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Tfap2a gehört zur Familie der AP-2-Transkriptionsfaktoren. Heterozygote Mutationen von TFAP2A im Menschen führen zum Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom (BOFS) und sind mit Nierenanomalien assoziiert. Molekulare Mechanismen, die zu diesen BOFS-assoziierten Nierenanomalien führen, sind noch unbekannt. In diesem Projekt wurde die Expression von Mitgliedern der AP-2-Familie in neugeborenen und erwachsenen Wildtyp-Mäusen analysiert. Tfap2a wurde in der Ureterknospe und der distalen Region des S-förmigen Körpers in den Nieren neugeborener Mäuse exprimiert. Die Expression blieb in ausgereiften distalen Tubuli und Sammelrohren erhalten. Tfap2b, ein zweites Mitglied der AP-2-Familie, das in der Niere exprimiert wird und mit Zystenbildung assoziiert ist, wurde im aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife sowie in den distalen Tubuli und dem in der Nierenrinde liegenden Sammelrohr exprimiert. Um die Rolle von Tfap2a in der Niere zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer sammelrohrspezifischen Deletion von Tfap2a (Tfap2a-KO) erzeugt. Phänotypische und morphologische Analysen ergaben, dass Tfap2a-KO-Mäuse mäßig reduzierte Nierengewichte und eine fortschreitende Dilatation der äußeren medullären Sammelrohre aufwiesen. Einzelkern- und RNA-Sequenzierung der Nieren adulter Mäuse zeigte eine deregulierte Expression von Genen, die mit der Organisation von Aktinfilamenten, Zelladhäsion, Wnt-Signalen und anderen Signalwegen der Nierenentwicklung in Verbindung stehen. In einem isolierten Modell von kultivierten Sammelrohrzellen mit einer Deletion von Tfap2a waren ähnliche Signalwege dereguliert. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass Tfap2a für die Differenzierung des Sammelrohrepithels und die Regulierung des Durchmessers des Tubuluslumens erforderlich ist. Dies ermöglicht Einblicke in die molekularen Grundlagen der beim BOFS beobachteten Nierenfehlbildungen., The transcriptional regulator Tfap2a is part of the AP-2 transcription factor family. Heterozygous mutations of TFAP2A in humans lead to branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) and are associated with renal anomalies. Molecular mechanisms leading to BOFS-associated renal anomalies are still unknown. In this project, expression patterns of AP-2 family members were analyzed in newborn and adult wildtype mice. Tfap2a was expressed in the ureteric bud and distal region of the S-shaped body in kidneys of newborn mice. Expression was maintained in mature distal tubules and collecting ducts. Tfap2b, a second AP-2 family member expressed in the kidney and associated with cyst formation, was found in the ascending limb and showed overlapping expression with Tfap2a in distal tubules and the cortical collecting duct. To investigate the role of Tfap2a in the kidney, mice with a collecting duct-specific deletion of Tfap2a (Tfap2a-KO) were generated by crossing mice carrying a Cre-recombinase under the Hoxb7 promotor and mice with floxed Tfap2a alleles. Phenotypic and morphological analyses revealed that Tfap2a-KO mice displayed moderately reduced kidney weights and a progressive dilation of outer medullary collecting ducts. Single-nucleus and bulk RNA sequencing of kidneys of three months old Tfap2a-KO mice and littermate controls indicated deregulated expression of genes associated with actin filament organization, cell adhesion, Wnt signaling, and other kidney developmental pathways. Genes deregulated in Tfap2a-deficient mice included several genes previously implicated in the development of congenital anomalies of the kidney and urinary tract. In an isolated model of cultured collecting duct cells carrying a Tfap2a knockout similar pathways were deregulated. Taking together, this study indicates that Tfap2a is required for collecting duct epithelium differentiation and tubular lumen diameter regulation, providing insights into the molecular basis of renal defects observed in BOFS.

Der hämorrhagische Schock ist nach Schädel-Hirn-Trauma die häufigste Todesursache bei schweren Traumata mit Todesfolge. Dabei sorgt eine im Verlauf auf-tretende überschießende Entzündungsreaktion mit Multiorganversagen für einen großen Anteil der Letalität. Die Grundlage besteht in physikalischen Gewebsschädigungen, Sauerstoffminderversorgung des Gewebes und vermehrtem Anfall von Radikalen Sauerstoffspezies im Gewebe nach Reperfusion. Die Niere ist im Verlauf des Schockgeschehens durch die Kombination aus Minderperfusion und erhöhte metabolische Ansprüche besonders vulnerabel gegenüber hypoxischen Schäden. Außerdem zeigten epidemiologische Studien besonders fulminante Verläufe von Traumapatienten mit vorbestehenden, chronischen Nierenerkrankungen. Eine wichtige, therapeutische Säule ist angesichts des Missverhältnisses aus Sauerstoffbedarf und -angebot die Beatmung mit hohem Sauerstoffanteil. Diese wird im klinischen Alltag angesichts der möglichen, toxischen Nebenwirkungen insbesondere durch Sauerstoffradikale, wie sie zudem auch in der Pathophysiologie des Schocks von Bedeutung sind, kritisch betrachtet. Diese Arbeit untersuchte nun Auswirkung einer 24-stündigen Beatmungstherapie mit reinem Sauerstoff bei Schweinen, bei denen zuvor durch Blutentnahme ein hämorrhagischer Schock herbeigeführt und durch Retransfusion, sowie supportive medizinische Maßnahmen behandelt wurde. Der Fokus lag auf der Nierenfunktion. Außerdem wurde die Therapieeffizienz einer Sauerstoffadministration bei vorerkrankten Schweinen beleuchtet. Bei den Tieren manifestierte sich durch eine Rezeptormutation eine familiäre Hypercholesterinämie. Mit zusätzlicher, speziell atherogener Diät entwickelte sich auf Grund hoher Blutfett-werte eine Atherosklerose mit koronarer Herzerkrankung und beeinträchtigter Kreatinin-Clearence. Nach einer Vorbereitungsphase mit Instrumentierung und kurzer Ruhephase wurde durch Entnahme von dreißig Prozent des kalkulierten Blutvolumens der hämorrhagische Schock eingeleitet. Nach dreistündigem Schock wurde dann das Blut des Schweins retransfundiert und die intensivmedizinische Versorgung mit Volumen-, Noradrenalingabe und lungenprotektiver Beatmung mit variierendem Sauer-stoffanteil begonnen. Dabei fand die randomisierte Zuteilung der Tiere in zwei Gruppen statt. Während die Kontrollgruppe eine Standardtherapie erhielt, wurde in der Hyperoxiegruppe der inspiratorische Sauerstoffgehalt auf 100% bis 24 Stunden nach dem Schock angehoben und danach standardisiert wie in der Kontrollgruppe angepasst. Direkt vor bzw. nach dem hämorrhagischen Schock, sowie in anschließenden Intervallen von zwölf Stunden bis insgesamt 48 Stunden nach dem Schock fan-den Messzeitpunkte statt. Gemessen wurden hämodynamische Paramater; es erfolgten Blutgasanalysen und Blutentnahmen für Entzündungswerte und Parameter oxidativen Stresses. Was die Nierenfunktion und deren Beeinträchtigung betrifft, wurden die Urinproduktion, der arterielle Blutfluss der rechten Niere, renal-venöse Blutgasanalysen, Retentionswerte sowie die Kreatinin-Clearance ermittelt. Nach dem Tod des Versuchstieres wurde außerdem eine Niere für die histologische, immunhistochemische und immunbiologische Aufarbeitung entnommen. Ein Trend zeigte bei den mit reinem Sauerstoff beatmeten Tieren eine bessere Überlebensrate ohne statistische Signifikanz. Die Sauerstoffgruppe imponierte weiterhin durch konstant niedrigere Kreatinin-Serumwerte, sowie einer leicht besseren Kreatinin-Clearence ohne statistische Signifikanz. Sowohl die Hämoxygenase-1, als auch die gespaltene Caspase-3 waren im Nierengewebe bei Hyperoxie deutlicher exprimiert. Immunhistochemisch imponierte die Niere der Sauerstoffgruppe durch verminderte 3-Nitrotyrosinbildung, weniger extravaskuläres Albumin und höher exprimierter Cystathionin-y-lyase. Dies lässt den Schluss auf milder ausgeprägte Hypoxie, sowie weniger oxidativen und nitrosativen Stress zu. Mit dem komorbiden Schwein wurde eine gute Annäherung an ein klinisch realitätsnahes Szenario etabliert. Das umfangreiche hämodynamische Monitoring war in diesem experimentellen Design sehr hilfreich, um die Qualität des hämorrhagischen Schocks und dessen Kompensation durch das Tier verfolgen zu können, wobei eine Verbindung zwischen Komorbidität und Empfänglichkeit für hämorrhagi-sche Kreislaufdepression ersichtlich wurde. Auf die Nierenfunktion wirkte sich reine Sauerstoffbeatmung nach hämorrhagischem Schock tendenziell positiv aus. Insgesamt ließe sich der positive Effekt des Sauerstoffs auf die Nierenfunktion am ehesten mit einer besseren Mitochondrienfunktion und somit einer ausgeglichenen Energiebilanz, sowie dem Wechsel von nekrotischem zu apoptotischem Zelltod bei un-veränderter Belastung durch sowohl oxidativen, als auch nitrosativen Stress erklären. Im klinischen Alltag sollte sich gerade bei der Frage des richtigen inspiratorischen Sauerstoffgehalts der therapeutische Ansatz mehr nach dem individuellen Risikoprofil der Intensivpatienten richten, in das verschiedene Faktoren wie Alter und Vorerkrankungen einbezogen werden.

Generation of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) via nitric oxide (NO)-sensitive guanylyl cyclase (NO GC) has been implicated in the regulation of many physiological processes. Therefore, it is not surprising that pharmacological modulation of the NO/NO GC/cGMP pathway has been proposed for treatment of several diseases like heart failure and hypertension. The pathophysiological conditions in some of these diseases involve increased oxidative stress and decreased NO bioavailability. Pharmacological NO GC stimulators counteract decreased NO bioavailability, as they can stimulate NO GC synergistically with NO. Oxidative stress, however, might lead to oxidation of NO GC’s heme cofactor, making it unresponsive to NO. NO GC activators specifically activate this heme-oxidized NO GC. The present study aimed to identify the role of the NO GC/cGMP signaling pathway in the kidney and in melanoma, and to explore how NO GC could be utilized as drug target in these tissues. To address these questions, cGMP was visualized in real time in live cells and tissues using a Förster/fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cGMP biosensor. For the first time, the spatiotemporal dynamics of cGMP signals induced by NO, the NO GC stimulators riociguat and BAY 41 2272, as well as the NO GC activator BAY 543 were analyzed in the kidney and in melanoma. Thereby, it was determined in which anatomical structures and under which conditions these drugs exert their effects. The cGMP imaging results were validated with classical immunostaining of tissue sections and Western Blot. Furthermore, the pathophysiological relevance of the NO GC/cGMP signaling pathway in melanoma was investigated by analyzing the in vivo tumor growth in tissue-specific NO GC knock-out mice. NO increased the glomerular cGMP levels in kidney slices ex vivo. NO GC stimulator potentiated this NO-induced cGMP generation. After ODQ-mediated NO GC oxidation, however, NO as well as NO GC stimulator were no longer able to induce cGMP generation, whilst NO GC activator strongly increased glomerular cGMP levels. In collaboration with specialized labs, these renal effects of NO GC activator were shown to correlate with dilation of glomerular arterioles and improved blood flow in the kidney. In primary melanoma, NO-induced cGMP generation was selectively detected in perivascular cells of the tumor stroma, most likely pericytes. NO GC stimulator potentiated the NO-induced cGMP generation in these tumor pericytes, similar to its effect in the murine kidney. Remarkably, Cre/loxP-mediated NO GC knock-out in the tumor pericytes resulted in reduced tumor growth in male mice, probably via an impaired tumor perfusion. Taken together, in the murine kidney and in melanoma, NO GC was found to be involved in (patho )physiologically relevant processes. In both tissues, NO GC stimulators potently increased the NO-induced cGMP generation in the vasculature. NO GC activators were ineffective under basal conditions but induced robust cGMP generation in renal glomeruli in the presence of ODQ. These results supported the hypothesis that the growing line-up of NO GC modulators can be utilized for the treatment of diseases involving dysregulated NO/NO GC/cGMP signaling. Dissertation ist gesperrt bis 22.06.2024 ! Die Biosynthese von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) durch die NO sensitive Guanylylzyklase (NO GC) ist in die Regulation vieler physiologischer Prozesse involviert. Daher ist es nicht weiter verwunderlich, dass sich die pharmakologische Modulation des NO/NO GC/cGMP-Signalwegs als Möglichkeit etabliert hat, verschiedene Krankheiten wie Herzinsuffizienz und Bluthochdruck zu behandeln. In einigen dieser Krankheiten zählen oxidativer Stress und eine verringerte NO-Bioverfügbarkeit zu den pathophysiologischen Merkmalen. Sogenannte NO GC-Stimulatoren stimulieren die NO GC synergistisch mit NO, wodurch die cGMP-Bildung trotz verringerter NO-Bioverfügbarkeit aufrechterhalten werden kann. Oxidativer Stress kann jedoch zur Oxidation des Häm-Kofaktors der NO GC führen, was im Folgenden eine Stimulation durch NO verhindert. Die sogenannten NO GC-Aktivatoren aktivieren spezifisch diese Häm-oxidierte NO GC. Das Ziel dieser Studie war, die Funktion des NO GC/cGMP-Signalwegs in der Niere und im Melanom zu untersuchen und herauszufinden, wie NO GC in diesen Geweben als Angriffspunkt für Therapien genutzt werden könnte. Dazu wurde cGMP in lebenden Zellen und Gewebeschnitten mithilfe eines Förster /Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierten cGMP-Biosensors in Echtzeit sichtbar gemacht. Zum ersten Mal konnten cGMP-Signale hervorgerufen durch NO, die NO GC-Stimulatoren Riociguat und BAY 41 2272, sowie den NO GC-Aktivator BAY 543 in der Niere und im Melanom mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung untersucht werden. In diesem Zusammenhang wurde bestimmt, in welchen anatomischen Strukturen und unter welchen Bedingungen diese Substanzen wirksam sind. Die Ergebnisse dieser hochmodernen cGMP-Bildgebung wurden mit klassischen immunhistologischen Färbungen sowie Western Blots validiert. Weiterhin wurde das Tumorwachstum in gewebespezifischen NO GC-Knockout-Mäusen verfolgt, um die pathophysiologische Relevanz des NO GC/cGMP-Signalwegs im Melanom zu untersuchen. NO führte zur Erhöhung der cGMP-Konzentration in den Glomeruli von Nierenschnitten ex vivo. Der NO GC-Stimulator verstärkte diese NO-induzierte cGMP-Biosynthese. Nach Oxidation der NO GC durch den Inhibitor ODQ konnten NO und der NO GC-Stimulator keine cGMP-Bildung mehr hervorrufen, während der NO GC-Aktivator die glomeruläre cGMP-Konzentration stark erhöhte. In Zusammenarbeit mit spezialisierten Laboren konnte gezeigt werden, dass diese Effekte von NO GC-Aktivatoren in der Niere mit der Dilatation von glomerulären Arteriolen sowie einer Verbesserung des Blutflusses in der Niere einhergehen. Im Melanom wurde NO-induzierte cGMP-Bildung ausschließlich in perivaskulären Zellen – vermutlich Perizyten – des Tumorstromas beobachtet. Der NO GC-Stimulator verstärkte diese NO-induzierte cGMP-Biosynthese in den Perizyten der Tumorgefäße, ganz ähnlich zu seiner Wirkung in der Niere. Bemerkenswerterweise war in männlichen Mäusen mit Cre/loxP-vermitteltem NO GC-Knockout in den Perizyten der Tumorgefäße das Tumorwachstum stark verringert, vermutlich bedingt durch eine schlechtere Durchblutung der Tumoren. Insgesamt wurde gezeigt, dass die NO GC in der Niere und im Melanom ein wichtiger Regulator von (patho-)physiologisch relevanten Prozessen ist. In beiden Geweben verstärkten NO GC-Stimulatoren die NO-induzierte cGMP-Biosynthese. NO GC-Aktivatoren hingegen hatten keine Effekte unter basalen Bedingungen, riefen aber in der Gegenwart von ODQ cGMP-Bildung in den renalen Glomeruli hervor. Diese Ergebnisse stützten die gegenwärtige Hypothese, dass die Wirkstoffklasse der NO GC-Modulatoren für die Behandlung von Krankheiten mit fehlreguliertem NO/NO GC/cGMP-Signalweg geeignet ist.

Zusammenfassung Bei letalem Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion kommt nach bisherigem Kenntnisstand eine Beteiligung mehrerer innerer Organe in Betracht. Im Vordergrund stehen pathologische Befunde im Lungengewebe, berichtet wird aber auch von direkt oder indirekt als Folge einer Infektion mit SARS-CoV‑2 auftretenden (histo-)pathologischen Befunden im Nierengewebe, in der Leber und im Myokard. Der Vergleich der histopathologischen Diagnostik mit konventionell-histologischen Färbungen bei 3 im Zusammenhang mit einer SARS-CoV-2-Infektion verstorbenen Männern zeigt teils identische Befunde und erlaubt Überlegungen zu Chronologie und Pathophysiologie des Krankheitsverlaufes. Zwei Männer wurden intensivmedizinisch invasiv beatmet; ein Mann starb nach 8 Tagen häuslicher Quarantäne ohne Therapie. Es zeigt sich ein großes Spektrum SARS-CoV-2-assoziierter Befunde.

Trotz der breiten Anwendung zielgerichteter Therapien und Immuncheckpoint-Inhibitoren, liegt die 5-Jahres-Überlebensrate beim metastasierten klarzelligen Nierenkarzinom (ccRCC) unter 15%. Um den Therapieerfolg für Patienten zu verbessern, werden neue Modelle benötigt, die die Tumorheterogenität rekapitulieren und eine personalisierte Therapieentwicklung ermöglichen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit habe ich Organoidkulturen direkt aus Patiententumoren und sortierten Krebsstammzellen (CSCs) etabliert und diese Organoide im Detail charakterisiert. Die Rolle von WNT und NOTCH, die zuvor in ccRCC CSCs bestimmt wurde, wurde in Organoiden bestätigt und konnte mit Hilfe von molekularen Inhibitoren als therapeutische Schwachstelle ausgenutzt werden. Diese Ergebnisse heben das Potenzial von Patienten-abgeleiteten Organoiden (PDOs) für die personalisierte Medizin und das Potenzial von WNT und NOTCH Inhibierung in der ccRCC Behandlung hervor. PDOs stellen Werkzeuge für die personalisierte Medizin dar, geben jedoch wenig Einblick in die frühen Stufen der Tumorentstehung. Deshalb habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation VHL, PBRM1 und SETD2 – die drei am häufigsten mutierten Gene in ccRCC – mit einer induzierbaren CRISPR-Cas9 Strategie in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Nierenorganoiden targetiert. Ich differenzierte iPSCs in nierenspezifische Zelltypen aus sowohl metanephrischem Mesenchym als auch Ureterknospen-Epithelium. Knockout von VHL, PBRM1 und SETD2 führte zur Hochregulation von Hypoxie-induzierbaren Genen in Organoiden und Knockout Effekte konnten durch längere Kultivierungszeiten und Zellselektion via FACS verstärkt werden. Obwohl ccRCC-spezifische Signalwege aktiviert wurden, wurde kein Wachstumsvorteil der transformierten Zellen beobachtet. Dennoch stellen diese Organoide ein einzigartiges Modell dar, das auf andere Nephropathien angewendet werden könnte, um die Nieren- und Nierenkrebsforschung weiter voranzutreiben. Despite the widespread application of targeted therapies and immune checkpoint inhibitors, the five-year survival rate for metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is below 15%, as unpredictable progression, therapy resistance, and tumor relapse occur. In order to improve patient outcome, novel models are needed that recapitulate tumor heterogeneity and allow for a more personalized therapy development. In the first part of my PhD thesis, I established organoid cultures directly from patient tumors and sorted cancer stem cells (CSCs) and I characterized these organoids thoroughly. The roles of WNT and NOTCH, which were previously determined in ccRCC CSCs, were confirmed in organoid cultures and could be exploited as a therapeutic weakness via small molecule inhibition. These results highlight the potential of patient-derived organoids (PDOs) for personalized therapy and further the potential of WNT and NOTCH inhibition for ccRCC treatment. PDOs present suitable tools for personalized medicine, but provide little insight into early stages of tumorigenesis. Therefore, in the second part of my thesis, I targeted VHL, PBRM1, and SETD2 – the three most frequently mutated genes in ccRCC – using an inducible CRISPR-Cas9 genome editing strategy in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived kidney organoids. I used a previously published protocol to differentiate iPSCs into kidney-specific cells originating from both metanephric mesenchyme and ureteric bud epithelium. Knockout of VHL, PBRM1, and SETD2 led to the upregulation of hypoxia-inducible genes in organoids and knockout effects could be enhanced by longer cultivation times and cell selection through FACS. Although ccRCC-specific signaling pathways were activated, a growth advantage of transformed cells was not observed. Nevertheless, these organoids present a unique model that could be applied to other nephropathies to further advance kidney and kidney cancer research.

The German Commission for the Investigation of Health Hazards of Chemical Compounds in the Work Area has re-evaluated hexachlorobutadiene [87-68-387-68-3], to derive a maximum concentration at the workplace (MAK value), considering all toxicity end points. Available unpublished study reports and publications are described in detail. The critical effect of hexachlorobutadiene is its toxicity and carcinogenicity in the kidney. In a 2-year feeding study in rats, hexachlorobutadiene caused significantly increased incidences of adenomas and carcinomas of the kidneys only at the highest dose of 20 mg/kg body weight, whereas nephrotoxicity was observed from 2 mg/kg body weight. From the NOAEL of 0.2 mg/kg body weight in this study, a MAK value of 0.02 ml/m3 is derived. As the critical effect is systemic, Peak Limitation Category II is assigned. The default excursion factor of 2 is set as no half-life is known. Concerning the carcinogenicity of hexachlorobutadiene, the Commission concluded that a non-genotoxic mode of action is of prime importance and genotoxic effects play at most a minor part provided the MAK value is observed. Therefore, hexachlorobutadiene was assigned to Category 4 of carcinogenic substances. As the possible genotoxicity of hexachlorobutadiene is specific for the kidney and it has not been shown to reach the germ cells in an active form, hexachlorobutadiene is not classified in any of the categories for germ cell mutagens. The difference between the NOAEC for developmental toxicity in rats of 10 ml/m3 and the MAK value is sufficiently large, so that damage to the embryo or foetus is unlikely when the MAK value is observed. Thus, the substance is classified in Pregnancy Risk Group C. Skin contact may contribute significantly to systemic toxicity and hexachlorobutadiene continues to be designated with an “H” notation. Sensitization is not expected from the limited data.

The German Commission for the Investigation of Health Hazards of Chemical Compounds in the Work Area has evaluated n-butylbenzene [104-51-8], considering all toxicological endpoints. Available publications are described in detail. In an oral two-generation study in rats, increased kidney weights and centrilobular hypertrophy in the liver is observed with n-butylbenzene. The corresponding NOAEL of 100 mg/kg body weight and day is scaled to a maximum concentration at the workplace (MAK value) of 10 ml/m3. Studies on the possible irritation of the airways after repeated inhalation exposure are lacking, however, the acute RD50 value of 710 ml/m3 in mice is indicative of an irritation threshold of about 20 ml/m3 in humans. Therefore, the systemic effect is critical and Peak Limitation Category II is designated. As the half-life of n-butylbenzene is not known, the default excursion factor of 2 for systemically acting substances is established. There are no developmental toxicity studies. Therefore, n-butylbenzene is assigned to Pregnancy Risk Group D. There are no data on genotoxicity, carcinogenicity and sensitization. According to skin absorption models, percutaneous absorption can contribute significantly to systemic toxicity and n-butylbenzene is designated with an “H” notation.

The German Commission for the Investigation of Health Hazards of Chemical Compounds in the Work Area has re-evaluated 1,1-dichloroethane [75-34-3] considering all toxicological end points. The critical effect is kidney toxicity. Inhalation of 1000 ml/m3 led to histopathologic injury to the kidneys, increased serum urea and creatinine after 3-month exposure of cats. A NOAEL of 500 mg/kg body weight and day for changes in the urinary excretion of acid phosphatase and N-acetylglucosaminidase was found in rats after 13-week oral exposure. Based on the NOAEC of 500 ml/m3, the maximum concentration at the workplace (MAK value) has now been lowered to 50 ml/m3 taking into account the increased respiratory volume at the workplace because the blood:air partition coefficient of 1,1-dichloroethane is > 5 (see List of MAK and BAT Values, Sections I b and I c). The same MAK value is obtained based on the oral NOAEL of 500 mg/kg body weight and day. As a systemic effect is critical, Peak Limitation Category II and the default excursion factor of 2 are retained. The margins between the MAK value and the NOAECs for developmental toxicity in rats are sufficient even taking into account the increased respiratory volume at the workplace. Therefore, damage to the embryo or foetus is unlikely when the MAK value is not exceeded and 1,1-dichloroethane remains assigned to Pregnancy Risk Group C. 1,1-Dichloroethane is genotoxic in vitro but the findings are not quite consistent. A carcinogenicity study was performed, which is of limited validity because of high mortality. In female rats, a few haemangiosarcomas and mammary gland adenomas developed which are identical to the tumour types induced by 1,2-dichloroethane. Therefore, 1,1-dichloroethane is classified in Carcinogen Category 3 B for suspected carcinogens. The substance is not regarded as a germ cell mutagen. Skin contact is suspected to contribute to systemic toxicity and the substance is designated with “H”. Studies of the sensitization potential are not available.

The German Commission for the Investigation of Health Hazards of Chemical Compounds in the Work Area has evaluated bis[O,O-bis(2-ethylhexyl) dithiophosphorato-S,Sʹ]dioxodi-μ-thioxodimolybdenum [68958-92-9; 72030-25-2] considering all toxicological end points. A study described in the ECHA registration dossier that was carried out according to OECD Test Guideline 422 found increased kidney weights in male rats and elevated levels of thyroid-stimulating hormone in female rats at 100 mg/kg body weight and day. As the percentage change in kidney weights was not specified and the study was not made available to the Commission, a maximum concentration at the workplace (MAK value) cannot be derived and bis[O,O-bis(2-ethylhexyl) dithiophosphorato-S,Sʹ]dioxodi-μ-thioxodimolybdenum has been assigned to Section II b of the List of MAK and BAT Values. Bis[O,O-bis(2-ethylhexyl) dithiophosphorato-S,Sʹ]dioxodi-μ-thioxodimolybdenum was not found to be genotoxic in vitro; neither in vivo data nor carcinogenicity studies are available. There is no clear evidence of a contact sensitizing potential and no data for sensitization of the respiratory tract. Bis[O,O-bis(2-ethylhexyl) dithiophosphorato-S,Sʹ]dioxodi-μ-thioxodimolybdenum is not expected to be taken up via the skin in toxicologically relevant amounts.

EPB4.1L5 ist ein Protein, welches wichtige Funktionen für die epitheliale Morphogenese hat. Es wurde als Interaktionspartner des Crumbs (Crb)-Polaritätskomplexes gefunden und ist als podozytenspezifischer Bestandteil von Fokalen Adhäsionen an deren Adhärenz beteiligt. Hinweise auf eine wichtige Rolle bei der Podozytenfunktion liefern zudem EPB4.1L5-knockout-Mäuse, die schwere Proteinurie sowie eine fokalsegmentale Glomerulosklerose entwickelten. Um mehr über die Funktionen von EPB4.1L5 und dessen Bezug zu Crb2 zu erfahren, wurden in dieser Arbeit erstmals HEK- und Podozyten-Zelllinien mit induzierbarer Überexpression von fluoreszenzmarkiertem EPB4.1L5 und Crb2 generiert. Crb2 ist eine in Podozyten hoch exprimierte und an der Schlitzmembran der Niere beteiligte Isoform. Die fortsatzreiche Zellmorphologie, die starke Zellmembranassoziation und die Umverteilung der Tight Junction-Komponente ZO1 deuten auf EPB4.1L5 als Schnittstelle zwischen Zytoskelett- und Zellkontaktregulation hin.