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Endonuclease G (EndoG) is an enzyme that specifically cleaves double stranded DNA at the dG and dC positions and has been shown to participate in chromatin degradation during apoptosis in Leishmania. The main goal of this work was to purify and crystallize EndoG in preparation for future structural studies that will permit a detailed understanding of the function of this enzyme. Materials and methods: EndoG protein was puri ed using Ni-af nity chromatography under denaturing conditions, then refolded in vitro and crystallized by the hanging-drop vapor diffusion method. Results and conclusion: The endonuclease G protein from Leishmania (viannia) panamensis was overexpressed, refolded, purified and demonstrated to be enzymatically active. Here, we reports the first successful crystallization of the EndoG protein in this group of protozoan parasites. The protein was crystallized by the hanging-drop vapor diffusion method. High quality EndoG crystals were obtained that perhaps will permit determination of the three-dimensional structure of EndoG using X-ray diffraction. RESUMEN: Antecedentes y objetivos: La endonucleasa G (EndoG) es una enzima que escinde específicamente en las posiciones dG y dC del ADN de cadena doble y se ha demostrado que participa en la degradación de la cromatina durante el proceso de apoptosis en Leishmania. El objetivo principal de este trabajo fue la purificación y cristalización de EndoG como preámbulo para los estudios estructurales futuros que permitan entender detalladamente el funcionamiento de esta enzima. Materiales y métodos: La proteína EndoG fue purificada en condiciones desnaturalizantes usando cromatografía de Ni, luego fue renaturalizada in vitro y cristalizada por el método de difusión de vapor por gota colgante. Resultados y conclusión: La proteína EndoG de Leishmania (viannia) panamensis fue sobreexpresada, renaturalizada, purificada y demostró estar enzimáticamente activa. Aquí, se registra la primera cristalización exitosa de la proteína EndoG de este grupo de parásitos protozoarios. La proteína fue cristalizada por el método de difusión de vapor por gota colgante. Se obtuvieron cristales de alta calidad de EndoG que posiblemente nos permitirán determinar la estructura tridimensional de EndoG usando difracción de rayos-X. COL0156275 COL0007462

Los parásitos del género Leishmania son los causantes de la enfermedad conocida como Leishmaniasis. Esta enfermedad es endémica en 98 países. Veinte especies de Leishmania sp han sido descritas como patógenos en humanos y varias de ellas presentan manifestaciones clínicas diferentes. No se dispone de vacuna, a pesar del considerable esfuerzo de muchos grupos de investigación. Las alternativas para descubrir nuevos medicamentos están basadas en el diseño de compuestos que interaccionen con blancos específicos, principalmente, proteínas encargadas de procesos metabólicos o celulares del patógeno, e.g. la parasitación de las células del huésped vertebrado. La eficiente parasitación del huésped vertebrado por Leishmania depende de la expresión de diferentes proteínas, incluyendo la proteína Lack. Parásitos deficientes de Lack no sobreviven internalizados en las células de los vertebrados. Este artículo presenta las condiciones de renaturalización, purificación y cristalización de la proteína Lack del patógeno humano Leishmania (Viannia) panamensis. Además, los resultados de modelación estructural de esta proteína muestran una conformación proteica similar a un ventilador organizado en 7 aspas, cada una compuesta de 4 hojas β. La estructura de la proteína Lack resultó similar a la proteína asociada a ribosoma RACK1 de Trypanosoma brucei y Saccharomyces cerevisiae, y a la de otros eucariotas. Las características estructurales de la proteína Lack podrían ser usadas para la exploración de nuevos. Leishamnia parasites are the causative agents of the leishmaniasis disease. Due to its broad distribution, parasites are endemic in approximately 98 countries. Twenty species of Leishmaniasp has been described as human pathogens and several of them present different clinical manifestations. This feature poses a significant challenge to the general goals of parasite control and erradication. There is no a protective vaccine for humans, despite substantial efforts by many research teams. Alternatives to discover new drugs are based on the design of new compounds that bind selected targets. Mainly, the targets are proteins involved in key metabolic or cellular processes of the pathogen, e.g. parasitization of vertebrate host cells. The efficient parasitization of the vertebrate host by Leishmania parasites depends on the expression of different molecules including Lack protein. The knockout parasites fail to survive inside the vertebrate host cells. In this article we highlight the conditions to perform the refold, purification, and crystallizing of the Lack protein of the human pathogen Leishmania (Viannia) panamensis. Moreover, we present structure modelling analysis which shows a protein conformation like a fan organized in 7 blades, each one composed of 4 b sheets. Furthermore, the structure of Lack protein was found to be similar to RACK1-ribosome associated protein from Trypanosoma brucei and Saccharomyces cerevisiae and other eukaryotes. The structural characteristics of Lack protein could be used for exploration of new drugs. Os parasitas do gênero Leishmania são os agentes causadores da doença conhecida como Leishmaniasis. Esta doença é endêmica em 98 países. Vinte espécies de Leishmania sp têm sido descritas como patógenos em humanos e várias delas apresentam manifestações clínicas diferentes. Não se dispõe de vacina, apesar do considerável esforço de muitos grupos de pesquisa. As alternativas para descobrir novos medicamentos estão baseadas no desenho de compostos que interajam com alvos específicos, principalmente, proteínas encarregadas de processos metabólicos ou celulares do patógeno, e.g. a parasitação das células do hóspede vertebrado. A eficiente infestação do hóspede vertebrado por Leishmania depende da expressão de diferentes proteínas, incluindo a proteína Lack. Parasitas deficientes de Lack não sobrevivem internalizados nas células dos vertebrados. Este artigo apresenta as condições de regeneração, purificação e cristalização da proteína Lack do patogénico humano Leishmania (Viannia) panamensis. Além disso, resultados de modelação estrutural desta proteína mostram uma conformação protéica similar a um ventilador, organizado em 7 pás, cada uma composta de 4 folhas β. A estrutura da proteína Lack resultou similar a proteína associada ao ribossomo RACK1 de Trypanosoma brucei y Saccharomyces cerevisiae, e à de outros eucariotas. As características estruturais da proteína Lack poderiam ser usadas para a pesquisa de novos fármacos.