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Recent studies concerning the pathophysiology of myelodysplastic syndromes (MDS) have shown evidences for the existence of complex interactions between hematopoietic stem cells and the bone marrow (BM) microenvironment. We analyzed the B-lymphocyte maturation in BM of patients with MDS. For this purpose, 41 newly-diagnosed patients were analyzed. Enumeration and characterization of CD34+ and CD34- B-cell precursors and mature B-lymphocytes was performed using multiparameter flow cytometry. BM from eight transplant donors and six orthopedic surgery patients were used as controls. CD34+/CD45(lo) B-cells were found in 17/22 patients with RA/RARS and in 5/13 with RAEB. In patients with RAEB-t and CMML no CD34+ B-cell precursors could be detected. A positive correlation was found between CD34+ and CD34- B-cell precursors (r=0.52). CD34+ B-cell precursors presented an inverse correlation with BM percentage of blasts and peripheral leukocytes and a positive one with hemoglobin. Asynchronous antigen expression (CD19+/CD79a- cells) was found in 7/11 cases of RA/RARS and 6/18 cases of RAEB in which this phenotype was examined. Abnormal patterns of expression for at least one antigen was found in 91% of RA/RARS cases and in 74% of RAEB. Underexpression of TdT and CD79a were the most frequent abnormalities. Our results present evidences of an abnormal B-cell maturation in MDS. This may be an evidence that B-lymphocytes are derived of the abnormal clone. But it may also be the consequence of influences of abnormalities of BM microenvironment leading to an impaired commitment and maturation of the B-cell line in MDS. Studies performed with purified well-characterized B-cells may further elucidate these abnormalities.

BACKGROUND Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) is a clonal plasma cell (PC) disorder usually characterized by a benign clinical course. However, in approximately 25% of patients, the disorder has been found to evolve into a multiple myeloma (MM). The mechanism leading to the evolution of MGUS remains unknown. The aim of the current study was, first, to assess by interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) the incidence of numerical abnormalities of chromosomes 6, 9, 13, and 17 in MGUS patients and to compare it with that found in MM and PC leukemia (PCL) patients and, second, to explore the potential heterogeneity of the pathologic PC in MGUS as a way to identify unique cytogenetic patterns different from those frequently observed in MM and PCL. METHODS Numerical abnormalities of chromosomes 6, 9, 13, and 17 were investigated by dual- and triple-color FISH in bone marrow PC from 208 patients corresponding to MGUS (n = 30), MM (n = 158), and PCL (n = 20) cases. In MGUS and MM patients with < 10% PC, both normal and phenotypically aberrant PC were discriminated by multiparameter flow cytometry, the latter subset being specifically sorted for FISH analysis with a purity of 93% ± 6%. RESULTS Overall, 57% of the MGUS patients displayed abnormalities for at least 1 of the 4 chromosomes analyzed compared with 75% of both MM and PCL cases. The most common single chromosome abnormalities detected in MGUS were gains of chromosomes 9 (23%) and/or 6 (21%) and loss of chromosomes 13 (21%) and/or 17 (17%). Compared with MM patients, MGUS patients were found to have both a lower incidence of gains of chromosome 9 (23% vs. 54%, P = 0.002) and monosomy 13/13q- deletions (21% vs. 38%, P = 0.07); with respect to PCL cases, MGUS patients were found to have a lower incidence of monosomy 13/13q- deletions (21% vs. 75%, P < 0.001) together with a slightly higher frequency of gains of both chromosomes 6 (21% vs. 0%, P = 0.05) and 9 (23% vs. 7%, P = 0.1). The simultaneous use of two or three different chromosome probes showed that within the purified compartment of phenotypically aberrant PC from most MGUS patients (67%), more than 1 PC clone could be identified. In contrast, the incidence of 2 or more PC clones was much lower in MM (19%, P < 0.001) and PCL (15%, P = 0.003). Interestingly, although some FISH patterns were shared by both groups of diseases (i.e., monosomy 13/13q- deletions alone, gains of chromosome 9 alone or together with trisomy 6), others were found almost exclusively in either MGUS (i.e., a clone with monosomy 6 and/or 17 together with nuclei displaying a normal chromosome number) or in MM (i.e., monosomy 13/13q- deletions together with gains of chromosome 6 and/or 9). CONCLUSIONS In summary, the results of the current study showed that MGUS patients displayed a high incidence of numerical alterations, which are usually associated with the presence of more than one tumor cell clone. It is interesting to note that the cytogenetic patterns observed in the aneuploid PC clones from MGUS patients were frequently different from those observed in both MM and PCL. Cancer 2003;97:601–9. © 2003 American Cancer Society. DOI 10.1002/cncr.11100

Epstein-Barr virus (EBV) is present in 95% of the world's adult population. The immune response participates in immune vigilance and persistent infection control, and this condition is maintained by both a good quality (functionality) and quantity of specific T cells throughout life. In the present study, we evaluated EBV-specific CD4+ and CD8+ T lymphocyte responses in seropositive healthy individuals younger and older than 50 years of age. The assessment comprised the frequency, phenotype, functionality and clonotypic distribution of T lymphocytes. We found that in both age groups a similar EBV-specific T cell response was found, with overlapping numbers of tumour necrosis factor (TNF)-α+ T lymphocytes (CD4+ and CD8+) within the memory and effector cell compartments, in addition to monofunctional and multi-functional T cells producing interleukin (IL)-2 and/or interferon (IFN)-γ. However, individuals aged more than 50 years showed significantly higher frequencies of IL-2-producing CD4+ T lymphocytes in association with greater production of soluble IFN-γ, TNF-α and IL-6 than subjects younger than 50 years. A polyclonal T cell receptor (TCR)-variable beta region (Vβ) repertoire exists in both age groups under basal conditions and in response to EBV; the major TCR families found in TNF-α+/CD4+ T lymphocytes were Vβ1, Vβ2, Vβ17 and Vβ22 in both age groups, and the major TCR family in TNF-α+/CD8+ T cells was Vβ13·1 for individuals younger than 50 years and Vβ9 for individuals aged more than 50 years. Our findings suggest that the EBV-specific T cell response (using a polyclonal stimulation model) is distributed throughout several T cell differentiation compartments in an age-independent manner and includes both monofunctional and multi-functional T lymphocytes., This study was supported by the following grants: ID 4149 and ID 3128 from the Pontificia Universidad Javeriana Bogotá, Colombia.

Mastocytosis comprises a heterogeneous group of disorders characterized by the presence of clonal mast cells (MC) in organs such as skin, bone marrow (BM), and gastrointestinal tract, among other tissues. The clonal nature of the disease can be established in most adult patients by the demonstration of activating KIT mutations in their BM MC. When highly sensitive techniques capable of identifying cells present at very low frequencies in a sample are applied, BM MC from virtually all systemic mastocytosis patients display unique immunophenotypical features, particularly the aberrant expression of CD25. By contrast, large, multifocal BM MC aggregates (the only World Health Organization major criterion for systemic mastocytosis) are absent in a significant proportion of patients fulfilling at least three minor criteria for systemic mastocytosis, particularly in subjects studied at early stages of the disease with very low MC burden. Moreover, recent molecular and immunophenotypical investigations of BM MC from patients with indolent systemic mastocytosis have revealed a close association of some biological features (e.g., multilineage involvement of hematopoiesis by the KIT mutation and an immature mast cell immunophenotype) with an increased risk for disease progression. These observations support the fact that, although the current consensus diagnostic criteria for systemic mastocytosis have been a major advance for the diagnosis and classification of the disease, rationale usage of the most sensitive diagnostic techniques available nowadays is needed to improve the diagnosis, refine the classification, and reach objective prognostic stratification of adult mastocytosis., This work was supported by grants from the Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) of the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economia y Competitividad of Spain (PS09/00032 and PI11/02399, FEDER); Fundación Sociosanitaria de Castilla-La Mancha (2007/36, 2010/008 y G-2010/C-002); Fundación Española de Mastocitosis (FEM 2010); Junta de Castilla y León (Grant SAN/103/2011); BioB-HVS supported by grant of RETICS RD09/0076/00074 (Toledo, Spain) and RETICS RD06/0020/0035, (FEDER) from the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economia y ompetitividad of Spain.

BACKGROUND: Clinical indications for lymphocyte subset enumeration by flow cytometry include monitoring of disease progression and timing of therapeutic intervention in infection with human immunodeficiency virus. Until recently international standardisation has not been possible due to a lack of suitable stable reference material. METHODS: This study consisted of two trials of a stabilised whole blood preparation. Eleven participants were sent two standard protocols for staining plus gating strategy and asked to report absolute counts for lymphocyte subsets. RESULTS: No significant difference was detected between the two methods when results from the two assays and all partners were pooled. Significant differences in results from the different partners were observed. However, representative mean counts were obtained for geometric means, geometric coefficient of variation, and 95% confidence interval for CD3 910 cells/mul, 9%, and 888 to 933, respectively), CD4 (495 cells/mul, 12%, and 483 to 507), and CD8 (408 cells/mul, 13%, and 393 to 422). CONCLUSION: We have introduced a stabilised blood preparation and a well-characterized biological standard. The availability of this reference material greatly simplifies the validation of new techniques for CD4(+) T-cell enumeration and the expansion of external quality assurance programmes for clinical laboratories, including those that operate in resource-restricted environments. (c) 2005 Wiley-Liss, Inc.

Multiparametric immunophenotyping of multiple myeloma (MM) and other plasma cell (PC) dyscrasias represents an attractive approach not only for research purposes but also in clinical practice. Based on well-established antigenic patterns, discrimination between myelomatous and normal PCs can be easily achieved in various types of samples, and this can be particularly valuable for the differential diagnosis between MGUS and MM and for monitoring residual disease in the latter. In addition, immunophenotyping may be an alternative and more reproducible method than morphology for evaluating PC infiltration, as well as for specifically analyzing DNA content and the cell-cycle distribution of different subsets of PCs. Despite the widespread use, standardization of methods and protocols still remains a challenge. In this chapter, we describe in detail the protocols and precise instructions for specimen collection, sample preparation, together with the methods for staining PCs and flow cytometry, data acquisition, and data analysis, including the more recent developments in the field. We highlight the most frequent limitations, and provide troubleshooting and practical recommendations that could help to solve them. The goal of this chapter is to emphasize the relevance of methodological issues in order to obtain reproducible and high-quality results regarding the phenotypic analysis of PCs.

Multiparametric immunophenotyping of multiple myeloma (MM) and other plasma cell (PC) dyscrasias represents an attractive approach not only for research purposes but also in clinical practice. Based on well-established antigenic patterns, discrimination between myelomatous and normal PCs can be easily achieved in various types of samples, and this can be particularly valuable for the differential diagnosis between MGUS and MM and for monitoring residual disease in the latter. In addition, immunophenotyping may be an alternative and more reproducible method than morphology for evaluating PC infiltration, as well as for specifically analyzing DNA content and the cell-cycle distribution of different subsets of PCs. Despite the widespread use, standardization of methods and protocols still remains a challenge. In this chapter, we describe in detail the protocols and precise instructions for specimen collection, sample preparation, together with the methods for staining PCs and flow cytometry, data acquisition, and data analysis, including the more recent developments in the field. We highlight the most frequent limitations, and provide troubleshooting and practical recommendations that could help to solve them. The goal of this chapter is to emphasize the relevance of methodological issues in order to obtain reproducible and high-quality results regarding the phenotypic analysis of PCs.

Número de publicación: 2 112 211. Número de solicitud: 9600715, Procedimiento para el estudio del ciclo celular de subpoblaciones de células presentes en muestras celulares heterogéneas. Comprende: incubar la muestra de forma secuencial con: 1) un pool de anticuerpos monoclonales diferentes marcados con un mismo fluorocromo y 2) con un fluorocromo que se une de forma específica a ácidos nucléicos; medir por citometría de flujo las emisiones fluorescentes; determinar el ciclo celular de forma específica de las subpoblaciones de células de la muestra identificadas mediante análisis multiparamérico que permite conocer todos los tipos celulares identificados la proporción de células en las fases G0/G1, de síntesis de ADN (S) y G2/mitosis (G2/M) del ciclo celular., Universidad de Granada

Trabajo de fin de Grado. Grado en Estadística. Curso académico 2021-2022., [ES]Los problemas de clasificación o discriminación son una constante en numerosos ámbitos de la actividad humana, y en concreto en investigación biomédica y clínica, pudiéndose plantear aproximaciones y soluciones a los mismos. Con ayuda de técnicas estadísticas de análisis multivariante podremos encontrar la solución más adecuada a estos problemas teniendo en consideración el tipo de información de la que se disponga. En este trabajo de investigación se desarrollará una explicación teórica acerca del universo que circunda el análisis multivariante para posteriormente aplicar dos de sus técnicas a un conjunto de datos reales. También introduciremos términos como Ciencia de Datos, Big Data, Inteligencia Artificial, Machine Learning y Deep Learning, [EN]Classification or discrimination problems are a constant in many fields of human activity, and specifically in biomedical and clinical research, and approaches and solutions to these problems can be proposed. Using techniques of multivariate analysis we can find the most appropriate solution to these problems taking into consideration the type of information available. In this research work we will develop a theoretical explana tion about the universe that surrounds multivariate analysis and then apply two of its techniques to a real data set. We will also introduce terms such as Data Science, Big Data, Artificial Intelligence, Machine Learning and Deep Learning

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] Desarrollo y validación de un nuevo método de citometría de flujo para la detección sensible y estandarizada de enfermedad mínima residual en médula ósea de pacientes con mieloma múltiple tras tratamiento y para el rastreo y cuantificación de células plasmáticas tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes con neoplasias de células plasmáticas al diagnóstico y una vez iniciado el tratamiento en el mieloma múltiple. Los hallazgos encontrados en este sentido, se traducen en la disposición de herramientas técnicas útiles en la monitorización terapéutica y discriminación diagnóstica entre estos pacientes con neoplasias de células plasmáticas.

El Mieloma Multiple (MM) es una discrasia de celulas plasmaticas (CP) que esta precedida por dos entidades consideradas premalignas: la Gammapatia Monoclonal de Significado Incierto (GMSI) y el Mieloma smoldering (MMS). La GMSI presenta un riesgo de progresion a MM del 1% al ano que persiste incluso tras 25 anos de seguimiento. Se trata de una enfermedad prevalente en la poblacion mayor de 50 anos por lo que es importante conocer la prevalencia en la poblacion general para planificar una estrategia de seguimiento adecuada. En la ultima decada, el estudio de las cadenas ligeras libres (CLL) en suero ha mejorado la sensibilidad y especificidad en la identificacion de las Gammapatias Monoclonales (GM). Generar rangos locales de las CLL con sueros normales en una poblacion urbana, teniendo en cuenta determinadas caracteristicas como la edad o la funcion renal, proporcionaria unos valores de referencia mas fidedignos. Actualmente, se sabe que la cantidad de celulas plasmaticas clonales (CPc) circulantes en sangre periferica (SP) aumenta progresivamente en los diferentes estadios de la enfermedad, desde la GMSI al MM. El empleo de la Next Generation Flow (NGF) ha demostrado su utilidad en la deteccion de CPc circulantes con mayor sensibilidad que otras tecnicas empleadas hasta ahora. En los ultimos anos, el estudio de la inmunoparesia evaluada mediante el ensayo de Hevylite Chain (HLC) ha demostrado su utilidad como factor pronostico en las GMSI, ya que indica el grado de supresion inmune y expansion clonal tumoral, de manera mas especifica y sensible. Se plantearon como objetivos el evaluar la prevalencia de la GMSI y detectar factores predictores de evolucion a MM, en pacientes mayores de 50 anos, en un estudio poblacional de la ciudad de Segovia. Se definieron los rangos e intervalos de referencia de las CLL en suero, obtenidos de una cohorte de donantes sanos en un estudio poblacional espanol. Finalmente, se evaluo el riesgo de progresion de los pacientes con GMSI a MM: segun el modelo de la Clinica Mayo y los del grupo de Salamanca; y otros factores predictores de riesgo de progresion nuevos: la presencia y la cantidad de CPc circulantes en SP detectadas mediante NGF; y la inmunoparesia determinada mediante Hevylite Chain®. Se concluyo que la prevalencia de GMSI en la poblacion segoviana mayor de 50 anos y de raza caucasica fue similar a la publicada en otros estudios en paises occidentales. Dicha prevalencia de GMSI aumentaba con la edad y fue mas frecuente en el sexo masculino. Se ratifico que la electroforesis de proteinas y la inmunofijacion electroforetica en suero son metodos validos para el screening de la GMSI en la poblacion general. Por otro lado, se reafirmo la aplicabilidad del rango de normalidad de las CLL propuesto por la Clinica Mayo y The Binding Site, para la poblacion espanola; y que es necesario utilizar valores de referencia de las CLL especificos en situaciones de insuficiencia renal y/o edad avanzada. Se constato que la NGF es mas sensible en la deteccion de CPc en SP que la inmunohistoquimica o la Citometria de Flujo convencional, de manera poco invasiva. Ademas, la presencia de CPc circulantes en CP en una cantidad mayor de 0,058/L se asocia con otros factores pronosticos conocidos en GMSI, que hacen referencia a la infiltracion tumoral, por lo que seria necesario realizar un seguimiento mas estrecho de estos pacientes. Por ultimo, se objetivo que la supresion del par del Hevylite Chain® presenta mayor sensibilidad para la deteccion de inmunoparesia, respecto a la nefelometria clasica. La ratio alterada del par de Hevylite Chain® de la inmunoglobulina monoclonal y la supresion del par de HLC, se asocian con factores pronosticos conocidos en GMSI, relacionados con una mayor carga tumoral de celulas plasmaticas en medula osea y supresion inmune policlonal, por lo que realizar un seguimiento mas estrecho tambien seria preciso en estos pacientes.

Esta tesis doctoral incluye tres trabajos originales publicados en revistas cientificas indexadas en Science Citation Reports, segun se detalla a continuacion: 1. Immunophenotypical, morphologic, and functional characterization of maturation-associated plasmacytoid dendritic cell subsets in normal adult human bone marrow. Transfusion. 2009 Aug; 49(8):1692-1708. doi: 10.1111/j.1537-2995.2009.02170.x 2. Classification and clinical behavior of blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasms according to their maturation- associated immunophenotypic profile. Oncotarget. 2015 Aug; 6(22): 19204–19216. doi: 10.18632/oncotarget.4146 3. Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm frequently shows occult central nervous system involvement at diagnosis and benefits from intrathecal therapy. Oncotarget. 2016. doi: 10.18632/oncotarget.7101 La neoplasia de celula dendritica plasmocitoide blastica (NCDPB) constituye una hemopatia maligna muy poco frecuente, caracterizada desde el punto de vista clinico por presentar habitualmente infiltracion cutanea y un curso muy agresivo. Se ha demostrado que la contrapartida normal de esta leucemia es un precursor de celula dendritica plasmocitoide, por lo que en la clasificacion mas reciente de la OMS de 2008 la NCDPB queda englobada dentro de las “leucemias mieloblasticas agudas y otras neoplasias relacionadas de precursores mieloides”. En base a los resultados obtenidos y de acuerdo a los objetivos planteados en la presente tesis, se obtienen las siguientes conclusiones: En relacion con el primer objetivo, centrado en la identificacion de los precursores de CDp en medula osea de adultos sanos y el analisis de sus caracteristicas morfologicas, fenotipicas y funcionales: 1. En la MO de adultos sanos se identifican al menos tres estadios madurativos diferentes de CDp, que muestran distintas caracteristicas morfologicas, fenotipicas y funcionales. 2. Los precursores de CDp mas inmaduros (CD34+) coexpresan niveles variables de marcadores asociados a CDp, junto a marcadores mieloides habitualmente relacionados con la celula dendritica convencional, lo que sugiere que podria tratarse de un precursor comun a ambas subpoblaciones de CDs, con caracteristicas fenotipicas asociadas con la generacion de tolerancia inmune. 3. El perfil inmunofenotipico de maduracion normal de la CDp de MO definido de forma detallada en este trabajo, proporciona un modelo de referencia para el diagnostico y clasificacion de pacientes con neoplasia de celula dendritica plasmocitoide blastica. En relacion con el segundo objetivo, que perseguia establecer una asociacion entre el estadio madurativo de la celula tumoral de pacientes con NCDPB y las caracteristicas clinico-biologicas y evolutivas de la enfermedad: 4. La CDp tumoral de la NCDPB muestra un perfil fenotipico heterogeneo, que permite subclasificar la enfermedad en tres subgrupos madurativos distintos: un grupo menos numeroso de NCDPB inmaduras, que expresa CD34+ al menos de forma parcial, un grupo intermedio CD34neg CD117+, y un tercer grupo en el que las celulas tumorales muestran un fenotipo de CDp relativamente madura CD34neg y CD117neg. 5. El grado de diferenciacion de la CDp neoplasica esta relacionado con la forma de presentacion clinica de la enfermedad. Asi, mientras que las NCDPB mas inmaduras se asemejan en su comportamiento a una leucemia aguda con citopenias perifericas y escasa frecuencia de afectacion extramedular, las NCDPB mas maduras habitualmente muestran afectacion de organos linfoides secundarios y de tejidos perifericos, especialmente de la piel. 6. Los protocolos terapeuticos asociados al tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda que incluyen profilaxis del SNC y/o el trasplante alogenico de precursores hematopoyeticos, parecen resultar las aproximaciones mas eficaces para el tratamiento de la NCDPB, al ser los unicos capaces de lograr remisiones completas duraderas. En relacion con la incidencia de infiltracion del sistema nervioso central observada al diagnostico en pacientes con NCDPB y el posible efecto beneficioso del tratamiento intratecal: 7. Pese a la ausencia de sintomatologia neurologica, los pacientes con NCDPB muestran una elevada frecuencia de infiltracion del SNC al diagnostico, especialmente en aquellos casos que debutan con formas leucemicas de la enfermedad, lo que sugiere que la CDp tumoral presenta un elevado tropismo por el SNC. 8. La administracion temprana de tratamiento intratecal en pacientes con NCDPB se asocia con remisiones completas duraderas y una supervivencia mas larga, lo que sugiere que el SNC podria actuar como un santuario para las CDp tumorales, de dificil acceso para los tratamientos sistemicos convencionales. De confirmarse en series mas amplias de pacientes con un seguimiento prolongado, estos hallazgos apoyarian la incorporacion sistematica de la profilaxis intratecal a los protocolos de tratamiento de NCDPB.

En el ámbito de la investigación científica, la informática es ya una herramienta clave para cualquier estudio y para el avance en cualquier área de conocimiento. Entre estas áreas dependientes de la computación están sin duda las ciencias biológicas ómicas , que necesitan de la informática para manejar las grandescantidades de datos que generan.La convergencia de la tecnología y desarrollo informático-computacional con las áreas citadas de investigación biológica-biomolecular de carácter global ( ómico ), ha dadolugar a la aparición de una nueva disciplina académica y científica, la bioinformática.El trabajo de investigación desarrollado en esta Memoria de Tesis Doctoral, ha sidorealizado en diversas sub-áreas de la investigación bioinformática. En los dos primeros capítulos se ha trabajado con información proveniente de estudios proteómicos, con los objetivos de desarrollar herramientas que faciliten el análisis global de mapas y redes de interacción de proteínas y de diseñar estrategias que mejoren la calidad de los datos de interacción. Los dos últimos capítulos, en cambio, han usado datos einformación generada por estudios transcriptómicos. El capítulo tercero describe eldesarrollo de un método robusto de búsqueda de perfiles de expresión correlacionados,que ha permitido construir redes de coexpresión génica que son analizadas en suestructura y en el tipo de funciones biológicas que muestran. Por último, el capítulo cuarto estudia la desregulación de la expresión genómica producida en estados funcionales alterados (como estados de enfermedad), por medio del diseño de un algoritmo de búsqueda de grupos de genes con el perfil de expresión altamente cambiante y desregulado.

[ES] Hoy día, se considera que está bien establecida la naturaleza pre-leucémica de la LBMhi, dado que prácticamente todos los casos de LLC están precedidos por LBMhi, y que esta última presenta una tasa de progresión anual a LLC con necesidad de tratamiento del 1-2%.Por el contrario, en el momento de iniciar este trabajo no se había podido demostrar aún una relación directa entre la LBMlo y la LLC, a pesar de la elevada prevalencia de la primera en la población general y la similitud de sus características fenotípicas y genéticas con las de las células tumorales de la LLC. Además, tanto en LLC como en LBMhi existe una clara situación de inmunodeficiencia secundaria, responsable de la elevada frecuencia de procesos infecciosos entre estos pacientes, constituyendo una de las principales causas de fallecimiento de los mismos. Este trabajo de tesis doctoral concluye que los clones característicos de LBMlo, no solo persisten a medio plazo, sino que se produce un incremento global del tamaño de los mismos, asociado a la adquisición de alteraciones citogenéticas, de tal manera, que ya identificamos un perfile citogenético característico de LBMhi, sin que exista progresión a formas más avanzadas de la enfermedad. A pesar de que no exista progresión, los sujetos con LBMlo, especialmente las mujeres, tienen una supervivencia significativamente más corta que la de la población general de la misma edad, sexo y área geográfica de procedencia, debido a una mayor mortalidad por infecciones. Estos hallazgos sugieren que, ya en las etapas más tempranas de desarrollo de la LLC podría existir una alteración de la respuesta inmune, potencialmente relacionada con la expansión de los pequeños clones de linfocitos B tumorales. En este trabajo, se constata que existe una alteración importante de la distribución de las principales poblaciones de linfocitos B normales residuales de sangre periférica en pacientes con LBMhi y LLC, siendo dicha alteración debida fundamentalmente a una reducción significativa del número de linfocitos B inmaduros y naive, lo que generaría un repertorio B más restringido. Esta reducción en los linfocitos B también se asocia a una reducción significativa de las CPs IgM+ en la LBMlo, seguido de una disminución de CPs de todos los isotipos de Ig en la LBMhi, y de un déficit especifico de CPs y linfocitos B de memoria que expresan subclases de Ig codificadas en el tercer bloque de genes IGHC (IgG2, IgG4 e IgA2) entre pacientes con LLC. Como consecuencia de la drástica reducción en el repertorio de linfocitos B normales circulantes, las respuestas humorales se ven restringidas a patógenos comunes del medio. De acuerdo con ello, nuestros resultados muestran que los títulos específicos de anticuerpos frente a virus latentes (como CMV o VEB) se encuentran proporcionalmente más representados en la LBMhi y la LLC que en donantes sanos y/o la LBMlo, lo que podría reflejar un mayor grado de reactivación de la respuesta inmune frente a estos patógenos, a medida que avanza la enfermedad, asociado a una progresiva disminución de los títulos de IgG frente a pneumococo a medida que avanza la enfermedad, lo que explicaría la elevada frecuencia de infecciones respiratorias ocasionadas por este patógeno.

[ES]El cáncer colorrectal esporádico (sCRC) es la tercera causa de muerte por cáncer en el mundo occidental. El 25% de los pacientes diagnosticados de sCRC presentan metástasis en el momento del diagnóstico, siendo el hígado el órgano afectado con más frecuencia. Este grupo de pacientes se caracteriza por presentar un pronóstico adverso y requerir tratamientos habitualmente agresivos. Desde 1990, cuando Fearon y Vogelstein propusieron el modelo de carcinogénesis del sCRC, se han logrado importante avances en la identificación de las alteraciones genéticas implicadas en la génesis de la enfermedad. Sin embargo, no se conoce con exactitud las alteraciones genéticas involucradas en el proceso metastásico que confieren a las células tumorales la capacidad para colonizar tejidos con un microambiente muy diferente al del epitelio intestinal. De hecho, la mayoría de las investigaciones actuales están dirigidas a la identificación de las anomalías genómicas involucradas en la progresión de la enfermedad, analizando de forma pareada muestras de tumores primarios y sus correspondientes metástasis hepáticas del mismo paciente. Los resultados de estas investigaciones han permitido identificar alteraciones cromosómicas asociadas a fenotipos más agresivos de las células tumorales, presentes tanto en los tumores primarios como en las muestras metastásicas. Asimismo, se ha demostrado la coexistencia de varios clones de células tumorales, tanto en el tumor primario como en las metástasis, permitiendo establecer diferentes modelos evolución clonal a nivel intra-tumoral que demuestran que las lesiones metastásicas probablemente derivan de un clon de células tumorales presente ya en el tumor primario. A pesar de estos avances, aún no se ha podido definir con precisión las regiones cromosómicas y/o genes implicados en la progresión del sCRC. Dicha definición permitiría identificar en el momento del diagnóstico aquellos pacientes con tumores potencialmente metastásicos y discriminarlos de aquellos casos podrían estar curados con la cirugía. Dentro del grupo de pacientes con sCRC, los diagnosticados con adenocarcinomas de recto localmente avanzado reciben en la actualidad una atención clínica específica, caracterizada por la administración de radio-quimioterapia (RQT) pre-operatoria; consiguiendo una notable mejoría en la calidad de vida de los pacientes. No obstante, la respuesta a la RQT es muy variable, desconociéndose en la actualidad las alteraciones genéticas que pudieran estar implicadas en la resistencia al tratamiento administrado. La identificación de estas alteraciones, permitiría identificar de forma temprana pacientes sensibles o resistentes a la RQT preoperatoria, contribuyendo así a un abordaje terapéutico personalizado para cada caso concreto y al incremento de la probabilidad de identificar pacientes cuyos tumores presenten mayor capacidad invasiva con los protocolos terapéuticos actuales. En base a estos antecedentes, en el presente trabajo doctoral nos hemos planteado como objetivo general identificar los perfiles de alteraciones genómicas característicos del sCRC, haciendo especial énfasis en los tumores metastásicos, analizando además su posible valor predictivo en la respuesta al tratamiento preoperatorio en el adenocarcinoma rectal localmente avanzado. Para lograr este objetivo, analizamos 58 tumores primarios de pacientes sCRC, 27 de ellos con metástasis en el momento del diagnóstico (sincrónicas) y 31 sin metástasis con una mediana de seguimiento de 96 meses. Además, analizamos 76 muestras tumorales pertenecientes a 45 pacientes con cáncer de recto localmente avanzado correspondientes con 45 muestras de biopsia de tejido tumoral tomadas antes de la administración de cualquier tipo de terapia, y 31 muestras tumorales pareadas post-cirugía. Con el fin de identificar el perfil genético característico de los sCRC metastásico y establecer el posible impacto pronóstico de la enfermedad, así como las alteraciones cromosómicas más frecuentes y los perfiles de evolución clonal asociados a la respuesta a la RQT en el cáncer de recto localmente avanzado, se emplearon técnicas genéticas que permiten el análisis simultáneo de diferentes alteraciones cromosómicas a nivel de células individuales (iFISH), en combinación con técnicas moleculares de análisis global del genoma. Esta aproximación nos ha permitido profundizar en el conocimiento de la heterogeneidad genética y las vías de evolución clonal existentes, tanto a nivel intra-tumoral en cada paciente como a nivel inter-tumoral entre distintos pacientes con sCRC. Además, nuestros resultados nos permitieron identificar un perfil genético asociado al proceso metastásico del sCRC y a un peor pronóstico de la enfermedad, definido por presentar una supervivencia global significativamente más corta. Además, pudimos evidenciar una asociación significativa entre el perfil citogenético del clon ancestral de las células tumorales de pacientes con cáncer de recto localmente avanzado y la respuesta a la RQT administrada antes de la cirugía.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES]Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son el tipo de inmunodeficiencias primarias más común. Se caracterizan por presentar defectos en la producción de anticuerpos y un cuadro clínico muy heterogéneo, que incluye desde individuos asintomáticos hasta pacientes con infecciones recurrentes y otras complicaciones no infecciosas, como autoinmunidad y linfoproliferación, que pueden manifestarse a cualquier edad. La inmunodeficiencia variable común (IDVC) es la inmunodeficiencia predominantemente de anticuerpos más importante desde el punto de vista clínico, y los déficits de isotipos de inmunoglobulinas los más prevalentes. Ambos grupos de enfermedades se caracterizan, además de por su alta heterogeneidad clínica, por un origen genético desconocido en la gran mayoría de los casos, por lo que su diagnóstico debe realizarse basándose en una combinación de criterios clínicos y biológicos. Los niveles de anticuerpos séricos son el parámetro más utilizado tanto para su diagnóstico como para su subclasificación, aunque estos no reflejan de forma adecuada el estado de la respuesta B en un momento dado, ni permiten predecir el comportamiento clínico de estos pacientes a medio/largo plazo. Por ello, en los últimos años diferentes estudios han evaluado las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos B de sangre en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos, correlacionándolas además con sus manifestaciones clínicas. No obstante, estos trabajos solamente han evaluado un número limitado de poblaciones, no teniendo en cuenta las subpoblaciones definidas por los isotipos y subclases de inmunoglobulina expresada, ni utilizando valores de referencia por grupo de edad. Ante estos antecedentes, nos planteamos como objetivo principal del trabajo de tesis doctoral desarrollar una metodología que nos permitiera estudiar en profundidad las subpoblaciones de linfocitos B en sangre mediante citometría de flujo, incluyendo las definidas por el isotipo y subclase de inmunoglobulina, para establecer valores de referencia en donantes sanos por grupo de edad, y de este modo definir con mayor precisión las alteraciones observadas en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos. Para llevar a cabo este objetivo, en primer lugar evaluamos una serie de 28 clones de anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles y previamente validados para detectar anticuerpos séricos, dirigidos frente a las subclases de IgG e IgA. De estos, 17 fueron capaces de identificar las subclases de IgG e IgA en la superficie de los linfocitos B de memoria y células plasmáticas, de los cuales seleccionamos 6, uno frente a cada una de las subclases de IgG e IgA, de acuerdo a su intensidad de marcaje y su disponibilidad conjugados con fluorocromos compatibles. Posteriormente, estos clones fueron validados, demostrando ser capaces de identificar de forma sensible y específica su correspondiente subclase de inmunoglobulina en linfocitos B y células plasmáticas, tanto en sangre como en otros tejidos humanos, así como en la superficie y el citoplasma celular. Una vez que disponíamos de la metodología que nos permitía diseccionar las subpoblaciones de linfocitos B y células plasmáticas de acuerdo no solo a su estadio madurativo, sino también al isotipo y subclase de inmunoglobulina expresada, nuestro objetivo se centró en conocer en profundidad la distribución de estas poblaciones B a lo largo de la vida y compararla con los niveles solubles de anticuerpos en plasma. Para ello, analizamos un total de 19 muestras de sangre de cordón umbilical, y 215 muestras de sangre periférica de individuos de distintas edades, desde recién nacidos a mayores de 80 años. Nuestros resultados mostraron que las subpoblaciones de linfocitos B varían a lo largo de la vida, tanto las definidas por su estadio madurativo como por la expresión de inmunoglobulinas. Así, las células plasmáticas son el compartimento que alcanza sus niveles más altos a edades más tempranas, seguidas de los linfocitos B de memoria y los anticuerpos solubles de plasma. Además, aquellas subclases de inmunoglobulinas codificadas más distalmente en el gen IGHC alcanzan sus niveles más altos, tanto en los compartimentos celulares como solubles, a edades más avanzadas, probablemente reflejando la existencia de cambios de isotipo/subclase de inmunoglobulina consecutivos a lo largo de la vida. Tras la evaluación de las subpoblaciones de linfocitos B de acuerdo a la edad, nuestro siguiente objetivo fue la identificación precisa de las alteraciones de estas poblaciones en pacientes con IDVC y déficits de isotipos de inmunoglobulina, comparando los valores obtenidos con los de donantes sanos del mismo rango de edad. De este modo, pudimos identificar que todos los pacientes analizados presentan alteraciones en al menos una población de linfocitos B y células plasmáticas, observándose distintos patrones de alteración en función del diagnóstico del paciente. Los casos con déficit selectivo de IgA se caracterizan por presentar defectos en las poblaciones IgA, sin apenas alteraciones en las IgG. Además, identificamos dos grupos de pacientes con déficit selectivo de IgA en función del grado del defecto en los linfocitos B de memoria IgA, los cuáles presentan distinto comportamiento clínico. Así mismo, los pacientes con IDVC, se caracterizan todos ellos por presentar alteraciones en las células plasmáticas, y un deterioro progresivo en la capacidad de cambio secuencial de isotipo/subclase de inmunoglobulina en los linfocitos B de memoria, afectando primeramente a aquellos isotipos y subclases localizadas más distalmente en el gen IGHC. De este modo, según el patrón de alteración observado en los linfocitos B de memoria podemos identificar hasta 6 subgrupos de pacientes con IDVC, que a su vez presentan diferentes características clínicas. En definitiva, el análisis detallado del compartimento de células B, de acuerdo al isotipo y subclase de inmunoglobulina, y a la expresión de otros marcadores funcionales, como CD21 y CD27, constituye una herramienta valiosa y complementaria a los anticuerpos séricos para el diagnóstico, la clasificación y la monitorización de los pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos.

[ES] La LLC es una enfermedad clínicamente muy heterogénea en la que, mientras algunos pacientes presentan un curso agresivo que requiere tratamiento, en otros la enfermedad tiene un comportamiento indolente y estable durante décadas. Esta heterogeneidad clínica de la LLC se ve reflejada también en una elevada diversidad genética y molecular, sin que se haya podido identificar hasta la fecha una alteración común capaz de explicar la transformación neoplásica y/o el comportamiento maligno de la enfermedad. Aun así, en la actualidad disponemos de un amplio abanico de marcadores clínicos y biológicos útiles a la hora de realizar una estratificación pronóstica de los pacientes ya desde el momento del diagnóstico, contribuyendo a definir en cada caso la estrategia terapéutica más adecuada. Dentro de los factores biológicos, merecen especial atención los marcadores genéticos, principalmente los derivados de la evaluación del estado mutacional de los genes IGHV y de las alteraciones citogenéticas - sobre todo aquellas que afectan a los cromosomas 13 [como la del(13q) con o sin deleción del gen RB1], 11 [del(11q), gen ATM], 17 [del(17p), gen TP53] y 12 (trisomía) -, además de las mutaciones descritas más recientemente, en especial las mutaciones del gen NOTCH1. En cierta medida, los avances recientes en el conocimiento de la célula tumoral de la LLC a nivel molecular son reflejo del desarrollo de las técnicas de secuenciación genómica masiva y de microarrays de expresión, cuya aplicación en el estudio de la LLC ha permitido una caracterización extensa y pormenorizada, especialmente a nivel génico, de las células B tumorales; con ello, se han logrado avances en el diagnóstico, la estratificación pronóstica y el seguimiento de los pacientes con LLC. En paralelo, en la LLC se han identificado también algunos factores fenotípicos de pronóstico adverso, como la expresión de las proteínas CD49d, ZAP70 y CD38. Estos últimos hallazgos, junto con los estudios inmunofenotípicos requeridos para el correcto diagnóstico de la enfermedad, suponen un punto de partida para la incorporación del análisis de proteínas concretas en la estratificación pronóstica de la LLC. Sin embargo, en el momento de iniciar este trabajo doctoral no existían estudios pormenorizados que abordasen la caracterización masiva y simultánea del conjunto de todas las proteínas – proteoma - expresadas en las células tumorales de la LLC. Tratándose la LLC de una enfermedad heterogénea tanto a nivel clínico como molecular, la valoración global (y conjunta) de los múltiples componentes moleculares que integran la célula tumoral adquiere especial relevancia. Esto es debido, en parte, a que es raro que una única proteína (al igual que una única mutación) pueda ser considerada como la causante única y directa de la enfermedad, y a que habitualmente se requiere de la alteración de un (extenso) entramado de conexiones moleculares intra- y extra-celulares para el desarrollo de un proceso neoplásico. Asimismo, a pesar del poder predictivo que presentan los marcadores génicos, los efectores finales responsables de las funciones celulares alteradas/patogénicas son las proteínas, lo que les convierte en elementos imprescindibles para conocer con precisión el papel que realmente juegan las alteraciones genéticas. En este sentido, es importante conocer no sólo qué proteínas se expresan en una célula y su cantidad, sino también su estado (p.ej. fosforilado/desfosforilado, u otras PTMs) que puede modificar e influir de forma decisiva en su comportamiento y/o localización, al desencadenar la activación o inhibición de la activación de vías de señalización concretas que determinan la actividad final de la célula. El conocimiento proteómico de la célula tumoral de la LLC no solamente permite avanzar en el conocimiento de su patogenia (incluyendo el conocimiento también del microambiente tumoral), sino que además puede abrir nuevas perspectivas terapéuticas al proporcionar una visión más amplia del proteoma celular de la LLC, que puede facilitar el diseño y desarrollo de tratamientos de acción múltiple dirigidos a proteínas/vías de señalización alteradas. En la actualidad, el origen celular de la LLC sigue siendo, en gran medida, desconocido, así como los cambios que se suceden a lo largo de la ontogenia de la célula B normal que llevan a su transformación maligna. Si bien se han planteado varios modelos teóricos, hasta la fecha ninguno de ellos ha sido capaz de esclarecer por completo el origen de la enfermedad y su elevada heterogeneidad. En este campo, el estudio proteómico detallado de la célula tumoral podría proporcionar también información útil a la hora de determinar con mayor precisión las etapas claves en los procesos de transformación neoplásica y progresión maligna de la LLC. Por todo lo anteriormente expuesto, entendemos que la metodología proteómica actual podría complementar la caracterización genética/genómica de la LLC, pudiendo la integración de la información derivada de ambos tipos de estudios ofrecer una visión más fidedigna de la enfermedad que pudiera traducirse en un abordaje más adecuado del diagnóstico, estratificación pronóstica, tratamiento y monitorización de la LLC. Así, en este trabajo doctoral nos planteamos como objetivo central la caracterización del proteoma de la célula tumoral de la LLC frente al de las célula B normales, integrando además esa información proteómica con información derivada de los estudios transcriptómicos. Los hallazgos derivados de esta tesis doctoral demuestran la posibilidad que existe hoy día de analizar de forma exhaustiva y global el proteoma de la célula B patológica y compararlo al de su contrapartida normal. No obstante, ello requiere no sólo de una caracterización cualitativa del proteoma, sino también cuantitativa, incluyendo además el análisis del fosfoproteoma como información clave a la hora de definir con más precisión las vías de señalización celular alteradas, con las potenciales implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas que tal conocimiento puede aportar. Además, el abordaje de la secuenciación peptídica del BCR de los linfocitos de la LLC ha supuesto un paso clave para impulsar futuros estudios en los que se caracterice a nivel proteómico el repertorio de receptores de célula B tumorales, lo que facilitaría la identificación de las regiones peptídicas específicas de unión a epítopos antigénicos determinados. Todo ello, asociado a la integración de la información proteómica generada con los resultados de análisis genómicos/transcriptómicos, permitirá sin duda en el futuro alcanzar una visión más amplia de las características e interacciones moleculares que definen a las células B patológicas y las diferencian de su contrapartida normal y de sus respectivos estados funcionales.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] La hematopoyesis tiene como finalidad la producción a lo largo de la vida del individuo, de un número relativamente estable de elementos celulares maduros y funcionales de cada una de las distintas líneas de células mieloides y infoides, a partir de un número relativamente reducido de células stem hematopoyéticas. La célula stem hematopoyética se caracteriza por ser una célula indiferenciada capaz de multiplicarse y diferenciarse mediante mecanismos de división asimétrica. Estos mecanismos aseguran por un lado, mantener un nivel constante de células stem, y por otra parte, producir un número adecuado de precursores y de células maduras de las diferentes líneas hematopoyéticas mieloides y linfoides. En este proceso intervienen múltiples vías de señalización celular, habitualmente moduladas por interacciones entre la célula stem hematopoyética y la matriz extracelular, los elementos celulares del microambiente medular y sus productos. En la clasificación actual de la OMS de las neoplasias hematológicas se definen siete grandes grupos de hemopatías mieloides entre las que se incluyen las leucemias mieloides agudas, los síndromes mielodisplásicos, las neoplasias mieloproliferativas, los SMD/NMP y las mastocitosis. En común, en estas neoplasias se observa afectación en grado variable de la célula stem hematopoyética, requiriéndose habitualmente para su desarrollo de la coexistencia de dos o más alteraciones genéticas y/o moleculares. En este sentido, las características biológicas y el comportamiento clínico de las hemopatías malignas mieloides dependería en gran medida de las alteraciones genéticas subyacentes presentes en la célula stem hematopoyética de cada paciente. Ante esta hipótesis, cabe sospechar que, aunque la mayoría de las LMA surgen aparentemente “de novo”, en realidad podrían originarse sobre una hematopoyesis ya alterada (p.ej. genéticamente); dicha alteración puede haberse manifestado como un déficit o un exceso en la producción de uno o más tipos de células hematopoyéticas, lo cual conllevaría a un comportamiento clínico característico de por ejemplo, un SMD o una NMP, respectivamente. Si, por el contrario, dicha alteración no se ve reflejada en una alteración del número de células hematopoyéticas maduras y/o en cambios morfológicos importantes, podría abocar a una hematopoyesis clonal de pronóstico indeterminado (CHIP), objetivable únicamente a nivel genético, en ausencia de consecuencias clínicas y biológicas inmediatas. En cualquier caso, la progresión desde la primera alteración genética, a una hemopatía clonal –ya sea un SMD, una NMP y/o una LMA– iría asociado a un acúmulo progresivo de alteraciones genéticas y moleculares asociado a la aparición de distintos patrones de evolución clonal en las células stem afectadas y su progenie. Por otro lado, dichas alteraciones se traducirían además en cambios fenotípicos asociados a una tasa de proliferación y/o supervivencia celular alterada, junto a cambios madurativos que terminan por afectar la producción normal de las diferentes líneas hematopoyéticas con las correspondientes citopenias (o expansiones) periféricas de una o más líneas celulares, y las manifestaciones clínicas asociadas a las mismas (p. ej. anemia, alteraciones hemorrágicas y/o infecciones). En este sentido, en la actualidad seguimos sin conocer si la transformación neoplásica de una célula stem hematopoyética normal y su evolución a LMA sigue un proceso de evolución (clonal) lineal o si por el contrario, existen múltiples vías de evolución clonal que terminan originando diferentes enfermedades, parcialmente solapadas entre sí. En este contexto, la mastocitosis sistémica (MS) constituye un modelo idóneo para el estudio de la progresión neoplásica y la transformación maligna de las hemopatías mieloides clonales. Por un lado, se trata de una enfermedad con una alteración molecular adquirida (somática) y universal: la mutación de KIT y en especial la mutación de D816V de KIT. Por otra parte, el diagnóstico de la enfermedad, con frecuencia se lleva a cabo en una etapa relativamente temprana de la misma (p.ej. inmediatamente tras el nacimiento), aunque clínicamente los pacientes terminan por mostrar un comportamiento heterogéneo que incluye desde formas indolentes (las más habituales, como la MSI) asociadas o no a la presencia de lesiones cutáneas, a formas agresivas que en un porcentaje significativo (5–10%) de los casos están asociadas a transformación (a medio y largo plazo) a SMD, SMD/NMP o LMA. Ante estos antecedentes, en este trabajo doctoral nos planteamos como objetivo general profundizar en el conocimiento de los mecanismos y vías que intervienen en el desarrollo y progresión de las hemopatías malignas mieloides, a través del estudio de los patrones de evolución clonal subyacentes, y las alteraciones proliferativas y madurativas asociadas a los mismos. Para ello, definimos cuatro objetivos específicos: - Analizar la tasa proliferativa de distintos compartimientos celulares de MO normal y de MO reactiva de pacientes con citopenias no clonales, con el fin de establecer un marco de referencia del índice proliferativo normal de los precursores CD34+ mieloides y de los distintos compartimientos madurativos de MO de las líneas celulares de granulocito neutrófilo, monocito y eritroide. - Definir las posibles alteraciones existentes en la tasa proliferativa de diferentes compartimientos celulares de MO de pacientes con LMA y SMD en distintos estadios de la enfermedad,respecto a su contrapartida normal, con el fin de identificar posibles asociaciones entre el patrón de alteración encontrado, y el comportamiento clínico y biológico de la enfermedad. - Identificar patrones de evolución clonal presentes en distintos compartimientos celulares de MO de pacientes con LMA y determinar su posible relación con la existencia de una hematopoyesis clonal residual y de alteraciones fenotípicas que pudieran contribuir al diagnóstico temprano de la enfermedad, incluso de forma previa a su transformación maligna; y, - Analizar los patrones de alteraciones genéticas y moleculares acumuladas en los distintos compartimientos de células hematopoyéticas de MO afectados, de pacientes con mastocitosis sistémica asociada a otras hemopatías mieloides y/o linfoides, con el fin de identificar distintas vías de evolución clonal que pudieran contribuir a explicar el comportamiento clínico y biológico heterogéneo de este subtipo de mastocitosis.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] Hoy en día el diágnostico y clasificación de las hemopatías malignas se asienta sobre las características citomorfológicas e histopatológicas del tumor, el inmunofenotipo de las células tumorales y sus características genéticas y moleculares, consideradas en el contexto del comportamiento clínico de la enfermedad.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES]La MS es el subtipo más frecuente de mastocitosis del adulto presentando un elevado grado de heterogeneidad en cuanto a su comportamiento y evolución clínica. En la actualidad son muchos los estudios en los que se describe que la mayoría de los pacientes con MS presentan la mutación D816V, e incluso que demuestran la presencia de esta mutación en otras células hematopoyéticas distintas del mastocito, por lo que implícitamente se considera que la mutación D816V de KIT podría ser un requisito indispensable para la manifestación o persistencia de la mastocitosis en la edad adulta. Sin embargo, en el momento de iniciar este trabajo existían también estudios que contradecían esta hipótesis, ya que describían la presencia de la mutación D816V en pequeños porcentajes de pacientes y, nunca identificaban esta mutación en otras líneas hematopoyéticas. Estas discrepancias pueden deberse tanto al tipo de pacientes seleccionados e incluidos en las diferentes series en función de su subtipo diagnóstico, como a diferentes niveles de sensibilidad de los métodos empleados para el análisis de la mutación. Por lo tanto, para esclarecer los mecanismos de la enfermedad sería clave establecer cuál es el porcentaje real de pacientes con MS que presentan esta mutación, determinar en qué momento de la ontogenia ocurre la mutación, si existen otras líneas hematopoyéticas que puedan estar afectadas por ella y con qué frecuencia aparecen, determinando además si la existencia de un patrón diferente de afectación de la hematopoyesis por la mutación de KIT se traduce en un comportamiento clínico distinto de la enfermedad. Este conocimiento permitiría sin duda, comprender mejor la heterogeneidad de la MS desde un punto de vista clínico‐biológico, a la vez que proporcionaría información clave para la estratificación pronóstica de la enfermedad y para un mejor seguimiento, tratamiento y control de la misma.Ante estos antecedentes, en el presente trabajo doctoral hemos planteado como objetivo general determinar con precisión la frecuencia con la que los pacientes con mastocitosis presentan mutación de KIT, el grado de afectación de la hematopoyesis y de las células de la MO por la mutación y su posible correlación con la presencia de la mutación en SP y la evolución clínica de la enfermedad. Para ello, nos hemos propuesto tres objetivos concretos: ‐ Determinar la frecuencia real de las mutaciones de KIT y en especial de la mutación D816V de KIT, en los mastocitos patológicos de pacientes con MS, y conocer el grado de afectación del resto de líneas celulares hematopoyéticas de la MO. ‐ Establecer la frecuencia con la que se detecta la presencia de la mutación D816V de KIT en SP de pacientes con MS y correlacionar el grado de afectación por dicha mutación en SP, con el grado de afectación de la hematopoyesis medular. ‐ Investigar la posibilidad de que la mutación D816V de KIT esté presente en células MSC de MO y determinar el impacto que éste hallazgo pudiera tener en la evolución a medio y largo plazo de la enfermedad.

[ES]En la actualidad se conoce que el adenocarcinoma ductal de páncreas (ADCP) es una neoplasia histológica y genéticamente heterogénea. No obstante, la información disponible acerca de los patrones genéticos de evolución clonal y de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad (ya sea en su desarrollo y progresión biológica o en su transformación maligna) y su comportamiento clínico, sigue siendo limitado, especialmente en lo que se refiere a la identificación de biomarcadores con utilidad diagnóstica y de posibles dianas terapéuticas. Un número creciente de estudios indica que el comportamiento clínico y biológico de una neoplasia depende en gran medida de las alteraciones genéticas subyacentes y de las interacciones entre las células tumorales y el micromedioambiente que las rodea, traducidas a su vez en distintos perfiles de alteración genética y de expresión génica, que para el ADCP, siguen sin conocerse en profundidad, especialmente en lo que se refiere a las distintas vías de evolución clonal existentes a nivel intratumoral. En el presente trabajo doctoral nos hemos planteado como objetivo general profundizar en el conocimiento de las alteraciones genéticas y genómicas del ADCP, con especial énfasis en las vías de evolución clonal presentes a nivel intratumoral, y su impacto en el comportamiento clínico y biológico de la enfermedad. Para esto hemos analizado tumores de 55 pacientes con ADCP mediante técnicas que permiten el análisis de las alteraciones cromosómicas a nivel de células individuales (iFISH), en combinación con técnicas moleculares de análisis global del genoma y su perfil de expresión. Esta aproximación nos ha permitido profundizar en el conocimiento de la heterogeneidad genética y de las vías de evolución clonal existentes, tanto a nivel intratumoral en cada paciente, como a nivel intertumoral entre distintos pacientes con ADCP. Nuestros resultados nos indican que el ADCP presenta perfiles de aberración citogenética y de expresión génica altamente complejos, asociados a la alteración de múltiples genes. A través de estas características, definimos subgrupos genéticos de tumores asociados a características clínicas e histopatológicas de la enfermedad, como el estadio y el grado histológico de los tumores, así como la supervivencia de los pacientes. En base a estos hallazgos construimos un sistema de estratificación de los pacientes con ADCP que los clasifica en categorías con distinto pronóstico, cuya aplicación en la clínica podría ayudar a definir estrategias para el seguimiento y el tratamiento de los pacientes con esta enfermedad.

[ES] Antecedentes Hasta ahora los estudios genómicos de alto rendimiento (aCGH) no se han correlacionado con las características clínico-patológicas en series amplias de cáncer gástrico ni se ha estudiado adecuadamente la heterogeneidad intratumoral. Los objetivos fueron: 1) determinar la incidencia de alteraciones cromosómicas mediante aCGH 2) correlacionarlas con el comportamiento clínico-patológico y evolución 3) determinar las vías de evolución clonal intratumorales. Material y métodos Se incluyeron 138 muestras del Hospital Universitario de Salamanca mediante aCGH de 1Mb de resolución. En 87 pacientes se analizó la heterogeneidad intratumoral mediante FISH. Resultados Las alteraciones más frecuentes fueron pérdidas en 17p (94%), 16q (87%), 12q (73%), 22q (56%), 7q (49%), 15q (29%) y ganancias en 13q (63%), 20p (47%), 10q (44%), 20q (32%), 1q (20%). Los pacientes con pérdidas en 4p, 12q, 15q y/o ganancias en 6p, 7p, 13q y 20p se asocio con estadios avanzados, además ganancias en 20p y 10q presentaron una alta incidencia en metástasis a distancia y tipo histológico intestinal. Una vez determinados los factores pronósticos independientes intentamos establecer un sistema de estratificación pronóstica en tres grupos de riesgo tanto para supervivencia global como libre de recidiva. El tipo histológico de Lauren, las anomalías en 6p y pT, son la mejor combinación pronóstica de supervivencia global, mientras que pN y las anomalías en 7p y 15q lo son para la supervivencia libre de recidiva. Los estudios de FISH mostraron que el 24% de los casos analizados presentaban un único clon tumoral, identificándose en los casos restantes (76%) dos ó más clones tumorales. En el 57% de los casos analizados, la célula ancestral tumoral mostró ganancias o amplificación de uno o más cromosomas, siendo frecuente la ganancia de 20q13 (31%) en combinación con las ganancias encontradas en 13q14 y amplificación de HER2 (17%) Conclusión Nuestros resultados muestran que los ADC gástricos son tumores genéticamente heterogéneos que presentan diferentes patrones de alteraciones cromosómicas, coexistiendo dos o más clones tumorales. Además, podemos identificar en el momento del diagnóstico distintos grupos de pacientes con ADC gástrico con diferente riesgo de recidiva y supervivencia., [EN] Background Until now genomic high-throughput studies ( aCGH ) have not been correlated with clinicopathologic features in a large series of gastric cancer is not well studied the intratumoral heterogeneity. The objectives were to : 1 ) determine the incidence of chromosomal abnormalities by aCGH 2) you correlate with clinical - pathological behavior and evolution 3) identify ways of intratumoral clonal evolution. Methods 138 samples Salamanca University Hospital were included by aCGH 1Mb resolution . In 87 patients, the intratumoral heterogeneity was analyzed by FISH . Results The most frequent alterations were losses in 17p ( 94%), 16q ( 87%), 12q ( 73%), 22q ( 56%), 7q ( 49%), 15q (29 % ) and gains on 13q (63% ) , 20p ( 47% ) , 10q ( 44 % ) , 20q ( 32 % ) , 1q ( 20 % ) . Patients with losses on 4p , 12q , 15q and / or gains in 6p , 7p , 13q and 20p was associated with advanced stages , further gains in 20p and 10q showed a high incidence of distant metastasis and intestinal histologic type. Having determined the independent prognostic factors try to establish a system of prognostic stratification in three risk groups for both overall survival and recurrence-free.

[ES]El Sarcoma de Ewing (SE) es un tumor maligno que afecta mayoritariamente a niños o adultos jóvenes. Dentro del grupo de sarcomas, después del osteosarcoma, es el que tiene peor pronóstico con una media de supervivencia del 30% en los casos metastásicos. A nivel molecular el SE se caracteriza por la presencia de una fusión génica entre el gen EWS y genes de la familia ETS principalmente FLI 1 (>90% casos) y ERG (5-10% casos . El producto de esta fusión es una proteína quimérica que actúa como factor de transcripción aberrante, desregulando ciertos genes tales como CD99 y genes relacionados con la ruta de IGF1R, entre otros genes. A nivel morfológico, las células de SE se caracterizan por la presencia de una elevada expresión del receptor de superficie CD99 en el 99% de las células. El tratamiento de primera línea se basa por regímenes multi-terapéuticos incluyendo quimioterapia con combinaciones de doxorubicina, vincristina, ifosfamida y etopósido, combinada con radioterapia y/o cirugía. Además en pacientes con tumores de mal pronóstico se han realizado varios ensayos clínicos con inhibidores de PARP, inhibidores de IGF1R y trasplante autólogo de células stem combinado con radioterapia, entre otros tratamientos. Todos estos estudios reflejan que la mejor estrategia terapéutica es el uso de de multi-tratamientos. En este sentido, estudios preclínicos, in vitro e in vivo han mostrado varias estrategias terapéuticas que podrían ser eficaces en el tratamiento de pacientes con SE de entre los cuales hay que destacar el bloqueo de las dianas clave en SE: la fusión génica, el eje IGF1-IGF1R y en segundo plano la sobre expresión de CD99., Este proyecto de tesis ha sido financiado por:- La Fundação para a Ciência e Tecnologia, Governo de Portugal, con el Proyecto: “The pathogenesis of Ewing Sarcoma: implications for novel treatment strategies” (SFRH/BD/69318/2010).- La Red de Excelencia de la Comunidad Europea EUROBONET, con el Proyecto Europeo “Molecular Pathology of Bone Tumors” (FP6-2004-Lifescihealth-5, 018814).- European Clinical trials in Rare Sarcomas within an integrated translational trial network (EUROSARC) FP7-HEALTH-2011-two-stage (Project ID 278742 Comisión Europea)- El Ministerio de Ciencia e Innovación, a través del Instituto de Salud Carlos III(RD12/0036/0017, RD06/0020/0059, PI1203102, PI1100018, PI081828, PI052524)-La Fundación Asociación Española Contra el Cáncer (AECC), con el proyecto “Búsqueda, validación y traslación clínica de nuevas dianas terapéuticas a partir de estudios de genómica y epigenómica integrativa en sarcoma de Ewing”. (GCB13131578DE Á)

[ES] La linfocitosis monoclonal de células B (LMB) es una entidad recientemente descrita que indica la presencia de, [EN] The monoclonal B cell lymphocytosis (LMB) is a recently described entity which indicates the presence of

[EN] This dissertation has proposed the following objectives: To evaluate the usefulness of flow cytometry in samples obtained by FNA cytology versus conventional (associated or not with histological / immunohistochemical) in the initial diagnosis and classification of SLPC. To investigate the utility of immunophenotyping for the expression of proteins of the tetraspanin family in the diagnosis and classification of SLPC-B, with reference to the pattern of expression of these proteins in normal B cells. Designing a new strategy that allows an objective assessment of the efficiency of a panel of antibody combinations used in the routine for the classification of the most common subtypes of SLPC-B, while providing information on the most useful markers and their contribution on this diagnostic classification., [ES] En el presente trabajo doctoral se ha propuesto los siguientes objetivos: Evaluar la utilidad de la citometría de flujo en muestras obtenidas por PAAF frente a la citología convencional (asociada o no al análisis histológico/inmunohistoquímico), en el diagnóstico inicial y la clasificación de los SLPC. Investigar la utilidad del análisis inmunofenotípico de la expresión de proteínas de la familia de las tetraspaninas en el diagnóstico y clasificación de los SLPC-B, tomando como referencia el patrón de expresión de estas proteínas en células B normales. Diseñar una nueva estrategia metodológica que permita evaluar de forma objetiva la eficiencia de un panel de combinaciones de anticuerpos empleado en la rutina para la clasificación de los subtipos más frecuentes de SLPC-B, proporcionando a la vez información sobre los marcadores más útiles y su contribución relativa a dicha clasificación diagnóstica.

[ES]Las células dendríticas constituyen una población heterogénea de leucocitos que desempeña un papel central en el control de la respuesta inmunitaria, ya que son las células más potentes en la estimulación de linfocitos T vírgenes. Debido precisamente a la importancia de las células dendríticas en la regulación de la inmunidad celular, en los últimos años ha cobrado gran interés el estudio del papel que desempeñan estas células en la patogenia de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), habiéndose descrito alteraciones significativas en su distribución numérica, fenotipo y función. A pesar de ello, en la actualidad sigue sin estar claro el efecto que provoca la infección por el VIH-1 sobre las células dendríticas de sangre periférica (SP), existiendo numerosas discrepancias en los resultados obtenidos en los últimos años en este campo, requiriéndose de estudios adicionales que ayuden a comprender mejor el efecto del virus sobre estas células, y su implicación en la patogenia de la infección por el VIH-1.En el presente trabajo de tesis doctoral nos hemos propuesto como objetivo general, profundizar en el conocimiento del papel que desempeñan diferentes poblaciones celulares del sistema inmunitario en la patogenia de la infección por el VIH-1, a través del análisis ex vivo y detallado de la distribución numérica y las características fenotípicas y funcionales de diferentes subpoblaciones de células linfoides y de células presentadoras de antígeno (CPA) de pacientes infectados por el VIH-1, así como el efecto que el tratamiento antirretroviral (TAR) induce sobre dichos parámetros, tanto a corto como a largo plazo.Las conclusiones obtenidas a partir del presente trabajo de tesis doctoral se detallan a continuación:1.Las células dendríticas mieloides y plasmocitoides de pacientes VIH-1+ progresores (VIH-1+P) muestran alteraciones significativas, tanto en su distribución en SP, como en la expresión de los correceptores del virus CXCR4 y CCR5, produciendo espontáneamente, junto a los monocitos, citocinas inflamatorias, lo que apoya la existencia de una activación del sistema inmune in vivo en estos pacientes. 2.El patrón de alteraciones numéricas, fenotípicas y funcionales detectadas en las células dendríticas y monocitos de SP de pacientes VIH-1+P es diferente a lo observado en individuos VIH-1+ que no progresan a largo plazo (VIH-1+NPLP) y VHC+/VIH-1-, lo que sugiere la importancia de estas subpoblaciones celulares en la patogenia de la infección por el VIH-1.3.La administración del TAR tiene importantes efectos beneficiosos sobre el sistema inmune de los pacientes VIH-1+. No obstante, las alteraciones numéricas observadas en los compartimientos de linfocitos T, células dendríticas y monocitos de SP de sujetos VIH-1+ persisten incluso después de un año de iniciado el TAR, asociándose a anomalías fenotípicas y funcionales de diferentes subpoblaciones de CPA, especialmente en aquellos pacientes que se encuentran en fases más avanzadas de la infección.4.Previamente a la administración del TAR, la capacidad de producción de citocinas inflamatorias en respuesta a un estímulo exógeno por parte de los monocitos y las células dendríticas de origen mieloide de SP de individuos infectados por el VIH-1 se encuentra significativamente alterada, dependiendo las anomalías detectadas de las subpoblaciones celulares en cuestión.5.Tras la administración del TAR, la recuperación parcial de la capacidad funcional de las células inflamatorias circulantes, se asocia con el grado de reconstitución de los niveles de linfocitos T CD4+ de SP en los pacientes más inmunodeprimidos, y con la presencia de co-infección por el VHC, en el caso de los individuos menos inmunodeprimidos.6.La evaluación cuantitativa de la expresión del antígeno CD38 en los linfocitos T y los monocitos de SP de pacientes VIH-1+ constituye un indicador precoz de la respuesta al TAR, asociándose el incremento en la expresión de este marcador a las pocas semanas de iniciarse el tratamiento, con un aclaramiento más rápido de la carga viral en plasma., Dendritic cells (DC) are specialized antigen-presenting cells (APC) that play a crucial role in linking innate and adaptive immunity and possess a unique ability to stimulate naive T-cells. Increasing evidence supports the notion that DC could be involved in HIV-1 pathogenesis, since different studies have shown the existence of significant abnormalities in their numerical distribution, phenotype and function. However, the effect of HIV-1 infection on DC remains controversial and requires further investigation, in order to improve the knowledge of the effect of the virus on these cells and the contribution of DC to HIV-1 pathogenesis.The general aim of the present Doctoral Thesis was to improve the knowledge of the role of different cellular subsets of the immune system in HIV-1 pathogenesis, through the ex vivo analysis of the numerical distribution, and phenotypic and functional characteristics of different subsets of peripheral blood (PB) lymphocytes and APC from HIV-1+ infected patients, as well as the analysis of the effect of antirretroviral therapy (ART) on these parameters, in both the short and long term.The main conclusions obtained are the flowing:1.Myeloid and plasmacytoid DC from HIV-1+ progresors (HIV-1+P) show distinct numerical and phenotypic abnormalities, consisting of a reduced number in PB and an altered expression of CXCR4 and CCR5 HIV-1 co-receptors. Moreover, PB DC and monocytes from these patients produce inflammatory cytokines in the absence of exogenous stimulation, supporting the existence of an in vivo activation of the immune system in HIV-1+P patients.2.The overall pattern of numerical, phenotypic and functional abnormalities detected in PB DC and monocytes from HIV-1+P patients is different from that observed in HIV-1+ long-term non-progressor patients (HIV-1+ LTNP) and hepatitis C virus positive (HCV+)/HIV-1- patients, suggesting the importance of these cell subsets in the pathogenesis of VIH-1 infection.3.Administration of ART has important beneficial effects on the immune system of HIV-1+ patients. However, numerical, phenotypic and functional abnormalities persist even after one year of ART, being specially pronounced in HIV-1+ individuals at advanced stages of the disease, which could be probably related to the persistence of undetected viral replication and a sustained activation of the immune system.4.Prior to ART, the ability of PB monocytes and DC from HIV-1+ patients to produce inflammatory cytokines after in vitro stimulation is severely altered, these abnormalities depending on the type of cell subset analyzed. 5.After administration of ART, the functional reconstitution observed in circulating inflammatory cells is associated with the degree of recovery of PB CD4+ T-cell counts in more immunocompromised patients and HCV co-infection in more immunocompetent HIV-1+ individuals.6.Quantitative evaluation of CD38 expression on PB T-cells and monocytes constitute an early indicator of response to ART, since the overall pattern of changes observed on the expression of this activation marker, early after starting ART, predicts for the kinetics of clearance of plasma viral load.

A pesar de que los meningiomas son tumores benignos del sistema nervioso central, se observan recidivas hasta en el 25% de los pacientes. Nuestros resultados sugieren que en los meningiomas, la recidiva que sigue a una resección quirúrgica completa, podría deberse al recrecimiento del tumor primario, y raramente al desarrollo de un nuevo tumor independiente del meningioma inicial, al estar relacionados desde el punto de vista citogenético, los clones de células neoplásicas detectados en el tumor primario y la recidiva. Por otra parte, los pacientes con meningiomas histológicamente benignos de tamaño > 5cm y que presentan coexistencia de monosomía 14 y del(1p36) en el clon tumoral ancestral, tienen una mayor probabilidad de sufrir una recidiva precoz, incluso después de habérseles realizado una exéresis completa del tumor, con lo que se debería realizar un seguimiento más cercano de este subgrupo de pacientes con meningioma.Además los pacientes varones respecto a las mujeres presentan diferentes patrones de alteraciones cromosómicas y perfiles de expresión génica, que podrían contribuir a explicar el comportamiento clínico ligeramente diferente de este tipo de tumores en ambos sexos.En cuanto a las alteraciones del cromosoma 14, nuestros resultados indican que la mayoría de las anomalías genéticas que se detectan en el cromosoma 14 de las células tumorales de pacientes con meningioma, son de tipo numérico, constituyendo las deleciones intersticiales a nivel de 14q31-q32 un hallazgo poco frecuente, tal y como lo demuestran los análisis de iFISH y de CGH arrays. De todas las alteraciones detectadas en el cromosoma 14, sólo la pérdida total o monosomía 14 mostró un impacto significativo sobre la supervivencia libre de recidiva, asociándose con un pronóstico adverso., Meningiomas are benign neoplasm of the central nervous systems, but recurrence is observed in the 25% of the patients. Our results indicate that the development of recurrent meningiomas after complete tumor resection is usually due to regrowth of the primary tumor and rarely to the emergence of an unrelated meningioma, because tumor cell clones detected are the same in the samples at diagnosis and recurrence. On the other hand, patients with large histologically benign/grade I meningioma carrying monosomy 14 and del(1p36) in the ancestral tumor cell clone have a high probability of relapsing early after diagnostic surgery. These findings suggest the need for a closer follow-up in this subgroup of patients.We show the existence of different patterns of chromosome abnormalities and gene expression profiles associated with patient gender, which could help to explain the slightly different clinical behaviour of these two patients group.As regards chromosome 14 abnormalities, most meningiomas with chromosome 14 alterations have numeric changes, with interstitial deletions of 14q31-q32 present in few cases, as demonstrated by iFISH and CGH arrays. Of the abnormalities detected, only monosomy 14 showed an adverse prognostic impact.

Tesis Univ. Granada. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e Inmunología. Leída el 4 de junio de 2007