Search

A three-year-old female with compound heterozygosity for Hb Knossos and IVS-I-1 mutation is presented. On physical examination she had no abnormality except for pallor. Hb was 6.9 g/dl, MCV 61 fl, Hb A2 2% and Hb F 38.5%. Acrylamidegel electrophoresis at a pH of 6 revealed the presence of Hb Knossos in the child and her father. DNA studies revealed that the child was compound heterozygous for Hb Knossos and the IVS I-1 mutation. When the clinical expression of this combination in a previously reported patient with Hb Knossos/FSC8 mutation is compared, it is shown that the newly presented patient has a more severe condition, indicating that the mutations in the trans of Hb Knossos may play a role in the phenotypical expression of the disease.

Ill ÖZET Bu çalışmanın amacı, Kaliforniya Üniversitesi' nden Dr. Bruce N. Ames tarafından geliştirilen Salmonella,. typhimurium-mikrozomal test sis temi ile aşağıda belirtilen konuları araştırmaktır. i) Yurdumuzda yaygın olarak kullanılan 23 pestisitin memeli mikrozo- mal enzimleri de (S9) kullanarak mutajenik etkileri araştırıldı, ii) Bitki özütleri, vitaminler ve bazı kimyasal maddelerin antimuta- jenik etkileri, standart mutajen-kanserojen kimyasallar ile bu çalışmada mutajenik olarak saptanan pestisitlere karşı denendi. Memeli mikrozomal enzimlerinin (S9) varlığında veya yokluğunda, Salmonella typhimurium TA100 ve TA98 test bakterileri kullanılarak Çaptan, Folpet, DDVP, Trifluralin, Actellic, Neo-pynamine, Azinphos Methyl, Piperonyl Butoxide, Malathion, Baygon, Azinphos Ethyl, PCNB, Bioresmethrin, Methomyl, Ethoprophos, Quinalphos, Dikotan, Dinoseb, Amitraz, Vinclozoline, Thimet, Sumithion, Propethomphos pestisitleri- nin mutajenik etkileri araştırıldı. S9'suz olarak Çaptan, Folpet ve DDVP'nin kuvvetli, Azinphos Methyl, Trifluralin ve Bioresmethrin '- in zayıf mutajenik etkileri olduğu belirlendi. S9 varlığında ise Azinphos Methyl, Trifluralin ve Bioresmethrin ' in mutajenik etkileri nin olmadığı, Çaptan, Folpet ve DDVP'nin mutajenik etkilerinin azal dığı saptandı. Ascorbic acid, Retinol, a -Tocopherol, riboflavin, Pyridoxamine, Pyridoxal Phosphate, Tiamin, Folic acid, Niacine, Biotin gibi vitamin lerin ve Glutathione, Cysteine gibi kimyasal maddelerin,IV 2-Aminofluoren (2-AF), Nitrosoguanidin (MNNG), Sodyum Azide (SA) ve Benzo(a)pyrene (B(a)P) üzerindeki antimutajenik etkileri araştırıl dı. Ascorbic acid, Retinol, Glutathione ve Cysteine 'in antimutaje nik etkileri olduğu saptandı. Urtica, Lepidium, Spinacia, Nerium, Davus, Cistus, Fumaria, Allium, Portuluca, Xanthium, Crinum, Brassica, Humulus, Lonicera ve Vibernum gibi bitki özütlerinin 2-AF, MNNG, SA ve B(a)P üzerindeki antimutaje nik etkileri araştırıldı. Spinacia, Lepidium ve Urtica' nin antimu tajenik etkileri olduğu saptandı. Bu çalışmada antimutajenik olarak bulunan Ascorbic acid, Retinol, Glutathione, Cysteine, Lepidium, Urtica ve Spinacia 'nın S9 varlığın da pestisitlerin mutajenik etkilerini önemli ölçüde azalttıkları belirlendi. SUMMARY The aim of this work was to investigate the following subjects, by Salmonella typhimurium-microsomal test system which has been developed by Dr. Bruce N.Ames from the University of California. 1) The mutagenic effect of 23 pesticides, which are widely used in our country have been searched by using mammalian-microsomal enzyme system (S9). 2) Antimutagenic effect of plant extracts, vitamins and some chemicals have been tested against the standard mutagen- carcinogen chemicals and pesticides which have been shown mutagenic effect in this work. The mutagenic effect of pesticides Çaptan, Folpet, DDVP, Trifluralin, Actellic, Neo-pynamine, Azinphos Methyl, Piperonyl Butoxide, Malathion, Baygon, Azinphos Ethyl, PCNB, Bioresmethrin, Methomyl, Ethoprophos, Quinalphos, Dikotan, Dinoseb, Amitraz, Vinclozoline, Thimet, Sumithion and Propethomphos were tested with Salmonella typhimurium TA100 and TA98 with and without mammalian-microsomal enzymes (S9). It has been determined that Çaptan, Folpet and DDVP have strong, Azinphos Methyl, Trifluralin and Bioresmethrin have weak mutagenic effects without S9. In the presence of S9, mutagenic activity of Çaptan, Folpet and DDVP was decreased and no mutagenic effect was seen for Azinphos Methyl, Trifluralin and Bioresmethrin.VI Vitamins such as Ascorbic acid, Retinol, a -Tocopherol, Riboflavin, Pyridoxamine, Pyridoxal Phosphate, Tiamin, Folic acid, Niacine, Biotin and chemicals like Glutathione and Cysteine were tested for their antimutagenic effect against the 2-Aminoflouren (2-AF), Nitro- soguanidin (MNNG), Sodyum Azide (SA) and Benzo(a)pyrene (B(a)P). It was shown that Ascorbic acid, Retinol, Glutathione and Cysteine have antimutagenic effect. The plant extracts of Urtica, Lepidium, Spinacia, Nerium, Davus, Cistus, Fumaria, Allium, Portuluca, Xantium, Crinum, Brassica, Humulus, Lonicera and Viburnum have searched whether they have antimutagenic effect against the 2-AF, MNNG, SA and B(a)P. It has been determined that Spinacia, Lepidium, and Urtica have had anti mutagenic effect. Ascorbic acid, Retinol, Glutathione, Cysteine, Lepidium, Urtica and Spinacia which their antimutagenic effect were observed in this work, have decreased the mutagenic effect of pesticides in the presence of S9. 81

Ill ÖZET Bu çalışmanın amacı, yurdumuzda yaygın olarak kullanılan 13 pestisit ve bazı kimyasal maddelerin mutajenik etkilerini Salmonella typhimurium mutant bakteri suşları ile saptamaktır. Kaliforniya Üniversitesi 'nden Dr. Bruce N. Ames tarafından geliştirilen yöntem ile kimyasal maddelerin mutajenik etkileri Salmonella typhimu rium bakterisinin mutant suşları ile basit ve çabuk olarak saptanabil- mektedir. Bu çalışmada Salmonella typhimurium bakterisinin mutant suşları TA1535, TA1537, TA1538, TA97, TA98, TA100, TA102 ve TA104 kullanılarak Nitroso- guanidin, Sodyum Azid, Benzo(a)pyrene, Benzidin, 2 Nitrosofluoren, 2 Acetoaminofluoren, Ethidium Bromide, Benzantracen, 2 Aminofluoren gi bi çevresel kimyasallar ve Trifluralin, Neo-pynamine, Azinphos Metil, Piperonyl biitoxide, Malathion, Actellic, Baygon, Sumithion, PCNB, Bio- resmethrin Azinphos Etil, Çaptan, Propethomphos gibi yurdumuzda yaygın olarak kullanılan pestisitlerin mutajenik etkileri kontrol edildi. Çevresel kimyasal maddelerin mutajenik etkileri spot test ve plak in- korparasyon testi metodları ile, pestisitlerin mutajenik etkileri ise spot test ve preinkübasyon testi metodları ile araştırıldı. Test bak terilerinde mutajen etki göstermeyen kimyasal maddelerden 2 Aminoflu oren ve Benz(a)pyrene sıçan karaciğerinden özütlenen mikrozomal frak siyon (S9 fraksiyonu) ile aktif hale getirilerek mutajen etkileri sap tandı. Bu çalışmada pestisitlerden Çaptan, Trifluralin, Azinphos Metil ve Bioresmethrin ' in mutajen etkiye sahip oldukları saptandı. IV SUMMARY The aim of this research is to study] the mutagenic effects of 13 pestioides widely used in our country and some chemicals by / mutant strains of Salmonella typhimurium.. Mutagenic effects of chemical compounds can be determined rapidly and simply, with mutant strains of Salmonella typhimurium by a method developed by Dr. Bruce N. Ames from the University of California. ; In this study mutagenic effects of environmental chemicals like Sodyum Azide, Nitrosoguanidin, Benzo(a)pyrene, Benzidin, 2 Nitroso- fluoren, 2 Acetpaminof luoren, Ethidium Bromide, Benzanthracen, 2 Aminofluoren are controlled by using mutant strains of Salmonella typhimurium TA1535, TA1537, TA1538, TA97, TA98, TA100, TA102 and TA104. Also possible mutagenic effects of widely used pesticides in our country such as Trifluralin, Azinphos Metil, Halathion j Azinphos Etil, piperonyl biitoxide, Çaptan, Sumithion.Propethomphos, Baygon, PCNB, Bioresmethrin, Actellic and Neopynamine are tested by using TA97 and TA100 tester strains of Salmonella typhimurium. Mutagenic effects of chemical compounds are tested by spot and plate incorporation test methods. Also, possible mutagenic effects of pesticides are investigated by spot and preincubation test methods. Chemical compounds like 2 Aminofluoren and Benzo(a)pyrene which do not show mutagenic effect on test bacteria, are activated by microsomal fraction (S9 fraction) isolated from rat liver. Then their mutagenic effects are determined. It was :Shown [that pesticides Çaptan, Trifluralin, Azinphos Metil and Bioresmethrin have mutagenic effect. 74

Astım, genetik ve çevresel faktörlerin birlikte rol oynadığı karmaşık bir genetik hastalıktır. Hastalıkla ilişkili genler ile bu genlerin işlevsel olduğu metabolik yolların ortaya konması, astım tanısı ve tedavisinde yeni açılımlar sağlayacaktır.Sağlıklı bir akciğerde, proteaz ve proteaz inhibitörleri denge içerisinde çalışarak doku homeostazını, yenilenme ve tamir gibi olayları düzenler. Astım gibi inflamatuvar akciğer hastalıklarında proteaz aktivitesinde artış gözlemlenir. Proteaz ve proteaz inihibitörleri arasındaki dengenin bozulması iç kaynaklı ve dış kaynaklı proteaz miktarındaki artışa bağlı olabilir. Astım patogenezinde proteaz inhibitörlerin rollerini açıklayan bazı kanıtlar bulunsada, bunlar tüm mekanizmayı açıklamak için yeterli değildir.Son dönemde yapılan çalışmalar Skuamoz Hücre Kanser Antijen 1 ve Skuamoz Hücre Kanser Antijen 2 (SCCA1 ve SCCA2) proteinlerinin astım patogenezi ile ilişkili olabileceğini göstermesine karşın proteinlerin etki mekanizmalarıyla ilişkili bilgilerimiz son derece sınırlıdır.Bu tez çalışmasının amacı, SCCA1 ve SCCA2 genlerinin astımda oynadıkları rolleri belirlemek ve günümüzde tam olarak anlaşılamamış astım patogenezinin açıklamasına katkıda bulunmaktır.Bu amaç doğrultusunda, SCCA1 ve SCCA2 genlerinin 5? uç bölgelerinin astımla ilişkili olabilecek genetik varyasyonları DNA dizi analiz yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Bulunan varyasyonların astım tanısı ve astım fenotipi ile olan ilişkisi incelenmiştir.SCCA1 proteininin hücre ölümü ve musin salınımı üzerine olan etkisi hücre kültür yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Son olarak astım patolojisinde önemli rolü olan eozinofillerde, bazal ve sitokinlerle uyarılmış düzeylerde SCCA1 ifadesi araştırılmıştır.Bu çalışmada, SCCA 1 geninin promotor bölgesinde atopik astımla ilişkili olabileceği öngörülen polimorfizmler saptanmıştır. Astımlı ve sağlıklı bireyler arasında polimorfizmlerin görülme sıklığında önemli bir fark bulunamamasına karşın, homozigot polimorfizmlerin görülme sıklığı atopik astımlılarda, atopik olmayanlara göre daha yüksek bulunmuştur. A549 akciğer epitel hücreleri ile yapılan hücre kültür çalışmalarında SCCA1 proteininin hidrojen peroksit ile uyarılan hücre ölümünü (olası apopitoz) engellediğine ve musin ifadesini transkripsiyonal düzeyde baskıladığına dair bulgular elde edilmiştir.Elde edilen sonuçlar, SCCA1 proteinin astım patogenezinde proteaz inhibitör etkisinden farklı hücresel yollar üzerinde de etkili olabileceğini düşündürmektedir. Asthma is a complex genetic disease in which both genetic and environmental factors play a role. Revealing disease related genes and the metabolic pathways will provide new developments for the diagnosis and treatment of asthma.In the healthy lung, protease and protease inhibitor work in balance for tissue homeostasis and regulation of regeneration and repair processes. Increased protease activity has been observed in the inflammatory lung diseases such as asthma. Disruption of protease and their inhibitors balance may depend on rising endogenous and exogenous protease amount. Even though some evidence found for protease inhibitors? role in asthma pathogenesis, these are not enough for explanation of whole mechanism.Although recent studies showed that Squamous Cell Carcinoma Antigen 1 and Squamous Cell Carcinoma Antigen 2 (SCCA1 and SCCA2) proteins which are protease inhibitors could be related to asthma pathogenesis. Our knowledge about these proteins role in asthma pathogenesis is very limited.The goal of this thesis studies is to determine the role of SCCA1 and SCCA2 genes in asthma and make contribution to the unrevealing of not accurately understood pathogenesis of asthma.Through this goal, genetic variations in the 5? end regions of the SCCA1 and SCCA2 genes are investigated with DNA sequence analysis. Relation of the variations with asthma diagnosis and asthma phenotype is investigated; effect of polymorphisms found in the promoter region of SCCA1 on promoter activity is examined.Effect of SCCA1 protein on cell death and mucin secretion is investigated with cell culture method. Finally in eosinophils, that have an important role in asthma pathogenesis, SCCA1 expression in basal and cytokine stimulated levels is examined.In this study, in SCCA1 gene?s promoter region, polymorphisms that can be related to asthma are determined. Although the frequency of polymorphisms were not found significantly different between asthmatic and healthy individuals, the frequency of homozygous polymorphisms in atopic asthma are found to be higher than non atopic type. In cell culture studies with A549 lung epitelial cells, evidences found that SCCA1 protein prevents cell death (probable apoptosis) induced by hydrogen peroxide and suppresses mucin expression at the transcriptional level.Obtained results suggested that in asthma pathogenesis SCCA1 protein could be effective on cellular pathways other than protease inhibitor effect. 100

Kitinazlar, insanlarda ve birçok parazitte yer alan ve kitin adı verilen polisakkaritleriparçalayan enzimlerdir. Arastırmalar, Asidik Memeli Kitinaz (AMKaz) enzimininastımın patofizyolojisinde önemli bir rol oynadıgını göstermistir.AMKaz geninin promotor bölgesinin genetik karakterizasyonunun yapılması,kitinaz enziminin degisik dokularda seçici ifadesinin AMKaz gen yapısından nasılgerçeklestirildiginin anlasılabilmesi yönünden de büyük öneme sahiptir. Promotorbölgelerinin, genlerin ifade özgüllüklerinde etkin ve önemli rol oynadıklarıdüsünüldügünde; AMKaz geninin promotor bölgesindeki varyantların, alternatifsıplayslarla birlikte AMKaz geni'nin ifadesinde etkili olabilecekleri öngörülebilir.Bu tez çalısması kapsamında, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi PediatrikAstım ve Alerji bölümünde klinik olarak takip edilen 24 hasta ve 22 kontroldenolusan bir grup bireyde AMKaz genine ait, promotor bölgesinin de yer aldıgı 5' uçbölgelerinin genetik analizleri gerçeklestirilmistir. Genetik varyantlarınbelirlenebilmesi için; 5' uç ve promotor bölgeleri uygun primerler ile amplifiyeedilmistir. Çalısılan astımlı ve normal bireylerde otomatik sekans yöntemiyle 5' uçve promotor bölgelerinde on adet polimorfizm tespit edilmistir.46 bireyin DNA dizi özelliklerine ait varyasyon verilerinin elde edilmesi, sonrakiçalısmalara yön vermek amacıyla önemlidir. Bu çalısmada AMKaz geni 5' uçbölgesinde küçük bir grupta saptanan polimorfizmlerin ve sıklıklarının, astımlı venormal gruplarda anlamlı farklar olusturup olusturmadıkları, polimorfizmlerdenhangisinin veya hangilerinin genin ifade özgüllügünü etkileyebilme potansiyelinesahip oldukları ve polimorfizmler arasında gerçekten baglantı olup olmadıgınınveya hangileri arasında oldugunun belirlenebilmesi için arastırılmaların klinikolarak iyi tanımlanmıs, genis ölçekteki 500-1000 kisilik hasta ve kontrolgruplarında yapılması zorunlulugu bulunmaktadır. Bu tez çalısmasında tanımlananvaryasyonlar, AMKaz'ın astım patogenezinde oynadıgı rolün daha netanlasılabilmesi yönünde yapılacak ileri arastırmalar için bir fikir olusturacaktır.Anahtar sözcükler: AMKaz, astım, polimorfizm, DNA dizi analizi. Chitinases are enzmes that break down chitin, a polysaccharide that can be foundin many human borne parasites. Recent studies have revealed the significant roleof acidic mammalian chitinase (AMCase), a novel molecule, in thepathophysiology of asthma. In order to understand the function of selective geneexpression of the chitinase enzyme in different types of body tissues, it is veryimportant to identify the genetic characterization of the promoter region of theAMCase gene. Given the fact that the promoter region have a significant role inthe gene expression of specific gene regions and their alternative splicingmechanism, it is safe to say that the variants localized at the promoter region ofthe AMCase gene may have a significant role in the expression of the AMCasegene.In order to identify the common variants, 5` upstream and the promoter regions ofAMCase gene were studied in a population of 24 asthmatic and 22 non-asthmaticpatients who were clinically investigated at the Hacettepe University, School ofMedicine, Pediatric Asthma and Allergy Section. To detect genetic variants, 5?upstream and the promoter regions of the gene were amplified using the properoligonucleotides. Ten polymorphisms were detected at the 5? upstream and thepromoter regions of both asthmatic patients and normal individuals by using theautomated sequencing method.The current analysis of the data of genetic variations from the DNA sequenceproperties of the current 46 individuals will be important for future studies. In thesefurther studies, the polymorphisms and their frequencies that have been detectedin the AMCase gene and 5? upstream region in a small population should bestudied in a clinically well-defined, wide range population of asthmatic and normalpatients in a population which would consist of 500-1000 individuals in order todetect whether they have statistically meaningful differences or not, whichpolymorphism(s) affect the specific expressivity of the gene, and to see if anypolymorphisms have cross-linkage(s). The genetic variants that have beenidentified throughout this study will inform further research in order to unravel theeffects of AMCase in asthma pathogenesis in the long run.Keywords: AMCase, asthma, polymorphism, genetics. 68

Türkiye'deki Bazı Genetik Hastalıkların Moleküler Patolojisinin AraştırılmasıEsra BİRBENÖZGünümüzde insan genom projesi sayesinde hastalıklara neden olan birçok genindizisi belirlenmiş bulunmaktadır. Artık bu dizilerden yararlanarak hastalığa nedenolan mutasyonların belirlenmesi ve fonksiyon analizlerinin yapılması mümkündür.Tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de, moleküler genetik çalışmaları giderek artanölçüde önem kazanmıştır. Hastalıkların ardında yatan genetik nedenlerinbelirlenmesi, akılcı tedavi yaklaşımlarının üretilmesi için büyük öneme sahiptir. Bu tezçalışmasında faktör XIII eksikliği ve eritrositlerdeki pirüvat kinaz eksikliği gibi bazıgenetik hastalıkların moleküler nedenlerinin belirlenmesi, bazı zorunlu β talasemiheterozigotlarında görülen normal HbA2 düzeyinin genetik nedenlerinin belirlenmesive multigenik bir hastalık olan ve özellikle gelişmiş ülkeler başta olmak üzeredünyada birçok ülkede ve ülkemizde birçok kişiyi etkileyen astım hastalığının genetiknedenlerinin incelenmesi amaçlanmıştır.Astım hastalarında ALOX-5 (Arachidonate 5-lipoxigenase) promotor genotipininfonksiyonu olarak eozinofillerde ALOX-5 mRNA ifadesi ve lökotriyen C4 salınımıaraştırılmıştır. Delesyonel varyantın iki kopyasını içeren bireylerden alınaneozinofillerin, her iki kromozomda yabanıl tip ALOX-5 geni taşıyan bireylerden alınaneozinofillere kıyasla daha az ALOX-5 mRNA'sı sentezledikleri ve daha az lökotrienC4 salgıladıkları gösterilmiştir.Bu çalışmada faktör XIII eksikliği olan beş hasta incelenmiştir. Dört adet yeni ve birtane de bilinen mutasyon tanımlanmıştır. Yeni mutasyonlardan birisi, protein dizisindeasparajinin lizine dönüşümü ile sonuçlanan 541. kodondaki CâG değişimidir. Diğeryeni mutasyon ise kodon 466-469 arasında yer alan tekrar dizilerindeki (CAAACAAA)dört nükleotidlik delesyondur. Diğer iki yeni mutasyon 235 LeuâArg değişimi veekzon 14'de yer alan 3 nükleotidlik delesyonlardır. Bilinen mutasyon ise, kodon 400`de yer alan C insersiyonudur. Bu çalışma Faktör XIII genindeki mutasyonlarınoldukça heterojen dağılım gösterdiğini ortaya koymuştur.Pirüvat kinaz eksikliği olan ve akraba olmayan 3 Türk hastanın incelenmesisonucunda, yeni bir mutasyon olan cDNA'da 1623. pozisyonda yer alan GâC(Lys541Asn) mutasyonu ile 1456 CâT(Arg486Trp), 1528 CâT (Arg510Dur) ve 1675CâG (Arg559Gly) olmak üzere bilinen üç mutasyon saptanmıştır. Tüm mutasyonlarproteinin C domeyninde yer almaktadır.Zorunlu (obligatory) β-talasemi heterozigotu olan ve birbirleriyle akraba olmayan üçailenin dört ebeveyni ve Hb Knossoslu iki ebeveyn bu hastalarda gözlenen normalHbA2 düzeyinin nedenlerini belirlemek amacıyla incelenmiştir. Bu hastaların δ-globingenlerinin Southern blot, restriksiyon endonükleaz analizi ve sekans analizi ileincelenmesi sonucunda -7.2 kb Corfu tipi delesyonun, kodon 27 (GâT), IVS-I-2(TâC) mutasyonlarının ve kodon 59 (-A) delesyonunun β-talasemi allelleri ile transya da cis konumunda bulundukları ortaya çıkarılmıştır.Anahtar Kelimeler: Astım, ALOX5, Faktör XIII Eksikliği, Pirüvat Kinaz Eksikliği,Talasemi TaşıyıcılığıDanışmanı : Prof. Dr. Cihan Öner, Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi, BiyolojiBölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Beytepe, Ankara, Türkiye. Investigation of the Molecular Pathology of Some Genetic Disorders in TurkeyEsra BİRBENABSTRACTRecently, sequences of the many genes that cause genetic disorders have beenestablished by Human Genome Project. Now, it is possible to determine themutations which cause the disorders and perform the functional analysis of themutations by using these sequences. Molecular genetic studies have gained moreand more importance in our country as in the rest of the world . It is important toshow the genetic cause of the disorders for revealing more efficient treatmentmethods. In this study, determination of the molecular pathology of some geneticdisorders such as Factor XIII deficiency, pyruvate kinase deficiency, and geneticreasons of the normal HbA2 levels seen in some obligatory β thalassemiaheterozygotes and investigation of the genetic reason of asthma a multigenicdisorder which effects a lot of people all around the world as well as in Turkey,especially in developed countries were aimed.ALOX-5 (Arachidonate 5-lipoxigenase) mRNA expression and the leukotriene C4secretion of eosinophils as a function of ALOX5 promoter genotype have beeninvestigated in asthma patients. It has been shown that eosinophils from individualsbearing 2 copies of deletional variants expressed less ALOX-5 mRNA and secretedsignificantly lower concentrations of leukotriene C4 than cells from homozygous wild-type individuals.In this study five patients with Factor XIII deficiency were investigated. Four noveland one known mutations were identified. One of the novel mutation was C to Gchange in codon 541 results in change asparagine to lysine in protein sequence.Other novel mutation was a deletion of four nucleotides in repeat sequences(CAAACAAA) between codons 466-469. Other two novel mutations were 235LeuâArg change and a deletion of three nucleotides in exon14. C insertion incodon 400 was the known mutation. This study showed that mutation on Factor XIIIgene is distributed highly heterogeneously.Investigation of three unrelated patients who have pyruvate kinase enzymedeficiency revealed one novel missense mutation located at cDNA nt 1623 GâC(Lys541Asn) and three known mutations at 1456 CâT(Arg486Trp), 1528 CâT(Arg510End), and 1675 CâG (Arg559Gly) in these patients. All four mutations arelocated in C domain of the protein.Four parents of three unrelated families who are obligatory β thalassemiaheterozygotes and two parents with Hb Knossos were investigated to explain normalHbA2 levels shown in these patients. Examination of δ-globin gene by southern blot,restriction endonuclease analysis, and sequencing revealed the presence of the -7.2kb Corfu type deletion, codon 27 (GâT) and IVS-I-2 (TâC) mutations and thecodon 59 (-A) deletion in trans or cis with β-thalassemia alleles.Keywords: Asthma, ALOX5, Factor XIII Deficiency, Pyruvate Kinase Deficiency,Thalassemia TraitsAdvisor: Prof. Dr. Cihan Öner, Hacettepe University, Faculty of Science, BiologyDepartment, Molecular Biology Section, Beytepe, Ankara, Turkey. 141

TÜRKİYE'DEKİ HİPERKOLESTEROLEMİ ve PROPİYONİK ASİDEMİHASTALIKLARINA NEDEN OLAN GENETİK PATOLOJİLERİN BELİRLENMESİve ÖZGÜL MUTASYON ÇEŞİTLERİNİN GEN İFADELERİNİN ARAŞTIRILMASIMustafa Mert SÖZENÖZGenetik hastalıklar, DNA yapısındaki genlerde meydana gelen bozulmalar(mutasyonlar) sonucunda ortaya çıkan, çoğu zaman ölümcül olan ya da yaşamkalitesini azaltan anormalliklerdir. Bu tip hastalıkların kesin tanılarının konulabilmesive gerekli önlemlerin alınabilmesi için ilk olarak hastalığın moleküler düzeydeaydınlatılması gerekir. Bu tez çalışmasında, Türk toplumunda görülen üç ayrı genetikhastalığın moleküler temelleri üzerine araştırmalar yapılmış ve her bir hastalık ayrıkısımlar halinde ele alınmıştır. Bu hastalıklardan ailesel hiperkolesterolemi vepropiyonik asidemiye neden olan mutasyonlar DNA düzeyinde yapılan taramalarlaaraştırılmıştır. Ayrıca, üçüncü bir hastalık grubuna giren anormal hemoglobinhastalıklarının özgül bir tipine neden olan Hb Volga mutasyonun gen ifadesini neşekilde etkilediği mRNA düzeyindeki çalışmalarla incelenmiştir.Ailesel hiperkolesterolemi (AH, FH-Familial hypercholesterolaemia), lipoproteinmetabolizmasını etkileyen otozomal dominant bir hastalıktır. Hastalığın nedeni,çoğunlukla düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör geninde (LDLR) bulunan çeşitlimutasyonlardır. Bu tez çalışmasının birinci kısmında ailesel hiperkolesterolemihastalarının LDLR genindeki mutasyonları taramak için kapiler elektroforez DNAanaliz sisteminde uygulanabilecek yeni bir yöntem olan floresan-SSCP veheterodupleks tekniği (F-SSCP-HDX) geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntemkullanılarak, AH klinik tanısı konmuş olan 36 Türk pediatrik hastanın (20 homozigotve 16 heterozigot) LDLR geninde mutasyon taraması yapılmıştır. F-SSCP-HDXanalizlerinde farklı bant profili gösteren bölgelerin DNA dizi analizi yapılmıştır. Buanalizler sonucunda, hasta grubunda daha önceden bildirilmemiş olan on adet yenive daha önce bildirilmiş olan yedi adet bilinen mutasyon bulunmuştur. Çalışılan hastagrubunda ailesel hiperkolesterolemiye neden olduğu tahmin edilen allellerin %66,1'isaptanmıştır. Bu veriler, ailesel hiperkolesteroleminin Türkiye'deki genetikheterojenitesini ortaya koymuş ve F-SSCP-HDX tekniğinin mutasyon saptamak içinkullanışlı bir ön tarama yöntemi olduğunu göstermiştir.Propiyonik asidemi (PA), bazı amino asitlerin, bazı yağ asitlerinin ve kolesterolünkatabolizmasını etkileyen otozomal resesif bir kalıtsal hastalıktır. Propionil-CoAkarboksilaz enzimindeki (PCC, EC 6.4.1.3) bozukluklardan kaynaklanır. PCC'nin αve β alt birimlerini kodlayan PCCA ve PCCB genlerindeki mutasyonlar, PAhastalığına neden olur. Bu tez çalışmasının ikinci kısmında 8 adet Türk PAhastasının PCCB geninin ekzonları, ekzon-intron bağlantılarını da kapsayacakşekilde olası mutasyonlara karşı taranmıştır. Ön tarama yöntemi olarak gümüş nitratboyama ile görüntülenen SSCP yöntemi kullanılmış, farklı bant profili gösterenörneklerin DNA dizi analizi yapılmış, ancak bu genin incelemeye alınan bölgelerindehastalığa neden olabilecek her hangi bir nükleotit değişikliği saptanmamıştır.Anormal hemoglobinlere dayalı hastalıklar, globin zincirindeki amino asit değişikliklerisonucu ortaya çıkan bozukluklardır. Bu tez çalışmasının üçüncü kısmında, anormalbir hemoglobin varyantı olan Hb Volga'ya neden olan mutasyonun β-globin genininifadesi üzerine olan etkisi mRNA düzeyinde incelenmiştir. βHb Volga allelinden üretilenβ-cDNA'sındancDNA, gümüş nitrat ile boyanan poliakrilamid jelde HbAayrıştırılabilmiştir. βA/βHbVolga mRNA oranında dengesizlik görülmemiştir.Anahtar Kelimeler: Ailesel Hiperkolesterolemi, LDLR, Propiyonik Asidemi, SSCP, F-SSCP, Heterodupleks, Gen İfadesi, RT-PZR, Hb Volga.Danışman: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi, BiyolojiBölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı IDENTIFICATION OF GENETIC PATHOLOGIES WHICH CAUSE HYPERCHOLESTEROLAEMIA and PROPIONIC ACIDEMIA DISEASES IN TURKEY andINVESTIGATION OF GENE EXPRESSIONS OF SPESIFIC MUTATION TYPESMustafa Mert SÖZENABSTRACTGenetic diseases are abnormalities resulted from defects called mutations occurredin the genes which are specific DNA segments. These abnormalities usually give riseto death or decrease the quality of life. Genetic diseases must be identified atmolecular level for exact diagnosis. In this thesis study, three different geneticdiseases were investigated at molecular level in Turkish Population. The mutationscausing familial hypercholesterolaemia and propionic acidemia which are two ofgenetic diseases concerned in the first two parts were investigated by screening andgenotyping methods at DNA level. In the third part, effect on gene expression of themutation causing Hb Volga which belongs to the third group of genetic disorders(abnormal haemoglobin disorders) has been investigated at the mRNA level.Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder of lipoproteinmetabolism. In the majority of patients FH is caused by mutations in the gene for thelow-density lipoprotein receptor (LDLR). In the first part of this thesis study, a highthroughput single strand conformation polymorphism (SSCP) and Heteroduplexmethod (F-SSCP-HDX method) has been developed for detection of mutations in theLDLR gene. This method is appropriate for capillary electrophoresis DNA analysissystems. This method was used for screening of the LDLR gene in a group of 36Turkish paediatric FH patients (20 homozygous and 16 heterozygous) for mutations.DNA sequencing of the patients with different SSCP and/or HDX banding patternsshowed ten novel and seven known mutations in the LDLR gene of different patients.66,1 % of the predicted FH causing alleles in the patient group were detected. Thesedata confirm the genetic heterogeneity of FH in Turkey, and demonstrate theusefulness of F-SSCP for mutation detection.Propionic acidemia (PA) is an autosomal recessive inborn error in the catabolism ofsome amino acids, odd-numbered chain length fatty acids and cholesterol. PA iscaused by a deficiency of propionyl-CoA carboxylase enzyme (PCC, EC 6.4.1.3).Mutations in the PCCA or PCCB genes, encoding α and β subunits of propionyl-CoAcarboxylase respectively, result in propionic acidemia, a life-threatening inborn errorof metabolism with autosomal recessive inheritance. In the second part of this thesisstudy, the PCCB gene was screened for the mutations in a group of Turkish PApatients. SSCP method was used for pre-screening of each exon of the gene withtheir exon-intron boundaries. The fragments with different SSCP banding patternswere sequenced. No nucleotide changes were detected in this group of patients.Abnormal haemoglobin disorders are results of amino acid changes in the globinchain. In the third part of this thesis study, effect of the mutation causing an abnormalhaemoglobin variant Hb Volga on the β-globin gene expression was investigated atthe mRNA level. The cDNA produced from βHb Volga allele could be distinguished fromthe HbA β-cDNA on a polyacrylamide gel stained with silver nitrate. The resultsshowed there is no imbalance between βA/βHbVolga mRNA ratios.Key Words: Familial Hypercholesterolaemia, LDLR, Propionic Acidemia, SSCP, F-SSCP, Heteroduplex, Gene expression, RT-PZR, Hb Volga.Advisor: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe University, Faculty of Science,Department of Biology, Molecular Biology Section. 123

KALITSAL RETİNAL DEJENERASYONLARIN GENETİK ANALİZİCeren AcarÖZKalıtsal retinal dejenerasyonlar ve fonksiyon bozuklukları klinik ve genetikolarak, heterojen bir hastalık grubunu oluşturmaktadır. Bu gruptaki pek çokhastalık, çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin erken ölümlerine ve dolayısıylagörme kaybına neden olmaktadır. Bu tez çalışmasında, X'e bağlı RetinitisPigmentoza (XLRP), Leber Konjenital Amarozu (LCA) ve Güçlenmiş S-KoniSendromu (ESCS) olan hastalarda hastalıkların moleküler patolojisiaraştırılmıştır. Ayrıca XLRP'den birinci derecede sorumlu Retinitis PigmentozaGTPaz Regülatörü (RPGR) geniyle etkileşime giren gen ürünlerini yakalamakamacıyla yapılan maya-iki-hibrit deneylerinde retina cDNA kütüphanesi avolarak kullanılmıştır.Retinitis Pigmentoza (RP) fotoreseptör dejenerasyonu ile karakterize edilenretinal distrofilerin heterojen bir grubudur. RP, gece körlüğüne, periferik görmealanının giderek artan kaybına ve daha ileri aşamalarda ise merkezi görüşünortadan kalkmasına neden olur. Hastalık otozomal dominant (baskın), otozomalresesif (çekinik), X'e bağlı ya da digenik (iki gene bağlı) olarak kalıtılır. XLRP,retina dejenerasyonlarının en önemli formlarından biridir. XLRP için bu günekadar 5 gen bölgesi (genetik lokus) haritalanmıştır: RP2, RP3, RP6, RP23,RP24. Vakaların %70-90'ı RP3, %10-20'si ise RP2 bölgesi ile bağlantılıdır.RPGR genindeki mutasyonlar, XLRP'nin RP3 alt tipi ile bağlantılıdır. RPGR'deekzon 1-14 arasında mutasyonlar tanımlanmış olmakla birlikte, Avrupa veKuzey Amerika'daki XLRP vakalarının %50-60'ına RPGR geninin ORF15bölgesi mutasyonları neden olmaktadır. ORF15 mutasyonlarına ayrıca ailesindehastalık görülmeyen bireysel erkek hastalarda da rastlanılmıştır. Bu çalışmada,XLRP'nin patolojisinden sorumlu olan RPGR geninde, mutasyonların en sıkrastlandığı ORF15 bölgesi ve RP2 geninin tüm ekzonları, SSCP ve DNA dizianalizi yöntemleri ile taranmıştır. İncelen örneklerde nükleotit değişikliğinerastlanmamıştır.iLCA, çocukluk çağı körlüklerinin en yaygın kalıtsal nedenidir ve bir yaşınagelmeden ortaya çıkan şiddetli retinal distrofi ile karakterize edilmektedir. LCAile ilgili tanımlanmış altı gen bulunmakla birlikte, hastaların ancak yarısında bugenlerde mutasyon saptanmıştır. ESCS ise otozomal çekinik bir retinopatidir. Bukalıtsal hastalıkta fotoreseptörlerin fonksiyon kazandığı gözlenmektedir. Bu tezçalışmasında bilinen genlerde daha önce mutasyon taraması yapılmış olan 50LCA, 17 ESCS ve 1 atipik retinal dejenerasyon hastasında retinada ifade olantranskripsiyon faktörlerinden biri olan Nöral Retina Lösin Fermuarı (NeuralRetina Leucine Zipper-NRL) aday geninde mutasyon taramasıgerçekleştirilmiştir. Sadece bir örnekte wobble bazında nükleotit değişikliğibulunmuştur.Maya-iki-hibrit sistemleri, genlerin hangi yollarda görev aldığının bulunmasındakullanılan güçlü bir yöntemdir. Retinada, RPGR geninin hangi yollarda görevaldığının bulunması amacı ile retina cDNA kütüphanesi kullanılarak, hibrit avlarıgerçekleştirilmiştir. cDNA kütüphanesinin yetersizliği nedeni ile RPGR proteiniile etkileşime giren bir protein bulunamamıştır.Anahtar Kelimeler: Kalıtsal retinal dejenerasyonlar, X geçişli retinitis pigmentoza,açık okuma çerçevesi 15 (ORF15), maya-iki-hibrit, RPGR,RP2,NRLDanışman: Prof. Dr. Cihan Öner, Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi BiyolojiBölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalıii GENETIC ANALYSIS OF INHERITED RETINAL DEGENERATIONSCeren AcarABSTRACTInherited retinal degenerations and malfunctions constitute the clinically andgenetically heterogenous disease group. Many diseases in this group causeearly visual loss by the death of rod and cone photoreceptor cells. In this thesisstudy molecular pathology of the disease is searched in patients with X LinkedRetinitis Pigmentosa (XLRP), Leber Congenital Amaurosis (LCA) and EnhancedS-Cone Syndrome (ESCS). By using retina cDNA library as prey, yeast-two-hybrid experiments were also performed to detect the gene products thatinteracts with the RPGR gene product, which is the primary responsible genefrom XLRP.Retinitis Pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of retinal dystrophies that ischaracterized by photoreceptor degeneration. RP causes night blindness, agradual loss of peripheral visual fields and eventual loss of central vision. Thedisease can be inherited in autosomal dominant, autosomal recessive, X-linkedand digenic modes. XLRP is one of the severe forms of progressive retinaldegeneration. Five loci have been mapped for XLRP; RP2, RP3, RP6, RP23and RP24. Among these, RP3 accounts for 70%-90% and RP2 accounts for10%-20% of genetically identifiable disease. Mutations in the RPGR gene areassociated with RP3 subtype of XLRP. Mutations in RPGR have been identifiedin exons 1-14; however, ORF15 is the hot spot for mutations accounting for 50-60% of XLRP in Europe and North America. ORF15 mutations have also beendetected in simplex RP males. Here we study XLRP and the molecular analysisof RPGR and RP2 genes responsible for the disease condition. No nucleotidechange has been found in our patients.LCA is the most common inherited reason and it is characterized with severeretinal dystrophy before the first year of life. There are six described genesassociated with LCA, but mutations in these genes are detected in half of thepatients. ESCS is an autosomal recessive retinopathy. In this inherited diseaseiiigain of function of photoreceptors is observed. In this study mutation screeningis performed in Neural retina Leucine Zipper (NRL) candidate gene, which is atranscription factor expressed in retina, in 50 LCA, 17 ESCS and a atypicalretinal degeneration patients who were screened before for the known genes. Inonly one sample nucleotide change has been found in the wobble base.Yeast two hybrid systems are the most available systems for describing thegenetic pathways. To find out genetic pathways in which the RPGR gene takesplace in retina hybrid hunts are performed by using retina cDNA library.Because of the deficiency of the cDNA library no protein is found interacting withRPGR protein.Key Words: Inherited retinal degenerations, X linked retinitis pigmentosa, openreading frame 15 (ORF15), yeast-two-hybrid, RPGR, RP2, NRLAdvisor: Prof. Dr. Cihan Öner, Hacettepe University, Faculty of Science, Departmentof Biology, Molecular Biology Sectioniv 97

Türkiye'deki Nadir 0 Talasemi Mutasyonlarının Prenatal Tanıya Destek Amaçlı PCR-RFLP-Haplotip ve DNA Sekans Analizi ile Tayini Asım HOCAOĞLU OZ (3-Talasemiler otozomal resesif geçiş gösteren, hipokromik ve hemolitik anemi ile karakterize olan kan hastalıklarıdır. Talasemi hastalarında globin zincirlerini oluşturan genlerde nokta mutasyonu veya delesyon/insersiyon söz konusudur. Beta talasemi gibi henüz kesin tedavisi yapılamayan yaygın genetik hastalıkları önlemenin en etkin yolu, taşıyıcılarının belirlenmesi ve doğum öncesi tanının (prenatal tanının) konmasıdır. Yaptığımız çalışmada, prenatal tanıya destek amaçlı olarak Hacettepe Üniversitesi Pediatrik Hematoloji bölümünde Türk populasyonunda p-geni mutasyonları için taranan ancak mutasyonu bulunamadığı için tanısı konulamayan örnekler için DNA sekans analizi uygulanmış ve bu amaç doğrultusunda PCR, SSCP, RFLP, ARMS ve haplotip analizi teknikleri uygulanmıştır. Çalışmamız sonucunda, bir hastada IVS 1-130, bir hastada IVS I- 116, bir hastada Fscd 16, nadir mutasyonları tespit edilmiştir. Ayrıca Fscd 5 (-CT) mutasyonu saptanan bir hastanın diğer mutasyonu tespit edilemediği için p-gen ifadesi Rivörs transkripsiyon PCR tekniği (RT-PCR) ile çalışılmıştır. Anahtar kelimeler : Beta Talasemi, Prenatal Tanı, PCR, RFLP, Haplotip Analizi, DNA dizi analizi, Danışmanı : Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe Üniversitesi Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Beytepe, Ankara, Türkiye. Determination of Rare p Thalassemia Mutations in Turkey by PCR-PFLP- Haplotype and DNA Sequence Analysis to Contribute to the Prenatal Diagnosis. Asım HOCAO?LU ABSTRACT P-thalassemia is a otosomal recessive disease characterized by hypochromic and hemolytic anemia. Genes forming globine chains in patients with thalassemia, posses point mutations or deletion / insertion. The most effective ways to prevent widespread diseases which can not be treated yet are to determine the carriers and prenatal diagnosis. In our study, DNA sequence analysis was applied for the undiagnosed samples examined to support prenatal diagnosis for (3-gene mutations within Turkish population in University of Hacettepe, department of pediatric hematology. For this purpose, PCR, SSCP, PFLP, ARMS and haplotype analysis were used. According to our results, one patient has IVS 1-130, one patient has IVS 1-1 16 and one patient has Fsc 16. In addition, (3-gene expression of the one patient studied with RT-PCR because other mutation of the patient could not be determined. Keywords: Beta Thalassemia, Prenatal Diagnosis, PCR-SSCP-Haplotype Analysis, DNA Sequence Analysis. Advisor: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe University Depertmant of Biology, Molecular Biology Section, Beytepe, Ankara, Turkey. IV 120

KALITSAL HASTALIKLARDAN GILBERT'DE UGT VE OBEZİTE'DE BETA -3 ADRENERJİK RESEPTÖR GENLERİNİN MOLEKÜLER ANALİZİ İ. Çağatay Karaaslan ÖZ Obezite 21. yüzyılın en yaygın sağlık sorunlarından birisidir. Yeme alışkanlıklarındaki değişiklikler, değişen sosyoekonomik durum ve genetik etmenler obezitenin gelişmesinde önemli rol oynamaktadır. Obeziteye neden olan, tek genli kalıtım gösteren genlerin yanısıra bazı genlerin de obeziteye yatkınlığa yol açtığı bulunmuştur. Beta-3 Adrenerjik reseptör geni (ADRB3) de termogenezis ve lipolizis metabolik yollarında görev alan ve obeziteye yatkınlığa yol açtığı düşünülen aday genlerden birisidir. Bu tez çalışması kapsamında, ADRB3 geni üzerindeki bir polimorfizmin vücut kitle indeksi (VKİ) ile ilişkisi 155 hasta ve 116 normal Türk bireyde araştırılmıştır. Polimorfızm, polimeraz zincir reaksiyonu ve restriksiyon parça boyu polimorfizmi analiz yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda, ADRB3 polimorfizmi ile VKİ arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunamamıştır (p0,05). Gilbert syndrome is a moderate disease which causes high bilirubine level in serum depending on the decrease in synthesis of UDP- glucuronosyltransferase enzyme. In literature it is mentioned that high bilirubin level is related to a polymorphism in the promotor region of the enzyme's coding gene (UGT1A1). Existence of this polymorphism is searched by polymerase chain reaction based denaturated gel electrophoresis method in 45 affected and 21 normal individuals. The frequency values between two groups is found to be close. This research carried out with Turkish population will provide a base for further studies. Keywords: ADRB3, UGT1A1, obesity, Gilbert syndrome, polymorphism,VKl, bilirubine Advisor: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe University, Department of Biology, Molecular Biology and Genetic Section 86

öz BASİT DİZİLİM TEKRAR DNA BELİRLEYİCİLERİ KULLANILARAK EKMEKLİK BUĞDAYLARIN GENETİK İLİŞKİLERİNİN SAPTANMASI Büyükünal-Bal, Emel Banu Ph.D. Department of Biotechnology Tez yöneticisi: Doç. Dr. Mahinur. S. Akkaya Ortak tez yöneticisi: Prof. Dr. Cihan Öner Ocak 2001, 143 sayfa Basit Dizilim Tekrar DNA' lan (BDTD) ya da mikrosatelitler Polimeraz Zincir Reaksiyonuna dayalı en güçlü DNA belirleyicilerinden biridir. Bununla birlikte BDTD primerlerinin dizaynı DNA dizisinin bilinmesini gerektirir. Bu ise çoğu zaman geleneksel yöntemler yardımıyla oluşturulan genomik DNA kütüphanelerinin oluşturulmasıyla sağlanabilir. Ancak son zamanlarda, BDTD' ler kütüphane oluşturulması öncesindeki zenginleştirme aşamalarıyla elde edilmektedir. Bu çalışmada, BDTD'ların bir Türk ekmeklik buğdayı olan 'Gerek-79''dan izolasyon çalışmaları hem geleneksel, hem de zenginleştirme metodları kullanılarak verilmiştir. Ancak yeni BDTD' lar elde edilememiştir. Bununla birlikte, Türkiye'de yetiştirilen 1 1 ekmeklik buğday arasındakigenetik ilişki saptanmıştır. Literatürde oldukça polimorfik olduğu belirtilen 19 buğday BDTD'sı kullanılarak, 11 ekmeklik buğday populasyonuna ait 65 genotip arasındaki ve içindeki çeşitlilik çalışılmıştır. BDTD verilerinden alel uzunluklarına, populasyonların alel frekanslarına ve genotiplere dayalı olarak üç farklı data matriksi hazırlanmıştır. Bu matriksler genetik ilişkileri temsil eden 'Nei 72' ve 'Euclidean' uzaklıklarına bağlı 'UPGMA' dendogramları ile 'Euclidean' uzaklığına bağlı standart koordinat analizi grafiklerinin oluşturulmasında kullanılmıştır. Bununla birlikte, yulaf BDTD' lerinin yulaf haritalama çalışmalarındaki uygunluğu saptanmıştır. Yulaf BDTD` lan önceden hazırlanan zenginleştirilmiş yulaf genom ik DNA kütüphanelerine ait BDTD klonlarından veya literatürden elde edilmiştir. Ellisekiz yulaf ve yirmi dokuz arpa BDTDMarı haritalama populasyonun ebeveynlerinde test edilmiştir. Son olarak, oldukça polimorfik iki arpa BDT belirleyicisinin, buğdayda parmakizi analizi amacına yönelik kullanılması test edilmiştir. Anahtar kelimeler: BDTD, DNA belirleyici, genetik ilişki, buğday, yulaf. vı ABSTRACT GENETIC RELATIONSHIP ANALYSIS OF BREAD WHEAT VARIETIES BY USING SIMPLE SEQUENCE REPEAT MARKERS Büyükünai-Bal, Emel Banu Ph.D. Department of Biotechnology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Mahinur. S. Akkaya Co-supervisor: Prof. Dr. Cihan Öner January 2001, 143 pages Simple Sequence Repeats (SSRs) or microsatellites are one of the most powerful Polymerase Chain Reaction-based DNA markers. On the other hand, designing of SSR primers requires sequence information. Most of the time, this requirement can be achieved by generation of a genomic DNA library by the means of traditional methods. Recently, SSRs are obtained by including enrichment steps prior to library construction. In this study, attempts for development of SSRs markers from a Turkish bread wheat variety 'Gerek-79' by using both traditional and enrichment-based methods have been presented. Unfortunately, generation of new SSRs could not been achieved. Also, assessment of genetic relationship of bread wheat varieties well adapted to grow in Turkey mwas performed. Sixty-five genotypes from 1 1 bread wheat varieties were used for -intra and -inter polymorphism analysis with 19 highly polymorphic wheat SSRs available in the literature. Three different types of matrixes based on allele sizes, allelic frequencies for populations, and individual genotypes were prepared from SSR data. Later, these matrixes were utilized to construct 'Nei 72' and 'Euclidean' distances based UPGMA dendograms and 'Euclidean' distances based Principle Coordinate Analysis plots, which represent genetic relationship. Moreover, applicability of available oat SSRs for mapping was detected. Oat SSRs were either obtained from SSR containing clones from previously constructed genomic libraries or published earlier. Fifty-eight oat SSRs and 29 barley SSRs were tested in both parents of a segregating population. Finally, two highly polymorphic barley SSR primers were tested for fingerprinting applications in wheat. Key Words: SSR, DNA marker, genetic relationship, wheat, oat. IV 143

m ÖZET insan mitokondri DNA'sı (mtDNA) 16,569 baz çifti uzunluğunda, kapalı dairesel, çift zincirli bir moleküldür ve oksidatif fosforilasyon için gerekli protein alt birimlerinden onüçüne ait genler ve bu genlerin ekspresyonu için gerekli rRNA ve 22 adet tRNA genlerini içerir. Çekirdek DNA'sından bağımsız replike olması, maternal kalıtım göstermesi, replikatif segregasyon özelliğine sahip olması, mtDNA'sının eşik değerdeki ekspresyonu ve evrim hızının çekirdek DNA'sından daha fazla olmasından dolayı, mtDNA genetiği çekirdek DNA genetiğinden büyük farklılıklar göstermektedir. Son yıllarda moleküler biyolojide geliştirilen teknikler sayesinde, çekirdek genomu ile çalışmaların yanı sıra mtDNA'sı da çok çalışılmaya başlanmıştır. Bu çalışmalar hem mitokondriyal hastalıklara neden olan mutasyonların saptanması şeklinde, hem de toplumlarda mtDNA'sı üzerindeki polimoriîk nükleotJd dizilerinin araştırılmasına dayanan arkeolojik ve evrimsel çalışmalar şeklinde görülmektedir. Bu tez çalışmasının amacı; 1. pekçok Avrupa, Asya, Afrika ve Amerika toplumunda yapılan ve mtDNA'sının translasyona uğramayan ve mutasyon oranı çok yüksek olan mtDNA D-loop bölgesinde ortaya çıkan dizi çeşitliliğinin araştırılmasını kapsayan çalışmaların Türk toplumunda yapılması ve Türk toplumundaki mtDNA dizi çeşitliliğinin araştırılması, Türk toplumundan elde edilen verilerin diğer toplumlardan elde edilen verilerle karşılaştırılması, 2. mitokondriyal hastalık şüphesi taşıyan kişilerde hastalığa belirli bölgedeki mitokondriyal mutasyonların neden olup olmadığının araştırılmasıdır. Türk toplumundaki mtDNA'sı D-Loop bölgesindeki dizi çeşitliliğinin araştırılması için, Türkiye'nin 5 farklı coğrafik bölgesinden (doğu, batı, güney, orta ve kuzey Anadolu olmak üzere) en az 14'er kişi olmak üzere toplam 75 kişiden alınan örneklerde DNA dizi analizi yöntemi ile mtDNA'sındaki polimorfık noktalar saptanmıştır. D-loop bölgesinde, yaklaşık 600 baz çifti (bç) uzunluğundaki değişken bölgelerin dizi analizi yapılmıştır. Türk toplumuna aitIV Neighbour-Joining filogenetik ağacı PHYLIP 3.5c bilgisayar programında bulunan NEIGHBOUR programı kullanılarak çizilmiştir. Sekanslar arasındaki genetik uzaklık, `Kimura two parameter distance method-Kimura iki parametreli uzaklık metodu` kullanılarak, gruplar arasındaki genetik yapı ise ARLEQUIN paketindeki `Molecular Variance Analysis Programı- Moleküler varyans analiz programı` (AMOVÂ) ile incelenmiştir Yapılan çalışma sonucunda, Türkiye genelinde mtDNA dizi çeşitliliği açısından heterojen bir yapı olduğu gözlenmiştir. Türkiye'deki coğrafik bölgelerde mtDNA D-loop bölgesindeki çeşitlilikte özgüllük görülmemiştir. Hiçbir bölge kendi içinde ayrı bir haplogrup oluşturmamaktadır. Daha önce diğer toplumlar üzerinde yapılan benzer çalışmalara ait sekans verileri ile, Türk toplumundan elde edilen verilerin karşılaştırılması sonucu ise, Avrupa ve Asya kıtalarına özgül olduğu bilinen haplogruplarTürk toplumunda da görülmüştür. Tez kapsamında yapılan diğer çalışmalarda ise mitokondriyal hastalık şüphesi taşıyan kişilere ait örneklerde Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR), Restriksiyon Fragment Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP) ve Southern blot teknikleri ile mtDNA mutasyonları taranmıştır. Mitokondriyal hastalık şüphesi taşıyan toplam 95 bireyden alınan kan ve doku örneklerinde Southern blot analizi ile mtDNA delesyonları araştırılmıştır. İncelenen hiçbir hastada mtDNA delesyonuna rastlanmamıştır. Ayrıca diyabet hastalığı ile ilişkili olduğu bilinen mtDNA tRNALeu geninin 3243. pozisyonunda ortaya çıkan A-^G mutasyonu PCR ve RFLP teknikleri kullanılarak araştırılmıştır. Tez çalışması kapsamında 53 insüline bağımlı olmayan (NIDDM) ve 47 insüline bağımlı olan (IDDM) diyabetli hastaya ait DNA örnekleri mtDNA 3243 A-»G mutasyonu ve 10.5 kb'lık delesyon açısından taranmıştır, incelenen örneklerde söz konusu mutasyonların bulunmaması, Türk toplumunda gözlenen Diabetes mellitus hastalığının etiyopatolojisirıde mtDNA 3243 A-*G mutasyonu ve 10.5 kb'lık delesyonun bir rolü olmadığı sonucunu ortaya çıkarmıştır. ABSTRACT Human mitochondrial DNA (mtDNA) is a double stranded, closed circular molecule of 16,569 base pair in length and contains 13 genes coding for protein subunits which are necessary for oxidative phosphorylation and rRNA and 22 tRNA genes which are necessary for expression. Mitocohndria! DNA genetics differs from nuclear DNA with its independent replication, maternal inheritance, replicative segregation, threshold expression and faster evolution rate than nuclear DNA. In recent years due to the techniques developed in molecular biology, the studies on mitochondrial DNA (mtDNA) as well as nuclear DNA have increased with utmost interest. These studies have been concentrated on both the identification of mtDNA mutations causing mitochondrial diseases and evolution of the population genetics and archeological studies based on the polymorphic nucleotide changes. The aim of this study was; 1. to detect polymorphic sequence variations of the non-coding D-loop region of the mtDNA which is characterized with the high mutation rate in Turkish population and also to compare the results obtained from the mtDNA gene pool of Turkish population to the various European, Asian, African and American populations. 2. to screen the notorious mitochondrial gene mutations in the patients who are suspected having the mitochondrial diseases. Total of 75 DNA samples from the individuals whose at least 14 of than from 5 different geographical regions of Turkey (eastern, western, northern, southern and central part of Turkey) have been sequenced to determine the nucleotide differences in the D-loop region of mtDNA in Turkish population. Sequencing region was limited for approximately 600 bp hypervariable regions of D-loop. The Neighbour-Joining tree of Turkish poulation was performed by using the NEIGHBOUR programme in PHYLIP 3.5c computer programme. Genetic distances between the sequences were calculated by `Kimura two parameterVI distance method` and genetical structures of the groups were analyzed by `Molecular Variance Analysis Programme` (AMOVA) in ARLEQUIN computer programme. This study indicated the presence of the heterogenous distrubiton of the mitochondrial genetic variations throughout Turkey. There is no genomic differentiation between the geographic regions of Turkey. None of the regions have their own specific haplotypes. Comparing the data obtained from Turkish population to the previous studies those were performed on the other populations has shown that Turkish population has close similarity to mitochondrial genetic structures observed in both European and Asian populations. The haplogroups which are specific for the European and Asian groups are also seen in Turkish population. In this study, the screening of the known mtDNA mutation was performed by using PCR, RFLP, and Soutiiern blot hybridization techniques. Total of 95 blood and tissue samples from the individuals who are suspected having the mitochondrial diseases were evaluated. Any mutation was not detected in any of the studied samples. The mtDNA 3243 A-»G mutation which is attributed to the Diabetes mellitus was also investigated by using PCR and RFLP techniques. We have screened 53 patients with non- insuline-dependent-diabetes mellitus (type II, NIDDM) and 47 patients with insuline- dependent-diabetes mellitus (type I, IDDM) for this mutation and also for 10.5 kb deletion. The absence of these mutations in all studied patients with Diabetes mellitus supports the evidence that there is no significant relation between the mtDNA mutations and Diabetes mellitus. 129

Ill ÖZET Revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile mRNA analizi bir çok globin geninin ifsdesinin ölçülmesinde çok önemli işlevi olan bir tekniktir. Bu tekniğin, Gyve Ay genlerinin mRNA ürünlerinin oranlarının ölçülmesinde, (5 talasemi durumunda P ve y genlerinin, orak hücre anemide ps ve pA mRNA'larımn oranlarının ölçülmesinde, kararlı olmayan hemoglobin hastalıklarında ve HbE heterozigotlarmda da uygulanması ile de önemli sonuçlar elde edilmiştir. Benzer sonuçlar alfa globin varyantlarına ve bazı alfa talasemilere yapılan uygulamalarla da elde edilmiştir. Bu çalışmada; a) beta talasemiye neden olan çeşitli intron, ekson, promotor ve 3TJTR bölge mutasyonlannın, b) moleküler gen organizasyonları delesyonal a-thal-1 (--/ ) ile birlikte ya a-thal-2 (3.7 ve 4.2 kb delesyon) ya da delesyonal olmayan (nokta mutasyonu taşıyan) alellerin oluşturduğu hastaların durumu, c) trizomi-8 (47 XY+8) genotipine sahip miyelodisplastik sendromlu bir hastada Hb F miktarındaki yükselmenin moleküler temeli, a/p, y/p mRNA oranları ile mRNA'larının sentez düzeyleri belirlenerek genetik ifade özellikleri araştırılmıştır. Bu çalışmanın sonuçlan ile talasemiye neden olan mutasyonların meydana getirdiği çeşitli gen yapılarındaki a2 ve al genlerinin ifadelerin göreceli olarak normal P geninin ifadesi ile etkileşimleri kıyaslanarak a/p run 1 : 1 oranlarındaki değişimlerinin moleküler mekanizması, mRNA düzeyindeki bilgilerle gösterilmiştir. Aynı zamanda, embriyonik ve fötal dönemde aktif olan, fakat yetişkin dönemde ifade edilmeyen y genlerinin farklı mutasyon tiplerindeki ifade düzeylerinin, mRNA sentez oranlan belirlenerek doğrudan ölçülmesi hedeflenmiştir. Diğer yandan (a2+al)/p- mRNA oranlannın bu genlerin ifadelerinin ölçülmesi ile elde edilen bulgular çeşitli hastalarda gözlenen farklı tipteki fenotipik özellikleri yönünden kıyaslanarak fenotip- genotip ilişkisi araştırılmıştır.IV Sonuç olarak, RT-PCR tekniği kullanılarak a ve P globin genlerinin mRNA düzeyindeki gen ifadelerinin incelenmesinin, hem talasemi hastalığının teşhisi, hem de mutasyonun etki mekanizmasının belirlenmesi için bir çok yönden avantajlı bir yöntem olduğu gösterilmiştir. 1. RT-PCR ekonomik, hızlı ve etkin bir yöntem olmasından ötürü, a- ve P- talasemi taramalarında DNA analizleri yerine kullanılabilecek bir yöntemdir. 2. Bu yöntem kullanılarak, P-talasemiye neden olan çeşitli mutasyonların ne şekilde etkili olduğu gösterilebilmiştir. 3. RT-PCR tekniğinin, ökaryotik gen ifadesinin düzenlenmesi konusunda en iyi çalışılmış olan ve fenotip-genotip korelesyonu belirlenmiş mutasyonu bilinmiş ve mutasyonu bilinen (promoter, başlama kodonu, intron, ekson, poly A...) 200'den fazla hemoglobin a ve p genlerine uygulanması ile yeni bilgilere ulaşmak mümkün olmuştur. Teknik, bu bakımdan da ayrı bir öneme sahiptir. ABSTRACT Messenger RNA ( mRNA analysis by reverse transcriptase-polymrase chain reaction (RT-PCR) is a powerful technique for measuring of several globin gene expressions. Previously, some important results have been obtained by determinating the relative quantities in P thalassemia major with spesific genotypes.This technique was applied also measuring the relative levels of ps to pA in sickle cell anemia and mRNA ratio of several unstable abnormal P globin chains and Hb E to pA Similar studies have been applied for alpha gene transcripts in alpha thalassemias and abnormal chain variants. In this study, the level of mRNA synthesis were determined by measuring the mRNA ratio of a/p and y/p globin genes and thus the differences in the globin gene expression level were investigated in a group of thalassemia patient with the following abnormal genotype; a) Beta thalassemia patients who carry the mutations within the intron, exon, promoter and 3' UTR region of the P globin genes, b) Patients bearing the deletional form of a-thal-1 (- / ) associated with a-thal-2 (With 3.7 and 4.2 kb deletion) or non-deletional a-thalassemia (with a point mutation), c) A myelodisplastic patient with a trisomy in chromosome 8 (47 XY+8) associated with increased level of hemoglobin F. In this study, the molecular mechanism of deviation from 1:1 ratios of a/p globin chains was evaluated at mRNA level by comparing the expressions of all al and a2 genes to P gene in various gene structures caused by thalasemic mutations. At the same time, it was aimed to measure the expressional levels of y genes which are active in embriyonic and fetal life but not in adult stage by determining the mRNA synthesis ratios in different course of P-thalassemia. On the other hand, phenotype-VI genotype correlation has been investigated by comparing the (al+a2)/ P mRNA ratios in thalassemia patients carrying the different types of mutations. This study has shown that the investigation of the expression of a- and p- globin genes at mRNA level by RT-PCR techniqueis very anvantageous for both the diagnosis of thalassemia and the determination of molecular mechanism of different mutations. As conclusion 1. Since the RT-PCR is an economic, fast and efficient method, it can be used for screening of the a- and P- thalassemia allels instead of conventional DNA analysis methods. 2. It is possible to show the molecular mechanism of various type of mutations cousing P-thalassemia using this technique. 3. Informational knowledge of the RT-PCR results obtained from the comparasional analysis between the well documented a- and P-globin gene mutations (including the promoter, iniciation codons, intron, exon, poly A regions) and phenotypical aspects of their clinical picture may be applied to study the expressional analysis of another specific gene. Therefore, this technique has another importance in this respect too. 131

ÖZET Komplemanın alt komponentlerinden biri olan Cıq'nun selektif komple eksikliği, tekrarlayan enfeksiyonlar ve sıklıkla lupus eritamatosusa benzeyen semptomatoloji ile karakterize olan nadir bir genetik defektir. Otozömal resesif bir geçiş gösterir. Defektin homozigot olduğu kişilerde komplemanın hemolitik aktivitesi ( CH50 testi ) sıfır olup, immünokimyasal tayinlerde d,, seviyesi normaldekinin %2'si civarındadır. Heterozigotlarda komplemana ait fonksiyonel ( CH5o testi ) ve immünokimyasal testler normal bulunmaktadır. Bu kişiler tamamen normal bir fenotip göstermektedir. Literatürde yayınlana 37 homozigot vakadan 8'i ülkemizdeki 5 ailede tanımlanmıştır. Literatürde genetik düzeyde incelenen Cu, ailelerinin tümünde, defektlerin terminasyon kodona neden olan tek baz mutasyonu. frameshift veya aminoasit değişiminden ileri geldiği ve başka aberasyonların bulunmadığı gösterilmiştir. İlk defa Slovak Cumhuriyeti'nden bir çingene (Gypsy) ailesinde, Ckl A geninde bir stop kodona neden olan belirli bir mutasyonun tanımlanmasından sonra,Türkiye'de incelenen 4 selektif komple Clq eksikliği ailesinde de benzeri mutasyonun bulunduğu saptanmıştır. Bu son gözlemler bize Güneydoğu Avrupa ve Türkiye halklarının Clq A geninde bu tipten defektif bir alleli taşıyabileceğini düşündürmüştür. Cıq A genindeki mutasyonu arayarak, popülasyonda heterozigot taşıyıcıları saptamayı amaçlayan bu çalışmada sekiz ayrı pediatri departmanının polikliniklerinde görülen 989 hasta, daha önce selektif komple Clq eksiliği saptanan 3 ailenin 124 bireyi, bunların yaşadığı yöre halkından toplanan 223 örnek ve 89 SLE'li hastanın Guthrie kartlarında toplanan kan örnekleri incelenmiştir. Daha önce geliştirilen yeni bir polimeraz zincir reaksiyon-IV restriksiyon fragment length polimorfizm (PCR-RFLP) analizi ve allel spesifik PCR testi ile taranan total 1425 örnek içinde hasta ailelerinin geldiği yöre halkında 1 heterozigot ve defekt olduğu bilinen ailelerde de total. 17 heterozigot saptanmış, sonuçlar DNA sekans analizi ile teyid edilmiştir. Ayrıca bu kişilere gereken genetik tavsiye verilmiştir. Yaptığımız bu çalışma Türk halkında Cıq A gen mutasyonunun mevcut olduğunu desteklemektedir. Clq eksikliği semptomatolojisiyle başvuranlarda ve bunların aile bireylerinde laboratuarımızda geliştirilen PCR-RFLP yöntemi ile birlikte allel spesifik PCR testinin uygulanması ileride yeni heterozigotların tanısına yardımcı olacaktır. ABSTRACT Complete selective C1q deficiencies of the complement component Ciq are rare genetic disorders that are associated with recurrent infections and a high prevalence of lupus erythematosus-like symptoms. The inheritance of the defect is autosomal recessive. In individuals with homozygous Cjq deficiency, the hemolytic activity of serum (CH5otest) is zero and serum Ciq level is less than %2 that of the normal serum by immunochemical analysis. Functional and immunochemical tests for Ciq are normal in heterozygotes who are normal phenotypically. In the literature 8 of the 37 published homozygous cases derive from 5 Turkish families. All Cq deficiencies studied at the genetic level revealed single base mutations leading to termination codons, frameshift or aminoacid exchanges and these were thought to be responsible for the defects as no other aberrations were found. One particular mutation, leading to a stop codon in the Ciq A gene was first identified in members of a Gypsy family from the Slovak Republic. The same mutation has been found in all cases in five Ciq deficiency families from Turkey. These observations prompted us to hypothesize that one particular defective allele is present in the population of Southeast Europe and Turkey. This study was aimed to investigate mutations in Ciq A gene for carriers (heterozygotes) in the Turkish population. Blood samples were collected into Guthrie cards from 989 patients seen in the outpatient clinics of 8 different Pediatric deparments in Turkey. Also 124 blood specimens were obtained from the relatives of the 3 families with selective complete Ciq deficiency, 223 specimens from the areas where these families lived, 89 specimens from 89 SLE patients. With the use of a novel polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis and allele spesific PCR we were able to detect 1 heterozygotes among the population of the areas where these families lived and 17 heterozygotes in the familiesVI with known selective complete Ciq deficiency. Mutations were confirmed by sequence analysis. In all heterozygotes.a genetic counceling was given. This study confirms that mutation of the Ciq A gene exists in Turkish population. The use of PCR-RFLP method along with allele-specific PCR might be helpful in diagnosing heterozygotes in individuals presenting with typical symptomatology of this defect and in their relatives. 104

V ÖZET İnsan mitokondri DNA' 3i (mtMA) 16569 baz çifti (bç) büyüklüğünde, kapalı dairesel, çift zincirli, bir moleküldür. Son yıllarda insan mitokondri MA* sı evrim çalışmaları, adli tıp, ve akrabalık ilişkilerinin tesbiti için yapılan çalışmalar ve özellikle mtMÂ' sında ortaya çıkan mutasyonlarla bağlantılı olan aitokondriyal hastalıkların incelenmesi için araştırma konusu olmak tadır. Bu tez çalışması kapsamında, ırklara batta bireylere göre özgüllük gösteren mtMÂ' sı D-loop bölgesi Polimeraz Zincir Beaksiyonu (PCS) ile çoğaltılarak, restriksiyon endonûkleaz analizi ve MÂ dizi analizi yöntemleri ile incelenmiştir. Ayrıca Diabetes mellitus, kardiyomyopati, ienal tubular asidozis hastalıkları ve Pearson sendromu taşıyan bireylerin mtMA' lan Southern blot analiziyle incelenerek delesyon olup olmadığı araştırılmıştır. Yapılan bu tez çalışması ile, B-loop bölgesindeki mutasyonlarm varlığı, varsa bu mutasyonlarm Türk populasyonuna özgül olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar, mitokondriyal MA hastalıkları, Türk populasyonunun evriminin araştırılması ve adli tıpta önemli olan MA parmak izi uygulamaları ile ilgili ileride yapılması düşünülen araştırmalar için gerekli yöntemleri işler hale getirmiş ve bir temel oluşturmuştur. ABSTRACT The double stranded, closed circular human mtDNA is a molecule of 16569 bp length. Recently, the studies on human mtDNA are concentrated on evolution researchs, forensic medicine and the determination of relationship. The mitochondrial diseases related to mutations found in mtDNA are also the subject of the studies. In this dissertation, the D-loop region in mtDNA which is specific to races and even to individuals is studied with polymerase chain reaction, restriction endonuclease analysis and BHA sequencing analysis techniques. The ittBHA of the individuals with diabetes mellitus, cardiomyopathy diseases and Pearson syndrome, are investigated by Southern blot analysis in order to determine whether there is a deletion or not. The purpose of this study is to detect the mutations in the D- loop region and to determine the specif ity of these mutations to Turkish population. This dissertation will be a basis for future researchs for the mtBIA diseases, the application of DNA finger printing technique in forensic medicine and evolution of mtDNA in Turkish population. 73