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Einzelzellomics bieten unvoreingenommene Einblicke in Transkriptionsprogramme und Genom-Zugänglichkeiten auf zellulärer Ebene, auch wenn der zelluläre Kontext verloren geht. Wir haben einen virtuellen Multi-omic Embryo der Drosophila melanogaster erstellt, basierend auf den Datentypen RNA (Transkriptom) und ATAC (Zugänglichkeit der DNA), welche gleichzeitig auf Einzelzell Ebene erhoben wurden. Mithilfe des Tools novoSpaRc, welches den räumlichen Ursprung der Zellen rekonstruiert, konnte ein regulatorischen Bauplan erstellt werden, der die Genexpression und die Zugänglichkeit von Enhancern widerspiegelt. Diese Ressource hilft beim Verständnis der regulatorischen Dynamik in der Entwicklung. Bei der Untersuchung von ATAC-Peaks konnten wir Überschneidungen zwischen den Mustern der Chromatin Zugänglichkeit und der Aktivität unabhängiger getesteter Enhancer feststellen, was die Bedeutung der Zugänglichkeit unterstreicht. Die nicht-negative Matrixfaktorisierung identifizierte Archetypen der Genexpression und der Chromatin-Zugänglichkeit. Archetypen, die möglicherweise durch Transkriptionsfaktoren (TFs) reguliert werden, wurden einer Motiv-Anreicherungsanalyse für Archetyp-assoziierte CRMs unterzogen. Ein Ansatz zur Vorhersage von Enhancern, ordnete die Enhancer den Genen auf der Grundlage partieller Ähnlichkeit der Muster zu. Zusammenfassend dient unser multimodaler virtueller Embryo als Ressource und präsentiert zum ersten Mal räumliche Chromatin-Zugänglichkeiten für genomische Regionen für einen ganzen Organismus. Die Ergebnisse geben Aufschluss über die Prinzipien der Genregulation und zeigen den regulatorischen Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf den Chromatinzustand von Enhancern., Single-cell-omics techniques provide unbiased insights into transcriptional programs and genomic accessibility patterns at the cellular level despite sacrificing spatial information. We created a multi-omic virtual Drosophila melanogaster stage 6 embryo by simultaneously assessing genome accessibility and transcriptional states in individual cells. Using novoSpaRc, a spatial mapping tool, we accurately reconstructed the spatial origin of cells, yielding a regulatory blueprint reflecting gene expression and enhancer accessibilities. This resource aids in understanding developmental regulatory dynamics. Examining ATAC-peaks, we observed overlapping chromatin accessibility patterns with the activity of independently testes enhancers, emphasizing accessibility's importance. Non-negative matrix factorization identified archetypes in gene expression and chromatin accessibility. Accessibility archetypes, potentially regulated by transcription factors (TFs), were subjected to motif enrichment analysis for archetype-associated CRMs. An enhancer prediction approach, utilizing a generalized linear model, assigned enhancers to genes based on partial pattern similarity. In summary our multi-modal virtual embryo serves as a resource and presents for the first time single-cell chromatin accessibilities for genomic regions reconstructed in space for a whole organism in a single developmental stage. The results shed light on gene regulatory principles, highlighting the regulatory impact of TFs on chromatin states of enhancers.

Einzelzell-Omics-Daten stehen derzeit im Fokus der Entwicklung computergestützter Methoden in der Molekularbiologie und Genetik. Einzelzellexperimenten lieferen dünnbesetzte, hochdimensionale Daten über zehntausende Gene oder hunderttausende regulatorische Regionen in zehntausenden Zellen. Diese Daten bieten den Forschenden die Möglichkeit, Gene und regulatorische Regionen zu identifizieren, welche die Bestimmung und Aufrechterhaltung der Zellidentität koordinieren. Die gängigste Strategie zur Identifizierung von Zellidentitätsmarkern besteht darin, die Zellen zu clustern und dann Merkmale zu finden, welche die Cluster unterscheiden, wobei davon ausgegangen wird, dass die Zellen innerhalb eines Clusters die gleiche Identität haben. Diese Annahme ist jedoch nicht immer zutreffend, insbesondere nicht für Entwicklungsdaten bei denen sich die Zellen in einem Kontinuum befinden und die Definition von Clustergrenzen biologisch gesehen potenziell willkürlich ist. Daher befasst sich diese Dissertation mit Clustering-unabhängigen Strategien zur Identifizierung von Markern aus Einzelzell-Omics-Daten. Der wichtigste Beitrag dieser Dissertation ist SEMITONES, eine auf linearer Regression basierende Methode zur Identifizierung von Markern. SEMITONES identifiziert (Gruppen von) Markern aus verschiedenen Arten von Einzelzell-Omics-Daten, identifiziert neue Marker und übertrifft bestehende Marker-Identifizierungsansätze. Außerdem ermöglicht die Identifizierung von regulatorischen Markerregionen durch SEMITONES neue Hypothesen über die Regulierung der Genexpression während dem Erwerb der Zellidentität. Schließlich beschreibt die Dissertation einen Ansatz zur Identifizierung neuer Markergene für sehr ähnliche, dennoch underschiedliche neurale Vorlauferzellen im zentralen Nervensystem von Drosphila melanogaster. Ingesamt zeigt die Dissertation, wie Cluster-unabhängige Ansätze zur Aufklärung bisher uncharakterisierter biologischer Phänome aus Einzelzell-Omics-Daten beitragen., Single-cell omics approaches are the current frontier of computational method development in molecular biology and genetics. A single single-cell experiment provides sparse, high-dimensional data on tens of thousands of genes or hundreds of thousands of regulatory regions (i.e. features) in tens of thousands of cells (i.e. samples). This data provides researchers with an unprecedented opportunity to identify those genes and regulatory regions that determine and coordinate cell identity acquisition and maintenance. The most common strategy for identifying cell identity markers consists of clustering the cells and then identifying differential features between these clusters, assuming that cells within a cluster share the same identity. This assumption is, however, not guaranteed to hold, particularly for developmental data where cells lie along a continuum and inferring cluster boundaries becomes non-trivial and potentially biologically arbitrary. In response, this thesis presents clustering-independent strategies for marker feature identification from single-cell omics data. The primary contribution of this thesis is a linear regression-based method for marker feature identification from single-cell omics data called SEMITONES. SEMITONES can identify markers or marker sets from diverse single-cell omics data types, identifies novel markers, outperforms existing marker identification approaches. The thesis also describes how the identification of marker regulatory regions by SEMITONES enables the generation of novel hypotheses regarding gene regulation during cell identity acquisition. Lastly, the thesis describes the clustering-independent identification of novel marker genes for highly similar yet distinct neural progenitor cells in the Drosophila melanogaster central nervous system. Altogether, the thesis demonstrates how clustering-independent approaches aid the elucidation of yet uncharacterised biological patterns from single cell-omics data.

Die Genregulation ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen die Menge der Genprodukte steuern, um ihre Identität auszubilden und auf Umweltveränderungen zu reagieren. Die CRISPR-Technologie hat genetische Screens revolutioniert und ermöglicht es, mehrere Transkripte gleichzeitig zu untersuchen. In dieser Arbeit werden die Vorteile und Herausforderungen gepoolter CRISPR-Screens zur Erforschung der Genregulation untersucht. Es wird ein CRISPR-ko-Screen in embryonalen Mausstammzellen (mESCs) beschrieben, der pluripotenzerhaltende Transkriptionsfaktoren identifiziert. Es zeigte sich, dass ein Screening mit einer kleinen Bibliothek den Großteil des biologischen Signals eines genomweiten Screens erfasst und die Identifizierung von Genkandidaten mit kleinen Effektgrößen verbessert. Nachfolgend wird CRISPTimeR, eine neue Methode für die Analyse von Zeitreihen von CRISPR-Screens, vorgestellt. Sie basiert auf gemischten linearen Modellen und ermöglicht es, Treffer zu identifizieren und gleichzeitig zeitlich zu klassifizieren. Als Nächstes wurde CRISPRi verwendet, um für die Pluripotenz von mESCs relevante lncRNAs zu untersuchen, was aufgrund ihrer schlechten Annotation und niedrigen Expressionsniveaus schwierig ist. Eine mögliche Lösung ist eine manuell verfeinerte Annotation von Transkriptionsstartstellen und kleinere Bibliotheks-Screens mit empfindlicherer phänotypischer Auslesung. Zudem wurde ein Sättigungsscreen genomischer Regionen rund um den PHOX2B-Lokus, zur Identifikation cis-regulierender Elemente, durchgeführt. Dabei wurden CRISPRa-reaktive Elemente identifiziert, die Gene in der PHOX2B-TAD regulieren, und mit diesen mittels Einzelzell RNA-seq in Verbindung gebracht. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit den Wert gepoolter CRISPR-Screens für die Erforschung der Genregulation und Herausforderungen der Analyse nicht-kodierender Elemente. Zusätzlich beschreibt sie ein neues Tool für die Analyse von kodierenden und nicht-kodierenden CRISPR-Screens in Zeitreihen., Gene regulation is a complex process in which cells control gene product levels to establish identity and respond to environmental changes. CRISPR technology has revolutionized genetic screening, enabling researchers to study multiple transcripts simultaneously. This thesis explores the advantages and challenges of using pooled CRISPR screens to study gene regulation. First, I describe a CRISPR-ko screen in mouse embryonic stem cells (mESCs) to identify transcription factors involved in pluripotency maintenance. I show that a small-library screen captures most of the biological signal observed in a genome-wide screen, and it improves the identification of candidate genes with small effect sizes. Next, introduce CRISPTimeR, a novel method for the analysis time-series CRISPR screens. CRISPTimeR is based on mixed linear models; it allows to use information from a time-series experiment to identify, and simultaneously perform temporal classification on, hits. Next, I use CRISPRi to study lncRNAs relevant to pluripotency in mESCs. Targeting lncRNAs poses challenges due to poor annotation and low expression levels. I suggest to address these issues by using a hand-refined annotation of transcription start sites and by designing small-library screens with more sensitive phenotypic readout. Finally, I describe a saturation screen targeting large genomic regions around the PHOX2B locus, to identify putative cis-regulatory elements. I identified CRISPRa responsive elements involved in regulating the expression of genes within the PHOX2B TAD, which were then matched with the genes they control using single-cell RNA-seq. Overall, in this thesis I demonstrate the value of CRISPR pooled screens for studying gene regulation, while highlighting the challenges associated with targeting non-coding elements and suggesting possible approaches to address these challenges. Moreover, I introduce a novel tool for the analysis of both coding and non-coding time-series CRISPR screens.