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3 results on '"PCR Extra-rápida"'

1. Caracterización Molecular de Genes cry de Bacillus thuringiensis Utilizando PCR Extra-Rápida

Author

Leonardo Mariño, Javier Hernández, Martha Orozco, and Javier Narvaez

Subjects
PCR Extra-rápida, Caracterización genética molecular, Bacillus Thuringiensis, Nota técnica, Extra-fast PCR, Molecular genetic characterization, Agriculture, Agriculture (General), S1-972, Animal culture, SF1-1100
Abstract

Nota Técnica BACILLUS thuringiensis (Bt) es el microorganismo más utilizado para el control biológico de insectos plagas en la agricul­ tura. Recientemente, se ha reportado el aislamiento de nuevas cepas de Bt con diferentes especificidades contra insectos lepidópteros, coleópteros y dípteros, así como contra nemátodos, platelmintos y protozoarios (Schnepf, 1995). Con el objetivo de caracterizar molecularmente el banco de cepas nativas colombianas de Bacillus thuringiensis de CORPOICA (Resultados sin publicar), se estandarizó una metodología basada en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando un grupo de oligonucleótidos generales que reconocen genes de las familias cryI, cryIIA, cryIIIA, cryIVA y cryV en aislamientos de Bt. Esta metodología permite una rápida evaluación de cepas nativas de Bt y la predicción de su actividad biológica como un paso previo a los ensayos de toxicidad de insectos. La PCR ha sido utilizada con éxito para la caracterización molecular de cepas nativas de Bt (Carozzi et al., 1991; Bourque et al., 1993; Gleave et al., 1993; Cerón et al. 1994), debido a su alta sensibilidad y especificidad. Generalmente, el tiempo requerido para una reacción de amplificación estándar de 30 ciclos es de aproximadamente 3 horas, con tiempos de denaturación, hibridación y extensión de 1 minuto cada uno. Tomando como base la experiencia reportada por Liu y Shearn (1995), se realizó un ensayo con el objetivo de disminuir estos tiempos a 1 segundo cada uno. Utilizando un termociclador de bloque (PTC­ 100, MJ Research, USA), se amplificaron los genes cryI, cryIA, IIA, IIIA, IVA y V de Bt, en mezclas de reacción que contenían 100 ng de DNA, 0.5 mM de cada oligonucleótido, 200 mM de cada dNTP (Amersham, UK), 1X PCR Buffer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 1.5 mM MgCl2) y 2.5 U de AmpliTaq DNA Polimerasa (Perkin Elmer, USA). Los parámetros para la amplificación consistieron en 1s a 94°C, 1s a 53°C y 1s a 72°C por 30 ciclos. Los resultados muestran que es posible reducir a menos de la mitad el tiempo re­ querido para amplificar fragmentos por PCR, de 3 horas a 1hora y 15 minutos. Utilizando esta PCR extra rápida se han amplificado fragmentos de hasta 800 pares de bases (pb) (Figura 1). Una denaturación y una extensión de 1 segundo es suficiente para obtener un buen producto de amplificación. Esto es debido a que hay un tiempo de transición entre las temperaturas de denaturación, hibridación y extensión de aproximadamente 30 segundos, que es suficiente para una síntesis completa de los fragmentos de genes cry amplificados. Este novedoso avance tecnológico está siendo implementado para la caracterización molecular de cepas nativas de Bt y puede ser empleado para otros propósitos en donde se requiera amplificar por PCR fragmentos de DNA menores de 800 pb.

Published
1996
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2. AMDAR e PCR extra-rápida para a identificação da Tartaruga-Comum Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae), utilizando o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI)

Author

Lancheros-Piliego, Daniel and Hernández Fernández, Javier

Subjects
Caretta caretta, Citocromo c oxidase I (COI), PCR extra-rápida, AMDAR, Cytochrome c oxidase I (COI), Citocromo c oxidasa I (COI), High-speed PCR, Código de barras, PCR de alta velocidade, Barcode
Abstract

Para identificación molecular de tortuga cabezona Caretta caretta, se utilizó Amplificación Mitocondrial DNA y Análisis de Restricción y PCR Extra-rápida. Se obtuvo muestras de sangre de juveniles de C. caretta de playa Don Diego (Magdalena; n=4) e Islas Del Rosario (Bolívar; n=2) en el Caribe colombiano. Se aisló DNA, se estandarizó la amplificación del gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI) por PCR extra-rápida, obteniendo fragmentos de 650 pares de bases, disminuyendo en un tercio el tiempo de reacción. El producto amplificado de COI se analizó con enzimas HindIII, HyCH4III y MseI generando perfil electroforético que al compararlo in silico con secuencias para otras especies de tortugas marinas; permitió identificar patrón específico para la tortuga cabezona. Las secuencias nucleótidicas se analizaron con BLAST y similaridad entre 97-99 % con C. caretta en cinco secuencias y 92 % en otra. La información de tortugas muestreadas fue integrada en base datos BOLD y se generó el código de barras. La metodología descrita para identificación de C. caretta es procedimiento rápido y bajo costo que minimiza el tiempo de PCR mejorando su especificidad. We molecularly identified the loggerhead turtle Caretta caretta using high-speed PCR amplification and restriction analysis of mitochondrial DNA. We isolated the DNA from blood from juvenile C. caretta from Don Diego beach (Magdalena; n=4), in Islas Del Rosario (Bolívar; n=2) in the Colombian Caribbean. By using high-speed PCR amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI), we reduced reaction by one third and obtained fragments of 650 base pairs. We analyzed the amplified IOC product using enzymes HindIII, HpyCH4III and MseI and generated an electrophoretic profile, which compared in silico to other sea turtle species sequences, revealed the loggerhead's specific pattern. We found similarity between 97-99% with C. caretta in five of the BLAST analyzed nucleotide sequences and 92% in another. We generated a bar code for the sampled turtle information and sequences and stored them in the BOLD database. The methodology described for the identification of C. caretta is a fast and inexpensive procedure that minimizes time and improves PCR specificity. Identificámos molecularmente a tartaruga-comum Caretta caretta usando PCR amplificado de alta-velocidade e análise de ADN mitocondrial restrito. Isolámos o ADN do sangue de juvenis C. carreta das praias Don Diego (Magdalena ; n=4), das Ilhas del Rosario (Bolívas; n=2) no Caribe Colombiano. Ao utilizar a amplificação por PCR de alta velocidade da citocromo c oxidase I (COI ), reduzimos a reacção a um terço, e obtivemos fragmentos de 650 pares de bases. Analisámos o produto IOC amplificado com as enzimas de restrição HindIII , HyCH4III e MseI e gerámos um perfil eletroforético, que comparado em silico com outras seqüéncias de espécies de tartarugas marinhas, revelou padrão específico à tartaruga-comum. Encontramos semelhanças entre 97-99 %, com C. caretta em cinco das seqüéncias de nucleotídeos BLAST analisados e 92% com outro. Gerámos um código de barras para a informação e seqüéncias das tartaruga amostradas e foram armazenados na base de dados BOLD. A metodologia descrita para a identificação de C. caretta é um procedimento rápido e barato, que minimiza o tempo e melhora a especificidade da PCR.

Published
2013

3. Caracterización Molecular de Genes cry de Bacillus thuringiensis Utilizando PCR Extra-Rápida

Author

Mariño Ramírez, Leonardo, Hernández, Luis Alfredo, Orozco C., Martha L., Narvaez V., Javier, Mariño Ramírez, Leonardo, Hernández, Luis Alfredo, Orozco C., Martha L., and Narvaez V., Javier

Abstract

BACILLUS thuringiensis (Bt) es el microorganismo más utilizado para el control biológico de insectos plagas en la agricul­ tura. Recientemente, se ha reportado el aislamiento de nuevas cepas de Bt con diferentes especificidades contra insectos lepidópteros, coleópteros y dípteros, así como contra nemátodos, platelmintos y protozoarios (Schnepf, 1995). Con el objetivo de caracterizar molecularmente el banco de cepas nativas colombianas de Bacillus thuringiensis de CORPOICA (Resultados sin publicar), se estandarizó una metodología basada en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando un grupo de oligonucleótidos generales que reconocen genes de las familias cryI, cryIIA, cryIIIA, cryIVA y cryV en aislamientos de Bt. Esta metodología permite una rápida evaluación de cepas nativas de Bt y la predicción de su actividad biológica como un paso previo a los ensayos de toxicidad de insectos.La PCR ha sido utilizada con éxito para la caracterización molecular de cepas nativas de Bt (Carozzi et al., 1991; Bourque et al., 1993; Gleave et al., 1993; Cerón et al. 1994), debido a su alta sensibilidad y especificidad. Generalmente, el tiempo requerido para una reacción de amplificación estándar de 30 ciclos es de aproximadamente 3 horas, con tiempos de denaturación, hibridación y extensión de 1 minuto cada uno. Tomando como base la experiencia reportada por Liu y Shearn (1995), se realizó un ensayo con el objetivo de disminuir estos tiempos a 1 segundo cada uno. Utilizando un termociclador de bloque (PTC­ 100, MJ Research, USA), se amplificaron los genes cryI, cryIA, IIA, IIIA, IVA y V de Bt, en mezclas de reacción que contenían 100 ng de DNA, 0.5 mM de cada oligonucleótido, 200 mM de cada dNTP (Amersham, UK), 1X PCR Buffer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 1.5 mM MgCl2) y 2.5 U de AmpliTaq DNA Polimerasa (Perkin Elmer, USA). Los parámetros para la amplificación consistieron en 1s a 94°C, 1s a 53°C y 1s a 72°C por 30 ciclos.Los resultados muestran que es posible redu

Published
1996

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