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[ES] El cáncer de mama triple negativo (CMTN) y el cáncer de ovario seroso de alto grado (COSAG) son dos subtipos de cáncer con mayor mortalidad en las mujeres. Tanto el cáncer de seno como el de ovario son altamente heterogéneos y presentan diversa morfología y respuesta al tratamiento. No obstante, estos subtipos de cáncer comparten características moleculares, como las mutaciones de p53 (mayor del 70% en ambos) y la sobreexpresión de aurora quinasas (AURKA) (entre un 20-50%). Las Aurora quinasas (AURKA, AURKB y AURKC) son enzimas reguladoras que participan en la segregación cromosómica durante el proceso de mitosis. Por otra parte, p53 actúa como un supresor tumoral restringiendo el crecimiento de las células que albergan irregularidades genómicas. Además, existe una regulación recíproca entre AURKA y p53. Las mutaciones genéticas de p53 y AURK contribuyen al desarrollo del cáncer al inducir la inestabilidad genómica y al mejorar la proliferación, supervivencia, migración e invasión de las células cancerosas. Debido a la agresividad y la falta de una terapia efectiva para COSAG y CMTN, es necesario estrategias de tratamiento alternativas. Una estrategia empleada en los últimos tiempos es la utilización de fármacos que reconstruyan la función normal de p53. APR-246 (PRIMA-1MET) es el primer componente en fase clínica que restaura la proteína mutante p53 e induce la apoptosis. El tratamiento combinado de APR-246 y compuestos basados en platino podría permitir mejorar la terapia de tumores portadores de mutaciones en p53. Por tanto, nos planteamos analizar el efecto de un tratamiento combinado con APR-246 y carboplatino sobre la viabilidad de líneas cancerígenas de CMTN y COSAG a través de la vía AURK-p53., [EN] Triple-negative breast cancer (TNBC) and high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) are subtypes of cancer with a high mortality in women. Both breast cancer and ovarian cancer are heterogeneous diseases, manifesting several morphology and response treatments. Therefore, these cancer subtypes share molecular characteristics, as p53 mutations (over 70 % in both) and aurora kinase overexpression (AURKA) (between 20-50 %). Aurora Kinases (AUKA, AURKB and AUKC) are regulatory enzymes of mitosis essential for accurate and equal chromosomic segregation. On the other hand, p53 acts like a tumoral suppressor blocking the growth of cells with genomic abnormalities. Recent findings reveal the existence of a regulatory feedback loop between ARKA and p53. Mutations in these genes contribute to the tumorigenesis inducing genomic instability and increasing proliferation, survival, migration and evasion of cancer cells. Due to the aggressiveness and the lack of an effective therapy, alternative strategies of TNBC and HGSOC treatments are necessary. A strategy used in the last years is to employ compounds that restore the normal function of p53. APR-246 (PRIMA-1MET) is the first compound in the clinical-stage that reactivates mutant p53 protein and induces apoptosis. Combined treatment with APR-246 and platinum-based drugs could allow improved therapy of p53 mutant tumors. In this study, we are investigating the combined treatment effect of APR-246 and carboplatin over the Aurora kinase-p53 pathway and cell viability in TNBC and HGSOC cell lines.

[ES] El SARS-CoV-2 (¿severe acute respiratory syndrome coronavirus 2¿) es el agente causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que ha provocado una pandemia sin precedentes en todo el mundo. El gran genoma de ARN de SARS-CoV-2 contiene la información de varias proteínas accesorias. Aunque estos pequeños ORF no son estrictamente necesarios para la infección o la replicación viral, se cree que desempeñan papeles importantes en la modulación de las funciones biológicas de las células huésped, como la respuesta al estrés o la apoptosis. Aquí investigamos las funciones biológicas de tres de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2, ORF3a, ORF6 y ORF7a en levadura como modelo celular. Construiremos un conjunto de plásmidos para la expresión constitutiva e inducible por galactosa de cada proteína viral, tanto en un número bajo como en un alto número de copias. Las fusiones de las proteínas ORF con el epítopo flag o con GFP permitirán su detección inmunológica en extractos de levadura o su localización intracelular por microscopía de fluorescencia confocal. Los experimentos de tinción conjunta con núcleos, vacuolas, retículo endoplásmico o mitocondrias revelarán aún más los sitios intracelulares de acción de estas proteínas. El efecto de la sobreexpresión de cada ORF sobre la viabilidad, proliferación, adaptación al estrés y muerte celular apoptótica se cuantificará para las diferentes dosis. En conjunto, desarrollaremos herramientas moleculares para estudiar las funciones biológicas de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 para comprender mejor cómo estas proteínas manipulan las funciones internas de las células huésped., [EN] : The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the causative agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19), which has caused an unprecedented pandemic all over the world. The large RNA genome of SARS-CoV-2 contains the information of several accessory proteins. Although these small ORFs are not strictly needed for viral infection or replication, they are thought to play important roles in the modulation of the host cells biological functions such as the stress response or apoptosis. Here we investigate the biological functions of three of the SARS-CoV-2 accessory proteins, ORF3a, ORF6 and ORF7a in yeast as the cellular model. We will construct a set of plasmids for the galactose-inducible and constitutive expression of each viral protein, both at low copy and high copy number. Fusions of the ORF proteins with the flag epitope or with GFP will allow their immunological detection in yeast extracts or their intracellular localization by confocal fluorescence microscopy. Co-staining experiments with nuclei, vacuoles, endoplasmic reticulum or mitochondria will further reveal the intracellular sites of action for these proteins. The effect of ORF overexpression on viability, proliferation, stress adaptation and apoptotic cell death will be quantified for the different ORF doses. Taken together, we will develop molecular tools to study the biological functions of SARS-CoV-2 accessory proteins to better understand how these proteins manipulate the host cells internal functions.

[ES] El virus de las venas amarillas del pimiento 5 (PeVYV-5), un virus con genoma de RNA de simple cadena y polaridad positiva perteneciente al género Polerovirus (familia Luteoviridae), fue detectado por primera y única vez en nuestro país en 2013. Este virus está estrechamente relacionado con al menos diez especies virales (englobadas bajo el acrónimo PeVYV seguido por un número) descritas en distintas partes del mundo, una diversificación que parece haber sido el resultado de mutaciones y/o recombinaciones, fenómenos frecuentes en virus de RNA y, de forma remarcable, en polerovirus. A pesar de que cualquiera de estos virus constituye una amenaza importante para el cultivo de Capsicum spp., desde la detección del PeVYV-5 y posterior secuenciación de su genoma en 2018, no hay más datos publicados sobre la presencia y/o variabilidad de este virus (o de cualquier otro PeVYV) en España. Recientemente, se han vuelto a observar los síntomas asociados al PeVYV en plantas de pimiento crecidas en invernaderos de Almería. En este trabajo se ha pretendido determinar si dichas plantas estaban, efectivamente, infectadas por PeVYV y, en tal caso, por qué especie concreta. Mediante hibridación molecular con sondas no radioactivas y RT-PCR se ha podido constatar la presencia del PeVYV-5 en algunas de ellas. Un análisis de la distribución y acumulación de este virus en plantas infectadas ha mostrado que los frutos presentan una carga viral superior a la de los peciolos, los pedúnculos de frutos y/o las hojas. La comparación de secuencias derivadas de dos regiones del genoma de los aislados del PeVYV-5 identificados en este trabajo, ha mostrado una heterogeneidad molecular considerable tanto a nivel nucleotídico como aminoacídico, lo que subraya la gran capacidad evolutiva de este patógeno., [EN] The Pepper vein yellows virus 5 (PeVYV-5), a virus with a single-stranded RNA genome and positive polarity belonging to the genus Polerovirus (Luteoviridae family), was detected for the first and only time in our country in 2013. This virus is closely related to at least ten viral species (included under the acronym PeVYV followed by a number) described in different parts of the world, a diversification that seems to have been the result of mutations and/or recombinations, frequent phenomena in RNA viruses and, remarkably, in polerovirus. Despite the fact that any of these viruses constitutes an important threat to the cultivation of Capsicum spp., since the detection of PeVYV-5 and subsequent sequencing of its genome in 2018, there are no more published data on its presence and/or variation of this virus (or any other PeVYV) in Spain. Recently, the symptoms associated with PeVYV have been observed again in pepper plants grown in greenhouses in Almería. In this work we have tried to determine if these plants were, indeed, infected by PeVYV and, if so, by which specific species. By means of molecular hybridation with non-radioactive probes and RT-PCR it has been possible to verify the presence of PeVYV-5 in some of them. An analysis of the distribution and accumulation of this virus in infected plants has shown that the fruits present a viral load higher tan that of the petioles, fruit peduncles and/or leaves. The comparison of sequences derived from two regions of the genome of the PeVYV-5 isolates identified in this work has shown considerable molecular heterogeneity both at the nucleotide and amino acid levels, which underlines the great evolutionary capacity of this pathogen.

[ES] La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos modelos que más se usan en Biotecnología y Biomedicina. De hecho, fue el primer eucariota en ser completamente secuenciado. Gracias al avance en secuenciación masiva, se han ido obteniendo cada vez más genomas completos, y se han ido aclarando fenómenos evolutivos complejos. De hecho, en los últimos diez años se ha puesto de manifiesto la importancia que juegan la duplicación génica en la emergencia de nuevas funciones. Saccharomyces cerevisiae es una de las especies de levaduras que se originaron tras un evento de hibridación entre especies hace unos 100 millones de años, que requirieron de una duplicación genómica para volver a ser fértiles. Sin embargo, tras esta duplicación genómica se produjo una rápida reducción del genoma, persistiendo actualmente el 30% del genoma en estado duplicado. Cuáles son los mecanismos moleculares que determinan qué genes se mantienen en duplicado y cuáles no, es uno de los retos que se ha intentado explicar en los proyectos de investigación BFU2015.66073-P y SEJI2018-074. En estos proyectos se ha puesto de manifiesto que el nivel transcripcional de los genes influye en su retención como duplicados, pero tras este largo tiempo evolutivo, se han acumulado mutaciones en cada una de las copias, que ha llevado a una divergencia de secuencia y divergencia funcional que puede estar tras el fenómeno de innovación funcional. Dentro de estos proyectos de investigación se ha generado un conjunto de líneas, procedentes de un ensayo de evolución experimental en que la levadura S. cerevisiae cepa Y06240 se ha sometido a pases diarios aplicando un cuello de botella del 1% en la fase de diversificación (100 pases), y posteriormente, se han generado líneas adaptadas a distintos estreses aplicando un cuello de botella del 10% de la población (durante otros 100 pases). En este TFG se va a: i) estudiar cómo responden estas levaduras evolucionadas ante el estrés oxidativo producido por e, [EN] The yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the most widely used model organisms in Biotechnology and Biomedicine. In fact, it was the first eukaryote to be fully sequenced. Thanks to the advance in massive sequencing, more and more complete genomes have been obtained, and complex evolutionary phenomena have been clarified. In fact, during the past ten years several researchers have shown the importance of gene duplication in the emergence of new functions through the tree of Life. Saccharomyces cerevisiae is one of the yeast species that originated after a hybridization event about 100 million years ago, which required genomic duplication to become fertile again. After whole genome duplication event, there was a rapid reduction of the genome, currently only 30% of the genome persist as duplicate. What are the molecular mechanisms that determine which genes are kept in duplicate and which are not, is one of the challenges that has been tried to explain in the research projects BFU2015.66073-P and SEJI2018-074. In these projects it has been shown that the transcriptional level of genes influences their retention as duplicates, but after this long evolutionary time, mutations have accumulated in each of the copies, which has led to a divergence of sequence and divergence. functional that may be behind the phenomenon of functional innovation. Within these research projects, a set of lines has been generated, from an experimental evolution test in which the yeast S. cerevisiae strain Y06240 has been subjected to daily passages applying a 1% bottleneck in the diversification phase (100 passages), and subsequently, lines adapted to different stresses have been generated by applying a bottleneck of 10% of the population (for another 100 passages). In this TFG we will: i) study how these evolved yeasts respond to the oxidative stress produced by the YPOxD medium (0.01% H2O2), obtaining data on growth rate (r), biomass yield or carrying capacity (k), and other paramete

[ES] El desarrollo de la inmunoterapia ha alcanzado un importante punto de inflexión en la historia del tratamiento del cáncer. El gran potencial de la inmunoterapia en cáncer se basa en el aprovechamiento del propio sistema inmune para combatir las células tumorales. Resultados recientes muestran la existencia de intersecciones entre fenómenos genéticos e inmunológicos en las células tumorales, por lo que es de crucial importancia la búsqueda de biomarcadores, que puedan predecir la respuesta a estos agentes inmunoterápicos. La sobreexpresión de PD-L1 es el único biomarcador predictivo de respuesta para la terapia anti-PD-1/PD-L1 que está aceptado y bien estudiado, aunque numerosos ensayos clínicos han tratado de correlacionar la expresión de PDL1 con la respuesta al tratamiento sin resultados determinantes, debiéndose esto a la expresión dinámica de PDL1 en los tumores. La unión entre ambos PD1/PD-L1 permite a la célula tumoral evadir la destrucción inmune generando un efecto inmunosupresor. Por tanto, dicha interacción se ha convertido en diana de interés y objeto de estudio para entender en qué condiciones el tratamiento PD-L1 será beneficioso para el paciente. En el presente TFM vamos a caracterizar PD-L1 en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Se partirá del trabajo realizado por el grupo de Joe Gray en la caracterización de las líneas de cáncer de mama para una primera caracterización de PD-L1. A nivel de laboratorio, se disponen de los datos de un array aCGH en el que se evaluaron 52 líneas celulares. También se evaluó mediante qPCR los posibles CNVs y la expresión de PD-L1 en estas 52 líneas. Para la validación de estos resultados, se pondrá a punto el FISH para la determinación de alteraciones en el número de copias y la IHC para la confirmación de la localización y expresión de PD-L1*. Por último, se obtendrán también los datos de la metilación de PD-L1 en 3 posiciones para las 52 líneas celulares. Estos datos serán analizados con el fin de eval, [EN] Immune therapy has become an inflexion point in cancer treatment. Immune therapy potential lie in the inherent ability of the own immune system to recognize and destroy cancer cells. Recent results show intersections between genetic and immunological processes in tumoral cells. Therefore, is important to identify possible biomarkers that can predict a positive outcome when immunotherapeutic agents are used. PDL1 overexpression is the only accepted and well-studied biomarker to determinate the outcome of the anti-PD1/PDL1 treatment. Despite of that, some clinical assay has tried to correlate PDL1 expression with treatment response without finding concluding results. This could be related with the dynamic expression of PDL1 in cancer cells. PD1 interaction with PDL1 allows the cancer cell to avoid immune response against tumor. The interruption of this interaction has become a potential target and an interesting topic of study to understand under which conditions PDL1 treatment could become beneficial to the patient. In this TFM, we will focus on the characterization of PDL1 in different breast cancer cell lines. Most of the cell lines included in this work has been previously characterized by Joe Gray¿s group, so we will start from his work to gather information about PDL1 in these cancer cell lines. Our research group has the characterization results of 52 cell lines performed by array aCGH. CNV and PDL1 mRNA expression will be evaluated by real time PCR. To validate these results, FISH and IHC will be optimized to validate CNV and expression, respectively*. Also, methylation in 3 genomics positions will be evaluated in all 52 cell lines. All the data will be evaluated to find any possible factor that can affect PDL1 expression. Finally, these results will be evaluated according to cell lines subtypes to understand if PDL1 expression correlates with genomic state and this, with some concrete molecular phenotypes. *FISH and IHC will be evaluated in no more than

[ES] La miocardiopatía arritmogénica (MCA) es una enfermedad genética rara (OMIM #107970; ORPHA247) con una prevalencia de entre 1:1000 y 1:5000. Se caracteriza por la sustitución progresiva del miocardio por tejido fibroadiposo y puede debutar directamente con muerte súbita. Se conocen 16 genes cuyas mutaciones pueden ser causantes de MCA, siendo más frecuentes las mutaciones en genes desmosómicos (desmoplaquina-DSP, placofilina-2, desmocolina-2, desmogleína-2 y placoglobina). El patrón de herencia de estos genes es con frecuencia autosómico dominante, tiene una penetrancia incompleta y una expresividad variable. La epigenética modula la producción proteica pero el estudio del tejido clave en la MCA plantea limitaciones éticas en tanto en cuanto supone tener que realizar una biopsia endomiocárdica asumiendo potenciales riesgos de complicaciones. Por ello, decidimos verificar si el frotis bucal (fácilmente accesible, barato y sin riesgos) puede actuar como como espejo de lo que sucede en el corazón. Más concretamente, desde un punto de vista bibliográfico evaluamos si el estado los promotores de los genes causantes de la enfermedad son metilables. De entre ellos seleccionamos el gen DSP para el estudio de su metilación por pirosecuenciación en la muestra disponible en humanos, pues es uno de los que tenemos familias bien caracterizadas en la consulta de Cardiopatías Familiares. Se reclutaron 13 portadores de mutación en DSP sin expresión del fenotipo de MCA, 25 pacientes MCA y 11 familiares sanos. Gracias a la actividad trasplantadora del centro en el que se realizó el trabajo, se reclutaron 7 pacientes con muestra pareada de frotis bucal y miocardio obtenidos al acudir a recibir un trasplante cardíaco por insuficiencia cardíaca terminal, independientemente del diagnóstico de base. Se analizaron 4 regiones del gen que comprendían 14 sitios metilables de una isla CpG y un shore localizada en el promotor del gen. Este estudio se realizó en queratinocitos bucales como, [EN] Arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) is a rare genetic disease (OMIM # 107970; ORPHA247) with a prevalence of between 1:1000 and 1:5000. It is characterized by the progressive replacement of the myocardium by fibrofatty tissue and can debut directly with sudden death. Mutations in 16 genes were identified as the cause of ACM with mutations being more frequent in desmosomal genes (desmoplakin-DSP, placophilin-2, desmocollin-2, desmoglein-2 and plakoglobin). The inheritance pattern of these genes is often autosomal dominant, has incomplete penetrance, and variable expressivity. Epigenetics modulates protein production, but the study of the heart tissue in ACM poses ethical limitations as it involves having to perform an endomyocardial biopsy, assuming potential risks of complications. Therefore, we decided to verify if oral keratinocytes (easily accessible, cheap and without risks) can act as a substitute of what happens in the heart. From a bibliographic point of view, we evaluated whether the state of the promoters of the genes causing the disease are methylable. From among them, we selected the DSP gene for the study of its methylation by pyrosequencing in the sample available in humans, since we have well-characterized families in the Family Heart Disease consultation. 13 DSP mutation carriers without expression of the ACM phenotype, 25 ACM patients and 11 healthy family members were recruited. Thanks to the transplantation activity of the center where the work was carried out, we recruited 7 patients with a paired sample of oral keratinocytes and myocardial tissue, regardless of the underlying diagnosis. 4 regions of the gene were analyzed that comprised 14 methylatable sites of a CpG island and shore located in the gene promoter. This study was carried out in oral keratinocytes as a surrogate phenotype biomarker of ACM. Given the health alert situation, the validation of the downstream results by quantifying the DSP mRNA in said samples are pending to correl

[ES] El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es el tejido implicado en la supervivencia y función de los fotorreceptores y de la coroides. Estudios previos ¿in vivo¿ e ¿in vitro¿ han demostrado que el estrés oxidativo inducido por consumo de alcohol genera especies reactivas de oxígeno (ROS), activando vías de señalización celular como son la inflamación, muerte celular o autofagia en otros tejidos. En este trabajo se estudiará en condiciones ¿in vitro¿ la respuesta de las células ARPE-19, modelo celular de RPE, a la exposición crónica de etanol (EtOH). Para ello se estudiará la viabilidad celular, generación de ROS, expresión génica y proteica de marcadores de estrés oxidativo e inflamación, así como la integridad de las uniones intercelulares (Tight Junctions, TJ)., [EN] The Retinal Pigment Epithelium (RPE) is a tissue involved in the survival and function of photoreceptors and choroid. Previous studies ¿in vivo¿ and ¿in vitro¿ have shown that oxidative stress is induced by ethanol (EtOH), it generates Reactive Oxygen Species (ROS) activating cellular signalling pathways such as, inflammation, cell death or autophagy in other tissues. We are going to study ¿in vitro¿ ARPE-19 cells response, a cellular model of RPE, at the chronic exposure to EtOH. Therefore, cell viability, ROS generation, gene and protein expression of oxidative stress and inflammation markers, and the tight junction (TJ) integrity in these cells will be investigated.

[ES] La manipulación dirigida de flujos metabólicos es de gran interés biotecnológico, sobre todo por el empleo industrial de microrganismos como factorías de productos de gran impacto económico; y permite la obtención de valiosos productos dirigidos a la medicina como son vacunas y fármacos, a un coste relativamente reducido. El metabolismo en su conjunto es un sistema complejo, donde las diferentes rutas metabólicas se coordinan y regulan finamente para asegurar la homeostasis celular. La modificación de estos flujos metabólicos en direcciones concretas es el objetivo de muchos grupos de investigación, pero la manipulación racional del metabolismo resulta ser bastante compleja, y requiere la optimización de nuevas estrategias. En este trabajo trataremos de utilizar una tecnología basada en el recableado con sistema cohesina-Dockerina en Saccharomyces cerevisiae, que permite la manipulación de la localización celular de proteínas, en nuestro caso trabajaremos con los enzimas glicolíticos Hxk2 y Fba1, y estudiaremos si un cambio de localización de estos enzimas a la membrana externa mitocondrial influye al equilibrio entre fermentación y respiración. Además realizaremos este proyecto comparando dos métodos de edición génica, uno tradicional donde la manipulación se realiza aprovechando la alta tasa de recombinación homóloga en levadura, otro más innovador mediante la tecnología CRISPR-cas12, de gran interés para el empleo de cepas industriales., [EN] The directed manipulation of metabolic flows is of great biotechnological interest, mainly due to the industrial use of microorganisms as factories of products of significant economic impact; and it allows obtaining valuable medicine products such as vaccines and drugs, at a relatively low cost. Metabolism as a whole is a complex system, where the different metabolic pathways are finely coordinated and regulated to ensure cellular homeostasis. Modifying these metabolic flows in specific directions is the goal of many research groups. Still, the rational manipulation of metabolism turns out to be quite complicated and requires the optimization of new strategies. In this work, we will try to use a technology based on the rewiring with the cohesin-Dockerin system in Saccharomyces cerevisiae, which allows the manipulation of the cellular location of proteins. In our case, we will work with the glycolytic enzymes Hxk2 and Fba1, and we will study if a change in Localization of these enzymes to the mitochondrial outer membrane influences the balance between fermentation and respiration. We will also carry out this project comparing two gene-editing methods: The traditional approach, where manipulation is carried out, taking advantage of the high rate of homologous recombination in yeast. And the more innovative, using CRISPR-cas12 technology, of great interest for the use of industrial strains.

[EN] The regulation of gene expression is a fundamental process enabling cells to respond to internal and external stimuli or to execute developmental programs. Changes in gene expression are highly dynamic and depend on many intrinsic and extrinsic factors. In this review, we highlight the dynamic nature of transient gene expression changes to better understand cell physiology and development in general. We will start by comparing recent in vivo procedures to capture gene expression in real time. Intrinsic factors modulating gene expression dynamics will then be discussed, focusing on chromatin modifications. Furthermore, we will dissect how cell physiology or age impacts on dynamic gene regulation and especially discuss molecular insights into acquired transcriptional memory. Finally, this review will give an update on the mechanisms of heterogeneous gene expression among genetically identical individual cells. We will mainly focus on state-of-the-art developments in the yeast model but also cover higher eukaryotic systems.

[ES] Los organismos eucariotas, desde hongos hasta humanos, poseen sistemas de transducción de señales para responder y adaptarse a una gran variedad de moléculas xenobióticas. La activación de estos sistemas multidrug es una causa importante de la resistencia pleiotrópica a los compuestos antifúngicos en hongos patógenos, así como a los tratamientos contra el cáncer en las células humanas. Aquí investigamos la diversidad natural de la respuesta multidrug , que se produce en aislados naturales evolucionados de manera diferente de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En este organismo, Pdr1 es el principal activador transcripcional, que reconoce directamente los xenobióticos y, posteriormente, activa la expresión de genes que codifican los transportadores de eflujo de fármacos, lo que genera resistencia al xenobiótico. En este trabajo, diferentes variantes de Pdr1 de diversas cepas naturales de S. cerevisae y de la levadura patógena Candida glabrata se fusionarán con el dominio de unión al ADN de Gal4. La capacidad de activación de estas proteínas de fusión Pdr1 se analizará en células de levadura mediante ensayos de luciferasa de células vivas en respuesta a concentraciones crecientes de xenobióticos (por ejemplo, menadiona). Esto permitirá comparar las sensibilidades de las diferentes variantes de Pdr1. Los datos obtenidos se compararán con las sensibilidades relativas de las diferentes cepas de levadura a las concentraciones de menadiona y otros xenobióticos que inhiben el crecimiento. En ensayos complementarios, los aislamientos naturales de S. cerevisiae, que han evolucionado en diferentes hábitats, se transformarán con reporteros de células vivas específicos para la respuesta PDR. Las diferentes cepas se examinarán para determinar su activación dependiente de la dosis de la respuesta multidrug mediante ensayos de luciferasa y para determinar su resistencia a xenobióticos mediante ensayos de crecimiento continuo. Tomados en conjunto, los resultados permitirán c, [EN] Eukaryotic organisms, from fungi to humans, possess signal transduction systems to respond and adapt to a great variety of xenobiotic molecules. Activation of these multidrug systems is a major cause of pleiotropic resistance to antifungal compounds in pathogenic fungi as well as to anticancer treatments in human cells. Here we investigate the natural diversity of a multidrug response, which occurs in differentially evolved natural isolates of the yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism, Pdr1 is the main transcriptional activator, which directly recognizes xenobiotics and subsequently activates the expression of genes encoding drug efflux transporters, thus leading to resistance to the xenobiotic. In this work, different Pdr1 variants from diverse natural S. cerevisae strains and from the pathogenic yeast Candida glabrata will be fused to the Gal4 DNA-binding domain. The activation capacity of these Pdr1 fusion proteins will be assayed in yeast cells by live cell luciferase assays in response to increasing concentrations of xenobiotics (for example menadione). This will allow to compare the sensitivities of the different Pdr1 variants. The obtained data will be compared with the relative sensitivities of the different yeast strains to growth inhibiting concentrations of menadione and other xenobiotics. In complementary assays, natural S. cerevisiae isolates, which have evolved in different habitats, will be transformed with live cell reporters specific for the PDR response. The different strains will be examined for their dose-dependent activation of the multidrug response by luciferase assays and for their xenobiotic resistance by continuous growth assays. Taken together, the results will allow to quantify natural diversity of yeast multidrug systems and specifically of Pdr1, and to compare these behaviors with the xenobiotic resistance of the respective strains.

[ES] La piel humana está continuamente expuesta a la radiación ultravioleta (UVR) solar. Esta exposición de la piel a la UVR genera gran variedad de respuestas biológicas que se van acumulando con el tiempo, incluyendo inflamación, daño del ADN, melanogénesis y generación de estrés oxidativo. Cuando la exposición es excesiva estos cambios pueden causar diferentes patologías, como eritema, envejecimiento degenerativo o cáncer de piel. Actualmente, la influencia de la radiación UV-B y UV-A en la fisiología de la piel humana es un área de investigación muy activa. Para entender mejor las bases moleculares que ocurren después de la exposición a la UVR, se estudiaron las respuestas de los queratinocitos y fibroblastos de la piel humana tras someterse a diferentes dosis de UV-B y UV-A. Estos datos pueden ser empleados en la industria como base para la caracterización de compuestos protectores o reparadores de los daños generados por la UVR., [EN] Human skin is continuously exposed to solar ultraviolet radiation (UVR). This exposure of the skin to UVR generates a variety of biological responses that accumulate over time, including inflammation, DNA damage, melanogenesis, and generation of oxidative stress. When exposure is excessive, these changes can cause different pathologies, such as erythema, degenerative aging or skin cancer. Currently, the influence of UV-B and UV-A radiation on the physiology of human skin is a very active area of research. To better understand the molecular bases that occur after exposure to UVR, the responses of human skin keratinocytes and fibroblasts after undergoing different doses of UV-B and UV-A were studied. This data can be used in industry as a basis for the characterization of protective or repair compounds from UVR damage.

[ES] El concepto partículas de tipo viral, en inglés virus-like particles (VLPs), da nombre a estructuras proteicas compuestas por diversas subunidades de origen viral con capacidad de autoensamblarse de forma competente, poseyendo una serie de ventajas que permiten su empleo como sistema para la exposición de antígenos para el posible desarrollo de vacunas. Este trabajo implica una revisión de la literatura disponible, abarcando los orígenes de estas partículas, su producción en diferentes sistemas de expresión (bacterianos, basados en levadura, plantas, células de insecto o mamífero, y sistemas libres de células), teniendo en cuenta ventajas, desventajas y rendimientos de los mismos. Además del procesado posterior de las partículas generadas (purificación y caracterización), la generación de partículas quiméricas (mediante fusión genética o conjugación química) y los métodos de cultivo aplicables (batch, fed-batch, continuous, perfusion). Por otro lado, se incluye una recopilación de las vacunas basadas en VLPs ya comercializadas, contra el virus del papiloma humano y los virus de la hepatitis B y E, y de aquellas en fase de ensayo clínico, por ejemplo contra la malaria, gripe y norovirus. Finalmente, se comenta la posibilidad de emplear vacunas VLPs contra enfermedades infecciosas emergentes., [EN] The concept virus-like particles (VLPs) gives name to multisubunit self-assembly-competent viral protein structures with characteristics that makes them a suitable system for the exposure of antigens for the possible development of vaccines. This work involves a review of the available literature, covering the origins of these particles, their production in different expression systems (bacteria, yeast based, plants, insect and mammalians cells, and cell-free protein synthesis), taking into account advantages, disadvantages and yields. Their subsequent processing (purification and characterization), the generation of chimeric particles (by genetic fusion or chemical conjugation) and the applicable culture methods (batch, fed-batch, continuous, perfusion). Furthermore, there is a review of vaccines based on VLPs already commercialized, against human papillomavirus and hepatitis E and B viruses, and those in clinical trial, against malaria, influenza and noroviruses for example. Finally, there is a discussion on the possibility of using VLPs vaccines against emerging infectious diseases.

[EN] Cells respond to external stimuli with transient gene expression changes in order to adapt to environmental alterations. However, the dose response profile of gene induction upon a given stress depends on many intrinsic and extrinsic factors. Here we show that the accurate quantification of dose dependent gene expression by live cell luciferase reporters reveals fundamental insights into stress signaling. We make the following discoveries applying this non-invasive reporter technology. (1) Signal transduction sensitivities can be compared and we apply this here to salt, oxidative and xenobiotic stress responsive transcription factors. (2) Stress signaling depends on where and how the damage is generated within the cell. Specifically we show that two ROS-generating agents, menadione and hydrogen peroxide, differ in their dependence on mitochondrial respiration. (3) Stress signaling is conditioned by the cells history. We demonstrate here that positive memory or an acquired resistance towards oxidative stress is induced dependent on the nature of the previous stress experience. (4) The metabolic state of the cell impinges on the sensitivity of stress signaling. This is shown here for the shift towards higher stress doses of the response profile for yeast cells moved from complex to synthetic medium. (5) The age of the cell conditions its transcriptional response capacity, which is demonstrated by the changes of the dose response to oxidative stress during both replicative and chronological aging. We conclude that capturing dose dependent gene expression in real time will be of invaluable help to understand stress signaling and its dynamic modulation.

[EN] Pleiotropic drug resistance arises by the enhanced extrusion of bioactive molecules and is present in a wide range of organisms, ranging from fungi to human cells. A key feature of this adaptation is the sensitive detection of intracellular xenobiotics by transcriptional activators, activating expression of multiple drug exporters. Here, we investigated the selectivity and sensitivity of the budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) multidrug response to better understand how differential drug recognition leads to specific activation of drug exporter genes and to drug resistance. Applying live-cell luciferase reporters, we demonstrate that the SNQ2, PDR5, PDR15, and YOR1 transporter genes respond to different mycotoxins, menadione, and hydrogen peroxide in a distinguishable manner and with characteristic amplitudes, dynamics, and sensitivities. These responses correlated with differential sensitivities of the respective transporter mutants to the specific xenobiotics. We further establish a binary vector system, enabling quantitative determination of xenobiotic-transcription factor (TF) interactions in real time. Applying this system we found that the TFs Pdr1, Pdr3, Yrr1, Stb5, and Pdr8 have largely different drug recognition patterns. We noted that Pdr1 is the most promiscuous activator, whereas Yrr1 and Stb5 are selective for ochratoxin A and hydrogen peroxide, respectively. We also show that Pdr1 is rapidly degraded after xenobiotic exposure, which leads to a desensitization of the Pdr1-specific response upon repeated activation. The findings of our work indicate that in the yeast multidrug system, several transcriptional activators with distinguishable selectivities trigger differential activation of the transporter genes.

[ES] El Receptor Activador del Factor Nuclear Kappa ß (RANK) se ha revelado en los últimos años como un elemento clave de la proliferación celular en tejidos con regulación hormono-dependiente, siendo confirmada su participación en la regulación del cáncer de mama y el cáncer endometrial. En la misma línea, a pesar de ser una enfermedad definida médicamente como benigna, la endometriosis presenta en su idiosincrasia características de similitud con procesos de malignidad, como el crecimiento progresivo e invasivo del tejido endometrial de implantación ectópica, la dependencia estrogénica de la proliferación, y la tendencia a recidivar y metastatizar, sugiriendo la posibilidad de compartir vías de regulación con procesos cancerígenos. Para el estudio se recogieron muestras de endometrio eutópico procedente de mujeres sanas sometidas a revisión ginecológica rutinaria como control (n=30) y muestras de endometrio eutópico (n=40) y ectópico -endometriomas ováricos- (n=11) de pacientes sometidas a cirugía. Se realizó un análisis inmunohistoquímico para detectar la presencia del receptor RANK utilizando el anticuerpo humano RANK/TNFRSF11A. Para la señalización y cuantificación de la tinción se utilizó el software Image Pro Plus 6.0, obteniendo la densidad óptica -intensidad- para el área seleccionada en cada muestra. Los datos fueron expresados en forma de logaritmo neperiano como media y desviación típica. Los resultados obtenidos presentaron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de RANK entre las muestras de endometrioma ovárico (2.67±1,36) y endometrio eutópico de mujeres con endometriosis (1.15±0.77), con un p valor < 0,01, y en menor medida, entre el endometrio eutópico de las pacientes en contraste con el endometrio eutópico sano (1.05±0.95) con un p valor < 0,05. Por tanto, el incremento de la tinción de RANK observada en las muestras de endometrioma ováricos podría sugerir la implicación del receptor RANK en el desarrollo de la enfermedad, pud, [EN] The Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa ß (RANK) signaling pathway has been revealed as a key element in cell proliferation in hormone-dependent systems. More specifically it has been confirmed as a regulatory factor in breast and endometrial cancers. In that sense and despite the fact that endometriosis is a disease medically defined as benign, it presents similarity with malignant processes, such as the progressive and invasive growth of ectopic endometrial tissue, estrogenic dependence of proliferation, and trend to recur and metastasize, suggesting a shared regulation path with carcinogenic processes. Eutopic endometrium was harvested from healthy women undergoing routine gynecological examinations as control (n=30), and eutopic endometrium (n=40) and ectopic endometrium -ovarian endometriomas- (n=11) were collected during endometriosis surgery. RANK immunohistochemical staining was performed using a human antibody RANK / TNFRSF11A. RANK staining was quantified using Image Pro Plus 6.0 by obtaining the average optical density (IOD) in the delineated areas. The amount of RANK staining was expressed as a logarithm function of the IOD (mean ± SD) and statistical analysis was performed with SPSS 24.0. Comparisons between group samples were made by ANOVA followed by Turkey post hoc. Statistically significant differences in RANK expression among different group samples were detected. Ovarian endometrioma showed higher expression (2.67±1.36) than eutopic endometrium from women with endometriosis (1.15±0.77) (p value < 0.01), and RANK staining was increased in eutopic endometrium obtained from endometriosis patients compared to eutopic endometrium from healthy women (1.05±0.95) (p value < 0,05). So, the increase of RANK staining in ovarian endometriomas may suggest a possible implication of the receptor in the development of the disease, and could explain why, despite being defined as a benign disease, endometriosis presents similarity with malignant process

[ES] La mitofagia es un tipo específico de autofagia que tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial. Es además un proceso que asegura el mantenimiento de la calidad mitocondrial en situaciones de estrés; de hecho, un mal funcionamiento de los mecanismos moleculares implicados en la mitofagia está relacionado con distintas enfermedades en humanos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un sistema modelo muy valorado en la biología molecular de procesos básicos, y una excelente herramienta para el estudio de los procesos mitofágicos. Recientemente se ha encontrado que la adaptación al estrés requiere una activación mitocondrial selectiva, por ejemplo, en el caso del transportador de piruvato Mpc se basa en la regulación coordinada de subunidades específicas del complejo. Hasta ahora el estudio de la mitofagia en levaduras se ha centrado casi exclusivamente en la mitofagia inducida por ayuno de nutrientes, mientras que en las células de mamíferos está bien establecido que la mitofagia contrarresta el daño causado por la despolarización de las mitocondrias, y su defecto se asocia a la enfermedad de Parkinson. En este trabajo se pretende diseñar nuevas herramientas biotecnológicas que permitan un estudio molecular de la mitofagia selectiva., [EN] Mitophagy is a specific type of autophagy that plays an essential role in the maintenance of mitochondrial homeostasis. It is also a process that ensures the maintenance of mitochondrial quality in stress; in fact, a malfunction of the molecular mechanisms involved in mitophagy is related to different diseases in humans. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a model system highly valued in the molecular biology of basic processes, and an excellent tool for the study of mitophagic processes. Recently, it has been found that adaptation to stress requires selective mitochondrial activation, for example, in the case of the pyruvate transporter Mpc, it is based on the coordinated regulation of specific subunits of the complex. So far, the study of mitophagy in yeast has focused almost exclusively on the mitophagy induced by fasting nutrients, while in mammalian cells it is well established that mitophagy counteracts the damage caused by the depolarization of mitochondria, and its incorrect functioning is associated with Parkinson's disease. In this work, it is intended to design new biotechnological tools that allow a molecular study of selective mitophagy.

[ES] La levadura es un modelo celular para comprender los mecanismos moleculares que emplean las células eucariotas para adaptarse a estreses químicos. Un importante mecanismo de señalización es el reconocimiento directo del compuesto químico por factores de transcripción que lleva a la activación de la expresión génica de diversos transportadores del tipo multidroga. En levadura existe una familia de activadores transcripcionales del tipo zinc-cluster que se dedican al reconocimiento de diferentes compuestos xenobióticos. Ácidos orgánicos como el ácido acético, sórbico o benzoico activan el sistema multidroga en levadura. En este proyecto queremos cuantificar de forma dosis-dependiente la respuesta a los tres ácidos con reporteros de luciferasa desestabilizada. Además, se investigará la función de factores de transcripción particulares (como Pdr1, Pdr3 y otros) en este proceso. El empleo de mutantes para estos activadores en ensayos de supervivencia nos indicará la función fisiológica de cada factor. Por otra parte, se pretende crear nuevas herramientas basadas en luciferasas desestabilizadas para la monitorización del ciclo celular durante las respuestas a estrés. Durante la adaptación a estrés químico se para transitoriamente el ciclo celular hasta la efectiva adaptación. Por lo tanto, la cuantificación de las células que reanudan el ciclo celular después de un insulto químico nos puede proporcionar una manera de cuantificar la eficiencia de su adaptación. Se fusionarán varios promotores naturales regulados por el ciclo celular, por ejemplo, CLN1, o regulados específicamente en células hijas, por ejemplo, DSE2, con el gen de luciferasa. Se comprobarán estas construcciones plasmídicas en levadura durante la adaptación a diferentes tipos y grados de estrés., [EN] Yeast is a cellular model to understand the molecular mechanism of the adaptation of eukaryotic cells to chemical stresses. An important signalling mechanism is the direct recognition of the chemical compound by transcriptional factors that leads to the activation of the gene expressions of various multidrugs transporters. In yeast there is a family of transcriptional activator of the zinc-cluster type that are engaged in the recognition of different xenobiotic compounds. Organic acids such as acetic, sorbic or benzoic acid activate the multidrug system in yeast. In this project we want to quantify in a dose-dependent manner the response to the three acids with reporters of destabilized luciferase. In addition, the function of particular transcription factors (such as, Pdr1, Pdr3, and others) will be investigated in this process. The use of mutants for these activators in survival trials will indicate the physiological function of each factor. On the other hand, we intend to create new tools based on destabilized luciferases for the monitorization of the cell cycle upon stress exposure. During the adaptation to chemical stress, the cell cycle is temporarily stopped until the effective adaptation. Therefore, the quantification of cells that resume the cell cycle after a chemical insult can provide us with a way to quantify the efficiency of their adaptation. Several natural promoters regulated by the cell cycle, for example, CLN1, or specifically regulated in daughter cells, for example, DSE2, will be fused with the luciferase gene. These plasmid constructions will be functionally tested in yeast during the adaptation to different types and degrees of stress.

[ES] Tradicionalmente se han considerado ciertas características neuropatológicas para definir a la enfermedad de Alzhéimer, como son las placas de beta amiloide y los ovillos de Tau hiperfosforilado, sin embargo estudios actuales incluyen a procesos como la resistencia a insulina y el aumento de la neuroinflamación como subyacentes al desarrollo y progresión de esta enfermedad. En el sistema nervioso central, la señalización de insulina/IGF1, regula la supervivencia y maduración neuronal, neurogénesis y sinaptogénesis, entre otros. Por tanto, es capaz de mediar los procesos de aprendizaje, memoria y plasticidad. Todos estos procesos se ven afectados en situaciones de resistencia a insulina, que puede aparecer como causa de un aumento en la neuroinflamación. Como consecuencia, cabe esperar que esto contribuya a la aparición de procesos neurodegenerativos. A su vez, la resistencia a insulina provoca un aumento en la neuroinflamación. La señalización de insulina/IGF1 viene mediada por la activación de proteínas de ensamblaje, los sustratos del receptor de insulina IRS1 e IRS2. Estudios previos del laboratorio han demostrado que la neuroinflamación inducida por dieta grasa va asociada a una disminución de los niveles de IRS2. Además, otros estudios muestran una expresión reducida de IRS2 en cerebros post-mortem de pacientes con enfermedad de Alzhéimer diagnosticada. Por ello, proponemos el silenciamiento de esta proteína de forma específica, sin neuroinflamación asociada, para estudiar su papel en el aprendizaje y memoria. Para ello se han generado shRNA para la generación de partículas virales AAV y poder llevar a cabo estudios in vivo. De esta manera, se trata de generar una herramienta para estudiar cómo y dónde (tipos neuronales y circuitos neuronales) la señalización de IRS2 regula o induce mecanismos que conducen a la neurodegeneración., [EN] Traditionally, certain neuropathological characteristics have been considered to define Alzheimer's disease, such as ß-amyloid plaques and hyperphosphorylated TAU tangles. However, recent studies include insulin resistance and an increased neuroinflammation characteristic factors of this disease. In the central nervous system, insulin/IGF1 signaling regulate neuronal survival and maturation, neurogenesis and synaptogenesis, among others. Therefore, it mediates in processes like learning, memory and plasticity and in fact all these processes are affected in situations of insulin resistance. Insulin resistance can appear as a cause of increased neuroinflammation. In turn, insulin resistance causes an increase in neuroinflammation. As a consequence, this process is postulated to contribute to the appearance of neurodegenerative pathologies Insulin/IGF1 signaling is mediated by the activation of assembly proteins, the substrates of the insulin receptor 1 and 2 (IRS1/2). Previous studies in our laboratory have shown that neuroinflammation induced by a fat diet is associated with a decrease in IRS2 levels. In addition, other studies show a reduced expression of IRS2 in post-mortem brains of patients with diagnosed Alzheimer's disease. How much IRS2 reduction as a consequence of neuroinflammation may be responsible for cognitive impairment is not known. Whether IRS2 reduction could alone (isolated from any neuroinflammation processes) alter neuronal survival and/or performance it is not known. Therefore, we propose the silencing of this protein, without associated neuroinflammation, to study its role in learning and memory. In order to accomplish that, shRNA has been generated for the generation of AAV viral particles to carry out studies in vivo. The major objective is to generate a biotechnology tool to study how and where (neural types and neural circuits) IRS2 signaling regulates cognitive function and whether its loss or reduction may lead to neurodegeneration.

[ES] La prevalencia de las lesiones óseas se encuentra en un elevado porcentaje de la población en los países en desarrollo, y se prevé que irá en aumento debido al envejecimiento de la misma. Las causas principales que desencadenan tales lesiones son alteraciones en la homeostasis ósea debido a fracturas o a desequilibrios hormonales afectando directamente a vías moleculares responsables de regular el proceso de diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales (MSC). Es cierto que el tejido óseo cuenta con un proceso regenerativo denominado remodelado óseo, que permite restaurar tejido viejo o dañado por nuevo. No obstante, esta capacidad regenerativa es limitada haciendo imposible reparar lesiones de elevado volumen y se ve afectada con la edad. Actualmente, se emplean los injertos y las técnicas de osteodistracción como terapias convencionales para tratar defectos óseos de gran tamaño. No obstante, estas terapias presentan ciertos inconvenientes tales como la escasez de donantes, la transmisión de patologías infecciosas, la morbilidad en el sitio de extracción y la imposibilidad de remodelación de los materiales empleados, haciendo que sea fundamental la búsqueda de nuevas alternativas. Por esto, la ingeniería tisular se ha convertido en una posible opción para restaurar, mantener y mejorar la función ósea mediante el empleo de las MSC, concretamente de las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSC) y de la pulpa dental (DPSC) debido a su fácil obtención por medio de técnicas poco invasivas para el paciente. Por lo tanto, en este proyecto se estudiará y analizará la diferenciación osteogénica a partir de ADSCs y DPSCs empleando como control positivo unas células de origen osteoblástico, las MG63. Para ello, se sembrarán las células sobre unas placas de cultivo que permitirán su crecimiento en 2D y se llevará a cabo una evaluación y una comparación entre dos medios inductores de la diferenciación osteogénica, uno de ellos comercia, [EN] The prevalence of bone lesions is found in a high percentage of the population in developing countries, and it is expected to increase due to the aging of the latter. The main causes which trigger the lesions are alterations in bone homeostasis due to fractures or hormonal imbalances that directly affect the molecular pathways which are responsible for the process of osteogenic differentiation of the mesenchymal stem cells (MSCs). It is true that bone tissue has a regenerative process called bone remodeling, which allows to restore old or damaged tissue for new one. However, this regenerative capacity is limited, making it impossible to repair large lesions and it is affected with age. Currently, grafts and osteodistraction techniques are used as conventional therapies to treat large bone defects. Nevertheless, these therapies have some drawbacks, such as the shortage of donors, the transmission of infectious pathologies, the morbidity in the extraction site and the impossibility of remodeling the materials used, making essential to search for new alternatives. Because of all the aforementioned, tissue engineering has become a possible option to restore, maintain and improve bone function through the use of MSCs, specifically adipose-derived stem cells (ADSC) and dental pulp stem cells (DPSC) due to its easy obtaining by means of low invasive techniques for the patient. Therefore, in this project the osteogenic differentiation will be studied and analysed with ADSCs and DPSCs, using as a positive control cells of osteoblastic origin, the MG63. To do this, the cells will be seeded on culture plates which will allow their growth in two-dimensions (2D) and an evaluation and comparison between two inductive mediums of osteogenic differentiation will be carried out. One of the inductive medium will be commercial and the other will be elaborated in the laboratory. The expression of certain osteogenic markers will be analyzed through inmunofluorescent staining and RT

El cáncer colorrectal metastático (CCRm) constituye un gran ejemplo de la medicina personalizada dado que resulta necesario el estudio de biomarcadores moleculares en el momento del diagnóstico de la enfermedad, con el objetivo de determinar el esquema de tratamiento más adecuado para cada paciente. Concretamente, las mutaciones en KRAS y NRAS constituyen biomarcadores predictivos de resistencia primaria a la terapia con anticuerpos monoclonales anti-EGFR (Cetuximab y Panitumumab) mientras que la mutación V600E en el gen BRAF se asocia a un mal pronóstico en estos pacientes. En la actualidad, tanto la Agencia de Alimentos y Medicamentos estadounidense (FDA) como la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) consideran mandatorio el estudio mutacional de los exones 2 (codones 12 y 13), 3 (codones 59 y 61) y 4 (codones 117 y 146) de KRAS y NRAS previo a la administración de tratamiento anti-EGFR ya que únicamente debe administrarse en ausencia de mutaciones en estos genes. En el laboratorio clínico, para el estudio mutacional sobre ADN genómico obtenido de tejido tumoral fijado en formaldehído e incluido en parafina (FFPE) se emplean, principalmente, diferentes aproximaciones de gen único basadas en la PCR en tiempo real (RT-PCR). No obstante, el desarrollo de tecnologías de última generación como la secuenciación masiva (NGS) ofrece la oportunidad de abordar el estudio mutacional de estos genes de manera simultánea en una misma plataforma permitiendo además, una caracterización más exhaustiva del perfil molecular de los tumores con un menor consumo de muestra., Metastatic colorectal cancer (mCRC) is a great example of "personalized medicine" since it is necessary to study molecular biomarkers at the diagnosis of the disease, in order to determine the most appropriate treatment scheme for each patient. Specifically, mutations in KRAS and NRAS are predictive biomarkers of primary resistance to therapy with anti-EGFR monoclonal antibodies (Cetuximab and Panitumumab) while the V600E mutation in the BRAF gene is associated with a poor prognosis. Nowadays, both the US Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA) consider mandatory the mutational study of exons 2 (codons 12 and 13), 3 (codons 59 and 61) and 4 (codons 117 and 146) of KRAS and NRAS prior to the administration of anti-EGFR. This treatment should only be administered in the absence of mutations in these genes. In molecular diagnostics laboratory, for the mutational study on genomic DNA obtained from formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue, different "single gene" approaches are used, based on real-time PCR (RT-PCR). However, the development of new technologies such as next generation sequencing (NGS) offers the opportunity to address the mutational study of these genes simultaneously in the same platform, also allowing a more exhaustive characterization of the molecular profile of tumors with lower sample consumption.

A pesar de la gran trascendencia sanitaria y económica de las helmintiasis intestinales, no existen herramientas de control útiles en la actualidad. Una de las principales razones que justifica esta carencia es que las estrategias empleadas hasta la fecha para el desarrollo de estas herramientas no han tenido en consideración los factores, dependientes del hospedador y del parásito que determinan la expulsión del helminto. Esto ha hecho que se hayan realizado innumerables intentos lo que ha supuesto un enorme gasto de tiempo y dinero sin obtener prácticamente ningún éxito. En este contexto, resulta necesario conocer los factores que determinan el establecimiento o la expulsión de los helmintos intestinales para poder desarrollar estrategias que permitan elaborar estas herramientas con uno consumo de tiempo y dinero razonable. En este contexto, el modelo Echinostoma caproni-ratón puede resultar de gran utilidad. Al contrario de los que ocurre con la mayoría de helmintos intestinales, la infección primaria con E. caproni en ratón induce una respuesta local Th1 con elevados niveles de IFN-gama. Este tipo de respuesta se asocia al desarrollo de infecciones crónicas con elevada patología. Sin embargo, los estudios realizados ponen de manifiesto que esta infección primaria genera un estado de resistencia frente a posteriores infecciones con la misma especie parásita. Esta resistencia se asocia con una respuesta Th2 con una elevada expresión de IL-13. Sin embargo, los mecanismos que regulan estas respuestas en esta y otras helmintiasis son poco conocidos. Los estudios realizados por nuestro grupo y otros grupos de investigación han puesto de manifiesto que diversas células (macrófagos, células linfoides innatas tipo 2 -ILC2- y células en cepillo o ¿tuft¿) juegan un papel fundamental en la regulación de las respuestas asociadas a susceptibilidad o resistencia frente a los helmintos intestinales. La susceptibilidad frente a la infección parece asociado a la incapacidad del p, Although the great sanitary and economic importance of intestinal helminthiasis, currently there are not useful control. One of the main reasons that justifies this lack is that the strategies used to date for the development of these tools have not taken into consideration the factors dependents on the host and the parasite that determine the expulsion of helminths. This has led to a great number of attempts involving an expenditure of time and money without practically any success. In this context, it is necessary to know the factors that determine the establishment or expulsion of intestinal helminths in order to develop strategies allowing the development of control tools with a reasonable time and money consumption. In this context, the model Echinostoma caproni-mouse can be very useful. Contrary to what happens with most intestinal helminths, primary infection with E. caproni in mice induces a local Th1 response with elevated levels of IFN-gamma. This type of response is associated with the development of chronic infections with intense local pathology. However, the studies carried out show that this primary infection generates a state of resistance against subsequent homologous infections. This resistance is associated with a Th2 response with a elevated expression of IL-13. However, the mechanisms that regulate these responses in this and other helminth infections are poorly understood. The studies carried out by our laboratory and other research groups have shown that a number cells (macrophages, innate lymphoid cells type 2 -ILC2- and cells in brush or "tuft") play a fundamental role in the regulation of responses associated with susceptibility or resistance to intestinal helminths. Susceptibility to infection seems to be associated with the inability of the parasite to activate the "tuft" cells, which implies a low production of IL-25. In this situation there is no activation of ILC2 and under-expression of IL-13. The fact that the same host generates Th1

[ES] El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común durante la infancia y deriva de las células precursoras del sistema nervioso simpático. Es el responsable del 15% de muertes en niños con cáncer y se caracteriza por ser una enfermedad con una gran heterogeneidad clínica, genética, histológica y biológica. Los factores pronósticos considerados en la estratificación de riesgo pretratamiento de los pacientes son: el estadio, la edad, la histopatología (categoría y grado de diferenciación), la ploidía y alteraciones cromosómicas específicas como la amplificación del gen MYCN y la deleción del brazo cromosómico 11q; de esta forma, se clasifica a los pacientes según su riesgo de muerte en los grupos: Muy Bajo, Bajo, Intermedio y Alto (Very Low, Low, Intermediate y High Risk). El laboratorio de la Dra. Rosa Noguera está llevando a cabo un proyecto en el que se analizan los perfiles pangenómicos obtenidos mediante arrays de SNPs (Single Nucleotide Polimorfisms). En este trabajo, colaboré en el estudio de 195 tumores neuroblásticos, para evaluar el número total de alteraciones cromosómicas segmentarias, la localización cromosómica de estas alteraciones, y el tamaño total de material genético ganado y perdido, así como la presencia de alteraciones focales (bien en amplificaciones o bien en ganancias o pérdidas) y alteraciones cromosómicas numéricas. El objetivo fue determinar si existía una asociación entre la cantidad de material genético ganado y/o perdido (en kilobases) y el número de alteraciones segmentarias o numéricas cromosómicas. Consideramos que relacionando estos resultados con la clínica de los pacientes y el riesgo de recaída o muerte podemos contribuir en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en neuroblastoma., [EN] Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor during childhood and is derived from the precursor cells of the sympathetic nervous system. It is responsible for 15% of deaths in children with cancer and is characterized as a disease with great clinical, genetic, histological and biological heterogeneity. The prognostic factors considered in the pretreatment risk stratification of patients are: stage, age, histopathology (category and degree of differentiation), ploidy and specific chromosomal alterations such as the amplification of the MYCN gene and the deletion of the 11q chromosome arm; in this way, patients are classified according to their risk of death in the Very Low, Low, Intermediate and High Risk. The laboratory of Dr. Rosa Noguera carries out a project in which the pangenomic profiles obtained by arrays of SNPs (Single Nucleotide Polimorfisms) are analyzed. In this work, I will collaborate in the study of 195 neuroblastic tumors, to evaluate the total number of segmental chromosomal alterations, the chromosomal location of these alterations, and the total size of genetic material gained and lost, as well as the presence of focal alterations (well in amplifications or gains or losses) and numerical chromosomal alterations. The objective is to determine if there is an association between the amount of genetic material gained and/or lost (in kilobases) and the number of chromosomal segmental or numerical alterations. We believe that by relating these results to the patients' clinic and the risk of relapse or death we can contribute to the development of new therapeutic strategies in neuroblastoma.

[ES] Las células eucariotas se adaptan continuamente a estreses abióticos como por ejemplo el estrés osmótico o el estrés oxidativo. Ambos estreses están fisiológicamente relacionados, y en estudios anteriores se ha podido establecer que una eficiente adaptación al estrés hiperosmótico y salino requiere una activación del metabolismo respiratorio a través de la inducción de la función mitocondrial y peroxisomal. En el presente trabajo se estudiará cómo influye la función de los dos orgánulos y el proceso del envejecimiento en la dinámica adaptación a estrés. Para ello, se plantean tres abordajes experimentales usando la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. 1- Se determinará cómo influye la función mitocondrial y peroxisomal en la respuesta dosis dependiente de la expresión génica a estrés osmótico. Se emplearán cepas transformadas con reporteros de luciferasa desestabilizada específicos para dicho estrés. Se cuantificará en tiempo real la capacidad de dosis respuesta de cada cepa y se comparará de forma cuantitativa la sensibilidad y posibles defectos de señalización entre las cepas sin y con mutaciones mitocondriales o peroxisomales. 2- Peroxisomas y mitocondrias están conectados físicamente por proteínas de la membrana exterior de los dos orgánulos, como Pex11 y Mdm34 en levadura. Previos estudios han mostrado que el número de peroxisomas asociados a la red mitocondrial aumenta en situaciones de estrés salino. En el presente trabajo se cuantificará el grado de asociación entre los dos orgánulos por microscopía de fluorescencia. Se usarán cepas modificadas con fusiones de Pex11 y Mdm34 con los dominios N- y C-terminales de YFP en ensayos de BiFC in vivo (complementación bimolecular de fluorescencia). Se cuantificará así la interacción de mitocondrias y peroxisomas durante la inducción de la respiración y la adaptación a estrés. 3- Se estudiará cómo influye el envejecimiento de las células en su capacidad de activar la expresión génica en respuesta, [EN] Eukaryotic cells continuously adapt to abiotic stresses such as osmotic or oxidative stress. Both stresses are physiologically related, and in previous studies it has been established that an efficient adaptation to hyperosmotic and saline stress requires an activation of respiratory metabolism through the induction of mitochondrial and peroxisomal function. In the present work we study how the function of the two organelles and the aging process influences the dynamic adaptation to stress. Three experimental approaches are proposed using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a cellular model. 1- It will be determined how mitochondrial and peroxisomal function influences the dosedependent response of gene expression to osmotic stress. Strains transformed with destabilized luciferase reporters will be used. The dose response capacity of each strain will be quantified in real time and the sensitivity and possible signaling defects between the strains without and with mitochondrial or peroxisomal mutations will be quantitatively compared. 2- Peroxisomes and mitochondria are physically connected by proteins of the outer membrane of the two organelles, for example Pex11 and Mdm34 in yeast. Previous studies have shown that the number of peroxisomes associated with the mitochondrial network increases in situations of salt stress. In the present work, the degree of association between the two organelles will be quantified by fluorescence microscopy. Strains modified with Pex11 and Mdm34 fusions with the N- and C-terminal domains of YFP will be used in BiFC assays in vivo (bimolecular fluorescence complementation). The interaction of mitochondria and peroxisomes during the induction of respiration and adaptation to stress will be quantified. 3- It will be studied how the aging of cells influences their ability to activate gene expression in response to oxidative stress. A key feature of aging cells is the accumulation of intracellular oxidative damage and a decreased ab

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune crónica en la que se producen autoanticuerpos frente ADN de doble cadena y otros componentes nucleares y citoplasmáticos que afectan a numerosos órganos, siendo la afectación renal nefropatía lúpica" (NL) la más frecuente. En el desarrollo de esta enfermedad parece jugar un papel importante la comunicación intercelular vía vesículas extracelulares (VE), sobretodo exosomas (Ex), que contienen proteínas, ARN mensajero (ARNm), micro ARN (miARN) y ADN, y que están presentes en fluidos biológicos. Se ha visto que la expresión de miARNs está modulada en el contexto del LES, especialmente cuando se produce NL activa (NLA), lo que sugiere que los miARNs tienen una función relevante en la patología. El miARN miR-146a , en concreto, se ha encontrado 100 veces aumentado en Ex en NLA, siendo capaz de discriminar la presencia o no de esta condición. El objetivo de este trabajo es cuantificar si hay mayor cantidad de miR-146a en Ex que en microvesículas (MV); comprobar si se observa incremento de este miARN, tanto en Ex como MV, en pacientes de LES con NL respecto al grupo control o pacientes sin NL; y estudiar el efecto sobre la expresión de las dianas moleculares de miR-146a, STAT1, STAT2, TLR4, IRAK1 y TRAF6, involucradas en la activación de genes de respuesta inflamatoria. Se obtuvieron muestras de orina de 40 pacientes de LES, 15 de los cuales con NLA y 10 con NL en remisión (NLR), además de 20 controles sanos. El aislamiento de las VE (Ex y MV) se realizó por ultracentrifugación diferencial. Se extrajo el ARN total de las VE para cuantificar los niveles de miR-146a y del sedimento urinario (pellet celular, PC) para la cuantificación de ARNm, en ambos casos mediante RT-qPCR. Los resultados muestran un incremento significativo de los niveles de miR-146a en Ex respecto a MV en el grupo de pacientes con NLA (20 veces, p< 0.0098). La cantidad de miR-146a exosomal en NLA se vio 79 veces aumentada frente al grupo co, Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic autoimmune disease in which autoantibodies are produced against double-stranded DNA and other nuclear and cytoplasmic components and affect many organs. Renal affectation lupus nephritis (LN) is the most frequent one. Intercellular communication by extracellular vesicles (EV), especially exosomes (Ex), which contain proteins, messenger RNA (mRNA), micro RNA (miRNA) and DNA, and which are present in biological fluids, seems to play an important role in the development of this disease. It has been shown that miRNA expression is modulated in SLE, especially in active LN (ALN), which suggests that miRNAs have a relevant role in the pathology. MicroRNA-146a (miR-146a), in particular, has been found to be 100-fold increased in Ex in NLA, being able to discriminate the presence or not of this condition. The objective of this work is to quantify whether there is a higher amount of miR-146a in Ex than microvesicles (MV); to check whether there is an increase of this miRNA (both in Ex and MV) in SLE patients with LN compared to the control group or patients without LN; and to study the effect on the expression of miR-146a molecular targets, STAT1, STAT2, TLR4, IRAK1 and TRAF6, involved in the activation of inflammatory response genes. Urine samples were collected from 40 patients with SLE, 15 of whom with ALN and 10 with LN with remission (RLN), and 20 healthy controls. Extracellular vesicles (Ex and MV) purification was performed by differential ultracentrifugation. Total RNA was extracted from EVs to quantify miR-146a levels and from the urine cell pellet (UCP) for mRNA quantification, in both cases by RT-qPCR. The results showed a significant increase in miR-146a levels in Ex compared to MV in ALN patients (20-fold, p < 0.0098). The amount of exosomal miR-146a in ALN showed a 79-fold change compared to that for controls (p < 0.0001), a 39-fold change compared to LN in RLN and a 26-fold change compared to SLE without LN. In ad

En la presente tesis se han estudiado los distintos mecanismos de toxicidad de las micotoxinas citrinina y ocratoxina A y la respuesta adaptativa a xenobióticos en el modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae, concretamente la regulación de los transportadores multidrogas del sistema PDR y sus factores de transcripción. La respuesta a xenobióticos permite a las células eucariotas adaptarse y sobrevivir a la exposición de gran variedad de compuestos exógenos, como toxinas o fármacos. En esta respuesta participan distintos tipos de proteínas, principalmente transportadores de membrana y factores de transcripción. Para estudiar esta respuesta adaptativa sometimos las células de levadura a distintos tratamientos con las micotoxinas citrinina (CIT) y ocratoxina A (OTA), y los oxidantes menadiona (MEN), y peróxido de hidrógeno (H2O2). Las micotoxinas CIT y OTA son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos que contaminan alimentos básicos y que son tóxicas para el ser humano. Aquí, estudiamos sus mecanismos de toxicidad a través de experimentos de expresión génica con reporteros luciferasa, ensayos transcriptómicos, y ensayos fenotípicos con mutantes de pérdida de función para determinadas proteínas involucradas en la defensa antioxidante y de transporte multidroga. Los resultados muestran diferencia de los mecanismos de toxicidad entre ambas micotoxinas. CIT induce la expresión de genes involucrados en el transporte de drogas y la respuesta a estrés oxidativo, mientras que OTA activa, principalmente, la expresión de genes implicados en el desarrollo, como meiosis o esporulación, y en menor medida, genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y al transporte multidroga. En levadura, los transportadores multidroga de la membrana plasmática que eliminan compuestos tóxicos de la célula forman parte del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Este sistema está compuesto por proteínas conservadas de bacterias a humanos, como transportadores multi, In the present thesis, we have studied the different toxicity mechanisms of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A and the adaptive response to xenobiotics in the yeast model of Saccharomyces cerevisiae, specifically the regulation of the multidrug transporters of the PDR network and its transcription factors. The response to xenobiotics allows eukaryotic cells to adapt and survive the exposure to a wide variety of exogenous compounds, such as toxins or drugs. Different types of proteins participate in this response, mainly membrane transporters and transcription factors. To study this adaptive response we subjected the yeast cells to different treatments with the mycotoxins citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA), and oxidants menadione (MEN), and hydrogen peroxide (H2O2). The mycotoxins CIT and OTA are secondary metabolites produced by several filamentous fungi, which contaminate staple foods and which are toxic to humans. Here, we studied their toxicity mechanisms through gene expression experiments with luciferase reporters, transcriptomic assays, and phenotypic assays with loss-of-function mutants for certain proteins involved in antioxidant defense and multidrug transport. The results show differences in the mechanisms of toxicity between both mycotoxins. CIT induces the expression of genes involved in drug transport and the response to oxidative stress, whereas OTA activates, mainly, the expression of genes involved in development, such as meiosis or sporulation, and to a lesser extent, genes related to response to oxidative stress and multidrug transport. In yeast, multidrug transporters of the plasma membrane that remove toxic compounds from the cell are part of the PDR (pleiotropic drug resistance) network. This system is composed of proteins conserved from bacteria to humans, such as multidrug transporters and transcription factors. When these transporters are overexpressed, it leads to a phenomenon known as pleiotropic drug resistance (PDR) or multidrug, En la present tesi s'han estudiat els diferents mecanismes de toxicitat de les micotoxines citrinina i ocratoxina A i la resposta adaptativa a xenobiòtics en el model de llevat Saccharomyces cerevisiae, concretament la regulació dels transportadors multidroga del sistema PDR i els seus factors de transcripció. La resposta a xenobiòtics permet a les cèl·lules eucariotes adaptar-se i sobreviure a l'exposició de gran varietat de compostos exògens, com toxines o fàrmacs. En aquesta resposta participen diferents tipus de proteïnes, principalment transportadors de membrana i factors de transcripció. Per estudiar aquesta resposta adaptativa vam sotmetre les cèl·lules de llevat a diferents tractaments amb les micotoxines citrinina (CIT) i ocratoxina A (OTA), i els oxidants menadiona (MEN), i peròxid d'hidrogen (H2O2). Les micotoxines CIT i OTA són metabòlits secundaris produïts per diversos fongs filamentosos que contaminen aliments bàsics i que són tòxiques per a l'ésser humà. Ací, estudiem els seus mecanismes de toxicitat a través d'experiments d'expressió gènica amb reporters luciferasa, assaigs transcriptòmics, i assajos fenotípics amb mutants de pèrdua de funció per a determinades proteïnes involucrades en la defensa antioxidant i de transport multidroga. Els resultats mostren diferència dels mecanismes de toxicitat entre les dues micotoxines. CIT indueix l'expressió de gens involucrats en el transport de drogues i la resposta a estrès oxidatiu, mentre que OTA activa, principalment, l'expressió de gens implicats en el desenvolupament, com meiosi o esporulació, i en menor mesura, gens relacionats amb la resposta a estrès oxidatiu i al transport multidroga. En llevat, els transportadors multidroga de la membrana plasmàtica que eliminen compostos tòxics de la cèl·lula formen part del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Aquest sistema està compost per proteïnes conservades de bacteria a humans, com transportadors multidroga i factors de transcripció. Quan aquests tr

[ES] La mitofagia es un tipo específico de autofagia que tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial. Es además un proceso que asegura el mantenimiento de la calidad mitocondrial en situaciones de estrés, de hecho, un mal funcionamiento de los mecanismos moleculares implicados en la mitofagia está relacionado con distintas enfermedades en humanos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un sistema modelo muy valorado en la biología molecular de procesos básicos, y una excelente herramienta para el estudio de los procesos mitofágicos. Recientemente se ha encontrado que la adaptación al estrés requiere una activación mitocondrial selectiva, por ejemplo, en el caso del transportador de piruvato Mpc se basa en la regulación coordinada de subunidades específicas del complejo. Además, se ha demostrado que la actividad respiratoria alta y/o la pérdida del potencial de membrana mitocondrial por el tratamiento con valinomicina, aumenta la tasa de degradación de complejos específicos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Nuestros resultados previos muestran que existen mecanismos de mitofagia selectiva en estas condiciones, y nuestra investigación actual se centra en descifrar los mecanismos moleculares de este proceso. Hasta ahora el estudio de la mitofagia en levaduras se ha centrado casi exclusivamente en la mitofagia inducida por ayuno de nutrientes, mientras que en las células de mamíferos está bien establecido que la mitofagia contrarresta el daño causado por la despolarización de las mitocondrias, y su defecto se asocia a la enfermedad de Parkinson. En este contexto se pretende identificar reguladores del control de calidad mitocondrial. Por un lado, se buscará los reguladores transcripcionales que estén implicados en la reposición de componentes mitocondriales, y además intentaremos identificar aquellas proteínas que participen de forma activa en la mitofagia selectiva., [EN] Mitophagy is a specific type of autophagy that has an essential role in the maintenance of mitochondrial homeostasis. It is also a process that ensures the maintenance of mitochondrial quality in situations of stress. In fact, a malfunction of the molecular mechanisms involved in mitophagy is related to different diseases in humans. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a model highly valued in the molecular biology, and an excellent tool for the study of mitophagic processes. Recently it has been found that stress adaptation requires a selective mitochondrial activation, which in the case of the pyruvate transporter Mpc is based on the coordinated regulation of specific subunits of the complex. High respiratory activity and/or loss of mitochondrial membrane potential by valinomycin treatment, also increases the rate of degradation of specific sub-complexes of the mitochondrial electron transport chain. Our results show that there are mechanisms of selective mitophagy under these conditions, and our currentresearch focuses on deciphering the molecular mechanisms of this process. Before our findings the study of mitophagy in yeast has been almost exclusively focused at starvation induced mitophagy, whereas in mammalian cells it has been well established that mitophagy counteracts the damage caused by the depolarization of mitochondria, and its failure is associated with Parkinson’s disease. In this context, we intend to identify regulators of mitochondrial quality control we will look for transcriptional regulators that are involved in the renewal of mitochondrial components, moreover we will also try to identify those proteins that participateactively in selective mitophagy.

[EN] Repair and removal of damaged mitochondria is a key process for eukaryotic cell homeostasis. Here we investigate in the yeast model how different protein complexes of the mitochondrial electron transport chain are subject to specific degradation upon high respiration load and organelle damage. We find that the turnover of subunits of the electron transport complex I equivalent and complex III is preferentially stimulated upon high respiration rates. Particular mitochondrial proteases, but not mitophagy, are involved in this activated degradation. Further mitochondrial damage by valinomycin treatment of yeast cells triggers the mitophagic removal of the same respiratory complexes. This selective protein degradation depends on the mitochondrial fusion and fission apparatus and the autophagy adaptor protein Atg11, but not on the mitochondrial mitophagy receptor Atg32. Loss of autophagosomal protein function leads to valinomycin sensitivity and an overproduction of reactive oxygen species upon mitochondrial damage. A specific event in this selective turnover of electron transport chain complexes seems to be the association of Atg11 with the mitochondrial network, which can be achieved by overexpression of the Atg11 protein even in the absence of Atg32. Furthermore, the interaction of various Atg11 molecules via the C-terminal coil domain is specifically and rapidly stimulated upon mitochondrial damage and could therefore be an early trigger of selective mitophagy in response to the organelles dysfunction. Our work indicates that autophagic quality control upon mitochondrial damage operates in a selective manner.

One of the main unresolved problems of chronic wounds is related to the inflammatory response that takes place in the wound. Although inflammation is a protective reaction, when it is exaggerated or persistent it can be associated with tissue damage. In order to minimize this problem, advanced dressings incorporating natural compounds have been developed. These are EPA and DHA omega 3 fatty acids enriched with precursors of lipid mediators SPMs or SPMs that possess both anti-inflammatory and pro-operative capacity for inflammation, a very appropriate concept for chronic unresolved inflammations, such as Diabetics. Its encapsulation would allow the progressive and effective release over time, being able to incorporate to the wound in different dressings with different formats according to the characteristics and requirements of the wound. The purpose of this work is to study very well the characteristics of these final dressings and their influence on the wound by preclinical tests both in vitro and in vivo., Uno de los principales problemas no resueltos de las heridas crónicas, está relacionado con la respuesta inflamatoria que tiene lugar en la herida. Aunque la inflamación es una reacción de protección, cuando es exagerada o persistente puede asociarse con daño tisular. Con el objetivo de minimizar este problema se han empezado a desarrollar apósitos avanzados que incorporan compuestos naturales. Éstos son ácidos grasos omega 3 EPA y DHA enriquecidos con precursores de mediadores lipídicos SPMs o SPMs que poseen tanto capacidad anti-inflamatoria como pro-resolutiva de la inflamación, un concepto muy apropiado para las inflamaciones crónicas no resueltas, como pueden ser las heridas de diabéticos. Su encapsulación permitiría la liberación progresiva y efectiva en el tiempo, pudiéndose incorporar a la herida en diferentes apósitos con distintos formatos según las características y requisitos de la herida. El objeto de este trabajo es estudiar muy bien las características de estos apósitos finales y su influencia en la herida mediante ensayos preclínicos tanto in vitro como in vivo.

Insulin receptor substrate 2 (IRS2), a key effector in the transduction of canonical insulin signaling, has been implicated in the development of insulin resistance, a pathological condition that characterizes patients with type II diabetes. As a consequence of hyperinsulinemia, these patients develop a set of complications, in target organs such as the liver. It is thought that IRS2 could play a key role in the transition from progenitor cells to mature liver cells because deletion of IRS2 reduces the livers regenerative capacity. The central aim of this project was to characterize in detail the spatio-temporal patterning of IRS2 expression during early HepaRG hepatogenesis using fluorescence time-lapse microscopy. The data from this study suggest that IRS2 plays a direct role in HepaRG-hepatocyte differentiation, and hence we conclude that strategies to promote IRS2 expression could potentially favor regenerative processes in the context of chronic liver injury or hepatocarcinoma in which intratumoral differentiation is associated with better prognosis. Thus, in the final part of this project we have begun to adapt our experimental protocol to enable future high-throughput screening of compounds that can promote IRS2 expression and help to drive human hepatogenesis. Towards this goal, we tested two compounds, which had previously been shown to promote differentiation and we discuss how future modifications to our protocol may serve to identify novel compounds to be used in a possible "differentiation therapy¿., El sustrato 2 del receptor de insulina (IRS2), efector clave en la transducción de la señalización canónica de la insulina, se ha visto que está implicado en el desarrollo de resistencia a insulina, estado patológico que caracteriza a los enfermos de diabetes tipo II. Como consecuencia de la hiperinsulinemia éstos desarrollan un conjunto de complicaciones, siendo uno de los principales órganos diana afectados el hígado. Se piensa que IRS2 podría jugar un papel clave el proceso de transición de células progenitoras a células hepáticas maduras debido a que en su ausencia el hígado pierde su capacidad intrínseca de regeneración. El principal objetivo de este trabajo ha sido el diseño de un protocolo que ayudará en la caracterización espaciotemporal de IRS2 durante la hepatogénesis temprana de células HepaRG, mediante time-lapse de fluorescencia. Los resultados muestran que IRS2 juega un papel directo en la diferenciación de los hepatocitos en cultivos HepaRG, por tanto, concluimos que estrategias para promover la expresión de IRS2 potencialmente podrían favorecer los procesos regenerativos en el contexto de la lesión hepática crónica o hepatocarcinoma, en el que la diferenciación intratumoral se asocia con mejor pronóstico. Por lo tanto, en la parte final de este proyecto hemos comenzado a adaptar nuestro protocolo experimental para avanzar hacia un futuro cribado de alto rendimiento, de compuestos capaces de promover la expresión de IRS2 y ayudar a impulsar la hepatogénesis humana. Con este objetivo, hemos probado dos compuestos, que anteriormente han demostrado promover la diferenciación en cultivos de HepaRG y discutimos cómo futuras modificaciones de nuestro protocolo podrían servir para identificar nuevos compuestos que podrían ser usados en una "terapia de diferenciación".

Until now, the methodology used to determine the best antibiotic concentration to destroy biofilm formation has been based on antibiotic sensitivity tests. However, most of these tests are done on planktonic mode of growth or on culture plates, and not the real situation (the biofilm), thus the results obtained frequently lead to the wrong treatment. RTCA-technology (Real Time Cell Analysis) allows the measurement of biofilm formation in real time in a fast and simple way. This is why we believe that introducing this technology in biofilm-former microorganisms of clinical interest would be a useful alternative to determine the antibiotic sensitivity. Previously, this technology has been developed for Staphylococcus aureus and S. epidermitis (both gram-positive bacteria). In this project, our aim is to employ this technique for gram-negative bacteria and fungi, and for this reason we re going to study the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans strains in the presence and absence of antibiotics and antifungals of common use to treat this type of infections., Hasta ahora, la metodología que se utiliza para determinar qué concentración de antibiótico es la más adecuada para destruir la formación de biopelículas se hace mediante ensayos de sensibilidad sobre los microorganismos crecidos en forma plantónica o sobre placas de cultivo y no sobre la situación real, que es el biofilm, por lo que, a menudo, los resultados que se obtienen inducen a decisiones erróneas sobre la elección del tratamiento. La tecnología RTCA (Real Time Cell Analysis) permite medir a tiempo real la formación de biopelículas de una forma rápida y sencilla, por lo que implantar esta tecnología en microorganismos formadores de biofilm de interés clínico sería una alternativa altamente útil para determinar la sensibilidad a antibióticos. Anteriormente, la técnica se ha desarrollado para Staphylococcus aureus y S. epidermitis (ambas bacterias grampositivas). En este trabajo se pretende poner a punto esta técnica para bacterias gramnegativas y hongos, para lo cual se trabajará con cepas de Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans, estudiando la formación de biofilms de estas especies en presencia y ausencia de los antibióticos y antifúngicos de uso habitual en este tipo de infecciones.

Colorectal cancer (CRC) is the third most frequent cancer at global level. It is the second cause of cancer dead in Europe. His origin is multifactorial; it is caused due to genetic factors (such as for example inherit mutations on MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 and EPCAM genes, that are related to DNA damage reparation), but it is also caused by environmental factors and habits, like smoking, diets rich on fats, or aging. Conventional treatments are based on distinct combinations of chemotherapies drugs (specifically; FOLFOX, FOLFIRI and CapeOx combinations), antibody specific treatment (bevacizumab, an anti-VEGF, and cetixumab and panitumumab, both anti-EGFR-A), and surgery for small tumours removal. Unfortunately, these therapies are generally associated with graves withdrawal effects. What¿s more, it is frequent the cases where patients have aggressive tumours, in an important grade of metastasis and with resistance to conventional treatments. There exist also sometimes patients who suffer from recurrence problems. Life average in patients with CRC at advanced stages is between 20 and 24 months. Because of that, it is necessary to develop new and efficient treatments against CRC. Considering this situation, nanomedicine stands as a promising option. The use of nanoparticles as drugs delivery systems and with a specific targeting will be a breakthrough in the increasing of the treatment efficacy, concentrating the drug in the tumour. It also will solve the problems associated to withdrawal effects caused by using directly the free drug. Our objective is to use this approach to attack the cancer stem cells (CSC) subpopulation. CSC are a tumour cell subpopulation; they present the capacities of self-renew, tumorgenicity and aggressive. Different studies confirm their presence in CRC tumours. CSC share an important number of pathways with normal stem cells (such as Wtn, Noth and Hedgehog pathways). They have the capacity of modulating their own environment, and comparing wi, El cáncer colorrectal (CRC) es el tercer cáncer más frecuente a nivel mundial, siendo la segunda causa de muerte por cáncer en Europa. Tiene un origen multifactorial; esta causado tanto por factores genéticos (por ejemplo, mutaciones hereditarias en los genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 y EPCAM, genes relacionados con la reparación del daño al ADN) como ambientales y hábitos de vida, tales como el tabaquismo, las dietas ricas en grasas o el envejecimiento. Los tratamientos convencionales consisten en diferentes combinaciones de fármacos quimioterapéuticos (las combinaciones FOLFOX, FOLFIRI y CapeOx), terapia con anticuerpos (bevacizumab, con función anti-VEGF, cetuximab y panitumumab, con función anti-EGFR-A) y cirugía para la extracción de tumores de pequeño tamaño. Desgraciadamente, estas terapias generalmente están asociadas a una alta toxicidad y efectos secundarios. Además, son frecuentes los casos de pacientes con tumores agresivos y metástasis, en muchos casos resistentes a los tratamientos convencionales. En ciertos casos, también existen problemas de recurrencia del tumor tras el tratamiento. La esperanza de vida en pacientes que presentan el CRC en estados avanzados se encuentra entre 20-24 meses, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos tratamientos. En esta situación, la nanomedicina se presenta como una prometedora opción. El uso de nanopartículas como sistemas de liberación de los fármacos y con una diana específica permitiría una enorme mejora de la eficacia del tratamiento al concentrar el fármaco en el tumor. Por otro lado, al estar en una nanopartícula, se evitan muchos de los efectos secundarios asociados al fármaco libre. Nuestro objetivo es utilizar esta aproximación para atacar a la subpoblación de células madre de cáncer (CSC). Las células madre de cáncer (CSC), es una sub-población celular tumoral; presentan capacidad de autorenovación, tumorgenicidad y alta agresividad. Diferentes estudios confirman su presencia en los tumores de CRC. Comp

In the present work we study the metabolic adaptation in response to stress in the yeast model, and more specifically we investigate the regulation of peroxisomal activity and the metabolism of sphingolipids. Peroxisomes are dynamic organelles and the sole location for fatty acid ß-oxidation in yeast cells. Here we find that peroxisomal function is crucial for the adaptation to salt stress, especially upon sugar limitation. Multiple layers of control regulate both peroxisomal activity and number upon stress. Activated Hog1 MAP kinase triggers the induction of genes encoding enzymes for fatty acid activation, peroxisomal import and ß-oxidation through the Adr1 transcriptional activator, which transiently associates with genes encoding fatty acid metabolic enzymes in a stress- and Hog1-dependent manner. Moreover, Na+ and Li+ stress induces an increase in peroxisomal number per cell in a Hog1-independent manner, which depends instead of the retrograde pathway and the dynamin related GTPases Dnm1 and Vps1. The strong activation of the Faa1 fatty acyl-CoA synthetase, which specifically localizes to lipid particles and peroxisomes, indicates that adaptation to salt stress requires the enhanced mobilization of fatty acids from internal lipid stores. Taken together, these results suggest that stress-induced peroxisomal ß-oxidation triggers enhanced respiration upon salt shock. Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. However, how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates impinge on mitochondrial function is unknown. Here we found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1 and degradation via Hfd1 of hexadecenal is critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase ROS production and mitochondrial fragmentation and viceversa. The location of the hexadecenal degr, En el presente trabajo se estudia la adaptación metabólica en respuesta a estrés en el modelo de levadura, y de forma más concreta se investiga la regulación de la actividad peroxisomal y el metabolismo de esfingolípidos. Los peroxisomas son orgánulos dinámicos, encargados de forma específica de la ß-oxidación de ácidos grasos en células de levadura. Aquí se muestra cómo la función peroxisomal es crucial para la adaptación al estrés salino, especialmente en condiciones de ayuno de glucosa. Se regula a múltiples niveles tanto la actividad peroxisomal como su número ante condiciones de estrés. La activación de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducción de genes que codifican enzimas para la activación, importación peroxisomal y ß-oxidación de los ácidos grasos. Esta regulación génica ocurre a través del activador transcripcional Adr1, que se asocia transitoriamente con los genes que codifican enzimas metabólicas de ácidos grasos de una manera dependiente del estrés y de Hog1. Además, el estrés causado por Na+ y Li+, provoca un aumento en el número de peroxisomas por célula de manera independiente de Hog1, que depende a su vez de la ruta retrógrada y de las dinaminas GTPasas Dnm1 y Vps1. La fuerte activación de la acil-CoA sintetasa Faa1, que se localiza específicamente en las partículas lipídicas y los peroxisomas, indica que la adaptación a estrés salino requiere una mayor movilización de ácidos grasos de los almacenes de lípidos internos. Estos resultados indican que la ß-oxidación peroxisomal inducida por estrés desencadena un aumento de la respiración ante el choque salino. Los esfingolípidos son reguladores de la muerte celular mediada por la mitocondria en eucariotas superiores. Sin embargo, se desconoce cómo, cambios en el metabolismo de los esfingolípidos y en intermediarios aguas abajo, afectan a las funciones mitocondriales. En este trabajo se describe cómo en la ruta de degradación de esfingolípidos de levadura, la producción de hexadecenal a través de Dp, Al present treball s'estudia l'adaptació metabòlica en resposta a estrés al model de llevat, i de forma més concreta s'investiga la regulació de l'activitat peroxisomal i el metabolisme d'esfingolípids. Els peroxisomes són orgànuls dinàmics, encarregats de forma específica de la ß-oxidació dels àcids grassos en cèl·lules de llevat. Ací es mostra com la funció peroxisomal es crucial per a l'adaptació a l'estrés salí, especialment en condicions de dejuni de glucosa. Es regula a múltiples nivells tant l'activitat peroxisomal com el seu número, davant de condicions d'estrés. L'activació de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducció de gens que codifiquen enzims per a l'activació, importació peroxisomal i ß-oxidació dels àcids grassos. Aquesta regulació génica té lloc mitjançant l'activador transcripcional Adr1, que s'assòcia transitoriamente amb els gens que codifiquen enzims metabòliques d'àcids grassos d'una manera dependent de l'estrés i de Hog1. A més, l'estrés causat per Na+ i Li+, provoca un augment en el número de peroxisomes per cèl·lula de manera independent de Hog1, que depén a la vegada de la ruta retrògrada i de les dinamines GTPases Dnm1 i Vps1. La forta activació de la acil-CoA sintetasa Faa1, que es localitza específicament a les partícules lipídiques i als peroxisomes, indica que l'adaptació a estrés salí necesita d'una major movilització d'àcids grassos dels magatzems de lípids interns. Estos resultats indiquen que la ß-oxidació peroxisomal induïda per estrés desencadena un augment de la respiració davant el xoc salí. Els esfingolípids són reguladors de la mort cel·lular mitjada per la mitocóndria en eucariotes superiors. No obstant, es desconeix cóm, canvis al metabolisme dels esfingolípids i en intermediaris aigües baix, afecten a les funcions mitocondrials. En aquest treball es descriu cóm en la ruta de degradació de esfingolípids de llevat, la producció d'hexadecenal mitjançant Dpl1 i la seua degradació mitjançant Hfd1, és crítica per a la funció m

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematologic malignancy characterized by the accumulation of hematopoietic mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. Leukemic stem cells acquire a broad spectrum of cooperating genetic (chromosomic and molecular) and epigenetic lesions, which leads to proliferation, apoptosis and differentiation deregulation and transformation of hematopoietic stem cells 1,2 Cytogenetic analyses allow patient stratification in different risk groups that can be treated accordingly. Normal karyotype AML (NK-AML) represents 50% of patients and it is included within the intermediate risk group, Howerver, his group shows a very heterogeneous clinical outcome. Therefore, identification of molecular alterations is especially relevant in this group in order to apply the most appropriate therapeutic strategy. The Cancer Genome Atlas (TCGA) described the most recurrently mutated genes in AML and recently, they have proposed 9 functional categories in which genes are grouped according to their biological function. This functional classification suggests new cooperations in the development of the leukemic phenotype (transcription-factor fusions, gene encoding nucleophosmin, tumor-suppressor genes, DNA-methylation-related genes, signaling genes, chromatin-modifying genes, myeloid transcription-factor genes, cohesin-complex genes, and spliceosome-complex genes)3. Besides genetic factors, recent studies demonstrated that epigenetic alterations such as aberrant DNA promoter methylation and aberrantly expressed microRNAs (miRNAs) play an important role in the pathogenesis of AML5. miRNAs are small non-coding RNA molecules which hybridize to the 3¿-untranslated regions (3¿ UTR) of messenger RNAs (mRNAs) and cause their post-transcripcional regulation. Therefore, when miRNA expression is modified, they are able to act as tumor suppressors or oncogenes, altering gene expression and consequently signaling pathways. In this sense, miRNA control processes s, La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica caracterizada por la acumulación de células hematopoyéticas mieloides inmaduras en la médula ósea y en sangre periférica. Estas células adquieren un amplio espectro de alteraciones genéticas (cromosómicas y moleculares) y epigenéticas que alteran la proliferación, apoptosis y los procesos de diferenciación1,2 y contribuyen a la transformación maligna. Las alteraciones citogenéticas permiten la estratificación de los pacientes en distintos grupos de riesgo, sin embargo, aproximadamente un 50% de las LMAs no muestran ninguna alteración citogenética, presentando un cariotipo normal (LMA-CN). Este grupo de pacientes se cataloga de riesgo intermedio, si bien su desarrollo evolutivo es muy heterogéneo. Por ello, la identificación de alteraciones moleculares en este grupo es especialmente relevante a la hora refinar la clasificación del riesgo y por tanto poder aplicar la estrategia terapéutica más adecuada para cada paciente. El Cancer Genome Atlas (TCGA) describió los genes más frecuentemente mutados en la LMA y los ha agrupado, en base a su función, en 9 categorías funcionales, destacando así nuevas cooperaciones en el desarrollo del fenotipo leucémico (metilación del DNA, modificadores de la cromatina, factores de transcripción mieloides, supresores de tumores, nucleofosmina, cohesina, señales de activación, espliceosoma y fusiones de factores de transcripción)3. Además recientes estudios han demostrado que las alteraciones epigenéticas como la metilación aberrante de los promotores o la expresión aberrante de microRNAs (miRNAs) tienen un papel relevante en la leucemogénesis5 Los miRNAs, moléculas de RNA no codificante, se unen a las regiones no traducidas en el extremo 3¿ (3¿-UTR) de los RNA mensajeros (mRNA) provocando su regulación postranscripcional. De este modo, cuando la expresión de los miRNAs se ve alterada, pueden actuar como supresores tumorales u oncogenes, alterando la expresión génica y consec

[ES] El control de calidad de las mitocondrias es una función esencial de las células eucariotas. En los seres humanos, la falta de eliminación de las mitocondrias dañadas o disfuncionales es una causa de neurodegeneración. Un importante mecanismo de control de calidad mitocondrial es la degradación regulada de las partes dañadas del orgánulo por vías autofágicas denominada mitofagia. En este trabajo se investiga en el modelo de levadura, si complejos específicos del transporte de electrones (ETC) se degradan diferencialmente en condiciones de estrés celular. Este trabajo pretende ampliar los estudios anteriores de nuestro grupo de investigación que mostraron evidencia de una degradación selectiva de los complejos mitocondriales y que la proteína Atg11 era necesaria para este reciclaje mitocondrial. En este trabajo se quiere ampliar estos estudios y (i) medir las tasas de degradación de subunidades específicas de CII, CIII y CV con diferentes grados de respiración y daños mitocondriales, (ii) visualizar mediante microscopía de fluorescencia el proceso de mitofagia en respuesta al daño mitocondrial, (iii) evaluar la importancia de diferentes proteínas Atg para el crecimiento eficiente a altas tasas de respiración y daño mitocondrial y (iv) comprobar cuáles de estas proteínas están involucradas en la generación de mayor estrés oxidativo al inducir un daño mitocondrial., [EN] The quality control of mitochondria is an essential function of eukaryotic cells. In humans, failure to remove damaged or dysfunctional mitochondria are the cause of neurodegeneration. One important mechanism of mitochondrial quality control is the regulated degradation of the damaged parts of the organelle by autophagic pathways termed mitophagy. In this work we investigate in the yeast model, whether specific respiratory or electron transport complexes (ETC) are differentially degraded upon cellular stress. Previous results from our group of investigation show evidence of selective ways of mitochondrial complex degradation and that Atg11 protein was required for this mitochondrial recycling. Here we want to extend these studies and (i) measure the degradation rates of specific subunits of CII, CIII and CV upon different respiratory activity and mitochondrial damage, (ii) visualize by fluorescence microscopy the process of mitophagy upon mitochondrial damage, (iii) evaluate the importance of different Atg proteins for efficient growth upon high respiration rates and mitochondrial damage and (iv) test which of these proteins are necessary for ROS balance upon mitochondrial damage.

[EN] Here, we review and update the recent advances in the metabolic control during the adaptive response of budding yeast to hyperosmotic and salt stress, which is one of the best understood signaling events at the molecular level. This environmental stress can be easily applied and hence has been exploited in the past to generate an impressively detailed and comprehensive model of cellular adaptation. It is clear now that this stress modulates a great number of different physiological functions of the cell, which altogether contribute to cellular survival and adaptation. Primary defense mechanisms are the massive induction of stress tolerance genes in the nucleus, the activation of cation transport at the plasma membrane, or the production and intracellular accumulation of osmolytes. At the same time and in a coordinated manner, the cell shuts down the expression of housekeeping genes, delays the progression of the cell cycle, inhibits genomic replication, and modulates translation efficiency to optimize the response and to avoid cellular damage. To this fascinating interplay of cellular functions directly regulated by the stress, we have to add yet another layer of control, which is physiologically relevant for stress tolerance. Salt stress induces an immediate metabolic readjustment, which includes the up-regulation of peroxisomal biomass and activity in a coordinated manner with the reinforcement of mitochondrial respiratory metabolism. Our recent findings are consistent with a model, where salt stress triggers a metabolic shift from fermentation to respiration fueled by the enhanced peroxisomal oxidation of fatty acids. We discuss here the regulatory details of this stress-induced metabolic shift and its possible roles in the context of the previously known adaptive functions.

[EN] Peroxisomes and mitochondria are the main intracellular sources for reactive oxygen species. At the same time, both organelles are critical for the maintenance of a healthy redox balance in the cell. Consequently, failure in the function of both organelles is causally linked to oxidative stress and accelerated aging. However, it has become clear that peroxisomes and mitochondria are much more intimately connected both physiologically and structurally. Both organelles share common fission components to dynamically respond to environmental cues, and the autophagic turnover of both peroxisomes and mitochondria is decisive for cellular homeostasis. Moreover, peroxisomes can physically associate with mitochondria via specific protein complexes. Therefore, the structural and functional connection of both organelles is a critical and dynamic feature in the regulation of oxidative metabolism, whose dynamic nature will be revealed in the future. In this review, we will focus on fundamental aspects of the peroxisome-mitochondria interplay derived from simple models such as yeast and move onto discussing the impact of an impaired peroxisomal and mitochondrial homeostasis on ROS production, aging, and disease in humans.

[EN] Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. Here, we investigate how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates of sphingosine impinge on mitochondrial function. We found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1p and degradation via Hfd1p of hexadecenal are critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase reactive oxygen species production and mitochondrial fragmentation and vice versa. The location of the hexadecenal-degrading enzyme Hfd1p in punctuate structures all along the mitochondrial network depends on a functional ERMES (endoplasmic reticulum-mitochondria encounter structure) complex, indicating that modulation of hexadecenal levels at specific ER-mitochondria contact sites might be an important trigger of cell death. This is further supported by the finding that externally added hexadecenal or the absence of Hfd1p enhances cell death caused by ectopic expression of the human Bax protein. Finally, the induction of the sphingolipid degradation pathway upon stress is controlled by the Hog1p MAP kinase. Therefore, the stress-regulated modulation of sphingolipid degradation might be a conserved way to induce cell death in eukaryotic organisms.

[EN] This project aims to develop a protocol for the metabolic analysis of bladder tumoral tissues by mass spectrometry. For this purpose, we will study with 9 samples of tissue from the same patient, what kind of solvent and extraction conditions are optimal. Once determined, a study " proof of concept level" will be done with 10 tissues from tumoral bladders and 10 from healthy tissues in order to determinate if exist significant differences between the metabolomic profiles obtained by mass spectrometry., [ES] Este proyecto pretende desarrollar un protocolo para el análisis metabolómico de tejido tumoral vesical mediante espectrometría de masas. Para ello, se estudiará con 9 muestras de tejido del mismo paciente, que disolvente y que condiciones de extracción son las óptimas. Una vez determinadas, se realizará un estudio a nivel "prueba de concepto" con 10 tejidos de vejigas tumorales de diferentes pacientes y 10 sanos para determinar si existen diferencias significativas entre los perfiles metabolomicos obtenidos por espectrometría de masas.

[EN] Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is currently the most common cause of chronic liver disease in Western countries. It has a prevalence of 20-30% in the general population, which rises up to a 70-90% in patients with the metabolic syndrome. In recent years researchers have solved some mechanisms of this disease but there are still many unresolved issues, there is a type of NAFLD there has been few investigated, NAFLD drug iatrogenic. Recent omics analyses and previous laboratory results that steatotic pro-drugs alter the expression of numerous transcription factors and cause significant disturbances in the transcriptome of the mouse liver. All these drugs could generate a unique signature or fingerprint which could serve to identify drug steatosis. In this context microRNAs would be the most appropriate biomarkers because it can also be detected in the bloodstream and allow non-invasive clinical diagnosis. Moreover, miRNAs play a key role in the regulation of gene expression and in the molecular base of many diseases. Therefore, the first objective was the selection of a miRNAs quantifying method, performing a comparison of four different methods. We also analyzed by microarray the miRNoma changes caused by the drug model steatosic: cyclosporine A. Then, we select potential miRNA biomarkers and we measure them in HepG2 cell cultures treated with drugs steatotic (valproate, doxycycline, amiodarone, cyclosporin A and tamoxifen) and non-steatotic (citrate, amitriptyline and ketotifen). Statistical analysis of the results allowed selecting the best miRNA biomarkers of steatosis iatrogenic (miR-3929, miR-21-3p, miR-22-5-p, miR-27a-5p, miR-126-3p…). Finally, and since miRNAs are present in body fluids, a sensitive and specific method of quantification of miRNAs in plasma was developed, to to assess, through that specific fingerprint, drug steatosis in patients diagnosed with NAFLD. (, [ES] La enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) es hoy día la causa más común de hepatopatía crónica en los países occidentales. Su prevalencia es del 20-30% en la población general y del 70-90% en los pacientes con síndrome metabólico. En los últimos años se han descifrado algunos mecanismos de esta enfermedad pero todavía quedan muchos aspectos sin resolver, existiendo un tipo de EHGNA que ha sido poco investigada, la esteatosis iatrogénica o EHGNA por medicamentos. Análisis ómicos recientes y resultados previos del laboratorio demuestran que los fármacos pro-esteatósicos alteran la expresión de numerosos factores de transcripción y causan una perturbación transcriptómica en el hígado. Todos estos fármacos podrían generar una firma o huella singular que podría servir para identificar la esteatosis por medicamentos. En este contexto los microRNAs serían los biomarcadores más adecuados ya que también se pueden detectar en el torrente circulatorio y permiten un diagnóstico clínico no invasivo. Además, los miRNAs tienen un papel clave en la regulación de la expresión génica y en la base molecular de numerosas patologías. Por ello, el primer objetivo del trabajo fue la selección de un método de cuantificación de miRNAs, realizándose una comparación entre cuatro procedimientos distintos. También analizamos por microarray los cambios en el miRNoma provocados por un fármaco esteatósico modelo: la ciclosporina A. Seguidamente, seleccionamos potenciales miRNA biomarcadores y los medimos en cultivos celulares de HepG2 tratados con fármacos esteatósicos (valproato, doxiciclina, amiodarona, ciclosporina A y tamoxifeno) y no esteatósicos (citrato, amitriptilina y ketotifeno). El análisis estadístico de los resultados permitió seleccionar los mejores miRNA biomarcadores de esteatosis iatrogénica (miR-3929, miR-21-3p, miR-22-5-p, miR-27a-5p, miR-126-3p…). Por último, y dado que los miRNAs se encuentran presentes en los fluidos corporales, se desarrolló un método sensible

[EN] Citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA) are important mycotoxins, which frequently co-contaminate foodstuff. In order to assess the toxicologic threat posed by the two mycotoxins separately or in combination, their biological effects were studied here using genomic transcription profiling and specific live cell gene expression reporters in yeast cells. Both CIT and OTA cause highly transient transcriptional activation of different stress genes, which is greatly enhanced by the disruption of the multidrug exporter Pdr5. Therefore, we performed genome-wide transcription profiling experiments with the pdr5 mutant in response to acute CIT, OTA, or combined CIT/OTA exposure. We found that CIT and OTA activate divergent and largely nonoverlapping gene sets in yeast. CIT mainly caused the rapid induction of antioxidant and drug extrusion-related gene functions, while OTA mainly deregulated developmental genes related with yeast sporulation and sexual reproduction, having only a minor effect on the antioxidant response. The simultaneous exposure to CIT and OTA gave rise to a genomic response, which combined the specific features of the separated mycotoxin treatments. The application of stress-specific mutants and reporter gene fusions further confirmed that both mycotoxins have divergent biological effects in cells. Our results indicate that CIT exposure causes a strong oxidative stress, which triggers a massive transcriptional antioxidant and drug extrusion response, while OTA mainly deregulates developmental genes and only marginally induces the antioxidant defense.

[EN] Lung cancer is one of the cancers with highest incidence in humans, responsible for the highest rates of cancer mortality worldwide. Lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 80% of all lung tumors. NSCLC represents a very heterogeneous tumor and the majority acquires resistance to available therapeutic agents. Despite important advances in the knowledge of the genetic alterations and aberrations in the signaling pathways, and the use of targeted therapies overall survival of patients with lung cancer remains low, less than 15% at 5 years. It is therefore an urgent need to develop new therapies in the fight against lung cancer. The model of cancer stem cells (CSCs) has attracted attention in recent years as a viable explanation for the heterogeneity, resistance to drugs, the latency and the recurrence and metastasis of different tumors. However, cancer stem cells have been relatively less characterized in lung cancers. It has been determined that the CSCs are the first components of the tumor that lead to tumor progression and metastasis. In addition to their ability to self-renew and differentiate, these cells are resistant to conventional chemotherapy. The objective of this work is to isolate and characterize CSCs derived from patients with NSCLC tumors. To address this characterization we will analyze the expression of surface and markers of proteins involved in different signaling pathways. The obtained profiles based on the expression of proteins will be essential in the understanding of the oncogenic signaling networks activated in these cells. These datawill be used to design potential strategies that can inhibit the signaling pathways that lead to pluripotency, in an effort to eradicate these cells and fight against lung cancer., [ES] El cáncer de pulmón es uno de los cánceres con mayor incidencia en el ser humano, responsable de los mayores índices de mortalidad oncológica a escala mundial. El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa aproximadamente el 80% de todos los tumores de pulmón. Se caracteriza por ser muy heterogéneo y la mayoría de los casos adquiere resistencia a los agentes terapéuticos disponibles. A pesar de los importantes avances en el conocimiento de las alteraciones genéticas y en las vías de señalización, y del uso de terapias dirigidas, la supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón sigue alrededor del 15% a los 5 años. Por lo tanto, es una necesidad urgente desarrollar nuevas terapias en la lucha contra el cáncer de pulmón. El modelo de células madre tumorales (CMTs) ha atraído la atención en los últimos años como una explicación viable para la heterogeneidad, la resistencia a los medicamentos, la latencia y la recurrencia y metástasis de diversos tumores. Sin embargo, las células madre tumorales han sido relativamente menos caracterizadas en los cánceres de pulmón. Se ha determinado que las CMTs son los primeros componentes del tumor que dan lugar a la progresión tumoral y metástasis. Además de su habilidad para renovarse y diferenciarse, estas células son resistentes a la quimioterapia convencional. El objetivo de este trabajo es aislar y caracterizar CMTs derivadas de tumores de pacientes con CPNM. Para abordar esta caracterización analizaremos la expresión de marcadores de superficie y de proteínas implicadas en diferentes rutas de señalización. Los perfiles obtenidos basados en la expresión de proteínas serán esenciales en la comprensión de las redes de señalización oncogénicas activadas en estas células y se utilizarán para diseñar estrategias potenciales que puedan inhibir las vías de señalización que conducen a la pluripotencia, en un esfuerzo por erradicar estas células y combatir el cáncer de pulmón.

[ES] La mitocondria es un orgánulo altamente dinámico, la actividad mitocondrial es muy sensible al entorno, es decir a las condiciones metabólicas celulares. Existen procesos moleculares bien descritos que garantizan el llamado control de calidad mitocondrial, como son la biogénesis mitocondrial y la mitofagia; ambos procesos se regulan fuertemente por variaciones ambientales. Deficiencias en la homeostasis mitocondrial están asociados a distintas enfermedades neurológicas en seres humanos. Un fallo en el sistema de control de calidad mitocondrial supone un desajuste metabólico, la acumulación de daños por el incremento del estrés oxidativo, y en último término puede derivar en procesos apoptóticos. En eucariotas superiores mitofagia y apoptosis están interconectados, de hecho ambos fenómenos comparten algunos de sus componentes moleculares más importantes, aunque todavía no se entiende demasiado como se dispara de forma específica cada uno de estos procesos. La levadura es un sistema modelo estupendo para el estudio de biogénesis mitocondrial y la mitofagia, pero no lo es tanto para los estudios de apoptosis, debido principalmente a la ausencia de elementos claves como son las proteínas de la familia Bcl-2. Sin embargo el empleo de levaduras humanizadas con miembros apoptóticos y antiapoptóticos de la familia Bcl-2, sorprendentemente ha demostrado que es un excelente sistema modelo para entender el proceso de apoptosis a nivel molecular. El TFG tendrá como objetivo vislumbrar nuevas rutas de regulación sobre los procesos de mitofagia y apoptosis, con el fin de poder alcanzar un conocimiento más completo del escenario molecular., [EN] The mitochondria is a highly dynamic organelle, the mitochondrial activity is very sensitive to the environment and the cell metabolic conditions. There are well described molecular processes that guarantee the so-called mitochondrial quality control, such as mitochondrial biogenesis and mitophagy; both processes are profoundly regulated by environmental variations. Deficiencies in mitochondrial homeostasis are associated with various neurological diseases in humans. A malfunction in mitochondrial quality control will induce a metabolic imbalance, accumulation of damage by increasing oxidative stress, and might eventually lead to apoptotic processes. In higher eukaryotes mitophagy and apoptosis are interconnected, both phenomena in fact share some of their most important molecular components, although up to date we don't understand how each of these processes is specifically regulated. Yeast is a wonderful model system for the study of mitochondrial biogenesis and mitophagy, but it is not for studies of apoptosis, mainly due to the absence of key elements such as proteins of the Bcl-2 family. However, the use of humanized yeast with apoptotic and anti-apoptotic members of the Bcl2 family, has surprisingly proved to be an excellent model system for understanding the process of apoptosis. The TFG will aim to discern new regulatory pathways to apoptosis and mitophagy, in order to achieve a more complete understanding at the molecular level.

[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specif, [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condicione, [CA] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electròn

[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in respon, [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumen, [CA] Les cèl·lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl·lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel·lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa

[EN] Fungi (yeasts) and human cells have developed defense systems against a wide variety of chemical compounds (toxins, drugs, etc). These adaptive responses are known as the "Pleiotropic Drug Resistance (PDR)". Activation of PDR in fungi can cause a hyperresistance against anti fungal treatments and can cause resistance to anti-tumor treatments in human cells. The central part of PDR form multiple transcriptional activators that activate gene expression of different types of ABC transporters. Result of the activation of PDR is the overexpression of one or more multi drug exporters which help the cell to lower the intracellular levels of the chemical. In yeast, activators such as the "zinc cluster" proteins Pdr1, Pdr3 and others are responsible for the rapid transcriptional activation of genes encoding drug transporters such as PDR5, PDR15, SNQ2, YOR1 and others through promoter sequences called PDRE ("Pleiotropic Drug Resistance Element"). It is not yet understood how a wide variety of chemical compounds activate the defense throuhg PDR in a specific manner for each drug or toxin. In the proposed work we will examine and, if possible, genetically decipher the transcriptional activation of several multi drug transporter genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae in response to different therapeutical molecules with anti-tumor and anti-inflammatory characteristics. As an experimental tool, a reporter system based of destabilized luciferase (lucCP+) will be applied to quantify in real time and in vivo the activation of gene expression in response to different drugs. Yeast strains with several promoters of genes for drug transporters such as PDR5, PDR15, SNQ2 and YOR1 fused to lucCP+ will be used. The following chemical agents will be applied: Menadione (control treatment for induction of yeast PDR), Paclitaxel (anti-cancer agent), doxorubicin (antibiotic anthracycline family member with extensive applications in chemotherapy), Cyclosporine A (potent suppressor of th, [ES] Hongos (levaduras) y células humanas tienen sistemas de defensa contra una gran diversidad de compuestos químicos (toxinas, drogas, fármacos etc). Estas respuestas adaptativas se llaman generalmente ¿Resistencia pleiotrópica a drogas¿ o ¿Pleiotropic Drug Resistance (PDR)¿. La activación de PDR en hongos puede causar una hiperresistencia de hongos patógenos a tratamientos anti fúngicos y en células humanas puede causar la resistencia a tratamientos anti tumorales. La parte central de PDR forman múltiples activadores transcripcionales que activan la expresión génica de diferentes tipos de transportadores de la familia ABC. Resultado de la activación de PDR es la sobreexpresión de uno o varios exportadores multi droga que ayuda a la célula de bajar los niveles intracelulares del compuesto químico. En levadura son los activadores del tipo ¿zinc cluster¿ como Pdr1, Pdr3 y otros que se encargan de la rápida activación transcripcional de genes que codifican transportadores multi droga como PDR5, PDR15, SNQ2, YOR1 y otros a través de secuencias promotoras denominadas PDRE (¿Pleiotropic Drug Resistance Element¿). Aún no se entiende como una gran diversidad de compuestos químicos activa una defensa PDR específica para cada droga o toxina. En este trabajo queremos estudiar y, si es posible, descifrar genéticamente la activación transcripcional de varios transportadores multi droga en la levadura Saccharomyces cerevisiae en respuesta a distintas moléculas de uso anti tumoral y anti inflamatorio. Como herramienta experimental se aplicará el sistema reportero de la luciferasa desestabilizada (lucCP+) para cuantificar en tiempo real e in vivo la activación de la expresión génica en respuesta a los diferentes fármacos. Se usarán cepas de levadura que tienen fusionados con lucCP+ varios promotores de genes para transportadores multi droga como PDR5, PDR15, SNQ2 y YOR1. En los tratamientos químicos se incluirán, entre otros, los siguientes agentes: Menadiona (tratamiento control

Cells respond to environmental stimuli by fine-tuned regulation of gene expression. Here we investigated the dose-dependent modulation of gene expression at high temporal resolution in response to nutrient and stress signals in yeast. The GAL1 activity in cell populations is modulated in a well-defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic change of histone remodeling and RNA polymerase II (RNAPII) association. This behavior is the result of a heterogeneous induction delay caused by decreasing inducer concentrations across the population. Chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression, because mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose-response profiles. In contrast, the GRE2 promoter operates like a rapid off/on switch in response to increasing osmotic stress, with almost constant expression rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 mitogen-activated protein (MAP) kinase seem to determine the different dose-response strategies at the two promoters. Accordingly, GAL1 becomes highly sensitive and dose independent if previously stimulated because of residual Gal3 levels, whereas GRE2 expression diminishes upon repeated stimulation due to acquired stress resistance. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose-sensitive gene expression outputs.

[EN] The main objective of this project is the study and characterization of different isoforms of the SUS1 gene in Saccharomyces cerevisiae. Elimination of introns in eukaryotes is a co/post transcriptional process which occurs in the nucleus of eukaryotic cells, by means of which sequences called ¿introns¿ are removed from a molecule of messenger RNA (mRNA), while the ¿exons¿, which code for proteins, are kept in the molecule. This process of splicing is strongly regulated, being one of the main mechanisms that play an important role in gene expression regulation and protein diversity. Furthermore, there is a process called ¿alternative splicing¿, which taking advantage of combining the different exonic and intronic sequences of a gene, allows the production of different proteins from a single gene. In particular during the development of this project, SUS1 gene will be studied, whose protein is involved at different steps of the gene expression pathway. Sus1 is necessary for histone H2B deubiquitination, mRNA export and gene gating, being part of the protein complexes SAGA and TREX-2 respectively. Moreover, interesting observations also suggest a link with the cytoplasmatic mRNP fate, being related to structures called P-bodies. However, the main feature of said gene is the fact that it has two introns, since just 5% of the total of genes of S. cerevisiae present introns, of which less than 2% have the two that can be found in SUS1 gene. It also worth noting that secondary structure plays a very important role in splicing regulation. Besides, by means of a transcriptomic analysis of this organism, a circular variant of the RNA of the second exon of SUS1 has been found (cE2RNA), being its function still unknown. This project will try to characterize this circular RNA molecule (cE2RNA) and study its possible biological function. In order to address this, these main goals will be undertaken: 1- The confirmation of the circular RNA (cE2RNA). 2- A strain containing a, [ES] El objetivo principal del presente proyecto es el estudio y caracterización de diferentes isoformas del gen SUS1 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La eliminación de los intrones es un proceso co/post-transcripcional que ocurre en el núcleo de las células eucariotas, mediante el cual se eliminan de la molécula de ARN mensajero (ARNm) unas secuencias denominadas ¿intrones¿, manteniéndose los ¿exones¿ que son codificantes en la molécula. Este es un proceso de splicing está fuertemente regulado, siendo uno de los mecanismos implicados en la regulación de la expresión génica y en la diversidad de proteínas. Además, existe un proceso denominado ¿splicing alternativo¿, mediante el cual, al combinarse los distintos exones e intrones de un mismo gen, pueden generarse múltiples proteínas diferentes a partir de un único gen. Concretamente, durante el desarrollo de este proyecto, se estudiará el gen SUS1, cuya proteína está implicada en diferentes pasos de la ruta de expresión génica. Sus1 es necesaria para la desubicuitinación de la histona H2B, el exporte de ARN mensajeros y el acercamiento de los genes hacia el complejo del poro nuclear, siendo parte de los complejos proteicos SAGA y TREX-2 respectivamente. Además, observaciones sugieren un vínculo con el destino de las ribonucleoporteínas mensajeras (mRNP) en el citoplasma, estando relacionada con unas estructuras denominadas cuerpos-P. No obstante, la principal característica de este gen es que presenta dos intrones, pues solamente el 5% de los genes de S. cerevisiae presenta algún intrón, y de éstos menos del 2% presentan los dos que se pueden encontrar en SUS1. Es importante también remarcar que la estructura secundaria de éstos juega un papel muy importante en la regulación del splicing. Además, mediante análisis transcriptómico de este organismo, se ha podido localizar la presencia de una variante circular del ARN del segundo exón de SUS1 (cE2ARN), pero su función es hasta el momento desconocida. En este pr

This research was originally published in Journal of Biological Chemistry, 2015 - 16 : 10175- 10163 © the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, [EN] Stress triggers complex transcriptional responses, which include both gene activation and repression. We used time-resolved reporter assays in living yeast cells to gain insights into the coordination of positive and negative control of gene expression upon salt stress. We found that the repression of housekeeping genes coincides with the transient activation of defense genes and that the timing of this expression pattern depends on the severity of the stress. Moreover, we identified mutants that caused an alteration in the kinetics of this transcriptional control. Loss of function of the vacuolar H+-ATPase (vma1) or a defect in the biosynthesis of the osmolyte glycerol (gpd1) caused a prolonged repression of housekeeping genes and a delay in gene activation at inducible loci. Both mutants have a defect in the relocation of RNA polymerase II complexes at stress defense genes. Accordingly salt-activated transcription is delayed and less efficient upon partially respiratory growth conditions in which glycerol production is significantly reduced. Furthermore, the loss of Hog1 MAP kinase function aggravates the loss of RNA polymerase II from housekeeping loci, which apparently do not accumulate at inducible genes. Additionally the Def1 RNA polymerase II degradation factor, but not a high pool of nuclear polymerase II complexes, is needed for efficient stress-induced gene activation. The data presented here indicate that the finely tuned transcriptional control upon salt stress is dependent on physiological functions of the cell, such as the intracellular ion balance, the protective accumulation of osmolyte molecules, and the RNA polymerase II turnover.

[ES] La levadura es un organismo unicelular que está expuesto a un entorno cambiante, con lo cual puede sufrir distintos tipos de estrés. Para poder adaptarse de manera rápida y eficaz a este entorno cambiante y hacer frente al estrés, las levaduras han desarrollado mecanismos de defensa y adaptación. Estos mecanismos incluyen la síntesis de proteínas, fluctuaciones del ciclo celular, etc., siendo esencial los cambios es los patrones de expresión génica. Además, se conoce la existencia del fenómeno de memoria transcripcional. Este fenómeno consiste en que una célula que previamente ha sido expuesta a una dosis de estrés no letal, proporciona una respuesta más rápida y eficaz cuando es sometida a un estrés posterior en un periodo corto de tiempo. En este trabajo se ha utilizado el sistema luciferasa para medir los cambios en la expresión génica in vivo y a tiempo real. El objetivo de este trabajo fue la construcción de un sistema integrativo de luciferasa desestabilizada. Este sistema fue aplicado al promotor osmoinducible GRE2 de levadura y de esta manera se consiguió estudiar la dinámica transcripcional de este gen en respuesta a estrés, comparando la construcción integrativa con una construcción plasmídica desarrollada con anterioridad. Además, se estudió también el fenómeno de memoria transcripcional en el gen GRE2 en respuesta a estrés osmótico. Como conclusión, el sistema integrativo de luciferasa desestabilizada permitió el estudio a nivel genómico de la dinámica transcripcional en respuesta a estrés osmótico. Por otra parte, se observó que el gen GRE2 no presenta el fenómeno de memoria transcripcional observado en los genes GAL, confirmando la existencia de una “memoria negativa”. Además, se pudo confirmar que la exposición previa a estrés salino proporciona una defensa frente a una exposición a estrés oxidativo posterior., [CA] El llevat és un organisme unicel·lular que es troba expost a un entorn canviant, per tant pot sofrir diferents tipus d’estrés. Amb el fi d’adaptar-se d’una manera rápida i eficaç a a aquest entorn canviant i fer front a l’estrés, el llevat ha desenvolupat mecanismes de defensa i d’adaptació. Aquests mecanismes inclouen la síntesi de proteïnes, fluctuacions del cicle cel·lular, etc., sent essencials els canvis als patrons d’expressió gènica. A més, es coneix l’existència del fenomen de memòria transcripcional. Aquest fenomen consisteix en que una cèl·lula, la qual prèviament ha estat exposta a una dosi d’estrés no letal, és capaç de respondre més rápida i eficaçment quan és sotmesa a un estrés posterior en un període curt de temps. En aquest treball ha sigut utilitzat el sistema luciferasa per a mesurar els canvis a l’expressió gènica in vivo i en temps real. L’objectiu d’aquest treball fou la construcció d’un sistema integratiu de luciferasa desestabilitzada. Aquest sistema fou aplicat al promotor induït per estrés osmòtic, GRE2, de llevat. D’aquesta manera es va aconseguir estudiar la dinàmica transcripcional d’aquest gen en resposta a estrés, comparant aquesta construcció integrativa amb una construcció plasmídica construïda amb anterioritat. A més, es va estudiar el fenomen de memoria transcripcional en el gen GRE2 en resposta a estrés osmòtic. Com a conclusió, el sistema integratiu de luciferasa desestabilitzada ha permés l’estudi a nivell genòmic de la dinàmica transcripcional en resposta a estrés osmòtic. D’altra banda, s’ha observat que el gen GRE2 no presenta el fenomen de memòria transcripcional descrit als gens GAL, confirmant així l’existència d’una “memòria negativa”. A més, s’ha pogut confirmar que l’exposició prèvia a estrés salí proporciona una defensa en front a una exposició a estrés oxidatiu posterior., [EN] Yeasts are single-cell organisms which are exposed to a changing environment, so they can suffer several kinds of stress. In order to adapt in a rapid and effective way to the changing environment and cope with stress, yeasts have developped different mechanisms for defense and adaptation. These mechanisms involve protein synthesis, cell cycle fluctuations, etc., being changes in gene expression patterns essential to this purpose. In addition, transcriptional memory has been previously described. This phenomenon consists of cells which have been previously exposed to a non-lethal dose of stress that are able to respond more quickly and effectively to a second round of stress in a short period of time. In this work, a luciferase system has been used in order to measure changes in gene expression in vivo and in real-time. The purpose of this work was the construction of an integrative system of destabilized luciferase. This system was applied to the yeast osmoinducible promoter GRE2 in order to study transcriptional dynamics of this gene in response to osmostress, comparing this integrative construction to a previously developped plasmid construction of the same gene. In addition, transcriptional memory of this gene in response to osmostress was also studied. As a conclusion, we were able to study in the chromosomal context the transcriptional dynamics in response to osmostress of the GRE2 gene using the integrative system of destabilized luciferase. On the other hand, it was observed that the GRE2 gene doesn’t show a transcriptional memory as described for the GAL genes, confirming the existence of a “negative memory”. In addition, we were able to confirm that a previous exposure to a non lethal dose of salt stress favours the later defensive response to oxidative stress.