismos individuos, los resultados positivos concuerdan en estar expuestos a los mismos factores de riesgo. El análisis estadístico aplicado la prueba de Diferencia de proporciones, se encontró que hay una diferencia significativa entre ambos ensayos, siendo el ensayo de serodiagnóstico más específico para este tipo de muestras. Sin embargo, aunque LAMP no haya mostrado una mayor cantidad de resultados positivos, se puede atribuir a que el tipo de muestra (sangre) no es el más adecuado para la identificación de ADN de T. gondii. Toxoplasmosis is a parasitic disease, which etiologic agent is a protozoan called Toxoplasma gondii. This parasite is responsible for one of the most common parasitic infections in humans and warm-blooded animals, being cats the only definitive hosts. Several diagnostic techniques have been used to find T. gondii in all types of samples, with the indirect ELISA methodology and direct PCR being the most reliable but not very affordable by the cost. The erratic behavior of the parasite does not facilitate the possibility of finding positive results throughout the life cycle of the parasite in the organism of the animal, so it can give us false negative results, although the animal has suffered the disease at some point in its life. The present study proposed to implement a LAMP test to detect genetic material of T. gondii in blood samples of cats (Felis catus domesticus) without distinction of race, age or sex, which main characteristic was to maintain direct contact with the outside environment, to have hunting habits and not having access to a sandbox, risk factors that expose the animal to acquire the disease more easily. Total DNA was obtained from 100 samples and the LAMP method was applied; the results showed 1 positive sample to Toxoplama gondii. Then with this result a comparison was made with the study of Seroprevalence of T. gondii in the City of Cuenca using the Indirect Inmunofluorescence technique with 300 blood samples from cats of which 48 were positive samples. Although the two trials differ in methodology, number of samples and do not belong to the same individuals, the positive results agree to be exposed to the same risk factors. The statistical analysis applied with the Difference of proportions test, found that there is a significant difference between both tests, being the most specific the Serodiagnosis. Despite, LAMP has not shown a greater amount of positive results, it can be attributed to the fact that the type of sample (blood) is not the most suitable for the study of Toxoplasmosis. Magíster en Medicina Canina y Felina Cuenca

Elucidação de crimes é um assunto de extrema relevância, já que a criminalidade é inerente à sociedade. A Medicina Veterinária Legal é uma área em ascensão e são cada vez mais frequentes processos judiciais envolvendo animais. Este artigo tem por objetivo classificar e descrever diferentes tipos de lesões de ordem mecânica que são encontradas com frequência em animais. A classificação é realizada de uma maneira comparativa com o Código Penal, tendo como base a traumatologia forense em humanos. Desta maneira é possível facilitar os profissionais que irão realizar estes exames a elaborar relatórios e melhorar a determinação do judiciário de sanções penais e administrativas proporcionais para os réus de acordo com a gravidade de cada situação.

El Gammaherpesvirus bovino 4 (BoHV-4) es un miembro del género Rhadinovirus, de la subfamilia Gammaherpesvirinae, dentro de la familia Herpesviridae. Al igual que los demás agentes virales de esta subfamilia, se caracteriza por su capacidad linfotrópica, pudiendo establecer latencia en linfocitos y monocitos, además de infecciones citolíticas en células epiteliales y o fibroblásticas. El BoHV-4 posee genes homólogos a los celulares, como el gen de la 2β-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa, con un 81.1% de similitud con la enzima producida por células de humano. Esta enzima tiene un rol crucial en la síntesis de glucanos. Asimismo, codifica una proteína esencial para el establecimiento de latencia, las proteínas v-Bcl2 y v-Flip (productos asociados a procesos de muerte celular), y la glucoproteína gp180 que tiene un rol importante en la provisión de un escudo de O-glucanos que enmascararía los epitopes en las glucoproteínas virales, contribuyendo a la evasión de los anticuerpos neutralizantes. En contraste con la mayoría de los gammaherpesvirus, el BoHV-4 presenta la capacidad de replicar en un amplio rango de especies domésticas y silvestres, así como en una gran variedad de cultivos celulares, incluyendo líneas celulares de humanos. Además, puede producir distintos tipos de síndromes, y si bien se lo asocia con enfermedad uterina posparto en bovinos, aún no se ha podido esclarecer el rol que desempeña en esta patología. El primer aislamiento del BoHV-4 fue realizado por Bartha en Hungría, en 1963; posteriormente fue aislado en Estados Unidos. Desde entonces, más de 40 cepas diferentes han sido aisladas en todo el mundo. A partir de estas cepas se establecieron tres grandes grupos basados en su análisis genómico: el tipo Movar 33/63, que comprende las cepas europeas; el tipo DN599, conformado por las cepas americanas, y un tercer grupo que incluye cepas de búfalo africano. La capacidad del BoHV-4 de presentar variaciones genómicas ha sido demostrada en estudios genéticos de cepas de referencia. Esta variabilidad sería el resultado de eventos de recombinación entre cepas y dentro de una misma cepa. En Argentina, el BoHV-4 fue aislado y caracterizado molecularmente por Verna et al. en el año 2007 a partir de muestras de vacas abortadas. El estudio de filogenia de las cepas locales aisladas demostró un importante grado de variabilidad genómica entre las cepas circulantes, revelando la existencia de tres grupos diferentes, designados como genotipos 1, 2 y 3. Las cepas de los genotipos 1 y 2 presentaron mayor similitud con los tipos europeo y americano, respectivamente; las del genotipo 3 constituyen un nuevo grupo filogenético. Actualmente hay más de 50 aislamientos de BoHV-4 en nuestro país; el 85 % de estos se obtuvieron de muestras de mucus cérvico-vaginal de vacas que presentaron abortos. Sobre la base de la información que aporta la bibliografía internacional y los antecedentes locales se puede inferir que existen amplias diferencias en las propiedades biológicas y en el potencial patogénico del BoHV-4. Las variadas manifestaciones clínicas asociadas a las infecciones por el BoHV-4 y la heterogeneidad en los patrones de restricción del genoma viral, sugieren que las variantes genómicas podrían asociarse a variaciones en la actividad biológica de este virus. Por lo mencionado precedentemente, considerando la importancia de la presencia del BoHV-4 en Argentina en función a su relación con pérdidas reproductivas y potencialidad de este virus para infectar células humanas, el objetivo de este trabajo de tesis fue realizar un estudio de cepas virales filogenéticamente diferentes, aisladas en nuestro país, a los efectos de conocer si la diferencias genéticas están asociadas a características biológicas particulares. Para cumplir con los objetivos propuestos se desarrollaron experimentos in vitro para estudiar la actividad biológica de seis cepas argentinas pertenecientes a los tres grupos genéticos mencionados, sobre líneas celulares de diferente origen. Se analizaron la cinética de replicación viral, la manifestación de efecto citopático, la capacidad lítica, la producción de placas de infección y la capacidad de infección de células de origen humano. Luego se estudiaron los efectos de las diferentes cepas sobre su capacidad de inducir apoptosis, para lo cual se procedió a identificar cambios nucleares compatibles con esta, detectar la fragmentación del ADN y detección y análisis de los genes v-Flip y v-Bcl2. Para complementar estos estudios se realizó un experimento in vivo, mediante la infección experimental de bovinos, con el objetivo de realizar un estudio descriptivo de la distribución tisular de las cepas locales del BoHV-4 genéticamente diferentes. El estudio de cinética de replicación se realizó con las seis cepas de BoHV-4 pertenecientes a los tres grupos genéticos en las líneas celulares de origen humano (HeLa y Hep2), la línea de origen bovino MDBK y la línea Vero de riñón de mono. La cepa (08/330), correspondiente al genotipo 2, alcanzó títulos de 5 a 9 logaritmos, significativamente más altos (p < 0.05) que el resto de las cepas. La cinética de replicación de las cinco cepas restante presentó mayor variabilidad en los cultivos de HeLa y Hep2 en comparación con las líneas celulares MDBK y Vero, con títulos que variaron de 2 a 4.5 logaritmos. La cepa 12/365 (genotipo 2), no manifestó actividad viral en la fracción extracelular a las 24 horas posinfección (hpi) en ninguno de los cultivos celulares, además esta cepa mostró mayor variabilidad en la cinética en las cuatro líneas celulares. Este ensayo permitió, además, comprobar que las líneas de origen humano y de mono son susceptibles y permisivas a la infección por estas cepas locales de BoHV-4. En los distintos ensayos, para confirmar la presencia del genoma viral se modificó y optimizó una nested PCR, descripta por Fábián y Egyed (2004), para amplificar un fragmento de 271 pares de bases (pb) del ORF25, el cual codifica la proteína mayor de la cápside. La mayoría de las cepas produjo efecto citopático entre las 24 y 48 hpi en células MDBK y Hep2. En las líneas celulares HeLa y Vero, la producción de efecto se evidenció más tardíamente (72 hpi). La presentación del efecto citopático fue variable entre las cepas y entre los cultivos celulares. En el ensayo de placa de lisis, se observó una amplia variabilidad en los tamaños de las placas, principalmente entre las líneas celulares. Las cepas 09/227, 08/263 y 07/435 produjeron placas de tamaño medio (1 a 3 mm) en células MDBK, el tamaño de estas placas fue significativamente mayor (p < 0.05) con respecto a las placas producidas por las cepas 08/330 y 12/365. Por el contrario, en las células HeLa, estas cepas produjeron placas significativamente mayores (p < 0.05) que las cuatro cepas restantes. En las células Hep2 y Vero, todas las cepas produjeron placas mínimas (< 1mm). No se produjeron placas grandes (> 3mm) en ninguno de los tipos de células. Como resultado de la inmunofluorescencia directa utilizada en el ensayo de placas de infección, se observó una marcada disparidad entre las distintas cepas para ser reconocidas por los anticuerpos disponibles. Posiblemente, el uso de reactivos elaborados con anticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos de cepas foráneas no resultan de utilidad para la identificación efectiva de aislamientos locales. En el estudio de los efectos de las cepas de BoHV-4 sobre la inducción de apoptosis se identificaron cambios nucleares indicativos de apoptosis mediante tinción con DAPI. El mayor número de células con cambios nucleares, representado como índice relativo de apoptosis (IRA) y la mayor variabilidad entre cepas se registraron en la línea celular MDBK. En los cultivos de células Hep2 y HeLa no se evidenciaron variaciones significativas (p > 0.05) entre las cepas, al igual que en la línea Vero, en la cual se registró el IRA más bajo. Para evaluar si las cepas de BoHV-4 analizadas inducen la fragmentación del ADN se utilizaron las técnicas de electroforesis en gel de agarosa y TUNEL sobre las líneas celulares MDBK y HeLa. Solamente en las células HeLa se observó fragmentación del ADN, a las 24 hpi, en las células inoculadas con las cepas 09/508 y 08/330. Utilizando la técnica de TUNEL, los IRAs más elevados se registraron, en las células MDBK a las 24 hpi, aunque sin detectarse diferencias entre el control positivo y las seis cepas de BoHV-4 (p > 0.05). A las 48 hpi solamente las cepas 08/263 y 09/227 mostraron IRAs significativamente más elevados (p < 0.05) que ambos controles. En las células HeLa, sólo la cepa 12/365 evidenció un IRA significativamente mayor (p < 0.05) que los controles a las 48 hpi. También se analizaron los genes v-Flip y v-Bcl2 en los seis aislamientos. En las cepas 08/263 y 08/330, correspondientes al genotipo 2, no fue posible amplificar la secuencia de ninguno de estos genes. Las variaciones halladas en las cuatro cepas restantes, ocasionadas por sustituciones nucleotídicas en ambos genes, se tradujeron en cambios en las respectivas proteínas y en mayor grado en la proteína v-Flip, por lo que se podría inferir que la actividad de esta proteína presentaría variaciones dependiendo de la cepa. Si bien sólo se utilizaron cuatro cultivos celulares de distinto origen, la evaluación general de los resultados revela que las cepas de BoHV-4 analizadas no inducen elevados niveles de apoptosis. Por último, se realizó un estudio in vivo en un modelo bovino para analizar la distribución tisular, presencia, tipo y severidad de lesiones y respuesta inmune humoral. Se seleccionaron tres cepas de BoHV-4 de diferente genotipo. Se utilizaron 4 terneros de 6 meses de edad, inoculados por vía intranasal mediante aerosolización, de la siguiente manera: ternero 1 (T1) cepa 09/508 (genotipo 1), ternero 2 (T2) cepa 08/330 (genotipo 2), ternero 3 (T3) cepa 07/435 (genotipo 3) y ternero 4 (T4) control inoculado con medio de cultivo como placebo. Se extrajeron muestras de secreciones nasales, oculares y sangre con y sin anticoagulante a los 0, 7, 14 y 21 días posinfección (dpi) para la detección de genoma viral, aislamiento viral y para la búsqueda y determinación de los títulos de anticuerpos neutralizantes. La eutanasia de los animales se realizó a los 21 dpi y se extrajeron muestras de diferentes tejidos para aislamiento viral, detección de genoma viral e histopatología. No se observaron signos clínicos en ninguno de los animales. El ADN viral se detectó en leucocitos de sangre periférica (LSP) del T1 a los 21 dpi y del T2 a los 14 y 21 dpi. En las muestras de tejidos, se detectó el genoma viral en bazo, médula, ganglio trigeminal, tráquea y lóbulo piriforme del T1 (cepa 09/508); bazo, tráquea, riñón, linfonódulo retrofaríngeo y lóbulo frontal del T2 (cepa 08/330), y linfonódulo pulmonar, lóbulos frontal y piriforme del T3 (cepa 07/435). Las muestras de secreciones, tejidos y LSP del ternero control (T4) resultaron negativas. La cepa 08/330 se aisló en las secreciones oculares y nasales del T2 a los 7 dpi y la cepa 07/435 de secreciones nasales del T3. A los 14 dpi se aislaron las cepas 09/508 (genotipo 1), 08/330 (genotipo 2) y 07/435 (genotipo 3) en las secreciones nasales de T1, T2 y T3, respectivamente. Todos los aislamientos se identificaron por nested PCR. Ninguna de las cepas se aisló de los tejidos y LSP de los tres animales inoculados, y las muestras del ternero control también resultaron negativas. Durante la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas en ninguno de los animales. Microscópicamente se observó una leve respuesta inflamatoria con infiltrado mononuclear en tejidos respiratorios y linfáticos del T1 (cepa 09/508) y T3 (cepa 07/435). En el tejido nervioso de estos animales se observó gliosis leve, neuronas colapsadas con núcleos picnóticos, citoplasma eosinofílico y cromatolisis, hipercromatosis neuronal y satelitosis leve. No se hallaron lesiones histológicas en las muestras de T2 (cepa 08/330) y T4 (control). En los sueros de los cuatro animales se observó actividad neutralizante para la cepa 08/330, al igual que para la cepa 07/435 en los T1, T2 y T3. Solamente se detectó seroconversión en T1, a los 21 dpi, cuando los sueros se enfrentaron con la cepa homóloga (09/508). Cuando se analizaron los sueros con las tres cepas no utilizadas en el ensayo in vivo (08/263, 12/365 [genotipo 2] y 09/227 [genotipo 3]) sólo se evidenció efecto neutralizante para la cepa 08/263 en T1, T3 y T4, en bajos títulos. Los hallazgos de este estudio sugieren que, aunque leves, hay diferencias en la actividad biológica de las cepas utilizadas en este trabajo, además de comprobarse que estos aislamientos locales de BoHV-4 pueden infectar células de origen humano. No obstante, a pesar de las diferencias observadas en la actividad de estas cepas de BoHV-4 in vitro, no fue posible establecer una asociación entre los grupos filogenéticos y los patrones de comportamiento biológico de cada cepa en los experimentos in vitro y en el modelo experimental in vivo. Fil: Morán, Pedro Edgardo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Verna, Andrea E. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Pérez, Sandra E. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Bovine Gammaherpesvirus 4 (BoHV-4) belongs to the Herpesviridae family, Gammaherpesvirinae subfamily and Rhadinovirus genus. Like the other members in this subfamily, BoHV-4 is characterized by its lymphotropism, and for establishing latency in lymphocytes and monocytes. It also produces cytolytic infections in epithelial and fibroblastic cells. This virus encodes cell-homologous genes, such as the 2β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene, with 81.1% similarity to the enzyme produced by human cells. This enzyme plays a crucial role in the synthesis of glucans. BoHV-4 also encodes essential proteins for the establishment of latency, the v-Bcl2 and v-Flip proteins (associated with cell death), and the gp180 glycoprotein that plays an important role in the provision of O-glucans shields, which would mask epitopes on viral glycoproteins, contributing to the evasion of neutralizing antibodies. In contrast to most gammaherpesviruses, BoHV-4 has the ability to replicate in a wide range of domestic and wild species, as well as in a wide variety of cell cultures, including human cell lines. In addition, it can produce different syndromes, and although it is associated with uterine postpartum disease in cattle, doubts persist about the role that BoHV-4 plays in this pathology. The first isolation of BoHV-4 was carried out by Bartha, in Hungary, in 1963; later, it was isolated in the United States. Since then, more than 40 different strains have been isolated around the world. Based in the genomic analysis of these strains, three large groups were established: the Movar 33/63 type, which comprises the European strains; the DN599 type, comprising the American strains, and the group that includes the African buffalo strains. The presence of genomic variations in BoHV-4 has been demonstrated in genetic studies of reference strains. This variability would be the result of recombination events among strains and within the same strain. In Argentina, BoHV-4 was isolated and molecularly characterized, by Verna et al., in 2007 from samples of aborted cows. The phylogenetic study of the isolated local strains showed an important degree of genomic variability, revealing the existence of three different groups, designated as genotypes 1, 2 and 3. The strains of genotypes 1 and 2 have greater similarity to the European and American types, respectively; and those of genotype 3 constitute a new phylogenetic group. Currently, more than 50 BoHV-4 strains have been isolated in our country; 85% of these isolates were obtained from samples of cervical-vaginal mucus from aborted cows. On the basis of the information provided by the international literature and local background, it can be inferred that there is a wide range of differences in the biological properties and the pathogenic potential of BoHV-4. The different clinical manifestations of BoHV-4 infections and the heterogeneity in the restriction patterns of the viral genome, suggest that the genomic variants could be associated to variations in the biological activity of this virus. Considering the aforementioned, the importance of BoHV-4 in Argentina, particularly in relation with reproductive losses and the potential of this virus to infect human cells, the objective of this thesis was to study phylogenetically different Argentinean BoHV-4 strains to determine whether genetic diversity is associated with their particular biological characteristics. To fulfill the proposed objectives, in vitro experiments to study the biological activity of phylogenetically divergent Argentinean strains, on cell lines from different origin, were carried out. The kinetics of viral replication, the manifestation of cytopathic effect, the lytic capacity, the production of infection plaques and the capability of the virus to infect human cell cultures were analyzed. Furthermore, the effects of the different strains on apoptosis were studied. For this purpose, nuclear changes compatible with apoptosis and DNA fragmentation were evaluated. In addition, detection and genomic analysis of the v-Flip and v-Bcl2 genes were performed. To complement these studies, a descriptive evaluation of the tissue distribution of these local BoHV-4 strains was carried out using an in vivo model of experimental infection of cattle. The study of replication kinetics was performed with six strains of BoHV-4 from different genetic groups in two human (HeLa and Hep2), one bovine (MDBK) and one simian (Vero) cell lines. The strain 08/330, corresponding to genotype 2, reached titers from 5 to 9 logarithms, significantly higher (p < 0.05) than the rest of the strains. The replication kinetics of the five remaining strains showed greater variability in HeLa and Hep2 cultures compared to the replication dynamics in the MDBK and Vero cells, with titers that ranged from 2 to 4.5 logarithms. Viral activity was not detected for strain 12/365 (genotype 2), in the extracellular fraction at 24 hpi in any of the cell cultures. Furthermore, this strain showed the greatest variability in the kinetics in the four cell lines. By this assay it was verified that the human and simian cell lines are susceptible and permissive to the infection by these BoHV-4 local strains. The presence of BoHV-4 genome in the different assays was confirmed by a nested PCR modified and optimized from that described by Fábián and Egyed (2004). This PCR amplifies a 271 bases pairs (bp) fragment of ORF25, which encodes the major protein of the capsid. Most of the strains produced cytopathic effect between 24 and 48 hours post infection (hpi) in MDBK and Hep2 cells. In HeLa and Vero cell lines, the effect was evidenced later (72 hpi). The cytopathic effects were variable among the strains and among cell cultures. In the lysis plaque assay, a wide variability in the sizes of the plaques was observed, mainly among the cell lines. Strains 09/227, 08/263 and 07/435 produced medium-sized plaques (1-3 mm) in MDBK cells, and the size of these plaques was significantly greater (p < 0.05) with respect to the plaques produced by 08/330 and 12/365 strains. On the contrary, these strains produced significantly greater plaques (p < 0.05) than the remaining four strains in HeLa cells. In Hep2 and Vero cells, all the strains produced minimum plaques (< 1 mm). Large plaques (> 3 mm) were not evident in any of the cell types. As a result of the direct immunofluorescence technique used in the fluorescent plaques assay, an evident variation was observed among the different strains to be recognized by the available antibodies. Possibly, the use antibodies directed against antigenic determinants of foreign strains is not useful for the effective identification of local isolates. Regarding the effects of BoHV-4 strains on apoptosis, nuclear changes indicative of apoptosis were identified by DAPI staining. The highest number of cells presenting nuclear changes, represented as a relative index of apoptosis (RIA) and the greater variability among strains were registered in MDBK cells. In cultures of Hep2, HeLa and Vero cells, no significant variations (p > 0.05) were observed among the strains. To evaluate whether the analyzed BoHV-4 strains induce DNA fragmentation, electrophoresis on agarose gel and TUNEL assays were used on MDBK and HeLa cells. DNA fragmentation was only observed in HeLa cells at 24 hpi in cells inoculated with strains 09/508 and 08/330. By TUNEL, the highest RIAs were recorded, in MDBK cells at 24 hpi, although differences were not detected among the positive control and the six strains of BoHV-4 (p > 0.05). At 48 hpi, only strains 08/263 and 09/227 showed significantly higher RIAs (p < 0.05) when compared with both controls. In HeLa cells, only the strain 12/365 showed a significantly higher RIA (p < 0.05) than the controls at 48 hpi. The v-Flip and v-Bcl2 genes were also analyzed in the six isolates. It was not possible to amplify the sequence of these genes in the strains 08/263 and 08/330, belonging to genotype 2. The variations found in the four remaining strains, caused by nucleotide substitutions in both genes, resulted in changes in the respective proteins, mainly in v-Flip. Thus, it can be inferred that the activity of this protein might present variations depending on the strain. Although only four cell cultures of different origin were used, the results reveal that these analyzed strains of BoHV-4 do not induce high levels of apoptosis. Finally, an in vivo study was carried out in a bovine model to analyze the tissue distribution, type and severity of lesions and humoral immune response. Three strains of BoHV-4 belonging to different genotypes were selected. Four 6 month-old calves were intranasally inoculated by aerosolization, as follows: calf 1 (C1) strain 09/508 (genotype 1), calf 2 (C2) strain 08/330 (genotype 2), calf 3 (C3) strain 07/435 (genotype 3) and calf 4 (C4) control, inoculated with culture medium as placebo. Nasal and ocular secretions, leukocytes from peripheral blood and serum samples were collected at 0, 7, 14 and 21 days post-infection (dpi) for viral genome detection, virus isolation and determination of neutralizing antibody titres. Euthanasia was performed at 21 dpi and samples were taken from different tissues for viral isolation, viral genome detection and histopathology. No clinical signs were observed in any of the animals. Viral DNA was detected in peripheral blood leukocytes (PBL) of C1 at 21 dpi and C2 at 14 and 21 dpi. In the tissue samples, the viral genome was detected in spleen, medulla, trigeminal ganglion, trachea and piriform lobe of C1 (strain 09/508); spleen, trachea, kidney, retropharyngeal lymph node and frontal lobe of C2 (strain 08/330), and pulmonary lymph node, frontal and piriform lobes of C3 (strain 07/435). Samples of secretions, tissues and PBL from the mock-infected calf (C4) were negative. Strain 08/330 was isolated in the ocular and nasal secretions of C2 at 7 dpi, and strain 07/435 from nasal secretions of C3. At 14 dpi, strains 09/508 (genotype 1), 08/330 (genotype 2) and 07/435 (genotype 3) were isolated in the nasal secretions of C1, C2 and C3, respectively. All isolates were identified by nested PCR. None of the strains was isolated from the tissues and PBLs from the three inoculated animals, and the samples from the uninfected control (C4) were also negative. No macroscopic lesions were observed in any of the animals at necropsy. The microscopical examination revealed slight inflammatory response with mononuclear infiltrate in respiratory and lymphatic tissues of C1 (strain 09/508) and C3 (strain 07/435). In the nervous tissue of these animals, mild gliosis, collapsed neurons with pyknotic nuclei, eosinophilic cytoplasm and chromatolysis, neuronal hyperchromatosis and mild satellitosis were observed. No histological lesions were found in the samples of C2 (strain 08/330) and C4 (negative control). Neutralizing activity was observed for strain 08/330 in the sera from the four animals. Similar results were obtained for strain 07/435 in the sera from C1, C2 and C3. Seroconversion was only detected in C1, at 21 dpi, when the sera were confronted with the homologous strain (09/508). Low neutralizing titers were observed only for strain 08/263 in C1, C3 and C4, when the sera were analyzed with the three strains not used in the in vivo assay (08/263, 12/365 [genotype 2] and 09/227 [genotype 3]). The findings of this study suggest that, although slight, there are differences in the biological activity of the strains used in this work; in addition, it was confirmed that these local isolates of BoHV-4 infect cells of human origin. However, in spite of the observed differences in the activity of these BoHV-4 strains in vitro, it is not possible to establish an association between the phylogenetic groups and the biological patterns of behavior of each strain in the in vitro experiments and in the in vivo experimental model.

Escherichia coli verotoxigénico (VTEC) representa un grupo muy importante de patógenos emergentes, causante de diarrea y severas enfermedades en seres humanos, tales como colitis hemorrágica o síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH afecta mayormente a niños menores de 5 años, es la principal causa de insuficiencia renal aguda, una de las más importantes de insuficiencia renal crónica y puede causar la muerte. El bovino es el principal reservorio y los alimentos contaminados, la principal vía de contagio al hombre. Argentina posee la mayor incidencia a nivel mundial de SUH y una alta prevalencia de VTEC en bovinos y alimentos derivados. El serotipo O157:H7 es el mayormente involucrado en los casos de enfermedad en el mundo, y en Argentina, también el más frecuentemente asociado al SUH. Sin embargo, no todos los aislamientos de O157:H7 tienen la misma capacidad de infectar y de causar enfermedad en el hombre. Estudios filogenéticos determinaron que las cepas O157:H7 integran subpoblaciones de dispersión mundial, las cuales diferirían en relación a su asociación con enfermedad. A partir del análisis comparativo de genomas, se han descripto varios métodos de subtipificación molecular, los cuales analizan distintas regiones y tipos de variación en el genoma. La combinación de los datos obtenidos por esta variedad de metodologías puede ofrecer una visión más amplia y robusta sobre la estructura poblacional y la virulencia de este serotipo. En este contexto se plantearon como objetivos conocer la diversidad genética de VTEC O157:H7 de Argentina, en particular de aquellas cepas que están circulando en la región pampeana, e identificar subtipos asociados a patogenicidad y virulencia. Para ello, se usaron distintos métodos de subtipificación molecular, tales como polimorfismos específicos de linaje (LSPA6), polimorfismos de nucleótido simple (SNP) (rhsA 3468 C>G y tir 255 T>A), análisis de múltiples loci VNTR (MLVA), y determinación de filogrupos. Por otro lado se analizó la presencia de genes relacionados con virulencia, tales como genes que codifican factores putativos de virulencia (FPV), genes codificados en plásmidos, de genes que codifican efectores no codificados en LEE (nle), presentes en islas de patogenicidad y genes que codifican factores de adherencia. Como complemento, se evaluó también, la actividad citotóxica de los aislamientos. El 98 % de ellos pertenecieron al linaje I/II (2 % al linaje II). El 100 % presentó el alelo del SNP (8_rhsA) correspondiente al clado 8. Un alto porcentaje de aislamientos presentó en alelo tir 255 T>A T, asociado a hipervirulencia, y fue asignado al filogrupo E. Según el MLVA se encontró una amplia diversidad genética. Todos los aislamientos mostraron el perfil plasmídico ehxA-espP-katP-stcE y poseyeron los genes ehaA, elfA, iha y lpfA variantes lpfA1-3, lpfA2-2 y ECSP_0242. Las frecuencias de los genes ECSP fueron 95 % ECSP_2687, 88 % ECSP_3286, 86 % ECSP_3620, 53 % ECSP_2870/2872 y 44 % ECSP_1733. Los aislamientos se agruparon en once perfiles nle, el 46 % fueron positivos para todos los genes nle, mientras que los aislamientos restantes, excepto dos, carecieron de nleF mostrando la OI-71 incompleta. Todas las cepas O157:H7, excepto el aislamiento identificado como linaje II, fueron citotóxicas en células Vero. Los resultados indican que las cepas de la región pampeana de Argentina son un grupo filogenéticamente homogéneo que presenta diversidad genética en relación a sus perfiles MLVA y de genes nle. La pertenencia de los aislamientos al clado hipervirulento 8 y al linaje I/II, la alta prevalencia del alelo tir 255 T>A T y de genes de factores putativos de virulencia, permite asignar a la mayoría de las cepas O157:H7 de esta región un alto riesgo para la salud pública. Fil: González, Juliana. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Bustamante, Ana Victoria. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Sanso, Andrea Mariel. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Verotoxin-producing E. coli (VTEC) O157:H7 is the dominant serotype isolated from patients with HUS and, Argentine has the highest rate of HUS in the world. However, not all O157:H7 isolates have the same ability to infect and cause disease in humans. Molecular typing had allowed to identify subpopulations related to the origin and virulence of O157:H7 strains. Our aim was to perform a genetic characterization of 43 O157:H7 strains isolated in Argentine mostly from cattle and humans in order to establish the potential public health risk. For this purpose, a combination of molecular subtyping methods were used, lineage-specific polymorphisms (LSPA6), simple nucleotide polymorphisms (SNP) (rhsA 3468 C>G y tir 255 T>A), multiple loci VNTR analysis (MLVA) and phylotyping determination; on the other hand, analysis of genes related to virulence, such as genes encoding putative virulence determinants (FPV), factors codified in plasmids, effectors not codified in LEE (nle) and genes encoding adherence determinants. Also, the cytotoxicity activity of the isolates was evaluated. The 98 % of them belonged to lineage I/II (2 % lineage II). All isolates carried the clade 8 SNP variant (8_rhsA). A high percentage of isolates presented tir allele 255 T>A T, associated with hypervirulence, and was assigned to phylogroup E. According to MLVA, a wide genetic diversity was found. All isolates showed the plasmid profile ehxA-espP-katP-stcE and harbored ehaA, elfA, iha and lpfA variants lpfA1-3 and lpfA2-2 and, ECSP_0242. The frequencies of the remaining ECSP genes were 95 % ECSP_2687, 88 % ECSP_3286, 86 % ECSP_3620, 53 % ECSP_2870/2872 and 44 % ECSP_1733. Isolates were grouped into eleven nle profiles, 46 % were positive for all nle genes, while the remaining isolates, except two, showed incomplete OI-71, particularly lacked nleF. All O157:H7 strains, except the isolate identified as lineage II, were cytotoxic on Vero cells. Results point out that argentinean pampa region strains are a phylogenetically homogenous group, which shows genetic diversity in MLVA and nle profiles. The belonging of the isolates to hypervirulent clade 8 and lineage I/II, the high prevalence of the allele tir 255 T>A T and nle and putative virulence factors genes, would allow assigning most O157:H7 strains of this region a high risk to public health.