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Malaria is one of the main infectious diseases in the world, particularly in tropical and subtropical areas. Among the species that can cause this disease, in recent years P. vivax has been growing due to its own attributes, which make it highly difficult to eradicate. This study was focused on analyzing and identifying the proteome of P. vivax during the blood stage through a mass spectrometry analysis (LC-MS-MS). Results allowed us to identify 743 proteins, of which 522 never had been described before. Furthermore, the comparison of the expression of these proteins with P. vivax transcriptional profile allowed us to corroborate the adaptive change in the P. vivax VCG-1 strain transcriptome, previously described., La malaria sigue siendo una de las principales enfermedades transmisibles del planeta, especialmente en áreas tropicales y subtropicales. Dentro de las diversas especies causantes de esta enfermedad, en los últimos años ha ganado relevancia el estudio de P. vivax debido a sus características propias, que la hacen especialmente difícil de erradicar. En el presente estudio, nos proponemos analizar e identificar las proteínas de la fase hemática de P.vivax mediante cromatografía líquida asociada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS-MS). Los resultados del estudio nos permitieron identificar 743 proteínas, de las que 522 no habían sido previamente descritas. Además, la comparación del perfil de expresión de estas proteínas con el perfil transcripcional de P. vivax nos permitió corroborar lo descrito en estudios anteriores: el cambio adaptativo en el perfil transcripcional de la cepa VCG-1 de P. vivax.

ilustraciones Plasmodium falciparum durante su ciclo de vida, expresa una amplia gama de proteínas entre las que se destaca la proteína del cuello de las roptrias 4 (PfRON4). Este es un candidato promisorio a vacuna, ya que se expresa tanto en merozoítos como esporozoítos, participa durante la formación del enlace fuerte con la célula hospedera a través del complejo RONs/AMA1 y es refractario a deleción genética. Pese a ello, aún no se conocen las regiones clave de este antígeno que interactúan con las células hospederas, siendo esta información de gran utilidad para combatir la enfermedad causada por este parásito. Por tal motivo, en este trabajo de investigación se sintetizaron 32 péptidos derivados de la región conservada de PfRON4 y se llevaron a cabo ensayos de interacción receptor-ligando para determinar la capacidad de unión de cada péptido a células hospederas, así como determinar la naturaleza del receptor y habilidad de éstos para inhibir la invasión del parásito en cultivo continuo in vitro con la cepa FCB2. Se identificaron cinco HABPs (High Activity Binding Peptides) denominados 42477, 42479, 42480, 42505 y 42513, los cuales se unieron con alta afinidad y especificidad a receptores de tipo proteico sobre la membrana de los eritrocitos. Por su parte, los péptidos 42477 y 42480 se unieron a la membrana de las células HepG2 con constantes de disociación en el rango sub-micromolar, siendo esta interacción dependiente de receptores tipo heparina y/o sulfato de condroitina. Los ensayos de inhibición de la invasión mostraron que los HABPs de PfRON4 fueron capaces de bloquear la entrada de los merozoítos a los eritrocitos hasta en un 50%. En conclusión, se encontró que las regiones de PfRON4 800-819 (42477) y 860-879 (42480) interactúan específicamente con las células hospederas y esto soporta su inclusión en el desarrollo de una vacuna multi-antígeno, multi-estadio basada en subunidades contra P. falciparum (Texto tomado de la fuente) Plasmodium falciparum expresses a wide range of proteins during its lifecycle, among which one the most important is rhoptry neck protein 4 (PfRON4); it is a promising vaccine candidate since it is expressed in merozoites and sporozoites, participates in a strong bond formation with host cells via the RONs/AMA-1 complex and is refractory to genetic deletion. Despite this, PfRON4’s key regions interacting with host cells remain unknown; such information would be extremely useful for combating P. falciparum-related malaria. For this reason, in this research work, thirty-two PfRON4 conserved region-derived synthetic peptides were chemically synthesized, and receptor-ligand interaction/binding assays were carried out for determining the binding capacity of each peptide to host cells, the nature of their receptors and their ability to inhibit in vitro parasite invasion with the FCB2 strain. Five HABPS (High Activity Binding Peptides) named 42477, 42479, 42480, 42505 and 42513 were identified, which bound with high affinity and specificity to protein-like receptors on the erythrocyte membrane. Peptides 42477 and 42480 bound to HepG2 cells’ membrane, both of them having submicromolar range kD, the interaction being dependent on heparin and/or chondroitin sulphate proteoglycan receptors. Invasion inhibition assays showed that PfRON4 HABPs were able to block merozoite entry into erythrocytes by up to 50%. In conclusion, PfRON4 regions 800-819 (42477) and 860-879 (42480) were found to specifically interact with host cells, which supports their inclusion in the development of a subunit-based, multi-antigen, multistage anti-malarial vaccine against P. falciparum Maestría Magister en Bioquímica Bioquímica y Biología Molecular

ilustraciones Plasmodium vivax es una de las especies que causa malaria en humanos con mayor importancia epidemiológica en el mundo dada su amplia distribución geográfica. Esta especie es difícil de propagar in vitro dada su preferencia por invadir reticulocitos humanos y por ende su estudio biológico es complicado. Durante la invasión de estos parásitos a sus células diana se presenta un contacto inicial mediado principalmente por moléculas de superficie las cuales establecen diferentes interacciones proteína-proteína. Sin embargo, en P. vivax únicamente se conocen dos proteínas de superficie de merozoitos relacionadas con la adhesión específica a los reticulocitos humanos: MSP1 y RBSA. Dada la importancia de saber qué otras proteínas del parásito participan en el contacto inicial con el hospedero, en este estudio se evaluó, por primera vez, la capacidad de unión de la proteína de superficie de merozoito 10 (PvMSP10) a reticulocitos de humanos adultos. De particular interés, se encontró que PvMSP10 se une a reticulocitos humanos a través de la región C-terminal, cuyo polimorfismo es muy bajo. Además, mediante un ensayo de competición proteína-célula, se determinó que dicha interacción se encuentra gobernada por dos regiones de 20 residuos de longitud (388DKEECRCRANYMPDDSVDYF407 y 415KDCSKENGNCDVNAECSIDK434), que hacen parte de los dominios similares a EGF de esta proteína. Estos hallazgos destacan la importancia de dichos fragmentos para estudiar su utilidad en una futura vacuna contra la malaria causada por P. vivax. (Texto tomado de la fuente) Plasmodium vivax is one of the species that causes malaria in humans with the greatest epidemiological importance in the world given its wide geographical distribution. This species is difficult to propagate in vitro given its preference for invading human reticulocytes and therefore its biological study is complicated. During the invasion of these parasites to their target cells, an initial contact occurs mainly mediated by surface molecules which establish different protein-protein interactions. However, only two merozoite surface proteins related to specific adhesion to human reticulocytes are known in P. vivax: MSP1 and RBSA. Given the importance of knowing which other parasite proteins are involved in the initial contact with the host, this study evaluated for the first time, the binding activity of merozoite surface protein 10 (PvMSP10) to adult human reticulocytes. It was found that PvMSP10 binds to human reticulocytes through the C-terminal region, whose polymorphism is low. Furthermore, by a protein-cell competition assay, it was determined that such interaction is governed by two regions of 20 residues in length (388DKEECRCRANYMPDDSVDYF407 and 415KDCSKENGNCDVNAECSIDK434), which are part of the EGF-like domains. These findings highlight the importance of these fragments to study their usefulness in a future vaccine against malaria caused by P. vivax. (Texto tomado de la fuente) Maestría Magíster en Ciencias - Microbiología Biología Molecular de Agentes Infecciosos

Este trabajo tuvo como objetivo identificar los alelos y haplotipos HLA-DRB1 y DQB1 relacionados con la persistencia, depuración y redetección de 6 tipos de VPH de alto riesgo (VPH-AR) (-16, -18, -31, -33, -45 y -58) en una cohorte de mujeres colombianas. A partir de muestras de cérvix de 276 mujeres, se realizó la tipificación de los loci DRB1 y DQB1 mediante el sistema MiSeq-Illumina. Se estimó la probabilidad de depuración y redetección en función del tiempo para cada uno de los 6 tipos de VPH-AR, con el método de Kaplan Meier. Se ajustaron modelos de supervivencia para identificar los alelos y haplotipos relacionados con la depuración y redetección teniendo en cuenta otras covariables. Se encontraron, para DRB1, 47 asociaciones (20 alelos), para DQB1, 6 asociaciones (3 alelos) y para los haplotipos, 87 asociaciones (34 haplotipos) con la depuración/persistencia de VPH. Con respecto a la redetección, 45 asociaciones de alelos DRB1 (23 alelos), 6 asociaciones para DQB1 (3 alelos) y 64 asociaciones, de 36 haplotipos, fueron identificadas. Se encontraron asociaciones tanto a favor como en contra de los eventos analizados, siendo algunas consistentes entre los tipos de VPH infectantes y otras diferentes. El efecto de los alelos y haplotipos de HLA sobre el curso clínico de las infecciones de VPH (depuración, persistencia y redetección viral) es dependiente del tipo de VPH responsable de la infección. El efecto independiente de algunos alelos fue consistente al configurar los haplotipos, mientras que para otros se observó una modificación del efecto. Abstract: The objective of this work was to identify HLA-DRB1 and DQB1 alleles and haplotypes related to the persistence, clearance and redetection of 6 high-risk HPV types (HR-HPV) (- 16, -18, -31, -33, - 45 and -58) in a cohort of Colombian women. From cervical samples of 276 women, DRB1 and DQB1 typing was performed using the MiSeq-Illumina system. The likelihood of clearance and redetection was estimated as a function of time for each of the 6 HR-HPV types with the Kaplan Meier method. Survival models were adjusted to identify alleles and haplotypes related to clearance and redetection, taking into account other covariates. We found, for DRB1, 47 associations (20 alleles), for DQB1, 6 associations (3 alleles) and for haplotypes, 87 associations (34 haplotypes) with clearance/persistence of HPV. With regard to redetection, 45 associations for DRB1 (23 alleles), 6 associations for DQB1 (3 alleles) and 64 associations for 36 haplotypes, were identified. Associations were found both in favor and against the events analyzed, with some being consistent between the infecting HPV types and others different. The effect of HLA alleles and haplotypes on the clinical course of HPV infections (clearance, persistence and viral redetection) is dependent on the HPV type responsible for the infection. The independent effect of some alleles was consistent when configuring the haplotypes, while for others a modification of the effect was observed. Maestría

La malaria causada por Plasmodium vivax es la segunda más prevalente a nivel mundial, siendo esta especie la responsable del 64% de los casos en las Américas. El desarrollo de una vacuna basada en subunidades hace parte de las estrategias de control de la enfermedad, sin embargo, debido a la dificultad en el cultivo continuo del parásito, el estudio de antígenos se ha visto retrasado. El uso de herramientas bioinformáticas y el estudio de proteínas homólogas a aquellas de Plasmodium falciparum, ha permitido el avance en la identificación de candidatos potenciales a vacuna. El objetivo del presente estudio es la identificación in silico de epítopes T de la proteína Pv12 (homóloga a Pf12) y estudiar su antigenicidad in vitro. Los epítopes seleccionados mediante el software NetMHCIIpan-3.1, el cual predijo su unión a alelos HLA-DRB1, fueron evaluados mediante ensayos de unión in vitro a moléculas HLA-DRB1. La antigenicidad de tres epítopes fue evaluada en células T CD4+ de individuos con previa exposición a malaria por P. vivax tipificados para el alelo HLA-DRB1. Los epítopes 39113 y 39117, de alta afinidad de unión a moléculas HLA-DRB1*04 y 1*11, así como a HLA-DRB1*07 y 1*13, respectivamente, fueron reconocidos por células T CD4+ de memoria, generando una respuesta proliferativa y una producción coordinada de TNF, IL-6 y IL-10, citoquinas que actúan como mediadores de la eliminación del parásito durante la infección. Debido a la respuesta antigénica observada para los epítopes, son propuestos como potenciales candidatos a ser incluidos en el desarrollo de una vacuna basada en subunidades contra P. vivax. Abstract: Plasmodium vivax is the second most prevalent parasite species causing malaria worldwide and is responsible for 64% of the cases in the Americas. The development of subunit-based vaccines is among the control strategies for the disease, however, due to the difficulty of culturing P. vivax in a continuous manner, the characterization of candidate antigens has been delayed. The use of bioinformatics tools and the quest for homologous proteins to those already found in Plasmodium falciparum have allowed the identification of new P. vivax potential vaccine candidates. The present study was aimed at identifying Pv12 (homologous to Pf12) protein’s T epitopes in silico and studying their antigenicity in vitro. The epitopes were selected using the NetMHCIIpan-3.1 software, which predicted their binding to HLA-DRB1 alleles and the high binding ones were subsequently evaluated by in vitro binding assays to purified HLA-DRB1 molecules. The antigenicity of these epitopes was evaluated in CD4+ T cells collected from individuals with previous exposure to P. vivax malaria typed for their HLA-DRB1 allele. Specific epitopes 39113 and 39117 that bound to HLA-DRB1*04 and 1*11, as well as HLADRB1*07 and 1*13, respectively were recognized by memory CD4+ T cells, generating a proliferative response and a coordinated production of TNF, IL- 6 and IL-10, cytokines that may mediate the elimination of the parasite during infection. Due to the antigenic response observed for the epitopes, they are here being proposed as potential candidates to be included in the development of a subunit-based vaccine against P. vivax. Maestría

[ES] La malaria es una de las enfermedades tropicales transmitidas por vectores más importantes a nivel mundial, donde Plasmodium vivax representa una de las especies más ampliamente distribuidas, afectando ~13.8 millones de personas por año. Pese a ello, el progreso aparentemente lento de la infección y los niveles bajos de parasitemia en el humano, comparados a lo reportado en Plasmodium falciparum, han llevado a clasificar a la infección por P. vivax erróneamente como benigna. Esto, sumado a los retos experimentales que trae consigo el cultivo de este parásito, obstaculizan en gran medida el conocimiento a nivel biológico, celular y molecular, necesario para el desarrollo de métodos de control efectivos contra P. vivax. Hoy en día, se conoce que un inadecuado diagnóstico, el mal manejo terapéutico y/o el retraso en el tratamiento, pueden llevar a recaídas y estados de enfermedad grave, similares a los reportados para la malaria producida por P. falciparum, lo que impone retos en la búsqueda de nuevas alternativas específicas contra esta especie. Teniendo en cuenta la necesidad de identificar posibles blancos terapéuticos contra P. vivax, este trabajo se enfocó en estudiar interacciones del tipo receptor-ligando y proteína-proteína de moléculas de P. vivax localizadas en los organelos apicales de esquizontes intraeritrocíticos. Basados en estudios previos en P. falciparum y Toxoplasma gondii, donde se describe la importancia funcional de las proteínas localizadas en el cuello de las roptrias (RONs) -2, -4 y 5 y del antígeno apical de membrana 1 (AMA1), se caracterizó en P. vivax la unión de cada una de estas proteínas con reticulocitos humanos y se evaluó la capacidad de PvRON2 para establecer interacciones con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Para esto, inicialmente se caracterizó mediante herramientas bioinformáticas y experimentales la presencia de los genes pvron4 y pvron5 en el genoma y transcriptoma de esquizontes de la cepa Vivax Colombia Guaviare 1 (VCG-1) de P. vivax. Estos dos genes codifican proteínas de alto peso molecular que se expresan en el polo apical de esquizontes y co-localizan con proteínas presentes en las roptrias. Para evaluar la capacidad de interacción de las proteínas PvRON2, PvRON4, PvRON5 y PvAMA1 con receptores sobre la membrana de reticulocitos humanos, todas ellas fueron producidas de forma recombinante y purificadas mediante cromatografía de afinidad. Se encontró que la proteína recombinante PvRON5 se unió tanto a normocitos como a reticulocitos CD71+, con una marcada preferencia por reticulocitos humanos. Por su parte, las proteínas recombinantes que incluyen los dominios I y II de PvAMA-1 (PvAMA-DI-DII), la región central de la proteína PvRON2 (PvRON2-RI) y la región carboxi-terminal de PvRON4, interactúan específicamente con reticulocitos CD71+CD45-. Los estudios de competencia de unión con péptidos sintéticos que cubren las secuencias de las proteínas recombinantes mostraron que los péptidos 21270 (derivado del DI de PvAMA1), 40305 (de PvRON4) y 40595 (de PvRON2-RI) fueron capaces de inhibir la unión de las proteínas recombinantes a reticulocitos CD71+CD45-, lo que sugiere que estas secuencias peptídicas contienen parte de las propiedades de unión de cada una de las proteínas de las que derivan. Los tres péptidos se unen específicamente y con alta afinidad a eritrocitos con porcentajes de unión mayores al 2% (obtenidas de las curvas de unión específica), permitiendo catalogarlos como péptidos con alta capacidad de unión a eritrocitos (HABPs, del inglés High Activity Binding Peptides). La unión de las proteínas PvAMA1 y PvRON4 a eritrocitos humanos fue sensible al tratamiento de los eritrocitos con diferentes enzimas (tripsina, quimotripsina y/o neuraminidasa), sugiriendo que la naturaleza de los receptores para estas proteínas es de tipo proteico. Estos resultados destacan la función de adhesina de las proteínas evaluadas y revelan las regiones mínimas de interacción con la célula hospedera, que sumado a la expresión de estas proteínas en esquizontes intraeritrocíticos y su localización en organelos apicales, sugieren una fuerte participación de estas moléculas durante el proceso de invasión de los merozoitos de P. vivax a reticulocitos humanos. Finalmente, mediante resonancia de plasmones de superficie, se caracterizaron las interacciones entre la proteína PvRON2 con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Los análisis revelaron que la región carboxi-terminal de la proteína PvRON2 (PvRON2-RII) y PvRON2-RI interactúan específicamente y con alta afinidad con el dominio II y III de PvAMA1 (PvAMA-DII-DIII) y con una menor afinidad con las proteínas PvAMA-DI-DII, PvRON4 y PvRON5. Al modificar algunos residuos de la proteína PvAMA1, reportados en P. falciparum como críticos en la interacción RON2-AMA1, no se encontraron diferencias importantes en los valores de las velocidades de asociación (Kon), disociación (Koff) y en la constante de disociación de la interacción (kD). Esto sugiere que, si bien existen interacciones proteína-proteína (IPP) conservadas entre estos parásitos (Pv-Pf), cada parásito utiliza distintas regiones de las proteínas para interactuar, lo que resalta su capacidad para especializarse o restringirse para invadir un tipo de célula específica y pone de manifiesto aún más la necesidad de diseñar medidas de control específicas contra P. vivax. [EN] Malaria is one of the most important tropical diseases transmitted by vectors worldwide; Plasmodium vivax represents one of the most widely distributed species (affecting ~ 13.8 million people worldwide per year). Despite this, the apparently slow progress of infection and low parasitaemia levels in humans compared to those reported in Plasmodium falciparum have erroneously led to P. vivax infection being classified as benign. Added to this, the experimental challenges involved in culturing this parasite greatly hinder accumulating the biological, cellular and molecular knowledge necessary for developing effective control methods against P. vivax. It is known nowadays that unsuitable diagnosis, poor therapeutic management and/or delayed treatment can lead to relapses and severe disease states similar to those reported for P. falciparum malaria, thereby imposing challenges regarding the search for new, specific, alternative approaches to tackling this species. The present work has been focused on studying receptor-ligand and protein-protein interactions of P. vivax molecules located in intra-erythrocyte schizonts’ apical organelles regarding the need for identifying therapeutic targets against P. vivax. Protein interaction with human reticulocytes was characterised in P. vivax and PvRON2 ability to establish interactions with PvRON4, PvRON5 and PvAMA1 was evaluated, based on previous P. falciparum and Toxoplasma gondii studies, describing the functional importance of rhoptry neck proteins. Work began by using bioinformatics and experimental tools for predicting pvron4 and pvron5 genes in the P. vivax VCG-1 (Vivax Colombia Guaviare 1) strain’s genome and schizonts transcriptome. These two genes encode high molecular weight proteins which are expressed at schizonts’ apical poles and co-localise with proteins in the rhoptries. Such proteins were produced recombinantly and purified by affinity chromatography for evaluating PvRON2, PvRON4, PvRON5 and PvAMA1 ability to interact with receptors on human reticulocyte membrane. Recombinant PvRON5 bound to both CD71+ normocytes and reticulocytes, having a marked preference for human reticulocytes. PvAMA1 domains I and II (PvAMA-DI-DII), PvRON2 central region (PvRON2-RI) and PvRON4 carboxy-terminal region specifically interacted with CD71+CD45- reticulocytes. Competition studies with synthetic peptides covering recombinant protein sequences showed that PvAMA1-derived peptide 21270, PvRON4-derived 40305 and PvRON2-RI-derived 40595, were capable of inhibiting recombinant protein binding to CD71+CD45- reticulocytes, suggesting that these peptide sequences contained some of the evaluated proteins’ binding properties. The three peptides bound specifically and with high affinity to erythrocytes having higher (2%) binding percentages (obtained from specific binding curves), thereby allowing their classification as high erythrocyte binding capacity peptides (HABPs). PvAMA1 and PvRON4 binding to human erythrocytes was sensitive to erythrocytes treatment with different enzymes (trypsin, chymotrypsin and/or neuraminidase), suggesting the receptors’ protein type nature. These results highlighted the adhesin function of the proteins evaluated and revealed minimum host cell interaction regions suggesting these molecules’ active participation during P. vivax merozoite invasion of human reticulocytes (along with these proteins’ expression in intra-erythrocytic schizonts and location in apical organelles). Surface plasmon resonance was used for characterising PvRON2 interactions with PvRON4, PvRON5 and PvAMA1. This revealed that PvRON2-RI and carboxy-terminal regions (PvRON2- RII) specifically interacted and with great affinity with PvAMA1 domain II and III (PvAMA-DIIDIII) but with less affinity with PvAMA-DI-DII, PvRON4 and PvRON5. No significant differences were found in interaction association (Kon) or dissociation (Koff) rates or dissociation constant (kD) values when modifying some PvAMA1 residues reported as being critical in the P. falciparum RON2-AMA-1 interaction, suggesting that although conserved interactions between these parasites (Pv-Pf) have been observed, each parasite uses different regions to interact, thereby highlighting their ability to specialise or restrict themselves to invading a specific cell type and the need for designing specific control measures against P. vivax.

Las proteínas tipo adhesinas son usadas por parásitos del género Plasmodium para unirse e invadir sus células diana. Por lo tanto, caracterizar las moléculas que participan en la interacción con los reticulocitos humanos es un punto clave para entender la base molecular del mecanismo de invasión utilizado por el parásito Plamodium vivax. Este estudio describe por primera vez la caracterización y la actividad de unión a reticulocitos del homólogo al Antígeno de Micronemas con Anclaje a GPI de Plasmodium falciparum (PfGAMA del inglés, GPI-Anchored Micronemal Antigen) en la cepa VCG-I de P. vivax. El gen pvgama se transcribe en esquizontes de la cepa VCG-I de P. vivax, codifica para una proteína de 771 aa la cual está compuesta de un péptido señal, una secuencia de anclaje a GPI y una región repetitiva exclusiva de la especie. PvGAMA se expresa en esquizontes maduros, presenta un patrón de localización apical y desencadena una respuesta antigénica durante una infección natural por P. vivax. Dos regiones conservadas de la proteína presentan actividad de unión a reticulocitos con fenotipo duffy Fya-Fyb+. Este estudio describe la caracterización funcional y antigénica de GAMA en P. vivax. La proteína es altamente antigénica y está compuesta por dominios de unión que interactúan con reticulocitos humanos. Estos hallazgos sugieren que PvGAMA tiene un importante papel como adhesina en merozoitos de P. vivax. Abstract. Adhesin proteins are used by Plasmodium parasites to bind to and invade target cells. Hence, characterizing such molecules or part of them participating in human reticulocyte interaction is a key point for understanding the molecular basis of Plasmodium vivax mechanism invasion. This study thus describes for the first time the characterization and the reticulocyte binding activity of the new homologous protein to Plasmodium falciparum GPI-Anchored Micronemal Antigen in the Plasmodium vivax VCG-I strain. The pvgama gene was transcribed in P. vivax VCG-I strain schizonts, encoding 771 amino acids which include a secretion signal, a GPI-anchor site and a repeat region exclusive to the species. PvGAMA was expressed on mature schizonts, had an apical localization pattern and could trigger an antigen response during natural infection. Two conserved regions of the protein displayed reticulocyte binding activity to cells having the Fya-Fyb+ duffy phenotype. This study describes the functional and antigenic characterization of GAMA in P. vivax. The protein is highly antigenic and is composed of binding domains that interact with human reticulocytes. These findings suggest that GAMA plays an important role as adhesin in merozoites of P. vivax. Maestría

Las interacciones hospedero-patógeno y la formación de complejos macromoleculares durante el proceso de invasión de los parásitos Apicomplexa a sus células hospederas, representan un blanco de acción importante para el diseño de métodos de control contra estos microorganismos. En Plasmodium vivax, el conocimiento acerca de la biología y de las funciones de las protemas e interacciones que ocurren durante el proceso de invasión es escaso debido a la difícil propagación del parásito in vitro. En este esñidio se evaluó si las protemas RON-2. -4 y AMA-1 de P. vivax tienen la capacidad de interactuar con reticulocitos humanos. Así mismo, se evalúo si existen interacciones binarias entre las proteínas RON2. -4. -5 y AMA-1 que puedan asociarlas como un complejo proteico como ha sido sugerido para P. falciparitm. Para las interacciones receptor-ligando se encontró que los fragmentos PvAMA-DI-IL PvR0N2-RI. PvR0N2-RII y P\ R0N4 se unen a reticulocitos CD71+. De particular interés, se encontró que el dominio I de PvAMA-1 contiene una región de 20 residuos responsable de la interacción específica y de alta afinidad con receptores de reticulocitos C'D71+. Por otro lado, mediante la técnica ELISA, se encontraron interacciones relevantes entre el fragmento rPvAMA-DII-III con rPvRON2-RI. 1P1RON2-RH y rPvRON4, y entre la proteína rPvRON5 con los fragmentos de PvRON2. Estos resultados representan un avance en el conocimiento biológico de P. vivax y sugiere la participación de algunas regiones de estas proteínas en interacciones hospedero-patógeno y proteina-proteína que pueden ser esenciales para la búsqueda de métodos de control específicos contra esta especie parasitaria. Host-pathogen interactions and macromolecular complex formation during Apicomplexa parasite invasion of their host cells represents an important action target for designing methods for controlling these microorganisms. Knowledge regarding the biology and functions of proteins and interactions occurring dining invasion is scarce regarding Plasmodium vivax due to the difficulty of propagating the parasite in vitro. This study was thus aimed at evaluating P. vivax RON-2, -4 and AMA-1 proteins, bearing in mind then capability for niteracting with human reticulocytes. An attempt was also made to ascertain whether binary interactions between R0N2. -4. -5 and AMA-1 proteins could be associated with a protein complex, as has been suggested for P. falciparum. Concerning receptor-ligand interactions, it was found that PiAMA-DI-II. PvR0N2-RI. PvR0N2-RII and P1R0N4 fragments bound to CD71+ reticulocytes. It was particularly interesting to find that Pi AMA-1 domain I contained a 20 residue-long region responsible for specific, high affinity interaction with CD71+reticulocyte receptors. ELISA revealed relevant interactions between the rPvAMA-DII-III fragment and iPi RON2-RI. rPiRON2-RII and rPrRON4 and between rPi RON5 and Pi RON 2 fragments. These results represent an advance regaiding knowledge concerning P. vivax biology and suggest the participation of some of these proteins’ regions in host-pathogen and protein-protein interactions which might be essential regarding the search for specific control methods against this parasite species. Magíster en Ciencias Biológicas Maestría

Tesis por compendio de publicaciones, [EN] Identifying and characterising proteins which use Plasmodium merozoites to invade host cells represents an important strategy for developing a method for controlling these parasites. However, basic P. vivax research has been delayed due to difficulties in propagating it in vitro as the parasite prefers to invade reticulocytes; there is a low percentage of these in adult human peripheral blood (1%-2%) and they are difficult to obtain with high purity, in a sufficient amount and totally viable. Consequently, knowledge is scarce regarding the amount of molecules being expressed by P. vivax and which of them represent good candidates for inclusion in an effective vaccine. This study has been aimed at evaluating the proteome of a primate-adapted P. vivax strain; antigenic molecules able to bind to human reticulocytes have been characterised. Analysing the P. vivax VCG-1 strain proteome led to detecting 734 proteins, some of them essential in key steps for establishing merozoite invasion of target cells. Furthermore, 811 A. nancymaae primate erythrocyte components (vital Plasmodium hosts) were identified; 51 of them were integral membrane proteins, 7 described as Plasmodium receptors. The presence, transcription, expression and antigenicity of genes encoding three P. vivax molecules (PvARP, PvRBSA and PvGAMA) were identified. Particularly interesting was the finding that a higher percentage of PvRBSA and PvGAMA bound to reticulocytes abundantly expressing the CD71 receptor (CD71hi), thereby suggesting that these molecules could be participating in P. vivax merozoite preferential selection for human reticulocytes. This the first study in Colombia which has determined the protein composition of a primate-adapted P. vivax strain as well as A. nancymaae erythrocytes. More importantly, P. vivax molecules were characterised which appear to be suitable candidates for being evaluated as components of a vaccine against malaria caused by the parasite species., [ES] La identificación y caracterización de proteínas que utilizan los merozoitos de Plasmodium para invadir a su célula hospedera, representan una estrategia importante para desarrollar un método de control contra estos parásitos. A pesar de ello, la investigación básica en P. vivax está retrasada por su difícil propagación in vitro, debido a la preferencia que tiene el parásito por invadir reticulocitos, los cuales se encuentran en escaso porcentaje en sangre periférica de humanos adultos (1-2%) y son difíciles de obtener con alta pureza, en suficiente cantidad y totalmente viables. Como consecuencia de lo anterior, el conocimiento del número de moléculas que expresa P. vivax y cuáles de ellas son candidatas para componer una vacuna, es escaso. En este estudio, se evaluó el proteoma de una cepa de P. vivax adaptada a primates y se caracterizaron moléculas antigénicas y con capacidad de adhesión a reticulocitos humanos. En el análisis del proteoma de la cepa VCG-1 de P. vivax, se detectaron 734 proteínas, algunas esenciales en los pasos clave para establecer la invasión del merozoito a su célula diana. Además, se identificaron 811 componentes de eritrocitos (hospederos vitales de Plasmodium) del primate A. nancymaae, de los cuales 51 son proteínas integrales de membrana, 7 descritas como receptores de Plasmodium. Por otro lado, se identificó la presencia, transcripción y expresión de los genes codificantes de tres moléculas de P. vivax: PvARP, PvRBSA y PvGAMA, así como su antigenicidad. De particular interés, se encontró que PvRBSA y PvGAMA se unen en mayor proporción a reticulocitos que expresan el receptor CD71 de forma abundante (CD71hi), lo que sugiere que estas moléculas pueden estar participando en la selección preferencial que tienen los merozoitos de P. vivax por los reticulocitos humanos. Este es el primer estudio en Colombia donde se determina la composición proteica de una cepa de P. vivax adaptada a primates, así como la de eritrocitos de A. nancymaae. Como resultado más importante, se caracterizaron moléculas de P. vivax que son candidatos idóneos a ser evaluados como componentes de una vacuna contra la malaria causada por esta especie parasitaria.

87 páginas In this research, advanced control strategies were designed under the Active Disturbance Rejection Control (ADRC) approach to increase the biomass production in microalgae cultures. For the above, from a control frame of reference, the development was envisaged into two stages, control and optimization. The first stage resulted in three different controllers designs: two ADRC strategies assisted by observer and a Model-Free Control (MFC). In each case, the aim was to guarantee the tracking of the reference signal. In the second stage, the design of two optimization strategies were achieves to increase the biomass production, offline and on-line. Comparing, at a simulation level, these strategies with other existing proposals, the following was found: 1) the ADRC strategies assisted by observer had a few dependence on the model, letting us to work with an approximate model that only required knowing of the system order and the input gain; 2) the off-line optimization, despite maximizing the biomass production, required knowing the model and 3) the proposal that combines MFC with on-line optimization, may act on any microalgae culture since it does not need a model. All the proposals are robust front to disturbances and variation of parameters allowing to increase the biomass production when an optimization strategy is used. La malaria es una de las enfermedades infecciosas más prevalentes y mortales a nivel mundial. Cinco especies de Plasmodium (protozoario intracelular obligado del filo Apicomplexa) infectan al humano, siendo Plasmodium falciparum la especie responsable de las manifestaciones clínicas más severas, con amplia distribución en las zonas tropicales y subtropicales del África Subsahariana. Según los estimados de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en el año 2010 se presentaron alrededor de 216 millones de casos de malaria y cerca de un millón de muertes, principalmente de niños menores de 5 años. Esta cifra se ha incrementado en los últimos años, luego de la aparición de variantes del parásito que son resistentes a drogas antimaláricas y por la resistencia a los insectidas por parte del mosquito. Es por lo tanto urgente el desarrollo de medidas de control efectivas que permitan la erradicación de esta parasitosis. Doctorado en Biociencias Doctor en Biociencias

[ES]La infección causada por Fasciola hepatica es una trematodosis ampliamente distribuida en el mundo, causando importantes pérdidas económicas a nivel veterinario. Se estima que hay 17 millones de personas infectadas y que entre 91 a 170 millones de personas residen en zonas con posibilidad de adquirir la enfermedad. El triclabendazol continúa siendo el fármaco de elección para el tratamiento de la fasciolosis tanto a nivel veterinario como en humanos. La aparición de estirpes resistentes al triclabendazol hacen que la vacunación sea una prioridad para la prevención de la enfermedad. En el presente estudio, realizamos una búsqueda de todas las proteínas de Fasciola hepatica que se encontraban descritas en el servidor web del Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI). Una vez obtenidas la secuencia de aminoácidos de las proteínas encontradas, seleccionamos aquellas que presentaban péptido señal y ausencia de regiones transmembrana. A partir de su secuencia de aminoácidos y haciendo uso de las herramientas de bioinformática BepiPred y SYFPEITHI diseñamos 12 péptidos con epítopos B y 12 péptidos con epítopos T, los cuales fueron sintetizados químicamente empleando una metodología de síntesis de péptidos en fase sólida. Los estudios in vitro utilizando macrófagos peritoneales de ratón mostraron que los péptidos sintéticos no presentan citotoxicidad en el rango de concentraciones utilizadas en este estudio. Estudiamos la respuesta inmunológica inducida en ratones BALB/c inmunizados con los péptidos sintéticos utilizando el sistema ADAD de vacunación, previamente descrito y utilizado en nuestro grupo de investigación. Analizamos la producción de anticuerpos de los tipos IgG, IgG1, IgG2a, IgE e IgM en diferentes tiempos durante el procedimiento de inmunización, comparando el efecto tanto de los péptidos (B o T) como del inmunomodulador utilizado (AA0029 o PAL). Evaluamos los niveles de citocinas de los tipos Th1, Th2, Treg y Th17 en sobrenadantes de cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos, así como cambios en los niveles de subpoblaciones de linfocitos B y T y subpoblaciones linfocitarias asociadas a la generación de memoria inmunológica. Aplicando un análisis estadístico univariante y multivariante seleccionamos los péptidos denominados B1, B2, B5, B6, T14, T15 y T16 que pertenecen a proteínas de amebaporo y catepsina B de F. hepatica. Además, el análisis estadístico demostró que el uso del imunomodulador AA0029 induce, en general, una respuesta inmunológica más potente que el inmunomodulador PAL. Para los estudios de protección, los péptidos fueron administrados individualmente y, de acuerdo al tipo de respuesta inmunológica inducida, se realizaron combinaciones de los péptidos. Cuando los ratones inmunizados fueron infectados con metacercarias de F. hepatica, obtuvimos diferentes niveles de protección medidos como porcentaje de supervivencia, recuperación de vermes y magnitud del daño hepático. La inmunización de ratones con la combinación de los péptidos T14, T15 y T16 produjo una supervivencia del 71,4%, así como una reducción significativa en el número de vermes y en la magnitud de las lesiones hepáticas. Estos datos indican que el uso de múltiples antígenos es necesario para obtener mejores resultados de protección. Finalmente, analizamos el transcriptoma en esplenocitos de ratones inmunizados con dicha combinación de péptidos mediante la tecnología de microarrays de Affymetrix, encontrando que la inmunización aumenta la expresión de genes implicados en rutas de señalización sobre producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno, así como de rutas de señalización de Il-12 e IL-8. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el uso de péptidos sintéticos procedentes de diferentes moléculas del parásito pueden ser posibles candidatos vacunales contra la fasciolosis causada por F. hepatica. Sin embargo, futuros estudios de inmunización en modelos naturales de fasciolosis deben ser realizados para validar nuestros resultados.

En el desarrollo y progresión de Cáncer de Cérvix (CC), además de la infección con Virus de Papiloma Humano (VPH), existen factores asociados como la inmunosupresión ocasionada por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH). Los programas de prevención de CC basados en la citología, presentan limitaciones que han llevado a explorar muestras alternativas como la de orina. El objetivo de este trabajo fue determinar las frecuencias de infección y distribución tipo-especifica de VPH en cérvix y orina en mujeres VIH positivas, y establecer sus características operativas. Se determinó una alta prevalencia de infección por VPH (70,1% en cérvix y 63,9% en orina), siendo el tipo VPH-16 el más prevalente en los dos tipos de muestra. Las características operativas de las dos fuentes de muestra fueron comparables. Adicionalmente, se encontró una asociación positiva entre anormalidad cervical y la detección viral en orina. En conclusión, la detección de VPH en muestra de orina es una herramienta que contribuye en el mejoramiento de los programas de tamización cervical, por su economía, practicidad, aceptabilidad y características operativas similares a las ofrecidas por la muestra cervical. Abstract: In addition to the infection with Human Papillomavirus (HPV), other factors are associated with the development and progression of Cervical Cancer (CC), such as the immunosuppression caused by the Human Immunodeficiency Virus (HIV). The CC prevention programs based on cytology have certain limitations that have led to explore alternative sample sources, such as urine. This study aimed at determining the frequency of infection and type-specific distribution of HPV in cervical and urine samples from HIVinfected women, and to determine the operative characteristics. High prevalence of HPV infection was found (70.1% in cervical and 63.9% in urine samples, respectively); HPV-16 was the most prevalent viral type in both sample sources, being the operating characteristics of them comparable. Positive association was found between cervical abnormalities and viral detection in urine. In conclusion, the detection of HPV in urine might become a useful tool to improve cervical screening programs due to its low cost, ease to obtain, acceptability and operational characteristics similar to those offered by the cervical sample. Maestría

ilustraciones, graficas Las infecciones por Clamydia trachomatis (Ct) se encuentran dentro de las más comunes transmitidas sexualmente y de mayor impacto en la salud pública; la tasa de infección bacteriana descrita para este microorganismo es variable según según la región geográfica y la población de estudio. En los ultimos años se han desarrollado estudios que permiten ampliar la información sobre efectos de los alelos HLA en el curso clínico de las infecciones por Ct; algunos de ellos han permitido establecer la relación directa entre la enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) con el HLA-A31 y la presencia de Ct. A su vez, se ha encontrado que alelos como DQA1*0401 y DQB1*0402 presentan una asociación significativa y al mismo tiempo una alta prevalencia en infecciones por Ct. En algunas poblaciones de mujeres se encontró la presencia de alelos DRB1 y DQB1 y una relación directa con la presencia de Ct y la infertilidad tubárica. Las infecciones causadas por Ct y su interacción con el sistema inmune aún son tema de estudio, uno de los métodos que permite el análisis esta interacción son los modelos murinos. Algunos estudios en estos modelos han permitido demostrar que los linfocitos T CD8+ son indispensables en la resolución de las infecciones por Ct; no obstante, los linfocitos T CD4+ y los alelos HLA clase II han sido asociados con la respuesta inmune frente al patógeno. Diversas hipótesis han comprobado que las células epiteliales infectadas pueden presentar conjuntos alélicos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II superpuestos, promoviendo así la inmunidad protectora hacia Ct. Es así como conocer los genes de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) que se relacionan con patologías derivadas de las infecciones por Ct, permite evaluar la respuesta inmune de los hospederos. Algunos análisis realizados en poblaciones de adolescentes mostraron que existen variantes alélicas que se relacionan con la presencia de Ct; sin embargo, las asociaciones entre los alelos HLA-II y las infecciones por Ct han sido pobremente exploradas. En este contexto, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto de los alelos y haplotipos HLA DRB1-DQB1 6 sobre el resultado de la infección, persistencia, depuración y reinfección por Ct en una cohorte de mujeres colombianas. Las muestas de este estudio corresponden a una cohorte bidireccional (prospectiva y retrospectiva); para el análisis prospectivo, se contó con muestras cervicales recolectadas entre los años 2007 y 2010 en centros hospitalarios de tres ciudades colombianas: Hospital San Juan Bautista en la ciudad de Chaparral en el departamento del Tolima; el Nuevo Hospital San Rafael en Girardot en Cundinamarca y el Hospital de Engativá Nivel II, en Bogotá, capital de Colombia; el objetivo de ese estudio fue determinar la historia natural de la infección por el virus de papiloma humano (VPH). Para desarrollar el presente estudio, se establecieron como criterios de inclusión la disponibilidad de la muestra cervical para el análisis de HLA- DRB1 y DQB1, mujeres que contaran con al menos cuatro seguimientos (visitas) y una periodicidad entre las visitas de 6 meses (± 3 meses), con el fin de determinar los efectos de los alelos y haplotipos HLA relacionados con los distintos eventos promovidos por Ct. Las muestras que cumplieron con los criterios de inclusión fueron sometidas a detección de Ct, ésta se llevó a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con sets de cebadores dirigidos hacia el ORF2 del plásmido críptico de Ct, amplificando los cebadores KL5/KL6 un fragmento de 350 pb y los cebadores KL1/KL2 un fragmento de 241 pb. La tipificación de los alelos HLA se realizó por NGS (de la sigla en inglés, Next Generation Sequencing) a partir de los exones 2 y 3 de los loci DRB1-DQB1 (resolución 3x) a través de la plataforma Illumina MiSeq. Como análsis adicional, a través del uso de herramientas inmunoinformáticas, se predijeron péptidos de proteínas derivadas de las serovariantes de Ct, seleccionadas para la evaluación de péptidos con alta actividad de unión a los alelos HLA-DRB1 y DQB1. Modelos proporcionales de Cox se llevaron a cabo con el fin de evaluar la relación alelos y haplotipos HLA-DRB1 y DQB1 y el desenlace de las infecciones por Ct; estos modelos fueron ajustardos por variables sociodemográficas y factores de 7 riesgo. Esto permitió establecer la probabilidad de desarrollar los distintos eventos presentados por Ct en función del tiempo y sus coeficientes se expresaron como tasa de riesgo (HR, de la sigla en inglés Hazard ratio), aquellos valores por debajo de 1 se interpretaron como una menor probabilidad de ocurrencia del evento, mientras que los valores por encima de 1 se asociaron con una mayor probabilidad de ocurrencia del evento. Adicionalmente, se estimó el supuesto de riesgos proporcionales con tests basados en los residuos de Schoenfeld, cuando no se cumplieron los supuestos de proporcionalidad, se corrieron modelos paramétricos (Lognormal, Log-logistic, Weibull y Gompertz), los valores por debajo de 1 se relacionaban con una ocurrencia mas temprana del evento, mientras que los coeficientes por encima de 1 indicaban una ocurrencia tardía del evento. Un total de 262 mujeres se incluyeron en el análisis retrospectivo, la media de edad fue de 41,7 años (DE= 23,1), un 29,8% (n=78) de las mujeres iniciaron el estudio con infección por Ct y un 8,9% presentaron al inicio del estudio alguna anormalidad cervical reportada por la citología. En cuanto a los alelos HLA-DRB1, se identificaron dieciséis alelos que presentan un efecto varible sobre el desenlace de las infecciones por Ct. Se observó que DRB1*08:02:01G y DRB1*12:01:01G se relacionaron con eventos que promueven la infección. Solo se encontró el alelo DQB1 *05:03:01G relacionado con eventos de depuración/persistencia para HLA-DQB1. Los sujetos homocigotos para HLA-DRB1 se asociaron a eventos con menor probabilidad de depuración y una aparición temprana de la persistencia. En cuanto a los haplotipos HLA DRB1-DQB1, se identificaron 47 con asociaciones relacionados con los eventos de Ct. Se encontraron 17 haplotipos que favorencían los eventos de infección (probabilidad ó una ocurrencia temprana); 11 haplotipos se asociaron con una ocurrencia tardía de los eventos de infección. Para depuración, 3 haplotipos favorencían su ocurrencia temprana, mientras que 1 presentó menor probabilidad. En cuanto a la reinfección, se relacionaron 8 haplotipos con un un efecto favorable (mayor probabilidad u ocurrencia temprana). Finalmente, se encontraron 9 haplotipos que presentaban una asociación a más de un evento. 8 Como resultado adicional, se realizó la predicción de epítopes con fuerte unión predicha a alelos HLA-DRB1-DQB1. Los resultados mostraron la predicción de 109 pétidos, de los cuales 27 podrían estar asociados a inmunidad protectora frente a Ct; aquellos derivados de las proteínas OMP y PMP exhibieron regiones con doble potencial para ser un epítope de células T o B. Gran parte de las infecciones por Ct cursan de forma asintomática, por lo que estudios epidemiológicos aportan al conocimiento del impacto de las Infecciones de Transmisión Sexual (ITS) en la salud sexual femenina. Aquí describimos por primera vez los alelos y haplotipos HLA-DRB1 y DQB1 relacionados con la resolución de las infecciones por Ct y los péptidos potencialmente involucrados en la respuesta inmune del hospedero. La información obtenida proporciona datos de base para el futuro desarrollo de medidas de promoción y prevención eficaces contra las infecciones por Ct. (Texto tomado de la funte) HLA class II (HLA-II) genes’ polymorphism influences the immune response to Chlamydia trachomatis (Ct), it is considered a sexually transmitted infection. However, associations between HLA-II alleles and Ct-infection have been little explored in humans; this study was thus aimed at determining HLA-DRB1-DQB1 alleles/haplotypes’ effect on Ct-infection outcome in a cohort of Colombian women. Cervical sample DNA was used as template for detecting Ct by PCR and typing HLA-DRB1-DQB1 alleles/haplotypes by Illumina MiSeq sequencing. Survival models were adjusted for identifying the alleles/haplotypes’ effect on Ct-outcome; bioinformatics tools were used for predicting secreted bacterial protein T- and B-cell epitopes. Sixteen HLA-DRB1 alleles having a significant effect on Ct-outcome were identified in the 262 women analysed. DRB1*08:02:01G and DRB1*12:01:01G were related to infection-promoting events. Only the DQB1*05:03:01G allele related to clearance/persistence events was found for HLA-DQB1. HLA-DRB1 allele homozygous women were associated with events having a lower probability of clearance and/or early occurrence of persistence. Twentyseven peptides predicted in silico were associated with protective immunity against Ct; outer membrane and polymorphic membrane protein-derived peptides had regions having dual potential for being T- or B-cell epitopes. This article describes HLA-DRB1-DQB1 alleles/haplotypes related to Ct-infection resolution and the peptides predicted in silico which might probably be involved in host immune response. The data provides base information for developing future studies leading to the development of effective prevention measures against Ct-infection. Maestría Magíster en Ciencias - Microbiología Epidemiología Molecular