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Hintergrund: Die Rolle der CT-Texturanalyse (CTTA) bei der Unterscheidung von duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC) und neuroendokrinen Neoplasmen des Pankreas (PNEN) in der portal-venösen Phase im Vergleich zur visuellen Beurteilung und dem Tumor-Pankreas-Attenuations-Verhältnis sollte untersucht werden. Methode: 53 Patienten (66,1 ± 8,6 Jahre) mit PDAC und 42 Patienten (65,5 ± 12,2 Jahre) mit PNEN, die sich einer kontrastverstärkten CT zum primären Staging unterzogen, wurden ausgewertet. Interessante Volumina (VOIs) wurden im Tumorgewebe in der portal-venösen Phase unter Ausschluss benachbarter Strukturen festgelegt. Auf der Grundlage der Pyradiomics-Bibliothek wurden 92 Texturmerkmale extrahiert, darunter Merkmale erster, zweiter und höherer Ordnung, und dann zwischen PNEN und PDAC verglichen. Die visuelle Beurteilung klassifizierte die Tumoren als hypo-, iso- oder hyperdicht zum Pankreasparenchym oder als homogen/heterogen. Zusätzlich wurden die Abschwächungsverhältnisse zwischen den Tumoren und dem unbeteiligten Pankreas berechnet. Ergebnisse: Es wurden 8/92 (8,6 %) hochsignifikante (p < 0,005) diskriminierende Texturmerkmale zwischen PDAC und PNEN identifiziert, darunter die Merkmale erster Ordnung "Median", "Gesamtenergie", "Energie", "10. Perzentil", "90. Perzentil", "Minimum", "Maximum" und das Merkmal zweiter Ordnung "Gray-Level Co-Occurrence Matrix (GLCM) Informational Measure of Correlation (Imc2)". Bei PNEN erwies sich das Merkmal höherer Ordnung "GLSZM Small Area High Gray-Level Emphasis" als signifikant höher bei G1-Tumoren im Vergleich zu G2/3-Tumoren (p < 0,05). Die Tumor/Parenchym-Verhältnisse sowie die visuelle Bewertung in hypo-/iso-/hyperdicht oder homogen/heterogen unterschieden sich nicht signifikant zwischen PDAC und PNEN. Schlussfolgerungen: Unsere Daten deuten darauf hin, dass die CTTA ein praktikables Instrument zur Differenzierung von PNEN von PDAC und auch von G1- von G2/3-PNEN in der portalvenösen Phase ist. Die visuelle Beurteilung und das Verhältnis von Tumor zu Parenchym waren für die Unterscheidung nicht hilfreich.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a quite frequent, hardly treatable and usually terminal neoplasia. Therefore, new approaches in cancer-immunotherapy are currently being searched for. B7-H1 represents a molecule with regulatory and immunosuppressive properties that is being positively correlated with poor prognosis in PDA. Due to the high complexity of the PDA tumor environment, this thesis is aimed at clarifying the influence of B7-H1 in this environment. Especially tumor-infiltrating macrophages and B7-DC, a ligand that binds to the same receptor as B7-H1 and who���s role in the PDA is up to now hardly known, were examined. The research deployed a murine Panc02 model in C75-Bl/6 (WT) and B7-H1 knockout mice (KO). In order to incorporate the impact of the currently used chemo- and immunotherapy, chemotherapeutic 5-fluorouracil (5FU) and interferon-�� (IFN-��) ��� as it is demonstrated in the CapRI scheme of the Universit��t Heidelberg ��� were added. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) and the Luminex technology were used for analyzing immune cell expression and cytokine concentration, while magnetic activated cell sorting (MACS) was used for studying macrophages. Knowing that PDA cells also express B7-H1 on their surface, this research included therapy with monoclonal anti-B7-H1-antibodies in tumor-bearing WT-mice. The results of this thesis showed a reduced T-cell response under the influence of B7-H1 with limited improvement when treated with 5FU and IFN-��. On the other hand, this treatment stimulated B7-H1 expression. In the presence of B7-H1 an increased amount of tumor-infiltrating M2-macrophages and an increase in tumor volume was detected. Furthermore, the immunosuppressive behavior of tumor-infiltrating macrophages was demonstrated with regard to the lack of T-cell proliferation, their promotion of an immunosuppressive tumor milieu as well as their reduced phagocytic activity. B7-DC did not show significant changes under absence of B7-H1 as was presumed. The blockade of B7-H1 using monoclonal antibodies resulted in increased survival of tumor-bearing mice and could therefore represent a new therapy approach for pancreatic cancer., Das Pankreasadenokarzinom (PDA) stellt eine sehr h��ufige, schwer therapierbare und zumeist t��dlich verlaufende Neoplasie dar. Daher werden aktuell vermehrt im Bereich der Immuntherapie neue Therapieans��tze gesucht. B7-H1 ist ein Molek��l mit regulatorischen und immunsuppressiven Eigenschaften, das im PDA mit einer schlechten Prognose korreliert. Aufgrund des sehr komplexen Tumormilieus im PDA sollte in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von B7-H1 auf dieses n��her gekl��rt werden. Genauer betrachtet wurden hierbei tumorinfiltrierende Makrophagen sowie B7-DC, welches wie B7-H1 an denselben Rezeptor bindet und dessen Rolle noch relativ wenig gekl��rt ist. Zur Untersuchung diente in dieser Arbeit ein murines Panc02-Modell, f��r das C75-Bl/6 (WT) sowie B7-H1-Knockout-M��use (KO) verwendet wurden. Um den Einfluss von Chemo- und Immuntherapien im PDA in die Untersuchungen einflie��en zu lassen, wurden 5-Fluorouracil (5FU) und Interferon-�� (IFN-��), wie sie im CapRI-Schema der Universit��t Heidelberg eingesetzt werden, erg��nzt. Mittels fluoreszenz-gekoppelter Durchflusszytometrie (fluorescenceactivated cell sorting=FACS) konnten Immunzellexpressionen und mittels Luminextechnologie Zytokinkonzentrationen erhoben werden. Eine genauere Betrachtung des Verhaltens von Makrophagen im PDA konnte mittels magnetischer Zellisolation (magnetic activated cell sorting=MACS) erm��glicht werden. Da B7-H1 verst��rkt auf Tumorzellen exprimiert wird, wurde zudem die Blockade von B7-H1 mittels Antik��rper in vivo untersucht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten eine reduzierte T-Zell-Antwort unter Einfluss von B7-H1, die durch 5FU und IFN-�� bedingt verbessert werden konnte. Die Therapie f��rderte jedoch zeitgleich die B7-H1-Expression. Unter Einfluss von B7-H1 zeigten sich zudem h��here Mengen an tumorinfiltrierenden M2-Makrophagen sowie erh��hte Tumorvolumina. Es konnte zudem anhand aus Tumoren stammender Makrophagen deren bereits beschriebenes, immunsuppressives Verhalten anhand fehlender Stimulation von T-Zellen zur Proliferation, Schaffung eines immunsuppressiven Milieus sowie reduzierter Phagozytoseaktivit��t gezeigt werden. B7-DC zeigte keine deutlichen Ver��nderungen unter Abwesenheit von B7H1. Die Blockade von B7-H1 mittels Antik��rper erwies sich daf��r als m��glicher, praxisnaher Therapieansatz mit deutlich verl��ngerter ��berlebenszeit.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas hat eine 5-Jahres-Überlebensrate von 8%. Der einzige kurative Therapieansatz ist die chirurgische R0-Resektion mit Strahlen- und Chemotherapie. Dennoch sind die Tumore oftmals therapieresistent. Der TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) kann über die Bindung an die Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 Apoptose in Krebszellen auslösen. Es werden agonistische, Rezeptor-spezifische Antikörper in klinischen Studien für die Behandlung verschiedener Tumorentitäten erprobt. Allerdings zeigen viele Tumorzellen Resistenzen gegenüber der apoptotischen TRAIL-Wirkung und weisen verstärkt TRAIL-vermittelte nicht-apoptotische, pro-inflammatorische Effekte auf. Eine Therapiemöglichkeit bietet die neue rekombinante TRAIL-Form APG350. In den in vitro Versuchen konnte bei identischer massenbezogenen Konzentration der Substanzen gezeigt werden, dass APG350, genauso effektiv wie TRAIL, die apoptotische Signalkaskade in PancTuI-Zellen induzierte. Beide Substanzen induzierten in gleichem Ausmaß Apoptose in der Apoptose-resistenten Zelllinie Colo357 Bcl-xL, jedoch war die Ausprägung der Apoptose im Vergleich zur parentalen Colo357-Zelllinie signifikant verringert. Der Vergleich der beiden TRAIL-Varianten zeigt, dass das APG350 weniger stark die Signalwege p38, JNK und NF-κB in Panc89- und Colo357-Zellen induziert. In den in vivo Untersuchungen zeigt die Behandlung mit APG350, dass das Wachstum von primären PancTuI- bzw. Colo357-Tumoren signifikant reduziert wurde. Die APG350-Therapie verringerte signifikant das Wachstum von PancTuI-Rezidivtumoren und reduzierte die Anzahl der Colo357-Vektor-Rezidivtumore. Zusammenfassend stellt die Behandlung mit dem APG350 ein vielversprechender Ansatz für die Eliminierung von Apoptose-sensitiven und von Apoptose-resistenten geringe Mengen an Bcl-xL-exprimierenden Zellen dar und führt zur verminderten Aktivierung pro-inflammatorischer Signalwege in Pankreaskarzinomzellen. The pancreatic ductal adenocarcinoma has a 5-year survival rate of 8%. The only curative therapy is the surgical R0-resection followed by radio- and chemotherapy. However, the effects of this therapy form are limited because of tumor resistance. The TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis via death receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 in tumor cells. Therefore, a recombinant form of soluble TRAIL and agonistic antibodies that specifically target TRAIL-R1 or TRAIL-R2 are tested in clinical trials for the treatment of different tumor entities. Unfortunately, tumor cells show resistance to TRAIL-therapy and exhibit TRAIL-induced non-apoptotic, pro-inflammatory signaling. The recombinant TRAIL-variant APG350 is a promising treatment option. The in vitro studies reveal that hexameric APG350 induces apoptosis similar to trimeric TRAIL by identical mass concentration in PancTuI-cells. With respect to tumor cell lines with different sensitivity, both TRAIL-variants induce apoptosis in the same range in resistant Colo357 Bcl-xL cells, but this induction was significantly reduced in comparison to Colo357 cells. Comparing the two TRAIL-variants by uniform mass concentration, hexameric APG350 induces signaling pathway p38, JNK and NF-κB less stronger than trimeric TRAIL in Panc89- and Colo357-cells. In in vivo studies APG350-treatment significantly reduces the growth of primary PancTuI- and Col357 vector-tumors. Therapy with APG350 also decreases the growth of PancTuI-recurrent tumors and furthermore the number of Colo357 vector-recurrent tumors in mice. In contrast to that, no reduction in apoptotic-resistant Bcl-xL-overexpressing Colo357-tumors can be achieved. In summary, treatment with APG350 represents a promising therapeutic agent for the elimination of apoptotic-sensitive tumor cells and apoptotic-resistant tumors cells with low Bcl-xL-expression and reduces the activation of non-apoptotic pro-inflammatory signaling in pancreatic cancer cells.

Es ist bekannt, dass CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) im Blut und Pankreasgewebe von Patienten mit duktalem Pankreasadenokarzinom (PDAC) erhöht sind und ihr Vorkommen mit einer schlechten Prognose korreliert. Das Adhäsionsmolekül L1CAM wird vermehrt im PDAC exprimiert ist ebenfalls mit einer ungünstigen Prognose verbunden. Die chronische Pankreatitis, bei der L1CAM im Vergleich zu Normalgewebe ebenfalls erhöht ist, gilt als Risikofaktor für die Entwicklung eines PDAC. Daraus ergab sich die Frage, ob L1CAM eine Rolle bei der Anreicherung von Tregs im PDAC spielt. CD4+ T-Effektorzellen und Tregs mit dem hoch immunsuppressiven Phänotyp CD4+CD25+CD49d-CD127- wurden aus dem Blut gesunder Spender isoliert und mit Pankreasgangepithelzelllinien cokultiviert. Die Pankreatitis und benigne Pankreasgangepithelzellen wurden durch die Zelllinie H6c7, das PDAC dagegen durch die maligne Zelllinie Panc1 simuliert. Beide Zelllinien wurden jeweils mit niedriger und hoher Expression von L1CAM eingesetzt. Dann wurden die T-Zellen bezüglich Phänotyp, Proliferation und Migration analysiert. Zudem wurden Prävalenzen unterschiedlicher T-Zell-Populationen im Blut und Gewebe von Patienten mit chronischer Pankreatitis und PDAC sowie im Blut gesunder Spender bestimmt und mit klinischen Parametern korreliert. Die Ergebnisse zeigen, dass L1CAM die Bildung einer neuen Subpopulation von Tregs mit einem CD4+CD69+CD25- Phänotyp und immunsuppressiver Potenz fördert. Der Phänotyp von CD4+CD25+CD49d-CD127- Tregs blieb unter gleichen Bedingungen stabil, wobei deren Migration in Anwesenheit von L1CAM im Vergleich zu T-Effektorzellen deutlich erhöht war. Zudem war die Proliferation von T-Effektorzellen nach Cokultur mit den L1CAM-exprimierenden Zelllinien erniedrigt. Neben seiner bekannten Bedeutung in der Vermittlung von Chemoresistenz und Migration bzw Invasion von Tumorzellen konnte in dieser Arbeit somit eine neue Rolle von L1CAM in der Tumorgenese des PDAC aufgezeigt werden.

Das duktale Pankreasadenokarzinom (PDAC) zählt mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 8 % zu den bösartigsten Tumoren. Durch die frühzeitige Metastasierung sowie ausgeprägte Chemoresistenz stellt es noch heute eine infauste Prognose dar. Ein wichtiger Mechanismus dabei ist die Epitheliale-Mesenchymale-Transition (EMT), bei der epitheliale Zellen die Charakteristika von beweglicheren mesenchymalen Zellen annehmen. Unterstützt wird die EMT durch ein inflammatorisches nicht-neoplastisches Stroma, zu dem diverse Immunzellen zählen. So geht die Anreicherung von Makrophagen, regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen im PDAC-Stroma einher mit einer niedrigeren Lebenserwartung der Patienten. Diese Arbeit hat einen Beitrag dazu geleistet, den Einfluss von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) auf das duktale Pankreasgangepithel zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über die frühen Veränderungen in der pankreatischen Tumorgenese zu erhalten. Dabei wurden Hinweise darüber erarbeitet, ob es Unterschiede zwischen PBMC von gesunden Individuen und PDAC-Patienten gibt. Insgesamt untermauern die in der vorgelegten Arbeit präsentierten Ergebnisse die Hypothese, dass die im Tumorstroma angereicherten Immunzellen nicht nur eine immunmodulierende Komponente während der Tumorigenese sind, sondern vielmehr eine direkte protumorigene Rolle in der Entwicklung epithelialer Tumore einnehmen. Hauptpromotoren der PDAC-Progression scheinen neben regulatorischen T-Zellen, Myofibroblasten und Makrophagen auch T-Effektorzellen darzustellen. Zur vollständigen Klärung der Rolle von Immunzellen, der von ihnen genutzten Signalwege bzw. ihrer Interaktion mit anderen Zellen genutzten Botenstoffe sind weiterführende Untersuchungen in größeren Kollektiven notwendig. Eine genaue Analyse und Übersicht des Zusammenspiels aller beteiligten Immunzellen schafft die Voraussetzung für effektive immunbasierte Antitumortherapien. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) belongs to the most malignant tumors with an overall 5-year-survival rate of 8%. Since the tumor is mostly diagnosed in an advanced stage, curative therapeutic options are limited to less than 20% of the patients. Moreover, PDAC exerts a profound radio- and chemotherapy resistance worsening therapeutic responses and prognosis of these patients. An important mechanism is the epithial to mesenchymal transition.

Für die Mehrzahl der Patienten mit einem duktalen Pankreasadenokarzinom (PDAC) besteht nach wie vor keine Aussicht auf eine Heilung. Dies ist maßgeblich bedingt durch das meist fortgeschrittene Krankheitsstadium bei Diagnosestellung sowie den intensiven Widerstand des Tumors gegenüber einer Chemotherapie. Charakteristisch für PDAC, aber auch für die chronische Pankreatitis (CP), die einen Risikofaktor für die Entstehung dieses Tumors darstellt, ist die starke desmoplastische Reaktion (Stroma). Ein Bestandteil des Stromas sind Immunzellen, deren Wirkung sowohl krankheitsfördernd als auch krankheitshemmend sein können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die spezifische immunhistochemische Färbung von γδ-T-Lymphozyten etabliert und eine Infiltration von γδ-T-Zellen im PDAC und bei der CP nachgewiesen. Gleichzeitig erfolgte die Quantifizierung von infiltrierenden CD3+, CD4+, CD8+ T-Lymphozyten und die Auswertung der Expression des Wachstumsfaktorrezeptors HER-2/neu in beiden Pankreaserkrankungen. Es konnte gezeigt werden, dass γδ-T-Lymphozyten wie auch CD3+ und CD8+ T-Lymphozyten in den gleichen Bereichen des Stromas und des Gangepithels beider Pankreaserkrankungen zu finden waren. Allerdings war die Dichte der γδ-T-Lymphozyten stärker im PDAC als in der CP ausgeprägt. Ferner sammelten sich die γδ-T-Lymphozyten im PDAC stärker im Gangepithel und im Stroma in der Nähe des Gangepithels an, während sie sich bei der CP vor allem im Stroma und fern von Gangepithelien ansammelten. Im Stroma waren CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen wesentlich häufiger in CP- im Vergleich zu PDAC-Gewebe zu finden. CD8+ T-Zellen kamen im Verhältnis zu CD4+ T-Zellen häufiger in PDAC- als in CP-Präparaten vor. Das Gegenteil galt für die CD4+ T-Zellen, sie waren im Verhältnis zu CD8+ T-Zellen häufiger in CP- als in PDAC-Präparaten zusehen. Bei der Auswertung der Expression bezüglich des Oberflächenmoleküls HER-2/neu (für Tumorzellen) war keine spezifische membranständige Expression zu sehen. Diese Arbeit weist auf die Bedeutung von γδ-T-Lymphozyten bei einer möglichen Tumortherapie gegenüber PDAC hin. Die Anwesenheit von γδ-T-Lymphozyten in der Nähe der Tumorzellen und deren Lokalisation innerhalb des malignen Gangepithels von PDAC unterstreicht deren potenzielle Rolle bei der Immunantwort.

In dieser experimentellen Arbeit konnten die Casein-Kinasen 1-delta und epsilon als Schlüsselenzyme für die beim Pankreasadenocarcinoms vorliegende Apoptoseresistenz identifiziert werden. Durch die Hemmung der Enzyme konnte die verminderte Ansprechbarkeit der Tumorzellen durch die CD95-vermittelte Apoptose verbessert werden.

MikroRNAs sind kleine nicht kodierende RNAs die regulierend auf post-transkriptionaler Ebene in die Genexpression eingreifen. TRAIL gehört zur TNF Superfamilie und induziert Apoptose hauptsächlich in Tumorzellen. PDACs weisen oftmals eine TRAIL-induzierte Apoptoseresistenz auf. Um die mögliche Deregulation der mikroRNA-Genexpression nach TRAIL-Rezeptor Aktivierung zu untersuchen, wurden Colo357-Zellen mit TRAIL behandelt und die Genexpression der mikroRNAs mittels mikroRNA-Array Analyse und qRT-PCR analysiert. Die TRAIL-Behandlung induzierte die Genexpression der reifen mikroRNA-197 und reduzierte die Genexpression der reifen mikroRNA-432* in TRAIL-sensitiven Colo357-Zellen. Des Weiteren wirkte sich das experimentelle Aus- und Anschalten von mehreren mikroRNAs (miR-197, miR-432* und miR 452*) nach TRAIL-induzierter Apoptose in TRAIL sensitiven Colo357-Zellen und in TRAIL-resistenten Panc89-Zellen auf die Apoptoseinduktion aus. Das Ausschalten der mikroRNA-197 in Panc89-Zellen erhöhte außerdem die Sensibilität gegenüber FasL, aber nicht gegenüber TNFα. Die Inhibition der mikroRNA-197 führte zu einer PARP-Spaltung in unbehandelten Panc89-Zellen. Wohingegen die Überexpression der mikroRNA-432* in Panc89-Zellen zu einer verstärkten PARP Spaltung nach TRAIL-induzierter Apoptose führte. Das Ausschalten der mikroRNA-197 und das gleichzeitige Anschalten der mikroRNA-432* resultierte in einer verstärkten Apoptose nach TRAIL-Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass mikroRNA-197 und mikroRNA-432* vielversprechende Kandidaten sein könnten, um TRAIL-resistente PDACs in TRAIL-sensitive PDACs umzuwandeln. Weiterhin reduzierte das Ausschalten der mikroRNA-197 Genexpression signifikant die Proliferation von Colo357- und Panc89-Zellen durch die Aktivierung des p38 Signaltransduktionsweges und führte auch zur Sezernierung von IL-6 und zu Caspase-abhängigen Zelltod. Ähnlich Effekte wurden auch bei HeLa-Zellen gemessen. Durch differentielle 2D-Gelelektrophorese und anschließende Massenspektometrie wurde nach Ausschalten der mikroRNA-197 eine Hochregulation der Ran GTPase Genexpression gemessen. MikroRNA-mRNA-Bindesequenzvorhersageprogramme zeigen, dass mikroRNA-197 an die 3’-UTR der mRNA der Ran GTPase binden kann. Dies konnte experimentell verifiziert werden. Da das Gen der Ran GTPase in vielen unterschiedlichen Tumoren überexprimiert wird und die Inhibition in Tumorzellen aber nicht in gesunden Zellen zu Apoptose führt, zeigen diese Daten, dass mikroRNA-197 eine wichtige Rolle in der Malignität von epithelialen Zellen, durch die Regulation der Ran GTPase-Genexpression, spielen könnte.