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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-10-03Bitstream added on 2014-06-13T19:19:45Z : No. of bitstreams: 1 nocelli_rcf_dr_rcla.pdf: 1089194 bytes, checksum: d94d842fe2798cc20aada21e5deda369 (MD5) Neste estudo foram analisados, histologicamente, o desenvolvimento pós-embrionário das glândulas de veneno e de Dufour, bem como os efeitos da aplicação tópica de hormônio juvenil, sobre a glândula de veneno do híbrido de Apis mellifera L., conhecido como abelha africanizada. Análises morfométricas comparativas das glândulas de veneno e de Dufour e bioquímicas da glândula de veneno da abelha africanizada e de três subespécies, A. m. ligustica, A. m. carnica e A. m. caucasica, foram, também, realizadas. As análises histológicas do desenvolvimento pós-embrionário mostraram que existem três pares de discos imaginais presentes no 7 , 8 e 9 segmentos larvais. Durante a metamorfose o par de discos do 7 segmento forma a placa subgenital, aquele do 8 origina as lancetas do ferrão e o par presente no 9 segmento origina as glândulas de veneno e de Dufour, além dos palpos do ferrão e bainha. Conforme mostrado histologicamente, as transformações glandulares que ocorrem durante a metamorfose, não foram influenciadas pelo hormônio juvenil exógeno, mas houve aceleração do ciclo secretor glandular em relação ao controle, em todas as idades analisadas nas glândulas de operárias que receberam aplicação de hormônio juvenil diluído em hexano e de hexano puro, durante o 5º estágio e na emergência. Estes dados indicam que o hormônio juvenil atua sobre a glândula de veneno e que esta atuação pode estar sendo potencializada pelo solvente utilizado. As análises morfométricas e bioquímicas comparativas da glândula de veneno mostraram que, as glândulas de abelhas africanizadas, tanto de operárias quanto de rainhas, apesar de maiores do que as das subespécies, possuem menor teor de proteína total. O perfil eletroforético protéico de tais glândulas revelaram que a única diferença entre as operárias ocorreu nas recém-emergidas de... . The present histological investigation analyzed the post-embryonary development of the Dufour and venom glands, as well as the juvenile hormone effect on the venom gland in Apis mellifera hybrids, which are also known as Africanized bees. Comparative morphometric and biochemical analyses of the venom gland in Africanized bee and in three subspecies, A. m. ligustica, A. m. carnica and A. m. caucasica, were also done. The histological post-embryonary development results showed three pair of imaginal discs present in segments 7th, 8th and 9th. During the metamorphosis, the pair of imaginal discs of segment 7th originates the subgenital plate, those of segment 8th originates the sting lancets and the pair of segment 9th originates the Dufour and venom glands, besides originates the oblong plates and sheath lobes of the sting. As shown by the histology, the glandular changes that occur in the venom gland during metamorphosis of workers treated with diluted juvenile hormone and pure hexane during 5th instars and emergence are not influenced by the exogenous juvenile hormone, but there was an increasing of the glandular cycle in relationship to the control. These data suggest that the juvenile hormone actuate on the venom gland and the solvent used may enhance such juvenile hormone action. The comparative morphometric and biochemical analyses of the venom gland showed that although the Africanized bee glands are larger than the subspecies, both workers and queens presented less amount of total protein. The eletrophoretic profile of the venom glands showed that, among workers, only A. m. caucasia does not present the 105.4 kDa band. Among queens, only A. m. ligustica does not present the 161.3 kDa band. The morphometric analyses showed a gradual increasing of the Dufourþs gland length from newly emerged to forager workers, and from virgin to fecundated queens, indicating that the venom gland is more developed in forager workers and in fecundated queens.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Ecotoxicological tests realized to assess the environmental risks of pesticides to bees used by countries around the world are based on the protocols developed by the Organization for Economic and Cooperation, where is recommended the use of isolated active ingredients in surrogate species Apis mellifera Linnaeus, 1758 (Hymenoptera, Apidae). Once the representativeness of these protocols concerning the surrogate and pesticide mixtures is pointed out as gaps regarding the pesticide risk assessment, the development of ecotoxicological studies about stingless bees is a crucial step toward achieving a more protective regulatory process in Brazil. The present work evaluated the toxicity of a neonicotinoid commercial product, isolated and combined with an herbicide and a fungicide in three species of stingless bees considered possible surrogates for the assessment of environmental risk in pollinators in Brazil Tetragonisca angustula Latreille, 1811 (Hymenoptera, Apidae), Scaptotrigona postica Latreille, 1807 (Hymenoptera, Apidae) and Melipona scutellaris Laitrelle, 1811 (Hymenoptera, Apidae).Through adapted oral toxicity tests and comparison of the sensitivity of these bees with the current biological model, we highlight that existing protocols do not protect stingless bee biodiversity due to the greater sensitivity found in representatives and due to toxicological interactions when the insecticide was offered in binary combinations. Therefore, it is a major necessity to incorporate these pollinators into the Brazilian environmental risk assessment process and create regulations regarding the use of mixtures before or after pesticide application. Os ensaios toxicológicos utilizados como padrão para avaliação de risco ambiental de agrotóxicos em abelhas adotados pelo Brasil e por outros países do mundo são estabelecidos pelos protocolos desenvolvidos pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico, onde é recomendado o uso de ingredientes ativos na espécie Apis mellifera Linnaeus, 1758 (Hymenoptera, Apidae). Em um contexto em que são apontadas lacunas quanto a representatividade desses protocolos em relação ao modelo biológico utilizado e a misturas entre diferentes classes de agrotóxicos, estudos ecotoxicológicos envolvendo abelhas nativas sem ferrão são passos importantes para o desenvolvimento de um processo regulatório mais protetivo no Brasil. O presente trabalho, avaliou a toxicidade de um produto comercial da classe dos neonicotinoides de maneira isolada e combinada a um herbicida e um fungicida em três espécies de abelhas sem ferrão consideradas modelos biológicos para a avaliação de risco ambiental em polinizadores no Brasil Tetragonisca angustula Latreille, 1811 (Hymenoptera, Apidae), Scaptotrigona postica Latreille, 1807 (Hymenoptera, Apidae) e Melipona scutellaris Laitrelle, 1811 (Hymenoptera, Apidae). Utilizando testes de toxicidade oral adaptados e comparando a sensibilidade dessas abelhas com o atual modelo biológico constatamos que os protocolos existentes não são protetivos devido a maior sensibilidade encontrada nos representantes desse grupo de abelhas e a interações toxicológicas quando o inseticida foi ofertado em combinações binárias. É necessário, portanto, incorporar esses polinizadores no processo de avaliação de risco ambiental brasileiro e criar regulamentações em relação ao uso de misturas antes ou após a aplicação. 001

Outra Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Pollination is an important process for maintaining biodiversity, and bees are the main pollinators of most natural environments. Among the species found in Brazil, is Scaptotrigona postica Latreille, 1807, a species with stunted, eussocial and belonging to the Trigonini tribe. Even though bees are considered of extreme importance, some actions are causing the population of these insects to decrease, as is the case of the exaggerated and mistaken use of pesticides. This study aimed to expose forage bees, orally, to sublethal concentrations isolated from the insecticide dimetoate and the fungicide azoxystrobin (acute and chronic exposure), and also to evaluate and compare the morphological changes caused in the midgut and Malpighian tubules by both types of exposure. The morphological analyzes were made from sections carried out in microtome, in different depths of the organs, which underwent double staining techniques using Hematoxylin and Eosin. The slides were analyzed taking into account the following changes in the organs: loss of cytoplasmic material, loss of brush border, elimination of cells to the lumen, loss of regenerative cell nests, cell swelling, cells with pycnotic nuclei, apocrine secretion and spherocrystals. For each observed change, a pre-established score value was used, which depends on the intensity of the change in the organ. From the results obtained, it was observed that acute and chronic exposure to sublethal concentrations of pesticides were able to cause changes in the parameters mentioned, in both organs, with the exception of apocrine and spherocrystal secretion. Thus, it is concluded that acute and chronic exposure to sublethal concentrations of dimethoate and azoxystrobin cause morphological changes in important organs involved in the metabolic route of pesticides in S. postica. A polinização é um processo importante para a manutenção da biodiversidade, sendo que as abelhas são os principais polinizadores de grande parte dos ambientes naturais. Dentre as espécies encontradas no Brasil, está Scaptotrigona postica Latreille, 1807, uma espécie com ferrão atrofiado, eussocial e pertencente à tribo Trigonini. Mesmo as abelhas sendo consideradas de extrema importância, algumas ações estão fazendo com que a população desses insetos diminua, como é o caso do uso inadequado de agrotóxicos. Este trabalho teve como objetivo expor as abelhas forrageiras, de forma oral, à concentrações subletais isoladas do inseticida dimetoato e do fungicida azoxistrobina (exposição aguda e crônica), e também avaliar e comparar as alterações morfológicas causadas no intestino médio e nos túbulos de Malpighi por ambos os tipos de exposições. As análises morfológicas foram feitas a partir de secções realizadas em micrótomo, em diferentes profundidades dos órgãos, as quais passaram por técnicas de dupla coloração por Hematoxilina e Eosina. As lâminas foram analisadas levando-se em consideração as seguintes alterações nos órgãos: perda de material citoplasmático, perda de borda em escova, eliminação de células para o lúmen, perda de ninhos de células regenerativas, inchaço celular, células com núcleos picnóticos, secreção apócrina e esferocristais. Para cada alteração observada, foi utilizado um valor de pontuação pré-estabelecido, que depende da intensidade da alteração no órgão. A partir dos resultados obtidos, foi observado que as exposições aguda e crônica às concentrações subletais dos agrotóxicos foram capazes de causar as alterações nos parâmetros citados, em ambos os órgãos, com exceção de secreção apócrina e esferocristais. Entretanto, a exposição crônica causou maiores prejuízos. Desta forma, conclui-se que tanto a exposição aguda quanto a crônica às concentrações subletais de dimetoato e azoxistrobina causam alterações morfológicas em importantes órgãos envolvidos na rota metabólica de agrotóxicos em S. postica. FUNEP: 2790 CAPES: 88882.441212/2019-01 FAPESP: 2017/21097-3

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Pollination is one of the most important ecosystem services for maintaining biodiversity, as it is a key process for restoring the function of altered ecosystems. It is largely carried out by bees both in agricultural and natural systems. Nevertheless, this process has been highly impacted by anthropogenic impacts in the environment. The restoration of these environments aims to reestablish these interactions by replacing the local flora. This work aimed to evaluate if the floristic composition of a restoration area is a place with important food resources for the bees. from the distribution of floral resources over a year. The floristic survey was made in a fragment under restoration inserted in an agricultural matrix, located in Holambra / SP. Field activities took place monthly from January to December 2018 in three parcels of 1,500m² each. Samples of flowering plant species were collected from each plot and the exsiccates were prepared and processed and incorporated into the UNESP campus Rio Claro Herbarium collection. Each species was identified and confirmed by experts, and information on the main pollination syndrome, habit, main floral resource offered to pollinators (pollen, nectar, oil) and origin (native or non-native) were obtained from specialized literature. To evaluate the distribution of floral resources during the year, we used circular analysis and applied the Rayleigh test (p) to identify the occurrence of seasonality and Pearson's index using the BioStat Pro 6.0 program to evaluate the occurrence or not of correlation between flowering and climatic factors such as temperature and temperature. precipitation. The families Asteraceae and Fabaceae presented the largest number of flowering species, with the most abundant species of herbaceous habit. About 75% of the identified plants were pollinated by bees, the most frequent syndrome. Among the melitophilous plants, the native species were the most frequent (70.5%) and in relation to the distribution of floral resources, the melitophilic plants presented seasonality in the flowering period, with peak in the rainy months, being the nectariferous species the most abundant. There were no representatives of non-native oil producing species. Regarding resource distribution in the stratification, native tree and shrub species flourished in greater numbers in the rainy season, while non-native species of these habits had a peak of flowering in the dry period. Native and non-native herbaceous plants bloomed most in the rainy months and lianas showed no flowering seasonality for nectar and pollen for both native and non-native species. The results showed that the vertical forest stratification is important for the supply of floral resources to pollinators, however herbaceous plants stood out in relation to the richness and abundance of flowering plants, both native and non-native, providing nectar, pollen and oil for the bees. These species are usually considered as weeds in agricultural environments being eliminated as a part of the management in these areas, extinguishing food sources for bees. The distribution of floral resources in stratification was quite variable, as floral resources were available in both dry and rainy periods of the year, highlighting the importance of the study area as an interesting place for bee survival. Verifying the distribution of floral resources is important because it provides information for the conservation of bees, showing the periods of abundance and food shortage, allowing the improvement of ecological management projects. A polinização é um dos serviços ecossistêmicos mais importantes para a manutenção da biodiversidade, pois é um processo chave para o restabelecimento da função dos ecossistemas alterados. Ela é realizada, em grande parte, por abelhas e apresenta importância ecológica em sistemas agrícolas e naturais. Apesar disso, este processo tem sido altamente impactado pelas alterações antrópicas nos ambientes. Logo, a restauração desses ambientes tem como objetivo restabelecer essas interações, a partir da reposição da flora local. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar se a composição florística de uma área de restauração é um local com importantes recursos alimentares para as abelhas, a partir da distribuição dos recursos florais durante um ano, promovendo a conservação desses insetos. O levantamento florístico foi feito em um fragmento em restauração inserido em uma matriz agrícola, localizado no município de Holambra/SP. As atividades de campo ocorreram mensalmente entre janeiro a dezembro de 2018 em três parcelas de 1.500m² cada. Em cada parcela foram coletadas amostras das espécies vegetais em floração e preparadas as exsicatas, que foram processadas e incorporadas na coleção do Herbário da UNESP campus Rio Claro. Cada espécie foi identificada e confirmadas por especialistas, e as informações sobre a principal síndrome de polinização, hábito, principal recurso floral oferecido aos polinizadores (pólen, néctar, óleo) e a origem (nativa ou não-nativa), foram obtidas a partir de literatura especializada. Para avaliar a distribuição de recursos florais durante o ano, nós utilizamos a análise circular e aplicamos o teste de Rayleigh (p) para identificar a ocorrência de sazonalidadede e o índice de Pearson pelo programa BioStat Pro 6.0 para avaliar a ocorrência ou não de correlação entre a floração e os fatores climáticos, como a temperatura e precipitação. As famílias Asteraceae e Fabaceae apresentaram o maior número de espécies em floração, tendo as espécies de hábito herbáceo o mais abundante. Cerca de 75% das plantas identificadas apresentaram síndrome de polinização por abelhas, sendo a síndrome mais frequente. Dentre as plantas melitófilas, as espécies nativas foram as mais ocorrentes (70,5%) e em relação a distribuição de recursos florais, as plantas melitófilas apresentaram sazonalidade no período de floração, com pico nos meses chuvosos, sendo as espécies nectaríferas as mais abundantes. Não houve representantes de espécies produtoras de óleo de origem nãonativa. Em relação a distribuição de recursos na estratificação, as espécies arbóreas e arbustivas nativas floresceram em maior número no período chuvoso, enquanto as espécies não-nativas desses hábitos tiveram pico de floração no período seco. As herbáceas nativas e não-nativas floresceram em maior número nos meses chuvosos e as trepadeiras não apresentaram sazonalidade de floração para néctar e pólen tanto para espécies nativas quanto não para não-nativas. Os resultados mostraram que toda a estratificação é importante para o fornecimento de recursos florais aos polinizadores, no entanto as plantas de hábito herbáceo se destacaram em relação a riqueza e abundancia de plantas em flor, tanto de origem nativa quanto não-nativas, fornecendo néctar, pólen e óleo para as abelhas. Essas espécies normalmente são consideradas infestantes em meios agrícolas e são eliminadas como forma de manejo nessas áreas, extinguindo fontes de alimento para as abelhas. A distribuição de recursos florais na estratificação foi bem variável, pois houve recursos florais disponíveis nos dois períodos secos e chuvosos do ano, mostrando que a área de estudo se torna um local interessante para a sobrevivência das abelhas. Verificar a distribuição de recursos florais é importante pois fornece informações para fins de conservação das abelhas na área, mostrando os períodos de abundância e escassez de alimento, permitindo a melhoria de projetos de manejo das áreas.

Orientadores: Felix Guillermo Reyes Reyes, Nadia Regina Rodrigues Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A contaminação por agrotóxicos de diferentes grupos químicos e diferentes classes provocam alterações no desenvolvimento do sistema imunológico e do sistema nervoso de abelhas, afetando a polinização. No Brasil, um dos maiores produtores agrícolas mundiais, colmeias de abelhas vêm sendo perdidas devido ao manejo equivocado de agrotóxicos. O mel e a cera de abelhas podem ser utilizados como indicadores ambientais desse tipo de contaminação. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de métodos analíticos para a determinação de resíduos de agrotóxicos no mel e cera de abelhas, utilizando técnicas de cromatografia líquida e cromatografia gasosa, acopladas a sistemas de detecção por espectrometria de massas e por fluorescência. A técnica de extração QuEChERS foi aplicada em amostras de cera brasileira e as mesmas foram analisadas por cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa (GC-MS/MS). Foram investigados 160 agrotóxicos e, das 19 amostras de ceras, 90% apresentaram um ou mais agrotóxicos. A estimativa do risco de exposição, calculada através do quociente de risco e dose letal (DL50), indicou um risco elevado para as abelhas devido à presença de clorpirifós e permetrina. Já na identificação e quantificação do herbicida glifosato e seu metabólito [ácido aminometilfosfônico (AMPA)] em amostras de mel, foi possível, através da técnica de cromatografia liquida acoplada ao detector específico de fluorescência, atingir níveis de LOQ de 0,04 mg kg-1, permitindo uma quantificação com exatidão e precisão necessárias. De 40 amostras de mel brasileiro, 06 apresentaram resíduos acima do limite máximo de resíduos (LMR) aceitáveis para essa matriz na Comunidade Europeia (50 µg kg-1). Por fim, no desenvolvimento de um método para a identificação dos inseticidas clorpirifós, dimetoato, imidacloprido, clotianidina, permetrina e cipermetrina em mel através da técnica cromatografia luqida acoplada a espectrometria de massas, foi aplicada a abordagem de Plackett-Burman para otimizar o preparo de amostras baseado em QuEChERS e d-SPE, economizando tempo e solventes. Este método foi então aplicado a 51 amostras de mel do Brasil e exterior, sendo que uma amostra apresentou resíduos em níveis de 102 µg kg-1 de cipermetrina, acima do LMR permitido. Os resultados obtidos demonstram a importância do monitoramento de agrotóxicos e a necessidade de novas práticas agrícolas e apícolas para a manutenção das colmeias e dos insetos polinizadores Abstract: Contamination by pesticides from different chemical groups and different classes causes changes in the development of the immune system and of the nervous system of bees, affecting pollination. In Brazil, one of the largest agricultural producers in the world, beehives have been lost due to the mismanagement of pesticides. Honey and beeswax can be used as environmental indicators of this type of contamination. The present work aimed to develop and validation of analytical methods for the determination of pesticide residues in honey and beeswax, using liquid chromatography and gas chromatography techniques, coupled to mass spectrometry and fluorescence detection systems. The QuEChERS extraction technique was applied in Brazilian wax samples, and they were analyzed by gas chromatography with mass spectrometry (GC - MS/MS). A total of 160 pesticides were investigated and, of the 19 wax samples, 90% presented one or more pesticides. The exposure risk estimate calculated using the hazard quotient and lethal dose (DL50), indicated a high risk to the bees due to the presence of chlorpyrifos and permethrin. In the identification and quantitation of the herbicide glyphosate and its metabolite [aminomethylphosphonic acid (AMPA)] in honey samples, it was possible, through the liquid chromatography technique coupled to the specific fluorescence detector, to reach LOQ levels of 0.04 mg kg-1 allowing an accurate quantitation and precision needed. Of 40 Brazilian honey samples, 06 showed residues above the permitted maximum residue limit (MRL) for honey in the European Community (50 µg kg-1). In the end, in the development of the method for the identification of the chlorpyrifos, dimethoate, imidacloprid, clothianidin, permethrin, and cypermethrin insecticides in honey by liquid chromatography wit mass spectrometry, the Plackett-Burman approach was applied to optimize sample preparation based on QuEChERS and d-SPE saving time and solvents. This method was applied to 51 honey samples from Brazil and others countries in which one sample showed residues at levels of 102 µg kg-1 of cypermethrin above the MRL. The results obtained demonstrate the importance of monitoring pesticides and the need for new agricultural and beekeeping practices for the maintenance of beehives and pollinating insects Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos CAPES 001

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Bees are the main pollinating agents of native and cultivated angiosperm plants, helping to maintain biodiversity and providing benefits in food production and savings for humans. However, the increase in temperature caused by climate change contributes to other factors, such as the incorrect use of pesticides and the degradation of forest areas in the decline of several species of bees. In this context, it is necessary to understand how the increase in temperature due to climate change will affect pollinators and what the consequences will be in the face of these changes. Thus, the study aimed to determine the average lethal time and average lethal temperatures for species of stingless bees Melipona quadrifasciata Lepeletier, 1836, when exposed to high temperatures, and to investigate the influence of local temperature and relative humidity on the behavior of species foraging. For such purposes, the work was conducted at CCA - Center for Agricultural Sciences at the Federal University of São Carlos, in Araras - SP and subdivided into two stages: In the first stage, four temperatures were tested in the laboratory using BOD 26 (control) 30, 45 and 52ºC to determine the average lethal time (TL50) and lethal temperature based on the Prechet protocol established in 1973. Foraging and foraging activities and temperature measurements were observed and recorded in the dry and rainy seasons. and relative humidity of M. quadrifasciata colonies and the environment in a fragment of seasonal Semideciduous Forest from 8 to 18 hours. The results obtained show that in relation to the exposure to the average lethal time (TL50) and the average lethal temperature, the temperatures of 45 (1 day) and 52º C (5/24) had a worse performance when compared to the temperatures of 26 (34 days) 30ºC (29 days), for causing the mortality of 50% population in a period less than one day for the bee species M. quadrifasciata, thus having significant differences (P

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) The cultivation of sugarcane is one of the oldest in human civilization. In Brazil the species Saccharum officinarum is of greater importance for the sugar-alcohol sector due to its high levels of sucrose. Over time, several factors and conditions allowed Brazil to be one of the largest producers of this cultivar. However, in order to guarantee high productivity, high levels of pesticides are applied in this crop, among which the neonicotinoid and systemic insecticide thiamethoxam (TMX) stands out. Systemic insecticides applied in crops are of great concern due to the possibility of the consumption of their derivatives by humans and animals. Therefore, considering the sugarcane juice a food matrix and the risks that TMX residues can offer, the objective of this work was to develop and validate a chromatographic method for quantification of this pesticide, as well as to evaluate its removal from aqueous and sugarcane juice media by a magnetic activated charcoal nanocomposite (AC-NP). The synthesis of ACNP was performed by the coprecipitation method, and the composite was characterized by XDR, FTIR, and SEM. After TMX adsorption assays, the pesticide was quantified by High Performance Liquid Chromatography coupled with a diode array detector (HPLCDAD) at 254 nm. The chromatographic operating conditions were: mobile phase acetonitrile:water (30:70) at 1.0 mL min-1 flow rate; C18 column; sample injection volume 20 μL; and analysis time of 6 min. The main parameters of the validation presented satisfactory results, and the selectivity of the method for TMX was observed in both water and sugarcane media, with limits of detection and quantification of 0.057 and 0.17 mg L1, respectively, and 4.6 min retention time. The matrix effect was not observed and r2 ranged from 0.9958 to 0.9985. Recovery tests presented results between 91 and 103%, and the coefficient of variation range was 1.9 – 4.3%. The nanomodification process was satisfactory and the characterization of AC-NP allowed to observe the effective impregnation of the magnetite. The TMX adsorption kinetics in sugarcane juice by ACNP was a pseudo-second order type, with r2 of 0.9999, indicating a chemical adsorption process. The experimental sorption capacity (SC) for both TMX (standard) and TMX-FP (formulated product) were 13.3 and 65.7 mg g-1, respectively, and Freundlich and SIPS isothermal models best fit the TMX data (r2 = 0.9740 and 0.9716), while TMX-FP data were adjusted to Langmuir and SIPS (r2 0.9941 and 0.9943). Therefore, it was possible to conclude that the chromatographic method proposed for the quantification of TMX and TMX-FP in aqueous and sugarcane juice media was highly satisfactory, and validated for its main parameters. The efficiency of AC-NP in the sorption of this analyte was confirmed by the excellent values of SC and kinetics, indicating its favorable use in the removal of TMX from complex matrices. O cultivo da cana-de-açúcar é um dos mais antigos da civilização humana, sendo no Brasil, a espécie Saccharum officinarum a que apresenta maior importância para o setor sucroalcooleiro devido aos seus altos teores de sacarose. Com o tempo, diversos fatores e condições permitiram ao Brasil ser um dos maiores produtores dessa gramínea. Entretanto, para garantir grandes produtividades, altos níveis de agrotóxicos são aplicados nesta cultura, dentre os quais destaca-se o inseticida, neonicotinoide e sistêmico, tiametoxam (TMX). A sistemicidade de um agrotóxico é preocupante em cultivos que é possível o consumo de seus derivados. Portanto, considerando o caldo de cana-de-açúcar uma matriz alimentar e os riscos que resíduos de TMX possam oferecer, objetivou-se desenvolver e validar um método cromatográfico para quantificação deste agrotóxico, bem como avaliar sua remoção, em meio aquoso e em caldo de cana, por um nanocompósito de carvão ativado e magnetita (CA-NP), em ensaios de adsorção. A síntese de CA-NP foi realizada através do método de coprecipitação e o compósito foi caracterizado através de técnicas de caracterização. Após ensaios de adsorção em bateladas, TMX foi quantificado em cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD). As condições operacionais cromatográficas foram: fase móvel acetonitrila:água (30:70); vazão da FM 1,0 mL min-1; coluna de separação C18; volume de injeção de amostra 20 µL, tempo de análise 6 minutos e comprimento de onda 254 nm. Os principais parâmetros de validação apresentaram resultados satisfatórios, sendo possível observar a seletividade do método para TMX tanto na ausência quanto na presença de matriz caldo de cana, com limites de detecção e quantificação 0,057 e 0,17 mg L-1, respectivamente, e tempo de retenção 4,6 minutos. O efeito de matriz não foi observado e r2 das curvas analíticas na presença e ausência de caldo estiveram em torno de 0,9958 – 0,9985. Ensaios de recuperação apresentaram resultados entre 91 – 103% e coeficiente de variação entre 1,9 – 4,3%. A nanomodificação do CA-NP foi satisfatória e sua caracterização permitiu observar a efetiva impregnação da magnetita. A cinética de adsorção de TMX em caldo de cana por CA-NP foi mais ajustada ao tipo pseudosegunda ordem, com r2 de 0,9999, indicando processo de adsorção química. Os ensaios de capacidade de sorção (CS) tanto para TMX (padrão) e TMX-PF (inseticida) apresentaram valores experimentais de 13,3 e 65,7 mg g-1, respectivamente, e os melhores ajustes para os dados obtidos foram os modelos isotérmicos de Freundlich e SIPS para a sorção de TMX (r2 = 0,9740 e 0,9716), e Langmuir e SIPS para TMX-PF (r2 0,9941 e 0,9943). Por fim, foi possível concluir que o método cromatográfico para a quantificação de TMX e TMX-PF em matrizes aquosas e de caldo de cana foi altamente satisfatório, sendo validado para seus principais parâmetros. A eficiência de CA-NP na sorção deste analito foi comprovada pelos excelentes valores de CS e cinética, indicando seu favorável emprego na remoção de TMX em matrizes complexas. CAPES: 001

Submitted by Patricia Azevedo (azevedo.p89@gmail.com) on 2018-05-04T18:07:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Arquivamento - Patricia Azevedo.pdf: 9010415 bytes, checksum: 3d9cd7558b503bf43955bd80807ae738 (MD5) Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-05-04T19:10:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 azevedo_p_me_rcla_par.pdf: 2626913 bytes, checksum: 969a5bbb5215d1233624f1cb425f9709 (MD5) Made available in DSpace on 2018-05-04T19:10:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 azevedo_p_me_rcla_par.pdf: 2626913 bytes, checksum: 969a5bbb5215d1233624f1cb425f9709 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As abelhas são importantes agentes polinizadores que auxiliam na manutenção da biodiversidade de plantas silvestres e cultivadas. Contudo, o uso exacerbado e indevido de agrotóxicos tem causado um desequilíbrio na população destes insetos que ao visitarem as flores para coleta de pólen e néctar, são expostos a diferentes substâncias químicas. Sendo assim, o presente estudo buscou padronizar um método de cultivo in vitro de tecido nervoso de abelha Apis mellifera africanizada. Para isso testaram-se os meios de cultura Grace, Schneider e Leibovitz’s e suas suplementações com 10% de Soro Fetal Bovino, 40% de Hank’s Balance Salt Solution e 10% de Insect Medium Supplement individualmente ou em conjunto. Os resultados obtidos mostraram que o meio Leibovitz’s suplementado com 40% de Hank’s Balance Salt Solution e o meio Leibovitz’s suplementado com 40% de Hank’s Balance Salt Solution e 10% de soro fetal bovino são potenciais meios para o cultivo de tecido nervoso uma vez que apresentaram um menor desarranjo tecidual, contudo tais meios apresentaram uma alta taxa de células fortemente coradas, indicando picnose e, portanto, morte celular. Sendo assim, posteriores suplementações são necessárias para a obtenção de um meio ideal para o cultivo de tecido nervoso de A. mellifera africanizada. Bees are important pollinators that help to maintain the biodiversity of wild and cultivated plants. However, the exacerbated and undue use of agrochemicals has caused an imbalance in the population of these insects that when visiting flowers for the collection of pollen and nectar, are exposed to different chemical substances. In addition, the toxicity tests used for the release and certificate of pesticides have been widely questioned by the scientific community due to the use of a large number of individuals (bees) for its accomplishment. Thus, the present study sought to standardize a method of in vitro culture of nervous tissue of Apis mellifera. For this the Grace, Schneider and Leibovitz's culture media and their supplements with 10% of fetal bovine serum, 40 % of Hank's Balance Salt Solution and 10 % of Insect Medium Supplement were tested individually or in combination. The results obtained showed that Leibovitz's media supplemented with 40 % of Hank's Balance Salt Solution and Leibovitz's medium supplemented with 40% of Hank's Balance Salt Solution and 10% of fetal bovine serum are potential media for the cultivation of nervous tissue since they presented a smaller tissue disarrangement, however such means presented a high rate of heavily stained cells, indicating pyknosis and thus cell death. Therefore, subsequent supplements are necessary to obtain an ideal medium for the cultivation of Africanized A. mellifera nerve tissue.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Pollinators are responsible for tropical forests polinization and also have direct and indirect action on human feeding. The pollinators are majorly represented by bees. Even though, this contribution has been affected by numerous factors, among them, agrochemicals. The tiametoxam and fipronil insecticides, from neonicotinoides and fenilpirazois classes, respectively, present numerous negative effects, including biochemical alterations, in different bees species. Therefore, the aim of this paper was to analyze, through biochemical techniques, acetilcolinesterase (AChE) and carboxilesterase (CaE) enzyme activities in the head and glutationa S-transferase in the intestines of Melipona scutellaris worker bees, exposed to the mentioned insecticides, combined and isolated. Bees forage were collected and divided into four experimental groups: Control, acetone control, LC50/2 (0,0226 ng i.a. tiametoxam/μL and 0,0056 ng i.a. fipronil/μL) and LC50/5 (0,00906 ng i.a. tiametoxam/μL e 0,0022 ng i.a. fipronil/μL) orally exposed, combined and isolated, for 1, 6, 12, 24, 48 and 96 hours. The brain and the intestines were dissected, weighted and submitted to LS drainage buffer solution, macerated and centrifuged. The absorbance readings were done in 412, 410, and 340 nm wavelength, respectively. The data was analyzed by the Mann – Whitney e Kruskal – Wallis tests. The results showed alterations in the AChE tissue activity to the fipronil insecticide raising in 1 hour (LC50/2 and LC50/5) and decreasing in 6 hours (LC50/2 and LC50/5) and 12 hours (LC50/2) and raising again in 96 hours (LC50/2 and LC50/5). To the tiametoxam insecticide there was a decrease at 6 hours (LC50/2 and LC50/5), 12 hours (LC50/2) and 24 hours (LC50/5) and a raise at 96 hours (LC50/2 and LC50/5). Combining these insecticides it was observed a decrease in AChE LC50/2 activity (6 and 12 hours) and LC50/5 (6 and 24 hours) and a raise in LC50/2 and LC50/5 (96 hours). In specific activity there was a decrease at 6 hours (Fipronil LC50/2 and LC50/5 and Combined LC50/2), 48 hours (Tiametoxam LC50/5) and 96 hours (Fipronil LC50/2 and Combined LC50/5). The following patterns were detected for the detoxification enzyme tissue CaE-3: Fipronil insecticide – decrease in 12 hours (LC50/2) and raise in 96 hours (LC50/2) and combined – activity decrease in CL50/5 group (6 hours). Differences statistically relevant weren’t identified in groups exposed exclusively to tiametoxam insecticide. Considering the GST activity, the acetone group obtained raise in one hour exposure; groups exposed to the fipronil insecticide LC50/5 (1 hour), LC50/2 and LC50/5 (96 hours) obtained decrease and raise in this enzyme activity, respectively. Considering tiametoxam insecticide it was observed a raise in the activity at 6 hours (LC50/2 and LC50/5) and at 12 hours (LC50/5); there was increase in the combination for the groups: LC50/2 (48 and 96 hours) and LC50/5 (6 and 12 hours). This way, we can conclude that the insecticides, combined or isolated, affect the analyzed enzymes, reflecting in the toxicity of these individuals when exposed to sublethal doses; they may cause death of the individuals, hives destructure, and impact ecosystem directly. Os polinizadores são responsáveis pela polinização de florestas tropicais e também tem ação direta e indireta na alimentação humana. Dentre os polinizadores, são representados, em sua maior parte pelas abelhas. Porém, estas contribuições vêm sendo afetadas por diversos fatores, dentre estes os agrotóxicos. Os inseticidas tiametoxam e fipronil, das classes dos neonicotinoides e fenilpirazois, respectivamente, apresentam diversos efeitos negativos em diferentes espécies de abelhas, inclusive alterações bioquímicas. Assim, o objetivo do trabalho foi analisar, através de técnicas bioquímicas, a atividade das enzimas acetilcolinesterase (AChE) e carboxilesterase (CaE) na cabeça e glutationa S-transferase no intestino de operárias da espécie Melipona scutellaris, expostas aos inseticidas citados, de forma isolada e combinada. Abelhas forrageiras foram coletadas e divididas em quatro grupos experimentais: Controle; Controle acetona; CL50/2 (0,0226 ng i.a. tiametoxam/μL e 0,0056 ng i.a. fipronil/μL) e CL50/5 (0,00906 ng i.a. tiametoxam/μL e 0,0022 ng i.a. fipronil/μL) expostas oralmente, de forma combinada e isolada, por 1, 6, 12, 24, 48 e 96 horas. Os cérebros e intestinos foram dissecados, pesados e submetidos à solução de extração tampão LS, macerados e centrifugados. As leituras de absorbância foram realizadas em comprimento de onda de 412, 410 e 340 nm, respectivamente. Os dados foram analisados pelos testes Mann – Whitney e Kruskal – Wallis. Os resultados mostraram a ocorrência de alterações na atividade tecidual de AChE para o inseticida fipronil com aumento em 1 hora (CL50/2 e CL50/5), queda em 6 horas (CL50/2 e CL50/5) e 12 horas (CL50/2) e novamente aumento em 96 horas (CL50/2 e CL50/5). Para o inseticida tiametoxam houve diminuição em 6 horas (CL50/2 e CL50/5), 12 horas (CL50/2) e 24 horas (CL50/5) e aumento em 96 horas (CL50/2 e CL50/5). Já na combinação destes inseticidas observou-se diminuição da atividade de AChE CL50/2 (6 e 12horas) e CL50/5 (6 e 24horas) e, aumento em CL50/2 e CL50/5 (96 horas). Já para a atividade específica obteve-se diminuição em 6 horas (Fipronil CL50/2 e CL50/5 e Combinado CL50/2), 48 horas (Tiametoxam CL50/5) e 96 horas (Fipronil CL50/2 e Combinado CL50/5). Para a atividade tecidual da enzima de desintoxicação CaE-3 foram constatados os seguintes padrões: Inseticida fipronil – diminuição em 12 horas (CL50/2) e aumento em 96 horas (CL50/2) e combinado - diminuição da atividade no grupo em CL50/5 (6 horas). Não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas para o grupo exposto exclusivamente ao tiametoxam. Já para a atividade de GST o grupo acetona obteve aumento em 1 hora de exposição; os grupos expostos ao inseticida fipronil CL50/5 (1 hora), CL50/2 e CL50/5 (96 horas) obtiveram diminuição e aumento na atividade desta enzima, respectivamente. Para o inseticida tiametoxam observou-se aumento na atividade em 6 horas (CL50/2 e CL50/5) e em 12 horas (CL50/5); para a combinação verificou-se aumento nos grupos: CL50/2 (48 e 96 horas) e CL50/5 (6 e 12 horas). Com isto, podemos concluir que os inseticidas, tanto de forma isolada como combinada, afetaram as enzimas analisadas, refletindo em toxicidade destes indivíduos quando expostos a doses subletais; podendo ocasionar morte dos indivíduos e desestruturação das colmeias, impactando o ecossistema. CAPES/CNPq

Submitted by Hellen Maria Soares Lima null (hellenmsoares@gmail.com) on 2017-08-01T19:07:04Z No. of bitstreams: 1 Soares-Lima, 2017.pdf: 29373808 bytes, checksum: c01bcbf34fe7e817b2543adc07835d86 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-03T17:31:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_hms_dr_rcla_par.pdf: 6729464 bytes, checksum: bd4fe17c3a36882d59bf4e0782f63a4e (MD5) Made available in DSpace on 2017-08-03T17:31:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_hms_dr_rcla_par.pdf: 6729464 bytes, checksum: bd4fe17c3a36882d59bf4e0782f63a4e (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) As abelhas Apis mellifera são importantes polinizadores de plantas nativas ou cultivadas, porém o contato com os agroecossistemas pode expor esses insetos à substâncias tóxicas, como o inseticida imidacloprido. A sistemicidade desse composto pode levar a contaminação não só das abelhas forrageiras, mas também dos outros indivíduos da colônia, inclusive, das larvas por meio do consumo de pólen e néctar contendo resíduos de imidacloprido. Assim, a primeira etapa desse trabalho determinou a toxicidade do imidacloprido para larvas e abelhas adultas do híbrido A. mellifera africanizada. Os resultados mostraram que as larvas são mais tolerantes ao imidacloprido do que as abelhas recém-emergidas e que alterações no desenvolvimento larval só foram observadas em concentração oito vezes maior do que a concentração letal média estabelecida para as abelhas adultas. Visto que não só os inseticidas, como também as parasitoses, como a nosemose, podem enfraquecer as colônias e comprometer a viabilidade destas, este trabalho visou avaliar, ainda, os efeitos da exposição de operárias de A. mellifera africanizada ao inseticida imidacloprido e/ou da infecção das abelhas por Nosema ceranae e compreender como esses fatores atuam isolados e em conjunto sobre o organismo desses insetos. A sobrevivência das abelhas diminuiu quando estas foram expostas ao inseticida e/ou infectadas pelo parasita, sendo que a combinação destes dois estressores comprometeu ainda mais a longevidade delas. Tanto a N. ceranae quanto o imidacloprido, isolados ou em combinação levaram às células do intestino médio das abelhas ao estresse, evidenciado pela imunomarcação da chaperona HSP 70 e a morte celular, provavelmente por macroautofagia, indicada pela intensa vacuolização e pela diminuição na expressão gênica da caspase-3. No intestino, a atividade tecidual da glutationa-S-transferase não foi afetada, provavelmente, devido aos danos encontrados no epitélio que afetaram as funções de metabolização e biotransformação. Uma vez com o intestino comprometido, uma maior quantidade do inseticida poderia ter atingido a hemolinfa, levando as células dos túbulos de Malpighi, órgão responsável pela excreção de substâncias tóxicas do organismo, à morte celular. No cérebro, o inseticida alterou a atividade sináptica dos corpos pedunculados, conforme demonstrado pela imunomarcação da sinapsina, causou estresse celular e aumento de células gliais, que podem indicar injúria do tecido nervoso. A ação neurotóxica do inseticida provocou, ainda, aumento da atividade tecidual das enzimas acetilcolinesterase e carboxilesterase na cabeça das abelhas. A atividade sináptica alterada e o aumento do estresse celular nos corpos pedunculados foram observados também nas abelhas infectadas apenas por N. ceranae, indicando resposta ao parasitismo. Adicionalmente, a combinação patógeno-inseticida e os estressores, quando isolados, causaram imunossupressão, diminuindo o número de hemócitos circulantes na hemolinfa e transcrição de genes relacionados a resposta imune individual e social. A partir dos resultados deste trabalho, concluiu-se que a combinação entre N. ceranae e concentrações residuais do imidacloprido afetou a sobrevivência das abelhas não só pela ação do inseticida em seu órgão alvo, o cérebro, mas, também, pelo comprometimento das funções digestórias e excretoras e pela diminuição da imunidade das abelhas. The Apis mellifera honeybees are importants pollinators both for native and cultivated plants. However, the contact with the agroecosystems may expose these insects to toxic substances, such as imidacloprid insecticide. Compound systemicity may lead to the contamination not only of forager honeybees, but also of other colony individuals, including larvae, through both pollen and nectar consumption containing imidacloprid residues. Thus, the first stage of this work evaluated the imidacloprid toxicity to both larvae and adult honeybees of hybrid Africanized A. mellifera. Results showed that larvae are more tolerant to imidacloprid than newly emerged honeybees, and alterations in larvae development were only observed at concentrations eight times higher than the average lethal concentration established for adult honeybees. Since not only insecticides, but also diseases such as nosemosis may weaken colonies and compromise its viability, the second stage of this work was the evaluation of the exposure effects of Africanized A. mellifera workers to imidacloprid insecticide and/or to honeybees infection by Nosema ceranae in order to understand how these factors act both isolated and together on organism of these insects. Honeybees survival decreased when they were exposed to insecticide and/or infected by parasite, and the combinations of these two stressors further compromised their longevity. Both N. cenarae as imidacloprid, either alone or in combination, led midgut cells of honeybees to stress, evidenced by HSP 70 chaperone immunostaining, and to cell death, probably by macroautophagy, as indicated by genic expression decrease of caspase-3. In the midgut, glutathione-S-transferase tissue activity was not altered, probably due to damage found on the epithelium that may affect both metabolization and biotransformation function. Once midgut was compromised, probably more quantity of insecticide reached hemolymph, leading cells from Malpighian tubules, organ responsible for toxic substances excretion from organism, to cell death. In the brain, the insecticide altered mushroom body synaptic activity, as verified by synapsin immunostaining, and it also caused cellular stress and increased of glial cells, which may indicate nerve tissue injury. Insecticide neurotoxic action also caused an increase in the activity of acetylcholinesterase and carboxylesterase enzymes in the heads of the honeybees. Altered synaptic activity and increased cellular stress in mushroom bodies were also observed for honeybees infected only by N. ceranae, indicating response to parasitism. Additionally, pathogen-insecticide combination and the stressors, when isolated, caused immunosuppression, reducing both the hemocytes circulating number in hemolymph and transcription of genes related to individual and social immune response. Based on results from this work, we may conclude that combination between N. ceranae and residual concentrations of Imidacloprid affected honeybees survival, due to insecticide action on their target organ (brain), impairment on digestory and excretory functions and honeybees imunity decreased. FAPESP: 2013/09555-5