Search

Mitochondria are organelles found in all eukaryotic cells and essential for metabolic functions and cell fitness. Mammalian mitochondria contain their own genome and ribosomes to synthesize 13 proteins that are core components of oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. The majorityof the mitochondrial proteome is encoded by the nuclear genome and are synthesized in the cytoplasm for transport into the organelle. Once imported into mitochondria, the 80 nuclear-encoded structural proteins assemble with the 13 mitochondrial-encoded counterparts to form multi-subunit complexes known as the OXPHOS system. Mitochondrial gene expression is the process of translating the information encoded on the mitochondrial genome into proteins that make up the OXPHOS complexes. This process involves nuclear-encoded factors and therefore requires tight coordination between mitochondrial and nuclear genome. During mitochondrial protein synthesis, nascent chains emerging from the ribosomes are inserted into the inner membrane for assembly into OXPHOS complexes and those that failed to insert or assemble into complexes are targeted for degradation. The co-translational insertion and degradation of mitochondrial nascent chain are regulated by a dedicated set of quality control machinery. Quality control of mitochondrial gene expression is a collective term for surveillance mechanisms that monitor molecular events leading to protein translation. In this dissertation, I have identified the chaperone protease complex composed of AFG3L2 subunits as the key component in co-translational quality control of mitochondrial nascent chains. AFG3L2 dysfunction triggers the activity of metalloprotease OMA1, which proteolytically process the dynamin-related GTPAse OPA1 and remodels the mitochondrial membrane morphology. Failure to counteract this stress response in a timely manner affects mitochondrial membrane dynamics and generates negative feedback on mitochondrial gene expression. My research establishes that this stress response is due exclusively to defects in quality control of mitochondrial nascent chains. Co-translational insertion of mitochondrial nascent chain is mediated by OXA1L insertase. Here, I have shown how OXA1L cooperates with AFG3L2 in regulating the insertion and turnover of mitochondrial nascent chains. In the absence of OXA1L, MT-ATP6 nascent chains are not inserted into the inner membrane and rapidly degraded by AFG3L2. These data have demonstrated how the activities of OXA1L and AFG3L2 determine the fate of a nascent chain. In addition, I have also found that translation of a specific pathogenic MT-ATP6 variant has a profound effect on mitochondrial gene expression. In the absence of AFG3L2 or OXA1L, this variant exhibits severe mitochondrial translation defect. Overall, these findings have provided new insights into the role of mitochondrial protein quality control mechanism in regulating mitochondrial gene expression. The last part of the dissertation addresses the frequency of errors at the 3' end of mitochondrial mRNAs. The human mitochondrial genome is transcribed into long polycistronic RNA transcripts that must be processed to release individual RNAs (rRNAs, tRNAs and mRNAs). Errors in the RNA processing step will generate aberrant mRNAs that interfere with the translation of fully functional proteins. To determine the error rate and diversity of aberrant mitochondrial mRNAs, a novel next generation sequencing approach was developed to provide comprehensive analysis of the 3’ end of mitochondrial transcripts. My results show the presence of aberrant mRNAs and variations in mitochondrial post-transcriptional modifications in health and disease. In addition, a significant proportion of these aberrant mRNAs lack a complete stop codon and are associated with translating mitochondrial ribosomes. Together, these observations demonstrate an inherent error rate in mitochondrial gene expression that requires quality control mechanisms to maintain functional protein synthesis. In conclusion, my thesis has identified critical steps in co-translational quality control of mitochondrial nascent chain synthesis and investigated the functional consequences of defective quality control system on mitochondrial gene expression. Mitokondriot ovat organelleja, joita esiintyy kaikissa eukaryoottisoluissa ja jotka ovat välttämättömiä aineenvaihduntatoiminnoille ja solujen kunto. Nisäkkäiden mitokondriot sisältävät oman genomin ja ribosomit syntetisoivat 13 proteiinit, jotka ovat oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) kompleksien ydinkomponentteja. Suurin osa mitokondrioproteomista on ydingenomi koodaama ja syntetisoituu sytoplasmassa kuljetettavaksi organelliin. Mitokondrioihin tuotuaan 80 tuman koodaamaa rakenneproteiinia yhdistyvät 13 mitokondrioiden koodaaman vastineen kanssa muodostaen monialayksikkökomplekseja, jotka tunnetaan nimellä OXPHOS järjestelmä. Mitokondrioiden geeniekspressio on prosessi, jossa käännetään koodattu tieto mitokondrioiden genomista proteiineihin, jotka muodostavat OXPHOS-kompleksit. Tämä prosessi sisältää ydinkoodaamia tekijöitä ja vaatii siksi tiukkaa koordinointia mitokondrioiden ja ydingenomin välillä. Mitokondrioiden proteiinisynteesin aikana ribosomeista nousevat ketjut liitetään sisäkalvoon OXPHOS-komplekseiksi kokoontumista varten, ja ne, jotka eivät onnistuneet liittämään tai koota komplekseiksi, kohdennetaan hajoamiseen. Mitokondrioiden syntymässä olevan ketjun yhteistranslaatiota ja hajoamista säätelee omistettu laadunvalvontakoneisto. Mitokondrioiden geeniekspression laadunvalvonta on yhteistermi seurantamekanismeille jotka valvovat proteiinien translaatioon johtavia molekyylitapahtumia. Tässä väitöskirjassa olen tunnistanut AFG3L2-alayksiköistä koostuvan kaperoniproteaasikompleksin avainkomponentiksi mitokondrioiden syntymässä olevien ketjujen kotranslationaalisessa laadunvalvonnassa. AFG3L2 toimintahäiriö laukaisee metalloproteaasi OMA1 toiminnan, joka prosessoi proteolyyttisesti dynamiiniin liittyvää GTPAasia OPA1 ja muokkaa mitokondrioiden kalvon morfologiaa. Epäonnistuminen vastustaa tätä stressireaktiota ajoissa vaikuttaa mitokondrioiden kalvodynamiikkaan ja tuottaa negatiivista palautetta mitokondrioiden geeniekspressiosta. Tutkimukseni osoittaa, että tämä stressireaktio johtuu yksinomaan mitokondrioiden syntymässä olevien ketjujen laadunvalvonnan puutteista. OXA1L-insertaasi välittää mitokondrioiden syntymässä olevan ketjun yhteistranslationaalisen insertion. Täällä minä ovat osoittaneet, kuinka OXA1L tekee yhteistyötä AFG3L2 kanssa säädellessäsi lisäystä ja kiertoa mitokondrioiden syntymässä olevat ketjut. OXA1L puuttuessa MT-ATP6 nousevia ketjuja ei lisätä sisäkalvoon ja AFG3L2 hajottaa sen nopeasti. Nämä tiedot ovat osoittaneet, kuinka OXA1L ja AFG3L2 aktiivisuudet määräävät syntymässä olevan ketjun kohtalon. Lisäksi olen myös havainnut, että spesifisen patogeenisen MT-ATP6-variantin translaatiolla on syvällinen vaikutus mitokondrioiden geeniekspressioon. AFG3L2 tai OXA1L puuttuessa tällä variantilla on vakava mitokondrioiden translaatiovirhe. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot ovat antaneet uusia näkemyksiä mitokondrioiden proteiinien laadunvalvontamekanismin roolista mitokondrioiden geeniekspression säätelyssä. Väitöskirjan viimeisessä osassa käsitellään virheiden esiintymistiheyttä mitokondrion 3'-päässä mRNA. Ihmisen mitokondrion genomi transkriptoidaan pitkiksi polykistronisiksi RNA-transkripteiksi joita on käsiteltävä yksittäisten RNA (rRNA, tRNA ja mRNA) vapauttamiseksi. Virheet RNA-käsittelyvaiheessa synnyttävät poikkeavia mRNA:ita, jotka häiritsevät täysin toimivien proteiinien translaatiota. Poikkeavien mitokondrioiden mRNA virhesuhteen ja monimuotoisuuden määrittämiseksi kehitettiin uusi seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmä, joka tarjoaa kattavan analyysin mitokondrioiden transkriptien 3'-päästä. Tulokseni osoittavat poikkeavien mRNA läsnäolon ja variaatioita mitokondrioiden transkription jälkeisissä modifikaatioissa terveydessä ja sairaudessa. Lisäksi merkittävältä osalta näistä poikkeavista mRNA:ista puuttuu täydellinen lopetuskodoni ja ne liittyvät mitokondrioiden ribosomien translaatioon. Yhdessä nämä havainnot osoittavat luontaisen virhesuhteen mitokondrioiden geeniekspressiossa, joka vaatii laadunvalvontamekanismeja toiminnallisen proteiinisynteesin ylläpitämiseksi. Yhteenvetona totean, että opinnäytetyöni on tunnistanut kriittiset vaiheet yhteiskäännösten laadunvalvonnassa mitokondrioiden syntymässä olevaa ketjusynteesiä ja tutkinut viallisen toiminnallisia seurauksia mitokondrioiden geeniekspression laadunvalvontajärjestelmä.