Search

Production of polyhydroxyalkanoates (PHA), microbial biopolyesters, employing extremophilic microorganisms is a very promising concept relying on robustness of such organisms against microbial contamination, which provides numerous economic and technological benefits. In this work, we took advantage of the natural susceptibility of halophilic and thermophilic PHA producers to hypotonic lysis and we developed a simple and robust approach enabling effective isolation of PHA materials from microbial cells. The method is based on the exposition of microbial cells to hypotonic conditions induced by the diluted solution of sodium dodecyl sulfate (SDS) at elevated temperatures. Such conditions lead to disruption of the cells and release of PHA granules. Moreover, SDS, apart from its cell-disruptive function, also solubilizes hydrophobic components, which would otherwise contaminate PHA materials. The purity of obtained materials, as well as the yields of recovery, reach high values (values of purity higher than 99 wt.%, yields close to 1). Furthermore, we also focused on the removal of SDS from wastewater. The simple, inexpensive, and safe technique is based on the precipitation of SDS in the presence of KCl. The precipitate can be simply removed by decantation or centrifugation. Moreover, there is also the possibility to regenerate the SDS, which would substantially improve the economic feasibility of the process.

Extremophilic microorganisms are considered being very promising candidates for biotechnological production of various products including polyhydroxyalkanoates (PHA). The aim of this work was to evaluate the PHA production potential of a novel PHA-producing thermophilic Gram-positive isolateAneurinibacillussp. H1. This organism was capable of efficient conversion of glycerol into poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB), the homopolyester of 3-hydroxybutyrate (3HB). In flasks experiment, under optimal cultivation temperature of 45 degrees C, the P3HB content in biomass and P3HB titers reached 55.31% of cell dry mass and 2.03 g/L, respectively. Further, the isolate was capable of biosynthesis of PHA copolymers and terpolymers containing high molar fractions of 3-hydroxyvalerate (3HV) and 4-hydroxybutyrate (4HB). Especially 4HB contents in PHA were very high (up to 91 mol %) when 1,4-butanediol was used as a substrate. Based on these results, it can be stated thatAneurinibacillussp. H1 is a very promising candidate for production of PHA with tailored material properties.

Aneurinibacillussp. H1 is a promising, moderately thermophilic, novel Gram-positive bacterium capable of the biosynthesis of polyhydroxyalkanoates (PHA) with tunable monomer composition. In particular, the strain is able to synthesize copolymers of 3-hydroxybutyrate (3HB), 4-hydroxybutyrate (4HB) and 3-hydroxyvalerate (3HV) with remarkably high 4HB and 3HV fractions. In this study we performed an in-depth material analysis of PHA polymers produced byAneurinibacillussp. H1 in order to describe how the monomer composition affects fundamental structural and physicochemical parameters of the materials in the form of solvent-casted films. Results of infrared spectroscopy, X-ray diffractometry and thermal analysis clearly show that controlling the monomer composition enables optimization of PHA crystallinity both qualitatively (the type of the crystalline lattice) and quantitatively (the overall degree of crystallinity). Furthermore, resistance of the films against thermal and/or enzymatic degradation can also be manipulated by the monomer composition. Results of this study hence confirmAneurinibacillussp. H1 as an auspicious candidate for thermophilic production of PHA polymers with material properties that can be tuned together with their chemical composition by the corresponding adjustment of the cultivation process.

The terpolymer of 3-hydroxybutyrate (3HB), 3-hydroxyvalerate (3HV), and 4-hydroxybutyrate (4HB) was produced employing Cupriavidus sp. DSM 19379. Growth in the presence of -butyrolactone, -caprolactone, 1,4-butanediol, and 1,6-hexanediol resulted in the synthesis of a polymer consisting of 3HB and 4HB monomers. Single and two-stage terpolymer production strategies were utilized to incorporate the 3HV subunit into the polymer structure. At the single-stage cultivation mode, -butyrolactone or 1,4-butanediol served as the primary substrate and propionic and valeric acid as the precursor of 3HV. In the two-stage production, glycerol was used in the growth phase, and precursors for the formation of the terpolymer in combination with the nitrogen limitation in the medium were used in the second phase. The aim of this work was to maximize the Polyhydroxyalkanoates (PHA) yields with a high proportion of 3HV and 4HB using different culture strategies. The obtained polymers contained 0–29 mol% of 3HV and 16–32 mol% of 4HB. Selected polymers were subjected to a material properties analysis such as differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry, and size exclusion chromatography coupled with multi angle light scattering (SEC-MALS) for determination of the molecular weight. The number of polymers in the biomass, as well as the monomer composition of the polymer were determined by gas chromatography.

Bakalárska práca sa zaoberá využitím osmotického stresu ako nástroja evolučného inžinierstva PHA produkujúcich bakteriálnych kmeňov. Cieľom práce je posúdiť využiteľnosť adaptácie mikroorganizmov na hypoosmotické prostredie ako inžinierskeho nástroja na ovplyvnenie efektivity biosyntézy PHA. Teoretická časť práce sa zaoberá princípom evolučného inžinierstva, metódami tejto stratégie a vplyvom fyzikálnych faktorov na mikroorganizmus. V rámci experimentálnej časti bol realizovaný experiment adaptívnej laboratórnej evolúcie s využitím bakteriálneho kmeňa Halomonas halophila CCM 3662. Ako stresový faktor počas sériovej kultivácie bol aplikovaný osmotický tlak v podobe zníženej koncentrácie soli v produkčnom médiu. Za účelom vyvinutia PHA produkujúcich adaptovaných mutantných kmeňov boli jednotlivé pasáže analyzované pomocou metód spektrofotometrie, gravimetrie a GC-FID. Na základe výsledkov dlhodobej kultivácie bol zistený adaptačný potenciál kmeňa HH35, kultivovaného pri 35 g/l NaCl, u ktorého obsah biomasy a koncentrácia PHB vykazovali najvyššie hodnoty. Z jednotlivých generácií kmeňa HH35 bola pre podrobnejšiu analýzu vybraná 15. pasáž a 30. pasáž, ktoré spolu s kontrolným divokým kmeňom H. halophila, boli podrobené hyperosmotickému a hypoosmotickému šoku. Pomocou metód FC a TGA bola sledovaná stresová odpoveď bakteriálnych kmeňov, v snahe zistenia viability buniek či potenciálnych morfologických zmien. Vyizolované polyméry boli charakterizované FTIR analýzou., This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.

Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen., This bachelor thesis is focused on stress resistance of PHA accumulating bacteria against unfavourable conditions associated with gastrointestinal tract. Two bacterial strains were chosen as model microorganisms for this purpose. Cupriavidus necator H16 producing PHA and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 without the ability of PHA accumulation. Firstly, three gastrointestinal juices of different concentrations were chosen for the experimental part, namely gastric, bile and pancreatic juices. The stressed bacterial strain was then determined using a spread plate method and a flow cytometry. Other methods used include antimicrobial tests. The agar diffusion method was first tested to determine the size of the inhibition zones. The last method that has been performed is the broth dilution method, which serves to compare the absorbance of pure bacterial suspensions and stressed suspensions with the given juice of a certain concentration. The results show that the production of PHA represents a disadvantage in context of conditions associated with gastrointestinal tract of accumulating bacterial strain.

Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu., This bachelor's thesis is focused on investigating the effect of different stress factors on the bacteria Schlegelella thermodepolymerans, which is capable of producing polyhydroxyalkanoates. In this case, in the form of poly(3-hydroxybutyrate). The selected stress factors were temperature shock, repeated freezing and defrosting. The last stress factor was osmotic stress, caused by sodium chloride solutions of different concentrations. In the theoretical part, polyhydroxyalkanoates, thermophilic organisms, mechanisms of individual stresses and methods of analysis of polyhydroxyalkanoates were characterized. In the experimental part, two strains of the thermophilic bacteria Schlegelella thermodepolymerans were compared, namely M 15344 and DSM 15344. The stress resistance of both strains was compared by measuring viability using flow cytometry. During the measurement, the increase in optical density was monitored, and the content of P(3HB) in the biomass was determined using GC-FID. Morphological changes caused by stresses were observed using Cryo-SEM and STEM electron microscopy methods. The DSM 15344 strain showed better growth and P(3HB) production than the M 15344 strain, which, on the other hand, showed better stress resistance.

Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství., The aim of this bachelor thesis is to document production of polyhydroxyalkanoates in selected bacterial strains, which were Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus thermostellatus. In the case of the microorganisms Tepidiphilus thermophilus and Pseudomonas thermotolerans, the production of PHA´s has not yet been described, and in the Chelatococcus bacteria, which were analysed in this work, the production has not yet been documented by electron microscopy. In this work, the selected producers were analysed by flow cytometry first, using BODIPY and Nile Red as fluorescence probes. Selected producers, for which was production confirmed, were analysed by other methods, such as fluorescence microscopy, cryo scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In the bacterial culture of Pseudomonas thermotolerans, PHA´s production wasn´t confirmed by the first analysis by flow cytometer. For other microorganisms was production confirmed. Chelatococcus bacteria clearly proved to be better producers. Bacterial cells of Tepidiphilus thermophilus produced smaller granules and in lower amount.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Předložená disertační práce se zabývá tematikou evolučního a genového inženýrství bakteriálních producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vyjma tato témata přímo související s názvem práce je rozvinuta o problematiku biotechnologické produkce PHA na modelových hydrolyzátech lignocelulosové biomasy s využitím extrémofilních mikroorganismů a dále o vývoj alternativního způsobu izolace PHA. Rozvíjející témata přitom volně navazovala na předchozí experimenty a reflektovala aktuálně řešené projekty na pracovišti. Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou její součástí ve formě příloh. Evoluční inženýrství bylo aplikováno především na modelový PHA produkující bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Adaptací na kyselinu levulovou byly získány izoláty produkující kopolymer P(3HB-co-3HV) s vyšším zastoupením frakce 3HV, což vede ke zlepšení vlastností polymeru pro další zpracování. Stejně tak i růst kultur a množství celkových PHA v biomase bylo vyšší. Dlouhodobou adaptací téhož kmene na osmotický stres a přítomnost měďnatých iontů byly získány izoláty charakterizované v rámci druhé publikace. Ze získaných dat bylo možné pozorovat rozdíly v adaptačním procesu, kdy adaptace na osmotický stres byla postupná, zatímco u mědi byl pozorován výrazný skok nárůstu biomasy a PHA signalizující rychlou adaptaci. Na základě analýz byla diskutována významná úloha PHA při adaptaci kmene C. necator H16 na testované stresory, která nespočívala pouze v nárůstu množství polymeru v biomase, nicméně v posílení celého cyklu, což vede také ke zvýšení poolu monomerních jednotek vykazujících protektivní účinky. Adaptací na -kaptolakton, unikátní prekurzor 4HB, byl získán kopolymer P(3HB-co-4HB). Jeho vlastnosti jsou opět výhodnější než u homopolymeru P(3HB), a to už při nízkém zastoupení 4HB, kterého jsme dosáhli také v laboratorním bioreaktoru. Dalšího navýšení frakce 4HB by mohlo být dosaženo s využitím delečních mutantů s absencí relevantních genů, This doctoral thesis deals with the topic of evolutionary and genetic engineering of polyhydroxyalkanoates (PHA) producing bacteria. Apart from these topics, the issue of biotechnological production of PHA on model hydrolysates of lignocellulosic biomass with the use of extremophilic microorganisms is also studied, as well as the development of an alternative method of PHA isolation. The themes were freely linked to previous experiments and reflected the currently solved projects in a working group. Doctoral thesis is prepared in the form of a commented discussion of published works, which are part of it in the form of appendices. Evolutionary engineering was mainly applied to the model PHA producing bacterial strain Cupriavidus necator H16. By adaptation to levulinic acid, isolates producing copolymer P(3HB-co-3HV) with a higher content of the 3HV fraction were obtained, which leads to improved properties of the polymer for further processing. As well as culture growth also the amount of total PHA in the biomass was higher. By long-term adaptation of the same strain to osmotic stress and the presence of copper ions, the isolates which are characterized in the second publication, were obtained. Based on obtained data, it was possible to observe differences in the adaptation process, where the adaptation to osmotic stress was gradual, while a significant step in the increase of biomass and PHA signaling faster adaptation was observed for copper. Based on the analyses, the significant role of PHA in the adaptation of the C. necator H16 strain to the tested stressors was discussed, it did not consist only in the increase in the amount of polymer in the biomass, but also in enhancement of whole PHA cycle, which also leads to an increase of the pool of monomeric units showing protective functions. By adaptation to -captolactone, a unique precursor of 4HB, the copolymer P(3HB-co-4HB) was obtained. The properties of this copolymer are again more favorable than of the homop

Předložená disertační práce se zabývá tematikou evolučního a genového inženýrství bakteriálních producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vyjma tato témata přímo související s názvem práce je rozvinuta o problematiku biotechnologické produkce PHA na modelových hydrolyzátech lignocelulosové biomasy s využitím extrémofilních mikroorganismů a dále o vývoj alternativního způsobu izolace PHA. Rozvíjející témata přitom volně navazovala na předchozí experimenty a reflektovala aktuálně řešené projekty na pracovišti. Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou její součástí ve formě příloh. Evoluční inženýrství bylo aplikováno především na modelový PHA produkující bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Adaptací na kyselinu levulovou byly získány izoláty produkující kopolymer P(3HB-co-3HV) s vyšším zastoupením frakce 3HV, což vede ke zlepšení vlastností polymeru pro další zpracování. Stejně tak i růst kultur a množství celkových PHA v biomase bylo vyšší. Dlouhodobou adaptací téhož kmene na osmotický stres a přítomnost měďnatých iontů byly získány izoláty charakterizované v rámci druhé publikace. Ze získaných dat bylo možné pozorovat rozdíly v adaptačním procesu, kdy adaptace na osmotický stres byla postupná, zatímco u mědi byl pozorován výrazný skok nárůstu biomasy a PHA signalizující rychlou adaptaci. Na základě analýz byla diskutována významná úloha PHA při adaptaci kmene C. necator H16 na testované stresory, která nespočívala pouze v nárůstu množství polymeru v biomase, nicméně v posílení celého cyklu, což vede také ke zvýšení poolu monomerních jednotek vykazujících protektivní účinky. Adaptací na -kaptolakton, unikátní prekurzor 4HB, byl získán kopolymer P(3HB-co-4HB). Jeho vlastnosti jsou opět výhodnější než u homopolymeru P(3HB), a to už při nízkém zastoupení 4HB, kterého jsme dosáhli také v laboratorním bioreaktoru. Dalšího navýšení frakce 4HB by mohlo být dosaženo s využitím delečních mutantů s absencí relevantních genů, This doctoral thesis deals with the topic of evolutionary and genetic engineering of polyhydroxyalkanoates (PHA) producing bacteria. Apart from these topics, the issue of biotechnological production of PHA on model hydrolysates of lignocellulosic biomass with the use of extremophilic microorganisms is also studied, as well as the development of an alternative method of PHA isolation. The themes were freely linked to previous experiments and reflected the currently solved projects in a working group. Doctoral thesis is prepared in the form of a commented discussion of published works, which are part of it in the form of appendices. Evolutionary engineering was mainly applied to the model PHA producing bacterial strain Cupriavidus necator H16. By adaptation to levulinic acid, isolates producing copolymer P(3HB-co-3HV) with a higher content of the 3HV fraction were obtained, which leads to improved properties of the polymer for further processing. As well as culture growth also the amount of total PHA in the biomass was higher. By long-term adaptation of the same strain to osmotic stress and the presence of copper ions, the isolates which are characterized in the second publication, were obtained. Based on obtained data, it was possible to observe differences in the adaptation process, where the adaptation to osmotic stress was gradual, while a significant step in the increase of biomass and PHA signaling faster adaptation was observed for copper. Based on the analyses, the significant role of PHA in the adaptation of the C. necator H16 strain to the tested stressors was discussed, it did not consist only in the increase in the amount of polymer in the biomass, but also in enhancement of whole PHA cycle, which also leads to an increase of the pool of monomeric units showing protective functions. By adaptation to -captolactone, a unique precursor of 4HB, the copolymer P(3HB-co-4HB) was obtained. The properties of this copolymer are again more favorable than of the homop

Předmětem bakalářské práce je produkce biosurfaktantů vybranými termofilními bakteriemi. Teoretická část obsahuje obecnou charakterizaci termofilních bakterií, popisuje struktury a klasifikaci biosurfaktantů, charakterizuje jejich vlastnosti a využití. Závěr teoretické části se věnuje produkci biosurfaktantů termofilními bakteriemi. Experimentální část se zabývá screeningem produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií. Termofilní bakterie byly získány z kompostů a aktivovaných kalů. Izolace není předmětem bakalářské práce. Celkově 39 bakteriálních izolátů bylo kultivováno a supernatanty kultivačního média byly testovány screeningovými metodami na přítomnost biosurfaktantů, a to stanovením aktivity emulze a solubilizací krystalického antracenu. Na základě výsledků těchto metod bylo vybráno 14 nejatraktivnějších producentů. Vybrané bakteriální kmeny byly znovu kultivovány a byla tak získána nová sada supernatantů. Pro podrobnější screening produkce vybranými termofilními bakteriemi byly kromě stanovení aktivity emulze a solubilizace krystalického antracenu přidány další metody: přímé měření povrchového napětí – Du-Noüy-Ring, metoda rozlévání kapky a metoda rozšiřování oleje. Výsledky byly zhodnoceny a metody byly znovu zopakovány pro novou sadu supernatantů za účelem ověření reprodukovatelnosti produkce. Výsledky všech testů byly porovnány a následně byli určeni tři nejspolehlivější termofilní bakteriální producenti., The subject of the bachelor thesis is the production of biosurfactants by selected thermophilic bacteria. The theoretical part contains a general characterization of thermophilic bacteria, describes the structures and classification of biosurfactants, characterizes their properties and uses. The final part of the theoretical part deals with the production of biosurfactants by thermophilic bacteria. The experimental part deals with the screening of biosurfactant production by selected thermophilic bacteria. Thermophilic bacteria were obtained from composts and activated sludges. Isolation is not a subject of the thesis. In total 39 bacterial isolates were cultivated and their supernatants were tested by screening methods – emulsification capacity assay and solubilization of crystalline anthracene. Based on the results of these methods, 14 most promising producers were selected. These bacterial strains were re-cultured to obtain a new set of supernatants. For more detailed screening of production by selected thermophilic bacteria, in addition to determining the activity of the emulsion and solubilization of crystalline anthracene, other methods were added: direct surface tension measurement – Du-Noüy-Ring, drop pouring method and oil spreading method. The results were evaluated and the measurements were repeated for a new set of supernatants to verify the reproducibility of the production. The results of all the tests were compared and then three most reliable thermophilic bacterial producers were determined.

Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu., This bachelor's thesis is focused on investigating the effect of different stress factors on the bacteria Schlegelella thermodepolymerans, which is capable of producing polyhydroxyalkanoates. In this case, in the form of poly(3-hydroxybutyrate). The selected stress factors were temperature shock, repeated freezing and defrosting. The last stress factor was osmotic stress, caused by sodium chloride solutions of different concentrations. In the theoretical part, polyhydroxyalkanoates, thermophilic organisms, mechanisms of individual stresses and methods of analysis of polyhydroxyalkanoates were characterized. In the experimental part, two strains of the thermophilic bacteria Schlegelella thermodepolymerans were compared, namely M 15344 and DSM 15344. The stress resistance of both strains was compared by measuring viability using flow cytometry. During the measurement, the increase in optical density was monitored, and the content of P(3HB) in the biomass was determined using GC-FID. Morphological changes caused by stresses were observed using Cryo-SEM and STEM electron microscopy methods. The DSM 15344 strain showed better growth and P(3HB) production than the M 15344 strain, which, on the other hand, showed better stress resistance.

Predložená bakalárska práca sa zaoberá štúdiom biotechnologickej produkcie polyhydroxyalkoanátov (PHA), použitím hydrolyzátov z pivovarského mláta a vybraných bakteriálnych zástupcov rodu Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas a Burkholderia. Cieľom tejto práce bolo zistiť, či hydrolyzáty pochádzajúce z pivovarského mláta môžu slúžiť ako vhodný substrát pri produkcii PHA. Dôraz bol pritom kladený na rôzne spôsoby predúpravy lignocelulózneho materiálu. Pivovarské mláto bolo podrobené kvantitatívnej analýze a pre komerčný enzýmový kokteil používaný pri hydrolýze, bolo stanovené teplotné a pH optimum. Najefektívnejšia premena cukrov na PHA bola dosiahnutá u baktérie H. organivorans za použitia hydrolyzátu mláta, ktoré bolo upravené plazmou. Hydrolyzáty, ktoré boli pripravené šetrnejšími metódami, obsahovali menej bakteriálnych inhibítorov a dostatočné množstvo cukrov, čím slúžili ako vhodnejší substrát pre rast mikroroganizmov., The presented bachelor thesis deals with the study of biotechnological production of polyhydroxyalkoanates (PHA), using hydrolysates from brewer’s spelt grain (BSG) and selected bacterial strains Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas and Burkholderia. The thesis aims to determine whether it is possible to use BSG hydrolysates as a substrate for PHA production, with the emphasis on different pretreatment methods of the lignocellulosic material. BSG was submitted to quantitative analysis and the optimum temperature and pH of the commercial enzymatic cocktail used for the hydrolysation was determined. The most effective transformation of sugars to PHA was accomplished by bacteria H. organivorans with the use of a hydrolysate from plasma pretreated BSG. Hydrolysates which were prepared with moderate methods, contained less bacterial inhibitors and sufficient amounts of sugars. These hydrolysates served therefore as preferable substrates for the microorganism growth.

Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství., The aim of this bachelor thesis is to document production of polyhydroxyalkanoates in selected bacterial strains, which were Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus thermostellatus. In the case of the microorganisms Tepidiphilus thermophilus and Pseudomonas thermotolerans, the production of PHA´s has not yet been described, and in the Chelatococcus bacteria, which were analysed in this work, the production has not yet been documented by electron microscopy. In this work, the selected producers were analysed by flow cytometry first, using BODIPY and Nile Red as fluorescence probes. Selected producers, for which was production confirmed, were analysed by other methods, such as fluorescence microscopy, cryo scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In the bacterial culture of Pseudomonas thermotolerans, PHA´s production wasn´t confirmed by the first analysis by flow cytometer. For other microorganisms was production confirmed. Chelatococcus bacteria clearly proved to be better producers. Bacterial cells of Tepidiphilus thermophilus produced smaller granules and in lower amount.

Předložená disertační práce se zabývá tematikou evolučního a genového inženýrství bakteriálních producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vyjma tato témata přímo související s názvem práce je rozvinuta o problematiku biotechnologické produkce PHA na modelových hydrolyzátech lignocelulosové biomasy s využitím extrémofilních mikroorganismů a dále o vývoj alternativního způsobu izolace PHA. Rozvíjející témata přitom volně navazovala na předchozí experimenty a reflektovala aktuálně řešené projekty na pracovišti. Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou její součástí ve formě příloh. Evoluční inženýrství bylo aplikováno především na modelový PHA produkující bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Adaptací na kyselinu levulovou byly získány izoláty produkující kopolymer P(3HB-co-3HV) s vyšším zastoupením frakce 3HV, což vede ke zlepšení vlastností polymeru pro další zpracování. Stejně tak i růst kultur a množství celkových PHA v biomase bylo vyšší. Dlouhodobou adaptací téhož kmene na osmotický stres a přítomnost měďnatých iontů byly získány izoláty charakterizované v rámci druhé publikace. Ze získaných dat bylo možné pozorovat rozdíly v adaptačním procesu, kdy adaptace na osmotický stres byla postupná, zatímco u mědi byl pozorován výrazný skok nárůstu biomasy a PHA signalizující rychlou adaptaci. Na základě analýz byla diskutována významná úloha PHA při adaptaci kmene C. necator H16 na testované stresory, která nespočívala pouze v nárůstu množství polymeru v biomase, nicméně v posílení celého cyklu, což vede také ke zvýšení poolu monomerních jednotek vykazujících protektivní účinky. Adaptací na -kaptolakton, unikátní prekurzor 4HB, byl získán kopolymer P(3HB-co-4HB). Jeho vlastnosti jsou opět výhodnější než u homopolymeru P(3HB), a to už při nízkém zastoupení 4HB, kterého jsme dosáhli také v laboratorním bioreaktoru. Dalšího navýšení frakce 4HB by mohlo být dosaženo s využitím delečních mutantů s absencí relevantních genů, This doctoral thesis deals with the topic of evolutionary and genetic engineering of polyhydroxyalkanoates (PHA) producing bacteria. Apart from these topics, the issue of biotechnological production of PHA on model hydrolysates of lignocellulosic biomass with the use of extremophilic microorganisms is also studied, as well as the development of an alternative method of PHA isolation. The themes were freely linked to previous experiments and reflected the currently solved projects in a working group. Doctoral thesis is prepared in the form of a commented discussion of published works, which are part of it in the form of appendices. Evolutionary engineering was mainly applied to the model PHA producing bacterial strain Cupriavidus necator H16. By adaptation to levulinic acid, isolates producing copolymer P(3HB-co-3HV) with a higher content of the 3HV fraction were obtained, which leads to improved properties of the polymer for further processing. As well as culture growth also the amount of total PHA in the biomass was higher. By long-term adaptation of the same strain to osmotic stress and the presence of copper ions, the isolates which are characterized in the second publication, were obtained. Based on obtained data, it was possible to observe differences in the adaptation process, where the adaptation to osmotic stress was gradual, while a significant step in the increase of biomass and PHA signaling faster adaptation was observed for copper. Based on the analyses, the significant role of PHA in the adaptation of the C. necator H16 strain to the tested stressors was discussed, it did not consist only in the increase in the amount of polymer in the biomass, but also in enhancement of whole PHA cycle, which also leads to an increase of the pool of monomeric units showing protective functions. By adaptation to -captolactone, a unique precursor of 4HB, the copolymer P(3HB-co-4HB) was obtained. The properties of this copolymer are again more favorable than of the homop

Bakalárska práca sa zaoberá využitím osmotického stresu ako nástroja evolučného inžinierstva PHA produkujúcich bakteriálnych kmeňov. Cieľom práce je posúdiť využiteľnosť adaptácie mikroorganizmov na hypoosmotické prostredie ako inžinierskeho nástroja na ovplyvnenie efektivity biosyntézy PHA. Teoretická časť práce sa zaoberá princípom evolučného inžinierstva, metódami tejto stratégie a vplyvom fyzikálnych faktorov na mikroorganizmus. V rámci experimentálnej časti bol realizovaný experiment adaptívnej laboratórnej evolúcie s využitím bakteriálneho kmeňa Halomonas halophila CCM 3662. Ako stresový faktor počas sériovej kultivácie bol aplikovaný osmotický tlak v podobe zníženej koncentrácie soli v produkčnom médiu. Za účelom vyvinutia PHA produkujúcich adaptovaných mutantných kmeňov boli jednotlivé pasáže analyzované pomocou metód spektrofotometrie, gravimetrie a GC-FID. Na základe výsledkov dlhodobej kultivácie bol zistený adaptačný potenciál kmeňa HH35, kultivovaného pri 35 g/l NaCl, u ktorého obsah biomasy a koncentrácia PHB vykazovali najvyššie hodnoty. Z jednotlivých generácií kmeňa HH35 bola pre podrobnejšiu analýzu vybraná 15. pasáž a 30. pasáž, ktoré spolu s kontrolným divokým kmeňom H. halophila, boli podrobené hyperosmotickému a hypoosmotickému šoku. Pomocou metód FC a TGA bola sledovaná stresová odpoveď bakteriálnych kmeňov, v snahe zistenia viability buniek či potenciálnych morfologických zmien. Vyizolované polyméry boli charakterizované FTIR analýzou., This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství., The aim of this bachelor thesis is to document production of polyhydroxyalkanoates in selected bacterial strains, which were Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus thermostellatus. In the case of the microorganisms Tepidiphilus thermophilus and Pseudomonas thermotolerans, the production of PHA´s has not yet been described, and in the Chelatococcus bacteria, which were analysed in this work, the production has not yet been documented by electron microscopy. In this work, the selected producers were analysed by flow cytometry first, using BODIPY and Nile Red as fluorescence probes. Selected producers, for which was production confirmed, were analysed by other methods, such as fluorescence microscopy, cryo scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In the bacterial culture of Pseudomonas thermotolerans, PHA´s production wasn´t confirmed by the first analysis by flow cytometer. For other microorganisms was production confirmed. Chelatococcus bacteria clearly proved to be better producers. Bacterial cells of Tepidiphilus thermophilus produced smaller granules and in lower amount.

Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen., This bachelor thesis is focused on stress resistance of PHA accumulating bacteria against unfavourable conditions associated with gastrointestinal tract. Two bacterial strains were chosen as model microorganisms for this purpose. Cupriavidus necator H16 producing PHA and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 without the ability of PHA accumulation. Firstly, three gastrointestinal juices of different concentrations were chosen for the experimental part, namely gastric, bile and pancreatic juices. The stressed bacterial strain was then determined using a spread plate method and a flow cytometry. Other methods used include antimicrobial tests. The agar diffusion method was first tested to determine the size of the inhibition zones. The last method that has been performed is the broth dilution method, which serves to compare the absorbance of pure bacterial suspensions and stressed suspensions with the given juice of a certain concentration. The results show that the production of PHA represents a disadvantage in context of conditions associated with gastrointestinal tract of accumulating bacterial strain.

Bakalářská práce se zabývá zapojením polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií, a to konkrétně při působení teplotního stresu. Teoretická část práce se zaměřuje na stresovou odpověď bakterií obecně, na mechanismus odpovědi vůči teplotnímu stresu a na zapojení PHA do stresové odpovědi. V rámci experimentální práce byla zkoumána souvislost mezi množstvím PHA v biomase bakterií a jejich viabilitě po působení teplotního stresu. Pro práci byly využity PHA produkující kmeny Cupriavidus necator H16, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari a PHA neprodukující mutantní kmen Cupriavidus necator PHB4. Bakterie akumulovaly poly(3-hydroxybutyrát) (PHB), přičemž jeho množství v biomase bylo stanovováno pomocí plynové chromatografie s FID. Viabilita živých bakteriálních buněk i buněk po expozici teplotním stresům byla stanovována pomocí průtokové cytometrie. Ukázalo se, že obsah PHB v biomase napomáhal bakteriím odolávat mrazovému šoku. Na základě porovnání viability bakterií C. necator H16 a C. necator PHB4 po expozici kombinovaným stresům bylo rovněž pozorováno, že PHB zvyšoval odolnost buněk vůči teplotnímu stresu a stresu způsobenému nízkým pH., This bachelor thesis deals with the involvement of polyhydroxyalkanoates (PHA) into the stress response of bacteria, specifically when they are exposed to temperature-mediated stress. The theoretical part focuses on the stress response of bacteria in general, the mechanism of response to temperature-mediated stress and PHA involvement into the stress response. The aim of experimental work was to study the correlation between the amount of PHA in the biomass of the bacteria and their viability after exposure to temperature-mediated stress. PHA producing bacterial strains Cupriavidus necator H16, Burkholderia cepacia and Burkholderia sacchari and non-producing mutant strain Cupriavidus necator PHB4 were used for experimental work. Bacteria accumulated poly(3-hydroxybutyrate) (PHB), the amount of PHB in the biomass was determined by gas chromatography with FID. Viability of live bacterial cells and cells after exposure to temperature-mediated stress was determined by using flow cytometry. It turned out that the content of PHB in biomass assists bacteria to resist the freezing shock. By comparing the viability of bacteria C. necator H16 and C. necator PHB4 after exposure to multiple stresses it also has been observed that PHB increased the resistance of cells against temperature-mediated stress and stress caused by low pH.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Diplomová práce se zabývá aplikací evolučního inženýrství na PHA produkující kmeny. Cílem práce je připravit prostřednictvím metod evolučního inženýrství kmeny adaptované na kyselinu levulovou, jakožto vybraný stresový faktor, a následně tyto kmeny charakterizovat. Teoretická část práce se zabývá především evolučním inženýrstvím a polyhydroxyalkanoáty. Pro evoluční experimenty byl využit bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Za účelem přípravy adaptovaných kmenů byla aplikována jednak samotná kyselina levulová, jednak kyselina levulová v přítomnosti mutagenu MMS. Selekce vhodných mutantů byla posuzována na základě růstového potenciálu a obsahu PHA v biomase. U pěti získaných PHA produkujících adaptovaných mutantů a kontroly byly prostřednictvím metod GC-FID, SEC-MALS, DSC a FT-IR charakterizovány vyizolované polymery. Bylo zjištěno, že vyšší obsah 3HV v kopolymeru vedl k nižší krystalinitě a tím i k nižší teplotě tání, z trendu se vymykal pouze kopolymer kmene M0151. Kromě charakteristik polymerů byly z biochemického hlediska posuzovány i samotné kmeny, a to prostřednictvím stanovování aktivit vybraných enzymů citrátového, glyoxalátového a 2-methylcitrátového cyklu, vybraných enzymů generujících NADPH, enzymu katabolismu kyseliny levulové a enzymů biosyntézy PHA. Na základě získaných dat byly diskutovány možné adaptační strategie, kdy se nejvíce odlišovat kmen E0575. Hodnoty specifických enzymových aktivit byly podrobeny metodám statistické analýzy AHC a PCA., This diploma thesis deals with the application of evolutionary engineering to PHA producing bacterial strains. The aim of the thesis is to prepare strains adapted to levulinic acid, a selected stress factor, by methods of evolutionary engineering, and then to characterize these strains. The theoretical part deals with evolutionary engineering and polyhydroxyalkanoates predominantly. The bacterial strain Cupriavidus necator H16 was used for evolutionary experiments. Levulinic acid and levulinic acid in the presence of the MMS mutagen were applied to prepare adapted strains. Selection of mutants was evaluated on the basis of growth potential and PHA content in biomass. Polymers produced by five obtained PHA-producing mutants and control were characterized using GC-FID, SEC-MALS, DSC and FT-IR. It was found that a higher content of 3HV in the copolymer led to a lower crystallinity and hence to a lower melting point, nevertheless, only the copolymer of the M0151 strain did not fit this trend. In addition to the characteristics of the polymers, the strains themselves were evaluated from the biochemical point of view by determining the activities of selected enzymes of the citrate, glyoxalate and 2-methylcitrate cycle, selected enzymes generating NADPH, levulic acid catabolism enzyme and PHA biosynthesis enzymes. On the basis of the obtained data, the possible adaptation strategies were discussed, when the E0575 strain was most differentiated from original culture. Values of specific enzyme activities were subjected to AHC and PCA statistical analysis methods.

Předmětem předložené diplomové práce je vliv elektrochemicky tvořeného peroxidu vodíku na produkci polyhydroxyalkanoátů. Peroxid vodíku byl v této práci generován přímo v kultivačním médiu s bakteriemi, a to dvouelektronovou redukcí kyslíku. Tato práce je dělena na teoretickou část, která se věnuje přiblížení tématiky polyhydroxyalkanoátů, oxidativního stresu, elektrochemické produkce H2O2 a propojení elektrochemie s biotechnologií. Experimentální část je zaměřena na aplikaci těchto poznatků. Peroxid vodíku byl generován aplikací elektrického potenciálu na elektrodový systém složený konkrétně z nerezové ocelové pracovní elektrody, titanové protielektrody a pseudoreferenční Ag/AgCl elektrody vložených do polypropylenového držáku. Po počáteční elektrochemické charakterizaci připraveného systému byl vybrán potenciál -0,8 V a -1 V pro aplikaci v kultivačních experimentech. Zde byl zkoumán vliv H2O2 na stresovou odpověď bakterie Cupriavidus necator H16 z České sbírky mikroorganismů. Z výsledků kultivačních experimentů bylo patrné, že elektrochemicky produkovaný H2O2 nemá výrazný vliv na vývoj bakteriální kultury. Avšak samotný elektrodový systém pozitivně ovlivňuje bakteriální růst. Vliv H2O2 nebyl patrný z důvodu nízké produkce v médiu. Ta byla způsobena nízkou koncentrací kyslíku v objemu kultivačního média. V průběhu práce byl navrhnut nový elektrodový systém s vyšší tvorbou H2O2, který mohl využívat vzdušného kyslíku pro redukci na H2O2. Avšak ani s tímto systémem nebylo dosaženo chtěné stresové odpovědi bakterie, jelikož zvýšené tvorbě H2O2 bránil biofilm vzniklý na elektrodách. Dále bylo v práci zjištěno, že materiály použité na elektrodový systém podporují tvorbu biofilmu, a to hlavně titan, nerezová ocelová mřížka a polypropylen., The subject of the presented thesis is the effect of electrochemically formed hydrogen peroxide on the production of polyhydroxyalkanoate. In this work, hydrogen peroxide was generated directly in the medium with bacteria by two-electron reduction of oxygen. This thesis is divided into a theoretical part, which is devoted to approaching the topic of polyhydroxyalkanoate, oxidative stress, electrochemical production of H2O2 and the connection of electrochemistry with biotechnology. The experimental part is focused on the application of these findings. Hydrogen peroxide was generated by applying an electrical potential to an electrode system composed of a stainless-steel working electrode, a titanium counter electrode, and a pseudo-reference Ag/AgCl electrode embedded in a polypropylene holder. After initial electrochemical characterization of the prepared system, a potential of 0,8 V and -1 V was selected for application in cultivation experiments. Here, the effect of H2O2 on the stress response of the bacterium Cupriavidus necator H16 from the Czech collection of microorganisms was investigated. From the results of the cultivation experiments, it was evident that the electrochemically produced H2O2 does not have a significant effect on the development of the bacterial culture. However, the electrode system itself positively affects bacterial growth. The influence of H2O2 was not noticeable due to the low production in medium. This was caused by a low concentration of oxygen in the medium. During this work, a new electrode system with higher H2O2 production was designed, which could use atmospheric oxygen for reduction to H2O2. However, even with this system, a desired stress response was not achieved, because increased production of H2O2 was prevented by the formation of biofilm on the electrodes. Furthermore, it was found that the materials used for the electrode system support the formation of biofilm, mainly titanium, stainless-steel mesh and polypropylene.

Bakalárska práca sa zaoberá využitím osmotického stresu ako nástroja evolučného inžinierstva PHA produkujúcich bakteriálnych kmeňov. Cieľom práce je posúdiť využiteľnosť adaptácie mikroorganizmov na hypoosmotické prostredie ako inžinierskeho nástroja na ovplyvnenie efektivity biosyntézy PHA. Teoretická časť práce sa zaoberá princípom evolučného inžinierstva, metódami tejto stratégie a vplyvom fyzikálnych faktorov na mikroorganizmus. V rámci experimentálnej časti bol realizovaný experiment adaptívnej laboratórnej evolúcie s využitím bakteriálneho kmeňa Halomonas halophila CCM 3662. Ako stresový faktor počas sériovej kultivácie bol aplikovaný osmotický tlak v podobe zníženej koncentrácie soli v produkčnom médiu. Za účelom vyvinutia PHA produkujúcich adaptovaných mutantných kmeňov boli jednotlivé pasáže analyzované pomocou metód spektrofotometrie, gravimetrie a GC-FID. Na základe výsledkov dlhodobej kultivácie bol zistený adaptačný potenciál kmeňa HH35, kultivovaného pri 35 g/l NaCl, u ktorého obsah biomasy a koncentrácia PHB vykazovali najvyššie hodnoty. Z jednotlivých generácií kmeňa HH35 bola pre podrobnejšiu analýzu vybraná 15. pasáž a 30. pasáž, ktoré spolu s kontrolným divokým kmeňom H. halophila, boli podrobené hyperosmotickému a hypoosmotickému šoku. Pomocou metód FC a TGA bola sledovaná stresová odpoveď bakteriálnych kmeňov, v snahe zistenia viability buniek či potenciálnych morfologických zmien. Vyizolované polyméry boli charakterizované FTIR analýzou., This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.

Predložená bakalárska práca sa zaoberá štúdiom biotechnologickej produkcie polyhydroxyalkoanátov (PHA), použitím hydrolyzátov z pivovarského mláta a vybraných bakteriálnych zástupcov rodu Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas a Burkholderia. Cieľom tejto práce bolo zistiť, či hydrolyzáty pochádzajúce z pivovarského mláta môžu slúžiť ako vhodný substrát pri produkcii PHA. Dôraz bol pritom kladený na rôzne spôsoby predúpravy lignocelulózneho materiálu. Pivovarské mláto bolo podrobené kvantitatívnej analýze a pre komerčný enzýmový kokteil používaný pri hydrolýze, bolo stanovené teplotné a pH optimum. Najefektívnejšia premena cukrov na PHA bola dosiahnutá u baktérie H. organivorans za použitia hydrolyzátu mláta, ktoré bolo upravené plazmou. Hydrolyzáty, ktoré boli pripravené šetrnejšími metódami, obsahovali menej bakteriálnych inhibítorov a dostatočné množstvo cukrov, čím slúžili ako vhodnejší substrát pre rast mikroroganizmov., The presented bachelor thesis deals with the study of biotechnological production of polyhydroxyalkoanates (PHA), using hydrolysates from brewer’s spelt grain (BSG) and selected bacterial strains Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas and Burkholderia. The thesis aims to determine whether it is possible to use BSG hydrolysates as a substrate for PHA production, with the emphasis on different pretreatment methods of the lignocellulosic material. BSG was submitted to quantitative analysis and the optimum temperature and pH of the commercial enzymatic cocktail used for the hydrolysation was determined. The most effective transformation of sugars to PHA was accomplished by bacteria H. organivorans with the use of a hydrolysate from plasma pretreated BSG. Hydrolysates which were prepared with moderate methods, contained less bacterial inhibitors and sufficient amounts of sugars. These hydrolysates served therefore as preferable substrates for the microorganism growth.

Bakalárska práca sa zaoberá využitím osmotického stresu ako nástroja evolučného inžinierstva PHA produkujúcich bakteriálnych kmeňov. Cieľom práce je posúdiť využiteľnosť adaptácie mikroorganizmov na hypoosmotické prostredie ako inžinierskeho nástroja na ovplyvnenie efektivity biosyntézy PHA. Teoretická časť práce sa zaoberá princípom evolučného inžinierstva, metódami tejto stratégie a vplyvom fyzikálnych faktorov na mikroorganizmus. V rámci experimentálnej časti bol realizovaný experiment adaptívnej laboratórnej evolúcie s využitím bakteriálneho kmeňa Halomonas halophila CCM 3662. Ako stresový faktor počas sériovej kultivácie bol aplikovaný osmotický tlak v podobe zníženej koncentrácie soli v produkčnom médiu. Za účelom vyvinutia PHA produkujúcich adaptovaných mutantných kmeňov boli jednotlivé pasáže analyzované pomocou metód spektrofotometrie, gravimetrie a GC-FID. Na základe výsledkov dlhodobej kultivácie bol zistený adaptačný potenciál kmeňa HH35, kultivovaného pri 35 g/l NaCl, u ktorého obsah biomasy a koncentrácia PHB vykazovali najvyššie hodnoty. Z jednotlivých generácií kmeňa HH35 bola pre podrobnejšiu analýzu vybraná 15. pasáž a 30. pasáž, ktoré spolu s kontrolným divokým kmeňom H. halophila, boli podrobené hyperosmotickému a hypoosmotickému šoku. Pomocou metód FC a TGA bola sledovaná stresová odpoveď bakteriálnych kmeňov, v snahe zistenia viability buniek či potenciálnych morfologických zmien. Vyizolované polyméry boli charakterizované FTIR analýzou., This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.

Patogeny jsou organismy, které jsou příčinou různých onemocnění hostitele. Patří zde: priony, viry, bakterie, houby, prvoci a živočichové. Tato bakalářská práce je zaměřená konkrétně na viry, způsobující lidská onemocnění jako jsou závažné respirační syndromy, onemocnění jater či rakovina děložního čípku. Cílem této bakalářské práce bylo pomocí webové aplikace Palindrome analyser charakterizovat přítomnost a umístění inverzních repetic v genomech organismů, které jsou patogenní pro lidský organismus. Byly vybrány 4 viry, z nichž dva jsou ze skupiny DNA virů a dva ze skupiny RNA virů. S ohledem na propuknutí pandemie na začátku roku 2020, kterou způsobil virus SARS-CoV-2, je v této bakalářské práci zařazen. Z RNA virů byly tedy vybrány: SARS-CoV a SARS-CoV-2. Z DNA virů byly vybrány: virus Hepatitis B a lidský papilomavirus. Sekvence virových genomů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Poté byly pomocí programu Palindrome analyser, který je dostupný online, analyzovány všechny čtyři viry na přítomnost inverzních repetic, jejich polohu a velikost. Největším genomem byl SARS-CoV-2 s velikostí 29 903 bp, který měl zároveň nejvíce inverzních repetic., Pathogens are organisms that cause various host diseases. These include prions, viruses, bacteria, fungi, protozoa and animals. This bachelor thesis is focused specifically on viruses causing human diseases such as severe respiratory syndromes, liver diseases or cervical cancer. The aim of this bachelor thesis was to characterize the presence and location of inverted repeats in the genomes of organism using the web application Palindrome analyzer. Four viruses were selected, two of them are from the group of DNA viruses and two from the group of RNA viruses. In view of the outbreak of a pandemic in early 2020 caused by virus SARSCoV-2, is included in this bachelor thesis. Thus, SARS-CoV and SARS-CoV-2 were selected from RNA viruses and hepatitis B virus and human papillomavirus were selected from the DNA viruses. The sequences of the viral genomes were obtained from the NCBI (National Center for Biotechnology) database. Then, all four viruses were analyzed for the presence of inverse repeats, their location and size using the Palindrome analyzer, which is available online. The largest genome was SARS-CoV-2 of 29 903 bp, which also had the most inverse repeats.

Předmětem bakalářské práce je produkce biosurfaktantů vybranými termofilními bakteriemi. Teoretická část obsahuje obecnou charakterizaci termofilních bakterií, popisuje struktury a klasifikaci biosurfaktantů, charakterizuje jejich vlastnosti a využití. Závěr teoretické části se věnuje produkci biosurfaktantů termofilními bakteriemi. Experimentální část se zabývá screeningem produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií. Termofilní bakterie byly získány z kompostů a aktivovaných kalů. Izolace není předmětem bakalářské práce. Celkově 39 bakteriálních izolátů bylo kultivováno a supernatanty kultivačního média byly testovány screeningovými metodami na přítomnost biosurfaktantů, a to stanovením aktivity emulze a solubilizací krystalického antracenu. Na základě výsledků těchto metod bylo vybráno 14 nejatraktivnějších producentů. Vybrané bakteriální kmeny byly znovu kultivovány a byla tak získána nová sada supernatantů. Pro podrobnější screening produkce vybranými termofilními bakteriemi byly kromě stanovení aktivity emulze a solubilizace krystalického antracenu přidány další metody: přímé měření povrchového napětí – Du-Noüy-Ring, metoda rozlévání kapky a metoda rozšiřování oleje. Výsledky byly zhodnoceny a metody byly znovu zopakovány pro novou sadu supernatantů za účelem ověření reprodukovatelnosti produkce. Výsledky všech testů byly porovnány a následně byli určeni tři nejspolehlivější termofilní bakteriální producenti., The subject of the bachelor thesis is the production of biosurfactants by selected thermophilic bacteria. The theoretical part contains a general characterization of thermophilic bacteria, describes the structures and classification of biosurfactants, characterizes their properties and uses. The final part of the theoretical part deals with the production of biosurfactants by thermophilic bacteria. The experimental part deals with the screening of biosurfactant production by selected thermophilic bacteria. Thermophilic bacteria were obtained from composts and activated sludges. Isolation is not a subject of the thesis. In total 39 bacterial isolates were cultivated and their supernatants were tested by screening methods – emulsification capacity assay and solubilization of crystalline anthracene. Based on the results of these methods, 14 most promising producers were selected. These bacterial strains were re-cultured to obtain a new set of supernatants. For more detailed screening of production by selected thermophilic bacteria, in addition to determining the activity of the emulsion and solubilization of crystalline anthracene, other methods were added: direct surface tension measurement – Du-Noüy-Ring, drop pouring method and oil spreading method. The results were evaluated and the measurements were repeated for a new set of supernatants to verify the reproducibility of the production. The results of all the tests were compared and then three most reliable thermophilic bacterial producers were determined.

Patogeny jsou organismy, které jsou příčinou různých onemocnění hostitele. Patří zde: priony, viry, bakterie, houby, prvoci a živočichové. Tato bakalářská práce je zaměřená konkrétně na viry, způsobující lidská onemocnění jako jsou závažné respirační syndromy, onemocnění jater či rakovina děložního čípku. Cílem této bakalářské práce bylo pomocí webové aplikace Palindrome analyser charakterizovat přítomnost a umístění inverzních repetic v genomech organismů, které jsou patogenní pro lidský organismus. Byly vybrány 4 viry, z nichž dva jsou ze skupiny DNA virů a dva ze skupiny RNA virů. S ohledem na propuknutí pandemie na začátku roku 2020, kterou způsobil virus SARS-CoV-2, je v této bakalářské práci zařazen. Z RNA virů byly tedy vybrány: SARS-CoV a SARS-CoV-2. Z DNA virů byly vybrány: virus Hepatitis B a lidský papilomavirus. Sekvence virových genomů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Poté byly pomocí programu Palindrome analyser, který je dostupný online, analyzovány všechny čtyři viry na přítomnost inverzních repetic, jejich polohu a velikost. Největším genomem byl SARS-CoV-2 s velikostí 29 903 bp, který měl zároveň nejvíce inverzních repetic., Pathogens are organisms that cause various host diseases. These include prions, viruses, bacteria, fungi, protozoa and animals. This bachelor thesis is focused specifically on viruses causing human diseases such as severe respiratory syndromes, liver diseases or cervical cancer. The aim of this bachelor thesis was to characterize the presence and location of inverted repeats in the genomes of organism using the web application Palindrome analyzer. Four viruses were selected, two of them are from the group of DNA viruses and two from the group of RNA viruses. In view of the outbreak of a pandemic in early 2020 caused by virus SARSCoV-2, is included in this bachelor thesis. Thus, SARS-CoV and SARS-CoV-2 were selected from RNA viruses and hepatitis B virus and human papillomavirus were selected from the DNA viruses. The sequences of the viral genomes were obtained from the NCBI (National Center for Biotechnology) database. Then, all four viruses were analyzed for the presence of inverse repeats, their location and size using the Palindrome analyzer, which is available online. The largest genome was SARS-CoV-2 of 29 903 bp, which also had the most inverse repeats.

Předmětem bakalářské práce je produkce biosurfaktantů vybranými termofilními bakteriemi. Teoretická část obsahuje obecnou charakterizaci termofilních bakterií, popisuje struktury a klasifikaci biosurfaktantů, charakterizuje jejich vlastnosti a využití. Závěr teoretické části se věnuje produkci biosurfaktantů termofilními bakteriemi. Experimentální část se zabývá screeningem produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií. Termofilní bakterie byly získány z kompostů a aktivovaných kalů. Izolace není předmětem bakalářské práce. Celkově 39 bakteriálních izolátů bylo kultivováno a supernatanty kultivačního média byly testovány screeningovými metodami na přítomnost biosurfaktantů, a to stanovením aktivity emulze a solubilizací krystalického antracenu. Na základě výsledků těchto metod bylo vybráno 14 nejatraktivnějších producentů. Vybrané bakteriální kmeny byly znovu kultivovány a byla tak získána nová sada supernatantů. Pro podrobnější screening produkce vybranými termofilními bakteriemi byly kromě stanovení aktivity emulze a solubilizace krystalického antracenu přidány další metody: přímé měření povrchového napětí – Du-Noüy-Ring, metoda rozlévání kapky a metoda rozšiřování oleje. Výsledky byly zhodnoceny a metody byly znovu zopakovány pro novou sadu supernatantů za účelem ověření reprodukovatelnosti produkce. Výsledky všech testů byly porovnány a následně byli určeni tři nejspolehlivější termofilní bakteriální producenti., The subject of the bachelor thesis is the production of biosurfactants by selected thermophilic bacteria. The theoretical part contains a general characterization of thermophilic bacteria, describes the structures and classification of biosurfactants, characterizes their properties and uses. The final part of the theoretical part deals with the production of biosurfactants by thermophilic bacteria. The experimental part deals with the screening of biosurfactant production by selected thermophilic bacteria. Thermophilic bacteria were obtained from composts and activated sludges. Isolation is not a subject of the thesis. In total 39 bacterial isolates were cultivated and their supernatants were tested by screening methods – emulsification capacity assay and solubilization of crystalline anthracene. Based on the results of these methods, 14 most promising producers were selected. These bacterial strains were re-cultured to obtain a new set of supernatants. For more detailed screening of production by selected thermophilic bacteria, in addition to determining the activity of the emulsion and solubilization of crystalline anthracene, other methods were added: direct surface tension measurement – Du-Noüy-Ring, drop pouring method and oil spreading method. The results were evaluated and the measurements were repeated for a new set of supernatants to verify the reproducibility of the production. The results of all the tests were compared and then three most reliable thermophilic bacterial producers were determined.

Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen., This bachelor thesis is focused on stress resistance of PHA accumulating bacteria against unfavourable conditions associated with gastrointestinal tract. Two bacterial strains were chosen as model microorganisms for this purpose. Cupriavidus necator H16 producing PHA and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 without the ability of PHA accumulation. Firstly, three gastrointestinal juices of different concentrations were chosen for the experimental part, namely gastric, bile and pancreatic juices. The stressed bacterial strain was then determined using a spread plate method and a flow cytometry. Other methods used include antimicrobial tests. The agar diffusion method was first tested to determine the size of the inhibition zones. The last method that has been performed is the broth dilution method, which serves to compare the absorbance of pure bacterial suspensions and stressed suspensions with the given juice of a certain concentration. The results show that the production of PHA represents a disadvantage in context of conditions associated with gastrointestinal tract of accumulating bacterial strain.

Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství., The aim of this bachelor thesis is to document production of polyhydroxyalkanoates in selected bacterial strains, which were Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus thermostellatus. In the case of the microorganisms Tepidiphilus thermophilus and Pseudomonas thermotolerans, the production of PHA´s has not yet been described, and in the Chelatococcus bacteria, which were analysed in this work, the production has not yet been documented by electron microscopy. In this work, the selected producers were analysed by flow cytometry first, using BODIPY and Nile Red as fluorescence probes. Selected producers, for which was production confirmed, were analysed by other methods, such as fluorescence microscopy, cryo scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In the bacterial culture of Pseudomonas thermotolerans, PHA´s production wasn´t confirmed by the first analysis by flow cytometer. For other microorganisms was production confirmed. Chelatococcus bacteria clearly proved to be better producers. Bacterial cells of Tepidiphilus thermophilus produced smaller granules and in lower amount.

Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen., This bachelor thesis is focused on stress resistance of PHA accumulating bacteria against unfavourable conditions associated with gastrointestinal tract. Two bacterial strains were chosen as model microorganisms for this purpose. Cupriavidus necator H16 producing PHA and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 without the ability of PHA accumulation. Firstly, three gastrointestinal juices of different concentrations were chosen for the experimental part, namely gastric, bile and pancreatic juices. The stressed bacterial strain was then determined using a spread plate method and a flow cytometry. Other methods used include antimicrobial tests. The agar diffusion method was first tested to determine the size of the inhibition zones. The last method that has been performed is the broth dilution method, which serves to compare the absorbance of pure bacterial suspensions and stressed suspensions with the given juice of a certain concentration. The results show that the production of PHA represents a disadvantage in context of conditions associated with gastrointestinal tract of accumulating bacterial strain.

Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství., The aim of this bachelor thesis is to document production of polyhydroxyalkanoates in selected bacterial strains, which were Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus thermostellatus. In the case of the microorganisms Tepidiphilus thermophilus and Pseudomonas thermotolerans, the production of PHA´s has not yet been described, and in the Chelatococcus bacteria, which were analysed in this work, the production has not yet been documented by electron microscopy. In this work, the selected producers were analysed by flow cytometry first, using BODIPY and Nile Red as fluorescence probes. Selected producers, for which was production confirmed, were analysed by other methods, such as fluorescence microscopy, cryo scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In the bacterial culture of Pseudomonas thermotolerans, PHA´s production wasn´t confirmed by the first analysis by flow cytometer. For other microorganisms was production confirmed. Chelatococcus bacteria clearly proved to be better producers. Bacterial cells of Tepidiphilus thermophilus produced smaller granules and in lower amount.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu., This bachelor's thesis is focused on investigating the effect of different stress factors on the bacteria Schlegelella thermodepolymerans, which is capable of producing polyhydroxyalkanoates. In this case, in the form of poly(3-hydroxybutyrate). The selected stress factors were temperature shock, repeated freezing and defrosting. The last stress factor was osmotic stress, caused by sodium chloride solutions of different concentrations. In the theoretical part, polyhydroxyalkanoates, thermophilic organisms, mechanisms of individual stresses and methods of analysis of polyhydroxyalkanoates were characterized. In the experimental part, two strains of the thermophilic bacteria Schlegelella thermodepolymerans were compared, namely M 15344 and DSM 15344. The stress resistance of both strains was compared by measuring viability using flow cytometry. During the measurement, the increase in optical density was monitored, and the content of P(3HB) in the biomass was determined using GC-FID. Morphological changes caused by stresses were observed using Cryo-SEM and STEM electron microscopy methods. The DSM 15344 strain showed better growth and P(3HB) production than the M 15344 strain, which, on the other hand, showed better stress resistance.

Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu., This bachelor's thesis is focused on investigating the effect of different stress factors on the bacteria Schlegelella thermodepolymerans, which is capable of producing polyhydroxyalkanoates. In this case, in the form of poly(3-hydroxybutyrate). The selected stress factors were temperature shock, repeated freezing and defrosting. The last stress factor was osmotic stress, caused by sodium chloride solutions of different concentrations. In the theoretical part, polyhydroxyalkanoates, thermophilic organisms, mechanisms of individual stresses and methods of analysis of polyhydroxyalkanoates were characterized. In the experimental part, two strains of the thermophilic bacteria Schlegelella thermodepolymerans were compared, namely M 15344 and DSM 15344. The stress resistance of both strains was compared by measuring viability using flow cytometry. During the measurement, the increase in optical density was monitored, and the content of P(3HB) in the biomass was determined using GC-FID. Morphological changes caused by stresses were observed using Cryo-SEM and STEM electron microscopy methods. The DSM 15344 strain showed better growth and P(3HB) production than the M 15344 strain, which, on the other hand, showed better stress resistance.

Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu., This bachelor's thesis is focused on investigating the effect of different stress factors on the bacteria Schlegelella thermodepolymerans, which is capable of producing polyhydroxyalkanoates. In this case, in the form of poly(3-hydroxybutyrate). The selected stress factors were temperature shock, repeated freezing and defrosting. The last stress factor was osmotic stress, caused by sodium chloride solutions of different concentrations. In the theoretical part, polyhydroxyalkanoates, thermophilic organisms, mechanisms of individual stresses and methods of analysis of polyhydroxyalkanoates were characterized. In the experimental part, two strains of the thermophilic bacteria Schlegelella thermodepolymerans were compared, namely M 15344 and DSM 15344. The stress resistance of both strains was compared by measuring viability using flow cytometry. During the measurement, the increase in optical density was monitored, and the content of P(3HB) in the biomass was determined using GC-FID. Morphological changes caused by stresses were observed using Cryo-SEM and STEM electron microscopy methods. The DSM 15344 strain showed better growth and P(3HB) production than the M 15344 strain, which, on the other hand, showed better stress resistance.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Predložená bakalárska práca sa zaoberá štúdiom biotechnologickej produkcie polyhydroxyalkoanátov (PHA), použitím hydrolyzátov z pivovarského mláta a vybraných bakteriálnych zástupcov rodu Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas a Burkholderia. Cieľom tejto práce bolo zistiť, či hydrolyzáty pochádzajúce z pivovarského mláta môžu slúžiť ako vhodný substrát pri produkcii PHA. Dôraz bol pritom kladený na rôzne spôsoby predúpravy lignocelulózneho materiálu. Pivovarské mláto bolo podrobené kvantitatívnej analýze a pre komerčný enzýmový kokteil používaný pri hydrolýze, bolo stanovené teplotné a pH optimum. Najefektívnejšia premena cukrov na PHA bola dosiahnutá u baktérie H. organivorans za použitia hydrolyzátu mláta, ktoré bolo upravené plazmou. Hydrolyzáty, ktoré boli pripravené šetrnejšími metódami, obsahovali menej bakteriálnych inhibítorov a dostatočné množstvo cukrov, čím slúžili ako vhodnejší substrát pre rast mikroroganizmov., The presented bachelor thesis deals with the study of biotechnological production of polyhydroxyalkoanates (PHA), using hydrolysates from brewer’s spelt grain (BSG) and selected bacterial strains Schlegelella, Halomonas, Tepidimonas and Burkholderia. The thesis aims to determine whether it is possible to use BSG hydrolysates as a substrate for PHA production, with the emphasis on different pretreatment methods of the lignocellulosic material. BSG was submitted to quantitative analysis and the optimum temperature and pH of the commercial enzymatic cocktail used for the hydrolysation was determined. The most effective transformation of sugars to PHA was accomplished by bacteria H. organivorans with the use of a hydrolysate from plasma pretreated BSG. Hydrolysates which were prepared with moderate methods, contained less bacterial inhibitors and sufficient amounts of sugars. These hydrolysates served therefore as preferable substrates for the microorganism growth.

Rekombinantné proteíny sú produkované využitím genetických modifikácií. Pri tomto procese sa do hostiteľského organizmu vkladá klonovací vektor s obsahom génu kódujúceho určitý proteín. Po transformácii klonovacieho vektoru do hostiteľského jedinca dochádza k produkcii rekombinantných proteínov. Expresia rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách je jedným z najefektívnejších spôsobov produkcie vybraných proteínov, za cieľom vyššej produkcie, zlepšených vlastností atď. Proteín p53 je nádorový supresorový proteín, ktorého hlavnou úlohou v bunkách je reagovať na poškodenie bunky. V dôsledku reakcie na rôzne vonkajšie alebo vnútorné podnety, vrátane poškodenia DNA, vykazuje proteín p53 rôzne biologické funkcie, ako je napríklad regulácia starnutia, bunkového cyklu či apoptózy. Teoretická časť je zameraná na charakteristiku základných vlastností proteínov, spôsoby ich využitia a metódy expresie rekombinantných proteínov, charakterizáciu proteínu p53 a metódy izolácie proteínov. Cieľom experimentálnej práce bolo určiť vplyv teploty inkubácie na produkciu rekombinantného proteínu p53. Súčasťou práce je izolácia plazmidovej DNA a jej následná transformácia do produkčných buniek E.coli. Produkované proteíny boli úspešne izolované a následne charakterizované pomocou SDS-PAGE a „Western Blottingu“., Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.

Bakalárska práca sa zaoberá využitím osmotického stresu ako nástroja evolučného inžinierstva PHA produkujúcich bakteriálnych kmeňov. Cieľom práce je posúdiť využiteľnosť adaptácie mikroorganizmov na hypoosmotické prostredie ako inžinierskeho nástroja na ovplyvnenie efektivity biosyntézy PHA. Teoretická časť práce sa zaoberá princípom evolučného inžinierstva, metódami tejto stratégie a vplyvom fyzikálnych faktorov na mikroorganizmus. V rámci experimentálnej časti bol realizovaný experiment adaptívnej laboratórnej evolúcie s využitím bakteriálneho kmeňa Halomonas halophila CCM 3662. Ako stresový faktor počas sériovej kultivácie bol aplikovaný osmotický tlak v podobe zníženej koncentrácie soli v produkčnom médiu. Za účelom vyvinutia PHA produkujúcich adaptovaných mutantných kmeňov boli jednotlivé pasáže analyzované pomocou metód spektrofotometrie, gravimetrie a GC-FID. Na základe výsledkov dlhodobej kultivácie bol zistený adaptačný potenciál kmeňa HH35, kultivovaného pri 35 g/l NaCl, u ktorého obsah biomasy a koncentrácia PHB vykazovali najvyššie hodnoty. Z jednotlivých generácií kmeňa HH35 bola pre podrobnejšiu analýzu vybraná 15. pasáž a 30. pasáž, ktoré spolu s kontrolným divokým kmeňom H. halophila, boli podrobené hyperosmotickému a hypoosmotickému šoku. Pomocou metód FC a TGA bola sledovaná stresová odpoveď bakteriálnych kmeňov, v snahe zistenia viability buniek či potenciálnych morfologických zmien. Vyizolované polyméry boli charakterizované FTIR analýzou., This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.

Předmětem bakalářské práce je produkce biosurfaktantů vybranými termofilními bakteriemi. Teoretická část obsahuje obecnou charakterizaci termofilních bakterií, popisuje struktury a klasifikaci biosurfaktantů, charakterizuje jejich vlastnosti a využití. Závěr teoretické části se věnuje produkci biosurfaktantů termofilními bakteriemi. Experimentální část se zabývá screeningem produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií. Termofilní bakterie byly získány z kompostů a aktivovaných kalů. Izolace není předmětem bakalářské práce. Celkově 39 bakteriálních izolátů bylo kultivováno a supernatanty kultivačního média byly testovány screeningovými metodami na přítomnost biosurfaktantů, a to stanovením aktivity emulze a solubilizací krystalického antracenu. Na základě výsledků těchto metod bylo vybráno 14 nejatraktivnějších producentů. Vybrané bakteriální kmeny byly znovu kultivovány a byla tak získána nová sada supernatantů. Pro podrobnější screening produkce vybranými termofilními bakteriemi byly kromě stanovení aktivity emulze a solubilizace krystalického antracenu přidány další metody: přímé měření povrchového napětí – Du-Noüy-Ring, metoda rozlévání kapky a metoda rozšiřování oleje. Výsledky byly zhodnoceny a metody byly znovu zopakovány pro novou sadu supernatantů za účelem ověření reprodukovatelnosti produkce. Výsledky všech testů byly porovnány a následně byli určeni tři nejspolehlivější termofilní bakteriální producenti., The subject of the bachelor thesis is the production of biosurfactants by selected thermophilic bacteria. The theoretical part contains a general characterization of thermophilic bacteria, describes the structures and classification of biosurfactants, characterizes their properties and uses. The final part of the theoretical part deals with the production of biosurfactants by thermophilic bacteria. The experimental part deals with the screening of biosurfactant production by selected thermophilic bacteria. Thermophilic bacteria were obtained from composts and activated sludges. Isolation is not a subject of the thesis. In total 39 bacterial isolates were cultivated and their supernatants were tested by screening methods – emulsification capacity assay and solubilization of crystalline anthracene. Based on the results of these methods, 14 most promising producers were selected. These bacterial strains were re-cultured to obtain a new set of supernatants. For more detailed screening of production by selected thermophilic bacteria, in addition to determining the activity of the emulsion and solubilization of crystalline anthracene, other methods were added: direct surface tension measurement – Du-Noüy-Ring, drop pouring method and oil spreading method. The results were evaluated and the measurements were repeated for a new set of supernatants to verify the reproducibility of the production. The results of all the tests were compared and then three most reliable thermophilic bacterial producers were determined.