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Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos. Schistosomiasis is a neglected tropical disease that affects over 240 million people in 78 countries worldwide. Despite the recent efforts to eradicate the disease, the poor coverage of mass drug administration programmes, low sensitivity diagnostic tests and reinfections in endemic areas compose the major challenges to control the transmission. Vaccine development is thought to be an alternative tool to fight the disease, although discovery of protective antigens has proven a difficult task. Nevertheless, the self-cure response exhibited by Rhesus macaque (Macaca mulatta) may serve as the basis for discovery of protective vaccine candidates. In this experimental model of schistosomiasis, parasites are killed and the infection cleared after a strong humoral response against schistosome interfaces such as the tegument and oesophagus. In this context, the present work aimed to characterize the Schistosoma mansoni oesophageal region using quantitative proteomics to propose new vaccine candidates. Initially, shotgun analysis revealed that proteins originated from parasite interfaces are the least abundant in a soluble worm antigen preparation (SWAP). We circumvented that by manually dissecting the oesophagus of adult male worms allowing for the enrichment of oesophageal gland constituents. A total of 628 protein groups were detected significantly enriched in the region of interest including 10 proteins encoded by Microexon genes (MEG), hydrolases, glycosyltransferases and proteins involved in vesicular transport. Furthermore, MEG proteoforms generated by amino acid substitution and/or deletion were detected, indicating structural plasticity of such molecules. Nine glandular proteins were quantified using QconCAT revealing MEG-12 as the most abundant. The calculated protein concentrations were used to estimate the number of protein copies per cell revealing that the secreted molecules are of high abundance in this subproteome. At last, the proteomic analysis of S. mansoni culture supernatant resulted in an expanded repertoire of proteins from the alimentary tract. Those included oesophageal MEGs, reinforcing that the secreted molecules are exposed in this host-parasite interface. Altogether, the quantitative proteomic analyses of the S. mansoni oesophageal region and alimentary tract revealed a new set of proteins that would repay attention for a rational selection of vaccine candidates or new targets for drug development.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. Imunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico. Immunoglobulins or antibodies are glycoproteins produced by B-cells. They can be found anchored to the plasma membrane or secreted in body fluids such as blood and ascites. The basic tridimensional structures of these molecules display a conserved assembly, corresponding to the association of light and heavy polypeptide chains. Due to their highly specific binding properties, antibodies are powerful tools in biomedical sciences with applications on research, diagnosis and immunotherapy. They are usually obtained from animal sera or cell culture after rigorous purification steps aiming to exclude commonly found contaminants such as viruses, pyrogens and highly abundant proteins. In particular, isolation of antibodies using affinity chromatography allows their purification and parallel depletion from plasma samples, prior to proteomic analyses. Although various antibody purification/depletion methods are currently available, some limitations such as restricted specificity to antibody classes or animal species and high cost, justify the development of alternative isolation approaches. The focus of the present study was the synthesis of chromatographic supports containing immobilized ε-aminocaproic acid (AEAC) for purification and depletion of antibodies. Four out of five produced chromatographic matrices demonstrated specificity to human plasma antibodies and IgY from Gallus gallus egg yolk. Under mild chromatographic conditions, e.g - elution at physiological pH and low ionic strength, functional antibodies were recovered as judged by Western blotting. A 2D SDS-PAGE profile followed by mass spectrometry analyses revealed a great heterogeneity of antibody isoforms and the isolation of the human isotypes IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM and IgY from Gallus gallus, at high purity. Moreover, aiming to deplete antibodies from micro-volume plasma samples, magnetic particles bearing ε-aminocaproic acid were also produced and proved successful. At last, performance evaluation of the synthetic matrices revealed the NHS-activated-AEAC as exhibiting the best binding capacity (30 mg antibody/g). In conclusion, coupling of ε-aminocaproic acid in the various matrices constituted suitable alternatives for purification and depletion of plasma antibodies and IgY. It is anticipated these findings may potentially raise biotechnological interest.

Protein acetylation is a crucial post-translational modification that controls gene expression and a variety of biological processes. Sirtuins, a prominent class of NAD + -dependent lysine deacetylases, serve as key regulators of protein acetylation and gene expression in eukaryotes. In this study, six single knockout strains of fungal pathogen Aspergillus fumigatus were constructed, in addition to a strain lacking all predicted sirtuins (SIRTKO). Phenotypic assays suggest that sirtuins are involved in cell wall integrity, secondary metabolite production, thermotolerance, and virulence. AfsirE deletion resulted in attenuation of virulence, as demonstrated in murine and Galleria infection models. The absence of AfSirE leads to altered acetylation status of proteins, including histones and non-histones, resulting in significant changes in the expression of genes associated with secondary metabolism, cell wall biosynthesis, and virulence factors. These findings encourage testing sirtuin inhibitors as potential therapeutic strategies to combat A. fumigatus infections or in combination therapy with available antifungals.