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Nella presente tesi indaghiamo la potenzialità di LCM e Reverse Phase Protein microarray negli studi clinici. Si analizza la possibilità di creare una bio banca con line cellular primarie, al fine di conseguire drug test di sensibilità prima di decidere il trattamento da somministrare ai singoli pazienti. Sono stati ottenuti profili proteomici da biopsie pre e post terapia. I risultati dimostrano che questa piattaforma mostra il meccanismo di resistenza acquisito durante la terapia biologica. Questo ci ha portato ad analizzare una possibile stratificazione per pazienti con mCRC . I dati hanno rivelato distinti pathway di attivazione tra metastasi resecabile e non resecabili. I risultati mostrano inoltre due potenziali bersagli farmacologici. Ma la valutazione dell'intero tumore tramite singole biopsie sembra essere un problema a causa dell’eterogeneità intratumorale a livello genomico. Abbiamo indagato questo problema a livello dell'architettura del segnale in campioni di mCRC e ccRCC . I risultati indicano una somiglianza complessiva nei profili proteomici all'interno dello stesso tumore. Considerando che una singola biopsia è rappresentativa di un intera lesione , abbiamo studiato la possibilità di creare linee di cellule primarie, per valutare il profilo molecolare di ogni paziente. Fino ad oggi non c'era un protocollo per creare linee cellulari immortalizzate senza alcuna variazione genetica . abbiamo cosiderato, però, l'approccio innovativo delle CRCs. Ad oggi , non è ancora chiaro se tali cellule mimino il profilo dei tessuti oppure I passaggi in vitro modifichino i loro pathways . Sulla base di un modello di topo , i nostri dati mostrano un profilo di proteomica simile tra le linee di cellule e tessuti di topo LCM. In conclusione, i nostri dati dimostrano l'utilità della piattaforma LCM / RPPA nella sperimentazione clinica e la possibilità di creare una bio - banca di linee cellulari primarie, per migliorare la decisione del trattamento., In the present thesis we investigate the potentiality of Laser Capture Microdissection (LCM) and Reverse Phase Protein microarray (RPPA) in clinical trials. Also we analyze the possibility to create a primary cell lines bio-bank in order to achieve sensitivity drug tests before to make a treatment decision. Proteomic profiles of pre and post therapy biopsies were obtained from the patients involved in a clinical trial. The results demonstrate that this platform shows the acquired resistance mechanism to the biological therapy. This had led us to discover a better stratification for patient with unresectable colorectal cancer liver metastasis. The RPPA data revealed distinct patterns activation between resectable and unresectable metastasis. Our results show two potential drug targets that could be combined for neo adjuvant treatment. But the evaluation of the whole tumor with single biopsies seems to be a problem due to the genomic intratumor heterogeneity. We investigate this problem in the functional signaling architecture of mCRC and ccRCC. The results indicated an overall similarity in the proteomic profiles within the same tumor. Based on the idea that a single biopsy is representative of a whole lesion, we evaluated the possibility to create primary cell lines, in order to evaluate the molecular profile for each patient for the best personalized therapy. To date there was not a protocol to create immortalized cell lines without any genetic change. We evaluate the innovative approach of the Conditionally Reprogrammed Cells. To date, it is still not clear if those cells mimic the tissue profile or not. Based on a CRC mouse model, our data show a similar proteomic profile between the cell lines and the mouse tissues. In conclusion, our data demonstrate the usefulness of LCM/RPPA platform in clinical trial and the possibility to create a primary cell lines bio-bank to improve treatment decision.

Nella presente tesi indaghiamo la potenzialità di LCM e Reverse Phase Protein microarray negli studi clinici. Si analizza la possibilità di creare una bio banca con line cellular primarie, al fine di conseguire drug test di sensibilità prima di decidere il trattamento da somministrare ai singoli pazienti. Sono stati ottenuti profili proteomici da biopsie pre e post terapia. I risultati dimostrano che questa piattaforma mostra il meccanismo di resistenza acquisito durante la terapia biologica. Questo ci ha portato ad analizzare una possibile stratificazione per pazienti con mCRC . I dati hanno rivelato distinti pathway di attivazione tra metastasi resecabile e non resecabili. I risultati mostrano inoltre due potenziali bersagli farmacologici. Ma la valutazione dell'intero tumore tramite singole biopsie sembra essere un problema a causa dell’eterogeneità intratumorale a livello genomico. Abbiamo indagato questo problema a livello dell'architettura del segnale in campioni di mCRC e ccRCC . I risultati indicano una somiglianza complessiva nei profili proteomici all'interno dello stesso tumore. Considerando che una singola biopsia è rappresentativa di un intera lesione , abbiamo studiato la possibilità di creare linee di cellule primarie, per valutare il profilo molecolare di ogni paziente. Fino ad oggi non c'era un protocollo per creare linee cellulari immortalizzate senza alcuna variazione genetica . abbiamo cosiderato, però, l'approccio innovativo delle CRCs. Ad oggi , non è ancora chiaro se tali cellule mimino il profilo dei tessuti oppure I passaggi in vitro modifichino i loro pathways . Sulla base di un modello di topo , i nostri dati mostrano un profilo di proteomica simile tra le linee di cellule e tessuti di topo LCM. In conclusione, i nostri dati dimostrano l'utilità della piattaforma LCM / RPPA nella sperimentazione clinica e la possibilità di creare una bio - banca di linee cellulari primarie, per migliorare la decisione del trattamento., In the present thesis we investigate the potentiality of Laser Capture Microdissection (LCM) and Reverse Phase Protein microarray (RPPA) in clinical trials. Also we analyze the possibility to create a primary cell lines bio-bank in order to achieve sensitivity drug tests before to make a treatment decision. Proteomic profiles of pre and post therapy biopsies were obtained from the patients involved in a clinical trial. The results demonstrate that this platform shows the acquired resistance mechanism to the biological therapy. This had led us to discover a better stratification for patient with unresectable colorectal cancer liver metastasis. The RPPA data revealed distinct patterns activation between resectable and unresectable metastasis. Our results show two potential drug targets that could be combined for neo adjuvant treatment. But the evaluation of the whole tumor with single biopsies seems to be a problem due to the genomic intratumor heterogeneity. We investigate this problem in the functional signaling architecture of mCRC and ccRCC. The results indicated an overall similarity in the proteomic profiles within the same tumor. Based on the idea that a single biopsy is representative of a whole lesion, we evaluated the possibility to create primary cell lines, in order to evaluate the molecular profile for each patient for the best personalized therapy. To date there was not a protocol to create immortalized cell lines without any genetic change. We evaluate the innovative approach of the Conditionally Reprogrammed Cells. To date, it is still not clear if those cells mimic the tissue profile or not. Based on a CRC mouse model, our data show a similar proteomic profile between the cell lines and the mouse tissues. In conclusion, our data demonstrate the usefulness of LCM/RPPA platform in clinical trial and the possibility to create a primary cell lines bio-bank to improve treatment decision.

// Erika Maria Parasido 1,2 , Alessandra Silvestri 1 , Vincenzo Canzonieri 3 , Claudio Belluco 4 , Maria Grazia Diodoro 5 , Massimo Milione 6 , Flavia Melotti 6 , Ruggero De Maria 7 , Lance Liotta 1 , Emanuel F. Petricoin 1,* and Mariaelena Pierobon 1,* 1 Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, Manassas, VA, USA 2 Department of Experimental Oncology, CRO-National Cancer Institute, Aviano, Italy 3 Department of Pathology, CRO-National Cancer Institute, Aviano, Italy 4 Department of Surgical Oncology, CRO-National Cancer Institute, Aviano, Italy 5 Department of Pathology, Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma, Italy 6 Department of Pathology, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, Milano, Italy 7 Department of Pathology, Sacred Heart Catholic University of Rome, Roma, Italy * These authors have contributed equally to this work Correspondence to: Mariaelena Pierobon, email: // Keywords : intra-tumor heterogeneity, personalized therapy, kinase signaling, laser capture microdissection, reverse phase protein microarray Received : August 16, 2016 Accepted : December 09, 2016 Published : December 15, 2016 Abstract Introduction: Recent studies indicated tumors may be comprised of heterogeneous molecular subtypes and incongruent molecular portraits may emerge if different areas of the tumor are sampled. This study explored the impact of intra-tumoral heterogeneity in terms of activation/phosphorylation of FDA approved drug targets and downstream kinase substrates. Material and methods: Two independent sets of liver metastases from colorectal cancer were used to evaluate protein kinase-driven signaling networks within different areas using laser capture microdissection and reverse phase protein array. Results: Unsupervised hierarchical clustering analysis indicated that the signaling architecture and activation of the MAPK and AKT-mTOR pathways were consistently maintained within different regions of the same biopsy. Intra-patient variability of the MAPK and AKT-mTOR pathway were