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Orientadora: Prof(a). Dr(a). Vânia Aparecida Vicente Coorientadora: Prof(a). Dr(a). Renata Rodrigues Gomes Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 23/10/2018 Inclui referências: p. 51-61 Resumo: Leveduras negras pertencentes à ordem Chaetothyriales, família Herpotrichiellaceae, abrangem diversas espécies associadas a colonização de hospedeiros humanos e animais, tal como relatado nos gêneros Exophiala, Cladophialophora, Capronia, Fonsecaea, Phialophora, Rhinocladiella, Veronea e Cyphellophora, sendo que entre as principais micoses causadas por este grupo destacam-se a cromoblastomicose e a feoifomicose. Nesta família existem espécies proximamente relacionadas com características morfológicas muito semelhantes, assumidas como espécies crípticas com ecologia diferente, reunindo desde sapróbias a patógenas. Diante disto, o presente trabalho objetivou desenvolver novos métodos moleculares capazes de identificar ferramentas para diferenciação e detecção de espécies crípticas, agentes causais de cromoblastomicose, uma micose de implantação, com forte ligação ambiental, causada por várias espécies de leveduras negras. Logo, a utilização de técnicas moleculares com maior sensibilidade, especificidade e eficácia, como o uso de sondas cadeado aliado à técnica de amplificação em círculo rolante (RCA), pode influenciar intrinsicamente no diagnóstico, em estudos de virulência e epidemiologia molecular, assim como no entendimento de vias de infecção, levando a identificação da espécie mesmo sem estudos de sequenciamento genômico. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo desenhar oligonucleotídeos espécie específicos para as espécies de Fonsecaea patogênicas como F. monophora, F. nubica, F. pedrosoi e F. pugnacius e a sonda cadeado baseada na amplificação de circulo rolante (RCA), para a espécie F. pugnacius. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para as espécies F. pedrosoi (FOPE), F. monophora (FOMO), F. nubica (FONU) e F. pugnacius (FOPU), utilizando como molde a região do gene CBF5 (centromere/microtubule-binding protein cbf5) e a sonda RCA cadeado para F. pugnacius (FPgP) utilizando como molde a região ITS1-5,8S-ITS2 do DNAr, com 94pb. Estas ferramentas demonstraram especificidade quanto as espécies de Fonsecaea em ensaios in silico e in vitro, comparando espécies de origem clínica ou ambiental (F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica, F. pugnacius, F. erecta e F. brasiliensis), além das demais espécies associadas à cromoblastomicose como Cladophialophora carrioni, C. samoensis, E. dermatitidis, P. verrucosa, R. aquaspersa, R. tropicalis e Cyphellophora ludoviensis. Palavras-chave: Cromoblastomicose. Detecção molecular. Oligonucleotídeos espécie-específico. Sonda cadeado RCA. Fonsecaea pugnacius. Abstract: The black yeasts from the Herpotrichiellaceae family of the Chaetothyriales order belong to several genus such as Exophiala, Cladophialophora, Capronia, Fonsecaea, Phialophora, Rhinocladiella, Veronea and Cyphellophora with related species associated to infection in human and animal hosts; as for instance the casual agents of Chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis. In the Herpotrichiellaceae family there are from saprobes to pathogens strains described as closely related species very similar in morphology but different in ecology. In this context, there is a necessity to develop new molecular methods capable to species discrimination and environmental and biological samples detection, especially for the causative agents of chromoblastomycosis, an implantation mycosis, with an important environmental link. Given that, the use of molecular techniques with high sensitivity, specificity and efficacy, such as the use of padlock probes associated to rolling circle amplification technique (RCA), represent a potential effective tool for diagnosis, virulence and molecular epidemiology studies. Likewise it could be useful for infection routes elucidation and species identification even without genomic sequencing. Therefore, this work aimed to design molecular markers species-specific for Fonsecaea pathogenic species as F. monophora, F. nubica, F. pedrosoi and F. pugnacius and develop a padlock probe RCA for F. pugnacius. Species-specific primers were designed for F. pedrosoi (FOPE), F. monophora (FOMO), F. nubica (FONU) and F. pugnacius (FOPU) using CBF5 gene (centromere microtubule-binding protein cbf5 ) and the RCA padlock probe (FPgP), for F. pugnacius using region ITS1-5.8S-ITS2 of rDNA as template, with 94pb. These tools demonstrated specificity for Fonsecaea sibling species in the in silico and in vitro assays using the clinical and environmental species: F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica, F. pugnacius, F. erecta and F. brasiliensis in comparison to other associated with chromoblastomycosis such as C. carrioni, C. samoensis, E. dermatitidis, P. verrucosa, R. aquaspersa, R. tropicalis and Cyphellophora ludoviensis. Keywords: Chromoblastomycosis. Molecular detection. Species-specific primers. RCA padlock probe. Fonsecaea pugnacius.

Antisense oligonucleotides (AS-ODNs) are short, single-stranded DNA molecules designed to bind specifically to a target messenger RNA (mRNA) and down-regulate gene expression. Despite being a promising class of therapeutics for a variety of diseases, they face major hurdles limiting their clinical application, including low intracellular delivery and poor in vivo stability. Among strategies available to enhance delivery, lipid nanoparticles have gained considerable attention. Active targeting of carriers of AS-ODNs is likely to further enhance delivery efficiency. For that, ligands for overexpressed receptors on the cell surface can be linked to the lipid nanoparticle, facilitating intracellular uptake, resulting in improved efficacy and reduced systemic toxicity. These include cell penetrating peptides (CPPs), transferrin, folate, oligosaccharides, polysaccharides and antibodies. Although targeted-lipid nanoparticles have been shown to enhance intracellular delivery and therapeutic effect of AS-ODNs, no clinical evaluation has been conducted yet. Therefore, more efforts are needed to turn these promising tools into clinical products.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:09Z : No. of bitstreams: 1 000870495.pdf: 1494495 bytes, checksum: 3b9f9ca073de023b7bdc8087537f82c7 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Leishmaniasis, a disease caused by the protozoan Leishmania spp. is expanding in the world and affects millions of people annually, reaching 98 countries in tropical and subtropical regions, representing an important public health problem. Subspecies Leishmania and Viannia, represented by at least 22 species, are responsible for the three most common clinical manifestations of the disease in humans. Routinely, in endemic areas, serological diagnosis are employed. However, other parasitological and/or molecular techniques have high sensitivity to identify the genus Leishmania. The publication of Leishmania genomes have provided a better understanding of their composition and molecular markers to identify protozoan species and intra-specific variations, however some species are still underdiagnosed. However, the differentiation of Leishmania species in clinical samples still has limitations. Thus, in order to find the solution for this issue, we sought to design specific sequences for different species of Leishmania deposited in trypanosomatid genomic database, carrying out an in silico assay for verification of the selected sequences. The information generated in this study will constitute an interesting diagnostic platform, after proper validation with clinical samples

Antisense oligonucleotide therapy is a growing field in cardiac, metabolic, and muscular diseases. This precision therapy allows for treatment of diseases due to specific genetic defects. Antisense has few side effects and is relatively long lasting. Some major targets for antisense therapy include hyperglycemia, hyperlipidemia, and hypercholesterolemia. ISIS Pharmaceuticals recently commercialized antisense therapy with Kynamro (Mipomersen) for homozygous familial hypercholesterolemia, opening the door for other antisense oligonucleotides for lowering proteins. Antisense can also be used to increase proteins that are inhibited by mutant exons. Sarepta is testing exon 51 skipping in the mutated dystrophin gene, which if successful will help affected individuals walk, and may help restore some cardiac function. These antisense techniques also could be applied as antisense therapies to overcome gene defects in hypertension, heart disease, muscular defects and metabolic syndrome.

A liberação da placenta após o parto envolve a perda da adesão materno-fetal e ocorre somente após a maturação completa do placentoma, que está relacionada com a diminuição da celularidade dos tecidos fetal e materno. A apoptose é requerida tanto para a maturação quanto para a liberação normal da placenta após o parto. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de apoptose em amostras de placenta de vacas em diferentes fases de gestação. Amostras de placentomas de 15 vacas saudáveis com 4 (n=5), 6 (n=5) e 9 (n=5) meses de gestação foram colhidas e processadas rotineiramente para a histologia, imunoistoquímica e histoquímica. As lâminas obtidas foram coradas em HE, Picrosirius Red e submetidas à análise imunoistoquímica das proteínas Caspase 3, Caspase 8, Bax, Bid e Bcl-2. O aumento no número de vasos não necessariamente se associou ao aumento do calibre destes durante a evolução da gestação. Os resultados de histomorfometria revelaram aumento da marcação para Bax e Caspases 3 e 8 em células trofoblásticas binucleadas no final da gestação, enquanto o Bid se manteve sem alteração significativa. A histomorfometria das células trofoblásticas mononucleadas revelou expressão alta para Bax no início de gestação, com diminuição aos 6 meses de gestação e aumento das imunomarcações para Caspases 3 e 8, e Bid com o avanço gestacional. Os colágenos tipo I e III não aumentaram do terço médio ao final da gestação, o que é importante para a diminuição da adesão materno-fetal. A dissociação das fibras do estroma das vilosidades coriônicas diminuiu aos 9 meses de gestação, ao contrário do índice apoptótico que aumentou progressivamente com o avanço da gestação. Esses resultados confirmam que as Caspases 3 e 8, e o Bax estão envolvidos nos mecanismos de ativação da apoptose pela via intrínseca mitocondrial e/ou extrínseca ao longo da gestação em células trofoblásticas binucleadas, e que nas células trofoblásticas mononucleadas o Bax deixa de ser importante, enquanto o Bid e as Caspases 3 e 8 se tornam os mais significativos. Placental release after birth involves loss of maternal-fetal adhesion and occurs only after complete maturation of the placentome, which is related to the decrease in cellularity of fetal and maternal tissues. Apoptosis is required for both the normal maturation and release of the placenta after birth. The aim of this study was to evaluate the occurrence of apoptosis in samples of placenta of cows in different stages of gestation. Samples of 15 healthy cows placentomes 4 (n = 5), 6 (n = 5) and 9 (n = 5) months of gestation were harvested and processed for routine histology, immunohistochemistry and histochemistry. The slides were stained with HE, Picrosirius Red and subjected to immunohistochemical analysis of proteins Caspase 3, Caspase 8, Bax, Bid and Bcl-2. Increase in number of vessels was not associated to increase in vascular area, during progression of gestation. The results of histomorphometry revealed increased labeling for Bax and Caspases 3 and 8 in trophoblastic binucleated cells in late pregnancy, awhile Bid remained without significant change. Histomorphometry analyzing the mononuclear trophoblast cells showed a high expression for Bax in early pregnancy, but decreased at 6 months of gestation. Immunolabeling revealed increased Caspases 3/8 and Bid with advancing of gestation. Further evaluation of type I and III collagens showed a decrease of both types of collagens at the end of gestation, which is very important to decrease maternal-fetal adhesion. The dissociation of the fibers of the stroma of chorionic villi decreased at 9 months of gestation, unlike the apoptotic index, which increased progressively with advancing gestation. These results confirm that Caspases 3 and 8 and Bax are involved in the mechanisms of activation of apoptosis through mitochondrial intrinsic and or extrinsic pathway during pregnancy in trophoblastic binucleated cells. In mononuclear trophoblast cells Bax loses importance in the apoptosis process, awhile Bid and caspases 3 and 8 become the most significant.

Nesse trabalho, o docking e a dinâmica molecular foram utilizados como métodos de investigação das formas de interação entre um oligonucleotídeo de B-DNA e duas novas Bases de Tröger fluorescentes, com o propósito de verificar sua potencialidade como sondas biológicas. Para o docking molecular foi utilizado o protocolo descrito por Ricci et. al. (2009), que demonstrou ser um método promissor para reconhecer os modos de ligação e descrever a interação entre as Bases de Tröger e os oligonucleotídeos. Os complexos obtidos a partir dos docking foram utilizados como ponto de partida para as simulações de dinâmica molecular usando o programa GROMACS e o campo de força AMBER03, como descrito por Ricci et. al. (2010). A análise dos resultados das simulações mostraram a possibilidade, de que as Bases de Tröger podem interagir de maneiras diferentes com o oligonucleotídeo com preferência pela interação com sulco menor desse receptor. Durante todas as simulações os ligantes mantiveram-se com uma forte interação com o oligonucleotídeo, sem causar a desnaturação do mesmo. Globalmente, os resultados sugerem que as Bases de Tröger podem interagir com o sulco menor do oligonucleotídeo mas também são capazes de interagir como intercaladores. Devido as fortes interações, e també as propriedades fotofísicas (das Bases de Tröger propostas nesse trabalho), essas moléculas podem atuar como possíveis sondas biológicas. In this work, docking and molecular dynamics simulations were used to ingestigate the interaction between a B-DNA oligonucleotide and two fluorescent Tröger´s bases, in order to verify their potential use as biological probes. For dockings was used protocol described by Ricci et. al. (2009), which proved to be a promising method to recognize the binding modes and describe the interaction between this class of compounds and the oligonucleotide. The complexes obtained from dockings were used as starting point for molecular dynamics simulations using GROMACS and the AMBER03 Force Field, as described by Ricci et. al. (2010). The analyzes of the simulation results showed the possibility that the Tröger Bases can interact in different ways with the oligonucleotide, with some preference for this receptor´s minor groove. During all simulations the ligands have maintained a strong interaction with the oligonucleotide, without causing denaturation of the same. Overall, the results suggest that Tröger´s Bases may interact with the minor groove of olinucleotide but are also able to interact as an intercalator, depending upon the substituents present. Due to the strong interactions, and also the peculiar photophysical properties, this class of molecules may act as a potential DNA probe.

La présente étude décrit des aspects technologiques, physico-chimiques et biologiques des complexes formés entre nanoémulsions cationiques et des oligonucléotides (ON) anti-topoisomérase II du Plasmodium falciparum. Les formulations ont été optimisées au travers d'un plan factoriel 23 complet. Deux formulations composées par des triglycérides à chaîne moyenne, de la lécithine de jaune d'oeuf et un lipide cationique oléylamine ou DOTAP ont été choisis en fonction de leur proprietés physicochimiques. ON phosphodiester ou phosphorothioate ont été adsorbés sur des nanoémulsions cationiques. Les isothermes d'adsorption indiquent une adsorption progressive des ON jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint, décrit par un modèle d’adsorption de Langmuir. Il a été détecté une quantité plus élevé d’ON adsorbés sur des formulations contenant le DOTAP par rapport à celles constituées par oléylamine. Des évidences supplémentaires de l'adsorption des ON ont été démontrées par l'inversion du potentiel zeta. L’analyse topographique et morphologique des complexes, obtenue par microscopie électronique à transmission et à force atomique, suggère l’adsorption des ON sur les nanoémulsions. L'organisation strucutrale dans une phase lamellaire a été identifiée par diffraction des rayons X d'énergie dispersive. L’association des ON et l'hémolyse augmentent avec le rapport de charge de complexes sur les érythrocytes sains ou infectés par Plasmodium falciparum. Des sondes fluorescentes (coassociées dans les complexes: fluorescéine et rouge du Nil) ont été localisées dans les érytrocytes infectés dans les étapes tardives du cycle d’évolution des parasites par microscopie confocale. Dans des conditions non hémolytiques, un effet d'inhibition d'environ 80% de la croissance de P. falciparum et un retard du cycle du parasite ont été observés in vitro. Les résultats globaux montrent que les complexes ON/nanoemulsions cationiques peuvent represerter une stratégie prometteuse contre les infections par Plasmodium falciparum. O presente estudo descreve aspectos tecnológicos, físico-químicos e biológicos de complexos formados entre nanoemulsões catiônicas e oligonucleotídeos (ON) antitopoisomerase II de P. falciparum. As formulações foram otimizadas através de um planejamento fatorial completo 23. Duas formulações compostas por triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo e pelo lipídeo catiônico oleilamina ou DOTAP foram selecionadas com base nas suas propriedades físico-químicas. ON fosfodiéster ou fosforotioato foram adsorvidos nas nanoemulsões catiônicas. As isotermas de adsorção indicam uma progressiva adsorção dos ON até que um platô seja atingido, descritos através do um modelo de adsorção de Langmuir. Foi detectada uma maior quantidade de ON adsorvida em nanoemulsões contendo DOTAP em comparação com as constituídas de oleilamina. Evidências suplementares da adsorção dos ON foram demonstradas através da inversão do potencial zeta. Análises topográficas e morfológicas, obtidas através de microscopia eletrônica de transmissão e de força atômica, sugerem a adsorção dos ON nas nanoemulsões. A organização estrutural em fase lamelar foi identificada através de difração de raios-X de energia dispersiva. A associação dos ON e hemólise aumentam com a relação de cargas dos complexos em eritrócitos sadios ou infectados por P. falciparum. Sondas fluorescentes (co-associadas nos complexos: fluoresceína e vermelho do Nilo) foram localizados em eritrócitos infectados nas etapas tardias do ciclo evolutivo dos parasitos por microscopia confocal. Em condições não hemolíticas, um efeito de inibição de cerca de 80% do crescimento de P. falciparum e um atraso no ciclo biológico do parasito foi observado in vitro. O conjunto dos resultados demonstra que o uso de complexos ON/nanoemulsões catiônicas podem representar uma estratégia promissora para o tratamento das infecções por P. falciparum. The present study describes the technological, physicochemical and biological aspects of complexes formed between cationic nanoemulsions and oligonucleotides (ON) targeted toward Plasmodium falciparum topoisomerase II. Formulations were optimized by means of a 23 full factorial design. Two formulations composed of medium-chain triglycerides, egg yolk lecithin and either oleylamine or DOTAP cationic lipids were selected based on their physicochemical properties. Phosphodiester or phosphorothioate ONs were adsorbed onto cationic nanoemulsions. The adsorption isotherms indicated a progressive ON adsorption until a plateau was reached, following a Langmuir adsorption model. It was observed that a higher amount of ON was adsorbed onto the DOTAP-based nanoemulsions compared to those based on oleylamine. Further evidence of ON adsorption was obtained through the inversion of the zeta potential. Topographical and morphological analysis of the complexes, by transmission electron and atomic force microscopy, indicated ON adsorption onto the nanoemulsions. Strucutural organization in a lamellar phase was also identified by energy dispersive X-ray diffraction. ON binding and hemolysis increased along with the charge ratio of the complexes in healthy or Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Fluorescent probes co-encapsulated into the complexes (fluorescein and Nile red) were located inside the infected erytrocytes at the late stages of the parasite life cycle by confocal microscopy. Under non-hemolytic conditions, Plasmodium falciparum growth inhibition effect of around 80% and a delay in the parasite life cycle were observed in vitro. The overall results showed that the use of ON/cationic nanoemulsions complexes may represent a promising strategy for the treatment of P. falciparum infections.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bacteria belonging to the genus Bacillus have physiological plasticity regarding to the conditions of temperature, pH and salinity of the environments in where they are found, such as: water, soil, polluted environments, among others. Under the environmental aspect, these bacteria have the capacity to produce biosurfactants which put them as potential microorganisms for the application of Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR).Technologies economically viable and of growing acceptance, like MEOR, can receive additional informations from the molecular tools about the microbial behavior. In this context, the fluorescence in situ hybridization technique (FISH) is an important tool for detection of microorganisms present in different samples. This technique allows the detection of microorganisms without the need of cultivation. Oligonucleotide probes complementary to the rRNA can be designed with specificities that range from the species level to the domains level. The aims of this work was to apply the FISH technique to detect bacteria of the genus Bacillus and establish the best combination of parameters which combines specificity and good fluorescence signal intensity of the probes utilized. In this way, it was utilized a specific probe for the genus Bacillus (BAC07) and a universal probe for the Domain Bacteria (EUB338). The in silico analysis revealed that the target sequence of probe BAC07 is found predominantly in bacteria of the genus Bacillus, however the possibility of hybridization of probe BAC07 with another member of class Bacilli was not discarded. The parameters analyzed for the application of the FISH technique and evaluation of the specificity of probe BAC07 were: cell fixation method, formamide concentration added to the hybridization buffer and pretreatment of cells with lysozyme. The combination of parameters that ensured the best signal for the probe EUB338 was: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 35% formamide, without pretreatment with lysozyme; the best conditions for the probe BAC07 were: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 40% formamide, without pretreatment with lysozyme. A specific detection of bacteria of the genus Bacillus was achieved by probe BAC07. However, the fluorescence signal intensity was very weak when in comparison to the signal of probe EUB338, thereby, for the utilization of probe BAC07 for detection of Bacillus in environmental samples, an enhanced signal is required. Bactérias pertencentes ao gênero Bacillus possuem grande plasticidade fisiológica no que se refere às condições de temperatura, pH e salinidade dos ambientes nos quais são encontradas, como: água, solo, ambientes poluídos, entre outros. Sob o aspecto ambiental, possuem a capacidade de produção de biossurfactantes que as colocam como micro-organismos potenciais para aplicação na Recuperação Avançada de Petróleo Melhorada por Micro-organismos (MEOR). Tecnologias economicamente viáveis e de crescente aceitação, como a MEOR, podem receber informações adicionais das ferramentas moleculares acerca do comportamento microbiano. Neste contexto, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) apresenta-se como uma importante ferramenta para detecção de microorganismos presentes em diferentes amostras. Trata-se de uma técnica que permite a detecção de micro-organismos sem a necessidade prévia de cultivo. Sondas de oligonucleotídeos complementares ao RNAr podem ser elaboradas com especificidade que varia desde o nível de espécie até o nível de Domínio. Este trabalho teve como objetivos aplicar a técnica de FISH para detectar bactérias do gênero Bacillus e estabelecer a melhor combinação de parâmetros que aliassem especificidade à emissão de um adequado sinal de fluorescência das sondas utilizadas. Desta forma, foram utilizadas uma sonda específica para o gênero Bacillus (BAC07) e uma sonda universal para o Domínio Bacteria (EUB338). A análise in silico revelou que a sequência-alvo da sonda BAC07 é encontrada predominantemente em bactérias do gênero Bacillus, porém não foi descartada a possibilidade de hibridização da sonda BAC07 com outros membros da classe Bacilli. Para aplicação da técnica de FISH e avaliação experimental da especificidade da sonda BAC07, os parâmetros avaliados foram: o método de fixação das células, a concentração de formamida adicionada ao tampão de xi hibridização e o pré-tratamento das células com lisozima. A combinação de parâmetros que garantiu o melhor sinal para a sonda EUB338 foi: células fixadas em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 35% de formamida, sem pré-tratamento com lisozima; as melhores condições para a sonda BAC07 foram: a fixação das células em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 40% de formamida e sem pré-tratamento com lisozima. Conseguiu-se uma detecção específica de bactérias do gênero Bacillus pela sonda BAC07. No entanto, o sinal de fluorescência foi muito fraco quando comparado ao sinal da sonda EUB338, de modo que, para utilização da sonda BAC07 para detecção específica de Bacillus em amostras ambientais, o estabelecimento de condições que promovam a intensificação do sinal é requerido.

This study describes the validation of a spectrophotometric method to estimate oligonucleotides association with cationic nanoemulsions. Phosphodiester and phosphorothioate oligonucleotides targeting Plasmodium falciparum topoisomerase II were analyzed at 262 nm. Linear response (r > 0.998) was observed from 0.4 to 1.0 nmol/mL, the relative standard deviation values for the intra- and inter-days precision were lower than 2.6% and the recovery ranged from 98.8 to 103.6% for both oligonucleotides. The association efficiency was estimated based on an ultrafiltration/centrifugation method. Oligonucleotides recovery through 30 kDa-membranes was higher than 92%. The extent of oligonucleotides association (42 to 98%) varied with the composition of nanoemulsions.

Ao contrário da necrose, a apoptose é um tipo de morte celular dependente de energia e síntese protéica. Tanto a proliferação celular quanto a apoptose desempenham papel importante na função placentária. Ambos os processos são inversamente proporcionais ao longo da gestação (Boos et al., 2003). A regulação e execução da apoptose é atribuída principalmente a duas grandes famílias de proteínas: A Bcl-2 e as Caspases.

Nanoemulsões catiônicas têm sido consideradas como potenciais sistemas carreadores para oligonucleotídeos (ON) antisenso. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver nanoemulsões catiônicas como um sistema de liberação para ON anti-topoisomerase II de Plasmodium falciparum. Primeiramente, nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol e água contendo os lipídeos catiônicos oleilamina ou DOTAP (2 mM) foram obtidas através do procedimento de emulsificação espontânea. Este procedimento resultou em formulações monodispersas com diâmetro de gotícula de 200-260 nm e potencial zeta de +50 e +55 mV. Após, um método espectrofotométrico no UV para quantificação dos ON em série fosfodiéster (PO) ou fosforotioato (PS) foi validado. O método mostrou-se linear, específico, preciso e exato para a determinação de PO e PS, sem diferenças significativas entre os ON. Nas condições validadas, as isotermas de adsorção dos ON às nanoemulsões foram obtidas através da determinação dos ON na fase aquosa externa das nanoemulsões, após ultrafiltração/centrifugação dos complexos. A taxa de recuperação através das membranas de ultrafiltração de celulose regenerada (30 kDa) foi superior a 92%. Os resultados indicam a adsorção progressiva dos ON com as nanoemulsões, até cerca de 60 mg/g de fase interna para o complexo DOTAP-PS. Finalmente, evidências adicionais da adsorção de PO e PS às nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. O conjunto dos resultados obtidos demonstra que ON de série PO e PS anti-topoisomerase II de P. falciparum podem ser adsorvidos eficientemente às nanoemulsões catiônicas. Cationic nanoemulsions have been recently considered as a potential delivery system for antisense oligonucleotides (ON). The aim of the present work was to evaluate cationic nanoemulsions as a delivery system for ON against the Plasmodium falciparum topoisomerase II gene. Firstly, nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, egg yolk lecithin, glycerol and water, containing the cationic lipids oleylamine or DOTAP (2 mM) were obtained through spontaneous emulsification process. This procedure resulted in monodisperse formulations with droplet size of 200-260 nm and zeta potential of +50 and +55mV. After that, an UV spectrophotometric method for the quantification of either phosphodiester (PO) or phosphorothioate (PS) ON was validated. The method was linear, specific, precise, and accurate for the determination of PO and PS, without significant differences between both ON. In the validated conditions, ON adsorption isotherms with nanoemulsions were obtained through the ON determination in the external phase of nanoemulsions, after ultrafiltration/centrifugation of complexes. The recovery through regenerated cellulose membranes (30kDa) was higher than 92%. The results showed a progressive ON adsorption to the nanoemulsions up to approximately 60mg/g of internal phase for DOTAP-PS complexes. Finally, additional evidences of PO and PS adsorption to nanoemulsions could also be detected by the increase of the mean droplet size, the inversion of the zeta potential and the morphology of the oil droplets obtained by transmission electron microscopy. The overall results showed that PO and PS ON against P. falciparum anti-topoisomerase II gene can be efficiently adsorbed to the cationic nanoemulsions.

Empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa para detecção do vírus da cinomose canina (CC). Para a padronização da técnica foram selecionados quatro pares de oligonucleotídeos (P1, P2, N1, H1), baseados em seqüências dos genes da fosfoproteína, neuraminidase e hemaglutinina, sendo utilizadas três cepas vacinais de vírus da CC como controles positivos. Foram analisadas três amostras isoladas de cães com cinomose e quatro amostras provenientes de cães com suspeita clínica de cinomose. Não houve amplificação nas amostras com suspeita clínica da doença. Os resultados obtidos com os oligonucleotídeos P1 e N1 foram superiores aos de H1. Os oligonucleotídeos P2 foram considerados inapropriados para a detecção do vírus da CC. Os amplicons obtidos com os oligonucleotídeos P1, N1 e H1 foram clivados com endonucleases de restrição, sendo os perfis das amostras virais comparados aos da amostra vacinal Lederle, utilizada como referência. Um padrão similar de restrição foi observado em todas as amostras analisadas. The reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect canine distemper virus (CDV). Four oligonucleotide pairs were selected (P1, P2, N1, H1), based on the sequences of the phosphoprotein, hemagglutinin and nuraminidase genes for assay standardization, and three CDV vaccine strains were used as positive controls. Three viral isolates from dogs with canine distemper and four samples from animals clinically suspected of distemper were analysed. No amplification was detected in suspected samples. Results obtained by using P1 and N1 oligonucleotides were superior to those with H1 ones. P2 oligonucleotides were considered inadequate for CDV detection. Amplicons resulting from amplification of P1, N1 and H1 oligonucleotides were submitted to cleavage by restriction endonucleases and restriction patterns of viral samples were compared to that of Lederle strain used as reference. A similar restriction pattern was observed in all analysed samples.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente consideradas como potenciais sistemas de liberação de oligonucleotídeos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da adição de quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos estearilamina (EA), oleilamina (OA) ou DOTAP (DT) sobre propriedades físico-químicas de nanoemulsões como sistemas de liberação de um oligonucleotídeo modelo (pdT16). As formulações foram preparadas pelo procedimento de emulsificação espontânea. As nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol, quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos (até 20 mM) e água foram caracterizadas em termos de diâmetro médio, pH, potencial zeta e viscosidade. Baseado nos resultados obtidos, as formulações contendo EA, OA e DT na concentração de 2 mM foram selecionadas para a continuidade do trabalho, uma vez que apresentam diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e 40-50 mV, respectivamente. A taxa de associação do pdT16 às nanoemulsões foi determinada, indiretamente, pelo doseamento deste, na fase aquosa externa após separação em membranas de ultrafiltração/centrifugação, por meio de espectrofotometria no UV. A maior taxa de associação do pdT16 foi detectada para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT (até ~70 mg/g de fase interna). Evidências adicionais da associação do pdT16 com as nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas. Em uma última etapa, um estudo preliminar da liberação do pdT16 foi realizado especialmente para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT. O fator de diluição e relação de cargas [+/-] foram identificados como os principais parâmetros que influenciam a liberação do pdT16 a partir das nanoemulsões. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra a influência da concentração e da natureza do lipídeo catiônico empregado sobre as propriedades físico-químicas de nanoemulsões catiônicas como sistemas de liberação de oligonucleotídeos.

Oligonucleotídeos foram construídos com base na sequência primária do gene codificando o rRNA de Plasmodium para amplificar DNA de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, de maneira gênero-específica. Três sistemas de PCR foram utilizados: PCR simples, hemi-nested PCR convencional e hemi-nested PCR em um único tubo, desenvolvidos em nosso laboratório. Na PCR simples, composta de 30 ciclos, foram utilizados os oligonucleotídeos GJ1 e HR842 (20 pmol/50μl), já testados por nosso grupo. Na hemi-nested PCR convencional utilizou-se três oligonucleotídeos (GJ1, PGFO3 e HR842), em duas reações sequenciais, sendo o PGFO3 construído durante o desenvolvimento do presente trabalho, visando a detecção do gênero Plasmodium. O par GJ1 e HR842 foram utilizados como oligonucleotídeos externos na primeira reação, e o PGFO3 como interno, ancorado ao HR842 na segunda reação. A hemi-nested PCR em um único tubo consistiu em 60 ciclos (92ºC, 30s; 58ºC, 30s e 72ºC, 45s), e concentrações limitantes de oligonucleotídeos externos (4 pmols/50μl) participavam da PCR sem competição com os oligonucleotídeos internos durante os primeiros 15 ciclos da reação e 40 pmol/50μl de primers internos (imobilizados na face interna da tampa do microtubo) foram introduzidos na PCR no 16º ciclo. As concentrações dos outros componentes da reação foram as mesmas utilizadas nas reações convencionais de PCR. Observou-se que a quantidade mínima de DNA genômico detectada pela PCR simples, hemi-nested PCR e hemi-nested PCR em um único tubo foi de 10 pg; 0,01 pg e 0,1 pg, respectivamente. Apesar da hemi-nested PCR em um único tubo ter sido menos sensível que a heminested PCR convencional, é muito mais simples e conveniente, já que o risco de contaminação cruzada é bem menor. Esses sistemas moleculares de diagnóstico podem ser usados em situações quando se requer uma alta sensibilidade e especificidade, tais como na avaliação da eficiência de quimioterapia, detecção precoce de infecção e prevenção de transmissão a partir de pacientes hipoparasitêmicos

The interaction between cationic bilayer fragments and a model oligonucleotide was investigated by differential scanning calorimetry, turbidimetry, determination of excimer to monomer ratio of 2-(10-(1-pyrene)-decanoyl)-phosphatidyl-choline in bilayer fragment dispersions and dynamic light scattering for sizing and zeta-potential analysis. Salt (Na2HPO4), mononucleotide (2′-deoxyadenosine-5′-monophosphate) or poly (dA) oligonucleotide (3′-AAA AAA AAA A-5′) affected structure and stability of dioctadecyldimethylammonium bromide bilayer fragments. Oligonucleotide and salt increased bilayer packing due to bilayer fragment fusion. Mononucleotide did not reduce colloid stability or did not cause bilayer fragment fusion. Charge neutralization of bilayer fragments by poly (dA) at 1:10 poly (dA):dioctadecyldimethylammonium bromide molar ratio caused extensive aggregation, maximal size and zero of zeta-potential for the assemblies. Above charge neutralization, assemblies recovered colloid stability due to charge overcompensation. For bilayer fragments/poly (dA), the nonmonotonic behavior of colloid stability as a function of poly (dA) concentration was unique for the oligonucleotide and was not observed for Na2HPO4 or 2′-deoxyadenosine-5′-monophosphate. For the first time, such interactions between cationic bilayer fragments and mono- or oligonucleotide were described in the literature. Bilayer fragments/oligonucleotide assemblies may find interesting applications in drug delivery.