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Orientador: Avelino Rodrigues de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Bibliografia: f. 63-73 Resumo: No presente trabalho foram realizados estudos que tiveram como finalidade: contribuir para o melhor conhecimento de algusn aspectos da fisiologia de Mycosphaerella melonis e verificar a possibilidade de se induzir resistência em plantas de melão suscetíveis a M. melonis pelo uso do próprio patógeno e do fungo Helmeinthosporium carbonum, não patogênico ao melão. Usando-se meio de BDA e feijão Azuki (Phaseolus angularis) para os ensaios, os resultados obtidos mostraram '24GRAUS¿ como a melhor temperatura para o desenvolvimento vegetativo e esporulação e, que o aspecto da cultura do microrganismo não varia em função da temperatura. A máxima germinação dos conídios foi obtida a 21-'24GRAUS¿ e a máxima esporulação ocorreu em culturas com 15 a18 dias. A melhor germinação foi conseguida em culturas com idade ao redor de 12 dias. Nos testes de inoculação com M. melonis mostraram-se pouco suscetíveis os cultivares Edisto Resistente e Jumbo Hale¿s Bst, medianamente suscetíveis Casca de Carvalho e Delicioso Perlita e altamente suscetíveis Amarelo Tendral e Valenciano Verde. Utilizando-se plantas de melão dos cultivares Amarelo Tendral e Valenciano Verde nos ensaios de indução de resistência, obteve-se uma proteção em torno de 73 e 88%, respectivamente, quando suspensões de esporos do não patógeno H. carbonum foram aplicadas 24 antes do patógeno ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The main goal of the present paper is to contribute towards a better understanding of some physiological aspects of M. melonis and to verify the possibility of inducing rsistance in muskmelon plants susceptible to M. melonis by using as inducer the own pathogenic to melon. Using PDA and Azuki bean (Phaseolus angularis Kaw.) as media for the assays, the results obtained showed that '24GRAUS¿C was the best temperature for mycelial growth and sporulation. The highest spore germination was obtained at 21-'24GRAUS¿C, and 15-18 days was the best age for sporulation. The best spore germination was obtained in 12-day-old cultures. Tests for resistence to M. melonis were carried out with six muskmelon cultivars. Observations indicated that ¿Edisto Resistente¿ and ¿Jumbo Hale¿s Best¿ were slightly susceptible, ¿Casca de Carvalho¿ and ¿Delicioso Perlita¿ were moderately susceptible, while ¿Amarelo Tendral¿ and ¿Valenciano Verde¿ were highly susceptible. Using the susceptible cultivar ¿Valenciano Verde¿ for the assays, suspencions of autoclaved spores of M. melonis and suspencions of non-autoclaved spores of H. carbonum induced protection of 79% and 88%, respectively, to a later challenge by the pathogen. The data obtained in the assays suggest that the cultivar ¿Valenciano Verde¿ shows a resistence potential against M. melonis and that this resistance is systemic ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Bioquímica Mestre em Ciências Biológicas

Orientador:Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas defendem-se continuamente contra ataques de bactérias, vírus, fungos, invertebrados e de outras plantas. O estresse oxidativo é um tipo de resposta fisiológica da planta após o reconhecimento do patógeno, podendo resultar em sintomas nas plantas dependendo da sensibilidade do hospedeiro, e também relacionada à mecanismos de defesa. Foram analisadas plantas de soja cultivares BRS132 (muito sensível) e IAC17 (pouco sensível) infectadas pelo Cowpea mild mottle virus (CPMMV) e plantas de feijoeiro cultivar BT2 infectado pelo Cowpea aphid-borne virus (CABMV). O trabalho teve como objetivos avaliar a concentração de peróxido de hidrogênio, analisar a resposta antioxidante das plantas à infecção viral quanto às variações na atividade da superóxido dismutase, catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase e verificar as localizações dos vírus e das peroxidases em diferentes tecidos das plantas. O CPMMV induziu uma doença aguda, com sintomas severos e culminando com a morte da planta de soja 'BRS132'. Na soja 'IAC17', o vírus induziu uma doença crônica com mosaico leve a partir da segunda folha trifoliolada. As concentrações de peróxido de hidrogênio e as atividades da catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase foram maiores nas plantas infectadas, tanto na soja 'BRS132' como na soja 'IAC17', em relação às plantas sadias. O CPMMV foi localizado nos tecidos do pecíolo e do caule, na soja 'BRS132' nas regiões periféricas e medula, e na soja 'IAC17' principalmente nas regiões periféricas. No feijoeiro cultivar BT2, o CABMV induziu resposta aguda na primeira folha foram maiores nas plantas infectadas, exceto a atividade da superóxido dismutase, que apresentou valores similares nas plantas infectadas e nas sadias. O CABMV foi localizado nas regiões periféricas e medula dos tecidos do pecíolo, e no caule a invasão foi limitada à região periférica. As peroxidases e a siringaldazina peroxidase foram localizadas nas mesmas regiões do pecíolo onde foram detectados o CPMMV e o CABMV. No feijoeiro 'BT2', a infecção viral induziu uma resposta semelhante à observada na soja 'BRS132', com algumas diferenças relacionadas ao fato de que neste caso, a infecção pelo CABMV não resultou na morte da planta de feijoeiro. Também se observou aumento expressivo de atividade da siringaldazina peroxidase no 7º dia após inoculação, diferente da soja 'BRS132' em que este aumento ocorreu mais tarde. A invasão generalizada dos vírus no pecíolo foi semelhante em feijoeiro 'BT2' e soja 'BRS132', principalmente nos dias em que começou a ocorrer abscisão dos folíolos. Já a invasão do caule foi generalizada em soja 'BRS132' e limitada à região periférica em feijoeiro. Possivelmente, o aumento precoce de atividade da siringaldazina peroxidase em feijoeiro, já no 7º dia após inoculação, limitou a invasão do vírus aos tecidos periféricos do caule. Isto explicaria o fato de o feijoeiro 'BT2' não sofrer morte da gema apical e da planta. trifoliolada, apresentando sintomas de mosaico, maior rugosidade, lesões necróticas nas nervuras e folíolos ''fechados''. Nesta cultivar, todos os parâmetros avaliados. Abstract: Plants defend themselves from attacks of bacteria, fungi, viruses, invertebrate and other plants. Oxidative stress is a kind of physiological response of the plant related to defense mechanisms after recognition the pathogen, which may result in disease symptoms depending on host sensitivity. In this work, plants of two varieties of soybean infected by Cowpea Mild Mottle Virus (CPMMV), one highly sensitive (BRS132) and other with low sensitivity (IAC17) to the virus, were analyzed. Also, responses of bean plants (cv. Black Turtle 2, BT2) to Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus (CABMV) were examined. The parameters assessed included peroxide content (as hydrogen peroxide, H2O2), and activity of the following enzymes: superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, guayacol peroxidase and syringadazine peroxidase. Distribution of virus and peroxidases in different tissues was also examined. In soybean cv BRS132, CPPMV induced an acute disease with severe symptoms finally resulting in plant death. In the less sensitive soybean cv IAC17, CPMMV induced a chronic disease with mild mosaic which was only visible in the second trifoliate and later leaves. Peroxide content and activity of guayacol and syringaldazine peroxidases were higher in infected plants of both cultivars. The virus was immuno-localized in stem and petiole cross sections, appearing in peripheral tissues and pith in cv BRS132, whereas in cv IAC17 it was localized mainly in the peripheral portion. In bean cv BT2, CABMV induced a acute response in the first trifoliate leaf, which presented a rough mosaic, necrotic lesions in veins and a "wilted" aspect. In this species all the assessed parameters showed higher values in the infected plants. Only the activity of superoxide dismutase was similar in healthy and infected plants. The vírus was localized in the pith and peripheral tissues of bean petioles, and only in the peripheral region of stems. Peroxidase and syringaldazine peroxidase activities were localized in the same tissues of the petiole where the CPMMV was localized in soybean plants and CABMV in bean plants. The response to CABMV observed in bean cv BT2 was similar to the response of soybean BRS132 to CPMMV, with some differences, since in bean the virus infection did not induce plant death. A significant rise in syringadazine activity was detected seven days after inoculation (DAI) in beans, while in soybean this increase occurred one day later. Both species also showed similar pattern of invasion of petiole tissues by the virus, mainly at the moment of abscission of leaflets. However, the virus invasion of stem was generalized in soybean BRS132 and contrastingly, limited to the peripheral tissues in bean. One possibility is that the early increase in syringaldazine activity observed in bean 7 DAI is indicative of some type of restriction to the spread of the virus, limiting it to the stem peripheral tissues. Probably this restricted spread of the virus in the stem underlies the survival of the apical meristem in bean cv BT2 in contrast to the death of the meristem in soybean cv BRS132. Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alessandra Alves de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Avaliou-se as alterações transcricionais em laranja 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.) promovidas por quitosana (CHI) e ácido salicílico (SA), utilizando RNA-seq, e o efeito destes compostos no controle do cancro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri) e da clorose variegada dos citros (CVC - Xylella fastidiosa). As plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, foram coletadas amostras foliares para avaliar seus transcriptomas. Para a avaliação dos eliciadores sobre o cancro cítrico e a CVC, as plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, inoculadas com as duas bactérias separadamente. A partir de 24h da inoculação, foram coletadas amostras foliares para avaliar a curva de crescimento de ambas as bactérias, a redução da severidade e/ou incidência das doenças e respostas de defesa da planta por RT-qPCR. Com os resultados do transcriptoma, observou-se que mais genes foram induzidos pelo tratamento com SA do que com CHI. O tratamento com SA aumentou a expressão de genes que participam da via de sinalização do SA na planta (WRKY50, PR2 e PR-9) e genes da biossíntese do etileno e ácido jasmônico (ACS 12, fator de transcrição contendo domínio AP2 e OPR3). Além disso, promoveu a indução de genes relacionados ao metabolismo secundário, processos redox e estresse biótico. No tratamento com CHI, foi observada maior indução de genes relacionados ao metabolismo secundário. Para ambos os tratamentos, a via da auxina foi reprimida. No experimento para controle do cancro cítrico, observou-se que ambos os eliciadores promoveram reduções na severidade e incidência da doença. Entretanto, a CHI pareceu não interferir diretamente na formação do biofilme pela bactéria, mas pode ter dificultado a multiplicação de X. citri na planta. O SA retardou a entrada da bactéria na planta e, aparentemente, inibiu mais a formação do biofilme bacteriano do que a CHI. Comparações da expressão gênica entre os eliciadores reforçam a ideia de que a CHI tem maior potencial de induzir resistência ao cancro cítrico do que SA. No experimento para o controle da CVC, observou-se que a CHI induziu importantes genes da via do SA (NPR1, TGA, EDS1) e etileno (EIN-3, PR-4) 24h após a inoculação. Aplicações exógenas de SA potencializaram o seu efeito endógeno na planta, pois houve indução de NPR1, TGA e PRs. Entretanto, não foi possível estabelecer uma relação clara entre a multiplicação de X. fastidiosa, a incidência da doença e o uso da CHI e SA em laranja 'Pera', já que na maioria das avaliações não houve redução da população bacteriana em amostras foliares e não houve redução da incidência em plantas tratadas. Com base nos resultados, observou-se que CHI e SA induziram diversos genes envolvidos em respostas de defesa em laranja 'Pera'. Entretanto, essas respostas podem ser moduladas diferencialmente a depender do patógeno que afeta a planta, pois os eliciadores foram eficientes no controle da X. citri, um patógeno que coloniza o mesófilo da planta, entretanto não foram efetivos no controle da X. fastidiosa, um patógeno que coloniza o xilema da planta, embora respostas de defesa tenham sido expressas nos momentos iniciais (24h) após a inoculação com X. fastidiosa Abstract: This study was carried out to evaluate transcriptional modification in sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.), promoted by chitosan (CHI) and salicylic acid (SA), using RNA-seq, and the effect of these compounds on citrus canker (Xanthomonas citri subsp. citri) and citrus variegated chlorosis (CVC - Xylella fastidiosa). Plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, leaf samples were collected to assess the transcriptome. In the experiments for disease assessment, the plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, inoculated. Starting from 24h after inoculation, leaf samples were collected to evaluate the multiplication of the pathogens (X. citri and X. fastidiosa), reduction of the severity and / or incidence and plant defense responses by RT-qPCR. Based upon the transcriptome results, it was observed that more genes were induced by SA than by CHI. SA treatment increased the expression of genes that participate in the SA signaling pathway in the plant (WRKY50, PR2 and-PR9), and genes involved in the biosynthesis of ethylene and jasmonic acid (ACS 12, transcription factor containing AP2 and OPR3 domain). Besides these, SA promoted induction of genes of secondary metabolism, redox processes and biotic stress. The treatment with CHI exhibited higher induction of genes related to secondary metabolism. For both treatments, the auxin pathway was suppressed. In the experiment for the control of citrus canker, it was observed that both elicitors reduced the severity and incidence of the disease. However, CHI seems not to interfere directly in biofilm formation, but may have hindered the multiplication of X. citri in the plant. The SA slowed down the entry of the bacteria into the plant and, apparently, inhibited the formation of biofilm more efficiently than the CHI. Comparisons of gene expression between elicitors reinforce the idea that CHI has higher potential to induce resistance to citrus canker than SA. In the experiment for the control of CVC, it was observed that the CHI induced important genes of the SA (NPR1, TGA, EDS1) and ethylene (EIN-3, PR-4) pathways 24h after inoculation. Exogenous applications of SA potentiated its endogenous effect in the plant, since there was induction of EDS-1, NPR1, TGA and PRs. However, it was not possible to establish a clear relationship between the multiplication of X. fastidiosa, the incidence of the disease and the use of CHI and SA in 'Pera' sweet orange, since most of the assessments did not show reduction of bacterial populations in leaf samples and there was no reduction of the incidence in treated plants. Based upon the results of this study, it was observed that CHI and SA induced several genes involved in defense responses in 'Pera' sweet orange. However, these responses can be modulated differentially depending on the pathogen that affects the plant. This fact was demonstrated in this study, as elicitors were effective in controlling X. citri, a pathogen that colonizes the mesophyll of the plant, but were not effective in controlling X. fastidiosa, a pathogen that colonizes the xylem of the plant, although defense responses were expressed in the early stages (24 h) after inoculation with X. fastidiosa Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Ronaldo José Durigan Dalio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A citricultura brasileira ocupa lugar de destaque no cenário mundial, onde o Brasil, atualmente, é um dos maiores produtores de laranja e principal exportador de suco concentrado. Em meio aos patógenos causadores de doenças em citros, destaca-se as espécies de "Phytophthora". A podridão de raiz e a gomose do tronco, provocadas pelo oomiceto "Phytophthora parasitica", é uma das mais graves doenças que acometem culturas de citros no âmbito mundial. Nas últimas décadas, avanços em genômica de patógenos revelaram uma quantidade muito grande de moléculas efetoras que possuem função fundamental na infecção. Sabe-se que os oomicetos patógenos de plantas e, principalmente as espécies de "Phytophthora", secretam proteínas efetoras para manipular as defesas das plantas, o que viabiliza a infecção e colonização. Os efetores citoplasmático Crinkler (CRN) formam uma família grande e diversa de proteínas secretadas, e identificadas de uma vasta gama de genomas de oomicetos sequenciados. Trifoliata ("Poncirus trifoliata") e tangerina Sunki ("Citrus sunki"), dois porta-enxertos amplamente utilizados na citricultura, apresentam interação de resistência e suscetibilidade com "P. parasitica", respectivamente, o que os torna modelos adequados para o estudo de mecanismos entre o patógeno e seus hospedeiros. As bases moleculares dessas interações permanencem pouco conhecidas. O presente trabalho objetivou identificar moléculas efetoras de P. parasitica envolvidas na interação com "P. trifoliata" e "C. sunki". Buscou-se também caracterizar funcionalmente proteínas efetoras da família Crinkler (CRNs) e elucidar alguns dos mecanismos dessas espécies em resposta a essas moléculas. Os algoritmos de GeNorm e NormFinder foram utilizados para avaliar os melhores genes de referência. Os genes mais estáveis para RT-qPCR análise de expressão em "P. trifoliata" foram GAPC2 e F-BOX, enquanto EGIDH e GAPC2 foram mais adequados para "C. sunki". A expressão ao longo do tempo de vários genes relacionados com a defesa de plantas foi avaliada em associação com o progresso da doença, resposta de hipersensibilidade e expressão de efetores de "P. parasitica". Efetores do tipo elicitinas, NPP1, CBEL, RxLR e CRN foram identificados como tendo sua expressão regulada positivamente em resposta a infecção em "C. sunki" (genótipo suscetível). Para detectar a presença de ROS foi utilizado DAB (3,3'-diaminobenzidina). A partir dos ensaios com DAB observou que "C. Sunki" responde ativando as principais vias de sinalização de defesa, resultando em resposta de hipersensibilidade (HR) e necrose. Apesar de forte, esta resposta de defesa não é eficiente para deter a invasão de "P. parasitica", provavelmente devido ao seu estilo de vida hemibiotrófico. Durante a infecção de "P. trifoliata" os efetores CRN, RxLR, CBEL, NPP-1 e Elicitina foram fortemente expressos em "P. parasitica", porém não induziram nenhuma modulação da imunidade, sugerindo um tipo de resistência não-hospedeiro, em que a planta se baseia em barreiras bioquímicas e anatômicas pré-formadas. Foram encontrados 80 candidatos a efetores Crinkler (CRN) no genoma de "P. parasitica". Alguns CRNs são exclusivos de "P. parasitica" IAC_01/95.1. Os níveis de expressão de efetores CRNs de P. parasitica na interação com "C. sunki" e "P. trifoliata" apresentaram expressão diferencial ao longo de 3, 6, 12, 24, 48, e 96 horas após infecção nos dois genótipos estudados. As análises de expressão gênica envolvendo efetores Crinkler demonstram um mecanismo finamente regulado de expressão de CRNs em "P. parasitica" em resposta a diferentes hospedeiros. Após agroinfiltração em "N. benthamiana", foi observado que o efetor PpCRN7 tem atividade epistática (sinérgica) quando co-infiltrado com elicitina INF-1 ao potencializar a reação de hipersensibilidade (HR), já PpCRN20 é supressor de HR. Os efetores PpCRN7 e PpCRN20 desencadeiam susceptibilidade em plantas e favorecem a colonização pelo patógeno Abstract: Brazilian citriculture occupies an outstanding place in the worldwide scenario, where Brazil, nowadays, is one of the largest producers of orange and the main exporter of concentrate juice. Among the pathogens that cause citrus diseases, "Phytophthora" species play an important role. Root rotteness and stem gummosis, caused by the oomycete "Phytophthora parasitica", is one of the most serious diseases affecting citrus crops in the world. In the last decades, advances in pathogen genomics have revealed a very large number of effector molecules that play a key role in infection. It is known that pathogenic oomycetes of plants, and especially "Phytophthora", secrete effector proteins to manipulate plant defenses and to make possible infection and colonization. Crinkler cytoplasmic effectors (CRN) form a large and diverse family of secreted proteins, and are identified from a wide range of sequenced oomycete genomes. Trifoliata ("Poncirus trifoliata") and Sunki tangerine ("Citrus sunki"), two rootstocks widely used in citrus cultivation, present tolerance and susceptibility in the interaction with "P. parasitica", respectively, making them suitable models for the study of mechanisms between the pathogen and their hosts. The molecular basis of these interactions remain not completely known. The present work had as goal to identify effector molecules of "P. parasitica" involved in the interaction with "P. trifoliata" and "C. sunki". It was also sought to characterize the effector proteins of the family Crinkler (CRN) and elucidate some of the mechanisms of these species in response to these molecules. The algorithms GeNorm and NormFinder were used to evaluate the best reference genes. The most stable genes for RT-qPCR expression analysis in "P. trifoliata" were GAPC2 and F-BOX, whereas EGIDH and GAPC2 were more suitable for "C. sunki". The expression over time of various genes related with the defense was evaluated in association with disease progress, hypersensitivity response and expression of effectors of "P. parasitica". Effectors of the type elicitins, NPP1, CBEL, RxLR and CRN were identified as having its expression regulated positively in response to infection in "C. sunki" (susceptible genotype). To detect the presence of ROS, it was used DAB (3,3'- diaminobenzidine). From the DAB assays it was observed that "C. sunki" responds by activating the main signal course of defense, resulting in hypersensitivity (HR) response and necrosis. Although strong, this defense response is not effective in stopping invasion of "P. parasitica", probably because of its hemibiotrophic lifestyle. During the infection of "P. trifoliata", the effectors CRN, RxLR, CBEL, NPP-1 and Elicitin were strongly expressed in "P. parasitica", but did not induce any manipulation of immunity, suggesting a type of non-host resistance, in which the plant bases on pre-formed biochemical and anatomical barriers. Were found 80 candidates for Crinkler effectors (CRN) in the genome of P. parasitica. Some CRNs are unique to "P. parasitica" IAC_01 / 95.1. The levels of expression of P. parasitica CRN effectors in the interaction with "C. sunki" and "P. trifoliata" showed differential expression over 3, 6, 12, 24, 48 and 96 hours after infection in the two genotypes studied. Gene expression analyzes involving Crinkler effectors demonstrate a finely regulated mechanism of expression of CRNs in "P. parasitica" in response to different hosts. After agro-infiltration in N. benthamiana, it was observed that the effector PpCRN7 has epistatic activity (synergistic) when co-infiltrated with elicitin INF-1 by potentiating the hypersensitivity (HR) reaction, but PpCRN20 was already a suppressor of HR. The effectors PpCRN7 and PpCRN20 trigger susceptibility in plants and make possible the colonization by the pathogen Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 465450/2014-2 CNPQ 2014/50880-4