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Acute kidney injury (AKI) is characterized by rapid and potentially reversible decline in renal function; however, the current management for AKI is nonspecific and associated with limited supportive care. Considering the need for more novel therapeutic approaches, we believe that lectins from Dioclea violacea (Dvl), based on their antiinflammatory properties, could be beneficial for the treatment of AKI induced by renal ischemia/reperfusion (IR). Dvl (1 mg/kg, i.v.) or vehicle (100 µL) was administered to Wistar rats prior to the induction of bilateral renal ischemia (45 min). Following 24 hours of reperfusion, inulin and para-aminohippurate (PAH) clearances were performed to determine glomerular filtration rate (GFR), renal plasma flow (RPF), renal blood flow (RBF) and renal vascular resistance (RVR). Renal inflammation was assessed using yeloperoxidase (MPO) activity. Kidney sections were stained with hematoxylin-eosin to evaluate morphological changes. Intracellular superoxide anions, hydrogen peroxide, peroxynitrite, nitric oxide and apoptosis were analyzed using flow cytometry. IR resulted in diminished GFR, RPF, RBF, and increased RVR; however, these changes were ameliorated in rats receiving Dvl. AKI-induced histomorphological changes, such as tubular dilation, tubular necrosis and proteinaceous casts, were attenuated by Dvl administration. Treatment with Dvl resulted in diminished renal MPO activity, oxidative stress and apoptosis in rats submitted to IR. Our data reveal that Dvl has a protective effect in the kidney, improving renal function after IR injury, probably by reducing neutrophil recruitment and oxidative stress. These results indicate that Dvl can be considered a new therapeutic approach for AKI-induced kidney injury.

Lectins are proteins capable of specific and reversible recognition of carbohydrates without modifying them. Many studies have isolated these molecules from Leguminosae seeds but little attention was given to subcellular localization and biological function of these molecules. Therefore, this work aimed to describe Canavalia brasiliensis seed structure and the subcellular localization of ConBr. In addition, we tested the affinity of anti-ConBr antibody for other lectins. To accomplish this, seed fragments were processed for light, scanning and transmission electron microscopy, as well as immunocytochemistry. The anti-ConBr affinity was also tested. Under SEM, the testa showed a regular contour of anticlinal walls without trichomes and inner integument of 10–20 cell layers. The cotyledons presented many parenchymatic cell layers with starch grains and cytoplasmic protein bodies. The immunological identity of anti-ConBr immunoglobulin to ConBr and other lectins was confirmed by immunodiffusion and Western blotting. Ultrastructurally, the cotyledons showed protein bodies characterized by heterogeneous appearance of irregularly formed electron-dense and electron-lucent areas. Immunolocalization showed lectin at both protein bodies and cell wall, however, more studies are required for the elucidation of ConBr functions. Moreover, the affinity of anti-ConBr for different lectins can make this molecule a useful biotechnological tool for lectin studies.

Based on their morphological and physiological features, red algae comprise a complex and variable group of multiple genera, including Hypnea. In particular, the genus Hypnea J.V. Lamouroux (Cystocloniaceae, Rhodophyta) consists of approximately 54 species, including Hypnea cervicornis and H. musciformis. Lectins were described for both species; however, the localization of these proteins is still unclear. Therefore, this work aimed to characterize the morphology and ultrastructure of Hypnea cervicornis and H. musciformis, as well as localize their lectins at the subcellular level. Samples were collected at Praia do Pacheco (FortalezaCE) and processed for light, scanning and transmission electron microscopy, in addition to immunocytochemistry. The studied species presented cortical cell layers, subcortical cells and medullary cells. Based on ultrastructural analysis, these species presented vacuolated cortical cells, with a dense cytoplasm containing chloroplasts. The cell wall consisted of concentric microfibrils embedded in an amorphous matrix. Immunochemistry analysis showed the expression of lectins in the cytoplasm and cell walls. While the structure of the studied algae was similar to the description of other species of the genera under different conditions, this is the first record of algae lectin localization.

Lectins are multidomain proteins with the ability to recognize carbohydrates in a specific way, in addition to interacting with molecules from other classes, such as hydrophobic compounds or secondary metabolites. Structural characterization of these molecules is crucial to understanding their function and activity in organisms and systems. An area with high potential of application for lectins is cancerology since most cancer cells exhibit alterations in glycosylation patterns and lectins may be able to recognize these alterations. In this work, the lectin isolated from the seed of Dioclea lasiocarpa, DLL, had its crystallographic structure determined and characterized, and it was also evaluated for the possibility of interaction with different carbohydrates by molecular docking. Lectin antiglioma potential was evaluated against C6 lineage glioma cells. The results obtained evidenced a high degree of similarity of DLL with other lectins isolated from legumes of the same subtribe, presenting a jellyroll-type binding motif (β-sandwich) and a metal binding site stabilizing the carbohydrate recognition domain. DLL demonstrated differential interactions with carbohydrates, varying according to the type of glycosidic bond present in the ligands. The elucidated molecule presented, as biological activity, a reduction in cell viability in cancer cells of the C6 lineage and showed strong antiglioma activity by mechanisms involving the activation of caspases 3. It was possible to conclude that the target molecule of this work recognizes carbohydrates present in cells of glioma and presents itself as a promising candidate to proceed in diagnostic tests and alternative therapy to mitigate resistance to glioma, a tumor well known to be resistant to cell death induction. As lectinas são proteínas de múltiplos domínios com capacidade de reconhecer carboidratos de forma específica além de interagir com moléculas de outras classes, tais como compostos hidrofóbicos ou metabólitos secundários. A caracterização estrutural dessas moléculas é crucial para entender sua função e atividade nos organismos e sistemas. Uma área com elevado potencial de aplicação para as lectinas é a cancerologia visto que a maioria das células cancerígenas exibem alterações nos padrões de glicosilação e as lectinas podem ser capazes de reconhecer essas alterações. Neste trabalho, a lectina isolada da semente de Dioclea lasiocarpa, DLL, teve sua estrutura cristalográfica determinada e caracterizada, também foi avaliada quanto à possibilidade de interação com diversos carboidratos por docking molecular. O potencial antiglioma da lectina foi avaliado frente às células de glioma da linhagem C6. Os resultados obtidos evidenciaram um alto grau de similaridade da DLL com outras lectinas isoladas de leguminosas da mesma subtribo, apresentando um motivo de ligação do tipo jellyroll (β sanduíche) e um sítio de ligação à metais estabilizando o domínio de reconhecimento a carboidratos. DLL demonstrou interações diferenciais com carboidratos, variando conforme o tipo de ligação glicosídica presente nos ligantes. A molécula elucidada apresentou, como atividade biológica, uma redução da viabilidade celular em células cancerosas da linhagem C6 e demonstrou forte atividade antiglioma por mecanismos que envolvem a ativação de caspases 3. Foi possível concluir que a molécula alvo deste trabalho reconhece carboidratos presentes em células de glioma e se apresenta como uma candidata promissora a prosseguir nos testes de diagnóstico e terapia alternativa para mitigar a resistência ao glioma, tumor bem conhecido por ser resistente à indução da morte celular.

Cells use surface glycans to encode information that modulates processes ranging from cell recognition and tissue development to apoptosis. The decoding of these messages stored in a glycocode is performed by carbohydrate-binding molecules, and among these, lectins stand out as they are well-characterized proteins that bind to glycans in a highly specific and reversible way. Thus, lectins may be able to recognize specific cell types according to the glycosylation profile expressed in the membranes of these cells. It is known that several pathologies, including cancer and diabetes, present mutated glycans on the surfaces of affected tissues. This fact raises interest in the area of glycobiology and lectinology as these fields try to unravel the relationship among the message conveyed by altered carbohydrates and the development and progression of diseases. In view of this, the bioprospection and characterization of new lectins that may have biotechnological potential is interesting in view of the proven applications that known lectins have presented so far. This work aimed to analyze the anticancer activity of the lectin from Canavalia villosa (Cvill), drawing a parallel among the lectin toxicity and its carbohydrate affinity profile. The three-dimensional structure of this lectin was also solved and used to analyze interactions with cancer glycans in silico. For this, Cvill, which was isolated and partially characterized previously, had its amino acid sequence determined by mass spectrometry and gene sequencing. The three-dimensional structure was solved by macromolecule crystallography and X-ray diffraction. The fine carbohydrate specificity of Cvill was studied by Glycan Array and Molecular Docking, and its anticancer activity was evaluated in HeLa cells, in which ROS production and caspase activation were assessed. The level of apoptosis and autophagy transcripts expression was analyzed by qPCR. The results showed that Cvill has a cytotoxic effect on HeLa cells, with participation of CRD and generation of intracellular ROS at the highest dose tested. It was also observed that cell death was triggered by mechanisms involving both autophagic and apoptotic pathways, with increased expression of LC3 and activation of caspases 8. Cvill presents a three-dimensional structure typical of legume lectins, with a β-sandwich domain and conserved carbohydrate and metal binding sites. Células utilizam glicanos de superfície para codificar informações moduladoras de processos que variam desde o reconhecimento celular e desenvolvimento de tecidos a apoptose. A decodificação dessas mensagens armazenadas em um glicocódico é desempenhada por moléculas ligantes de carboidratos, e dentre estas, as lectinas se destacam devido a elas serem proteínas já bem caracterizadas e que se ligam a sacarídeos de forma específica e reversível. Dessa forma, as lectinas podem ser capazes de reconhecer determinados tipos celulares de acordo com o perfil de glicosilação expresso nas membranas dessas células. Sabe-se que diversas patologias, incluindo câncer e diabetes, apresentam glicanos mutados nas superfícies de tecidos afetados. Este fato desperta o interessa na área de glicobiologia e lectinologia, no que concerne a busca para desvendar a relação entre a mensagem passada por carboidratos alterados e o desenvolvimento e progressão de enfermidades. À vista disso, a bioprospecção e caracterização de novas lectinas que apresentem potenciais biotecnológicos é interessante em vista das comprovadas aplicações que as lectinas já estudadas apresentam. Este trabalho teve como objetivo analisar a atividade anticâncer da lectina de Canavalia villosa (Cvill), traçando um paralelo entre essa ação e o perfil de afinidade a carboidratos dessa lectina. A estrutura tridimensional de Cvill também foi resolvida, e a partir disso foram feitas análises de interações com glicanos de câncer in sílico. Para isso, Cvill, que já apresenta protocolo de isolamento descrito, teve sua sequência de aminoácidos obtida por espectrometria de massas e sequenciamento gênico. A estrutura tridimensional foi resolvida por cristalografia de macromoléculas e difração de raios X. A especificidade a carboidrato fina de Cvill foi analisada por Glycan Array e Docking molecular, e sua atividade anticâncer foi testada em células de HeLa, nas quais foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), e a ativação de caspases. O nível de expressão de transcritos relacionados com apoptose e autofagia foi avaliado por qPCR. Os resultados mostraram que Cvill apresenta um efeito citotóxico em células de HeLa, com participação do CRD e geração de ROS intracelular na maior dose testada. Também foi observado que a morte celular foi desencadeada por mecanismos que envolvem tanto vias autofágicas quanto apoptóticas, com a expressão aumentada de LC3 e a ativação de caspase 8. Cvill apresenta uma estrutura tridimensional típica de lectinas de leguminosas, com um domínio β-sanduíche e sítios de ligação a carboidratos e metais conservados.

Lectins are a group of carbohydrate-binding proteins found in all organisms. Among these proteins, a species that stands out for having several biological activities is Vatairea guianensis lectin (VGL). Techniques involving antibodies can range from classic immunochemistry assays to advanced microscopy techniques. Thus, they can become valuable biotechnological tools since they are able to specifically recognize epitopes of the target molecules. Immunoglobulins or antibodies are proteins whose main function is to bind with antigens foreign to the individual, in order to neutralize them. In the case of birds, the main class of immunoglobulins Y (IgYs) can be found not only in blood but also in egg yolks. This fact allows for quick and efficient purification of these molecules, facilitating their use as biotechnological tools. This work aimed to produce antibodies against VGL in chickens, implementing a methodology for the production biotechnological tools for the study of lectins. For that purpose, laying hens were immunized with VGL for 15 weeks at 10-day intervals. Collected eggs had the IgY purified and the produced antibody was able to recognize VGL as observed by western blotting. In this sense, the IgYs produced in this work constitute a powerful biotechnological tool available for future studies. Lectinas são um grupo de proteínas que se ligam a carboidratos sendo encontradas em todos os organismos. Dentre essas proteínas, uma que se destaca por possuir diversas atividades biológicas é a lectina de Vatairea guianensis (VGL). As técnicas que envolvem anticorpos podem variar de ensaios clássicos de imunoquímica a técnicas avançadas de microscopia. Assim, eles podem se tornar ferramentas biotecnológicas valiosas, uma vez que são capazes de reconhecer especificamente epítopos de moléculas alvo. As imunoglobulinas ou anticorpos são proteínas cuja principal função é se ligar a antígenos estranhos ao indivíduo, para neutralizá-los. No caso das aves, a principal classe de imunoglobulinas Y (IgY) pode ser encontrada não apenas no sangue, mas também nas gemas. Esse fato permite a purificação rápida e eficiente dessas moléculas, facilitando seu uso como ferramentas biotecnológicas. Este trabalho teve como objetivo a produção de anticorpos contra VGL em ovos de galinhas poedeiras, implementando uma metodologia para a produção de ferramentas biotecnológicas para o estudo de lectinas. Para tanto, as galinhas foram imunizadas com VGL por 15 semanas em intervalos de 10 dias. Os ovos coletados tiveram as IgY isoladas e purificada e o anticorpo produzido foi capaz de reconhecer VGL conforme observado por western blotting. Nesse sentido, as IgYs produzidas neste trabalho constituem uma poderosa ferramenta biotecnológica disponível para estudos futuros.

Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and are able to form complexes with molecules containing saccharides without changing their structure. Because of the many biological activities displayed by these proteins, they have great applicability in biotechnology. Controlled/slow drug release technology is one of the most promising applications of nanotechnology for disease treatment and diagnosis because it overcomes several problems associated with the use of macromolecules such as proteins as drugs. In this context, the present investigation aimed to develop a system for the controlled release of Dioclea violacea lectin (DVL), a mannose/glucose-specific legume lectin with anticancer properties, by applying two different sizes of CaCO3 particles, a low-cost, broadly available and biocompatible compound. Results show that the systems are feasible and present desirable properties of adsorption and release. The application of the bioconjugates on HeLa cells indicates that the proposed system is effective as a cytotoxic agent against this cell type, even more than the free lectin. The present data demonstrate that the system has a potential application in cancer treatment and the methodology enables the use of other anticancer lectins/proteins. As lectinas são proteínas que se ligam especificamente à carboidratos e são capazes de formar complexos com moléculas contendo sacarídeos sem alterar sua estrutura. Devido às muitas atividades biológicas exibidas por essas proteínas, elas possuem grande aplicabilidade na biotecnologia. A tecnologia de liberação controlada/lenta de medicamentos é uma das aplicações mais promissoras da nanotecnologia no tratamento e diagnóstico de doenças, visto que supera diversos problemas associados ao uso de macromoléculas, como proteínas e medicamentos. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema para a liberação controlada da lectina de Dioclea violacea (DVL), uma lectina de leguminosa específica para manose/glicose com propriedades anticâncer, através da aplicação de dois tamanhos diferentes de partículas de CaCO3, um composto de baixo custo, amplamente disponível e biocompatível. Os resultados mostraram que os sistemas são viáveis e apresentam propriedades desejáveis de adsorção e liberação. A aplicação dos bioconjugados nas células HeLa mostrou que o sistema proposto é eficaz como agente citotóxico contra esse tipo de célula, mais potente inclusive que lectina livre. Os dados obtidos demonstram que o sistema tem uma aplicação potencial no tratamento do câncer e a metodologia permite o uso de outras lectinas/proteínas anticâncer.

Agriculture in the 21st century seeks to produce more food to meet the need for a growing population with a smaller rural workforce. This population increase is accompanied by increasing investments in agricultural production and, consequently, in the use of insecticides that aim to guarantee pest management, as these pests can progressively and dangerously affect this investment. The problem with the use of chemical pesticides is the harzard caused to environment and human life, as their use can directly interfere in decrease of species biodiversity or even contribute to the emergence of resistant species that cause irreversible damage to the environment. There is a great effort to reduce the risk of human exposure to pesticides, some studies even focus on safer and more selective insecticides for natural pests. The demand for insecticides with new modes of action and formulations is being developed and registered based on strict regulations, considering environment and non-target species safety. The prospection of other molecules that present insecticidal activity is a main goal of the scientific community, as it would make possible the use alternatives that are less aggressive to the environment and to the human being itself. In this sense, the insecticidal activity of a phycobiliprotein, HMLp, purified from Hypnea musciformis, against insect cells of Drosophyla melanogaster strain S2 and Choristoneura fumiferana strain CF1 was evaluated. The protein showed cell growth inhibition activity of Drosophila melanogaster S2 after 48 hours of incubation. Regarding Choristoneura fumiferana strain CF1, HMLp did not inhibit cell growth when compared to the control. The biochemical characterization of HMLp showed that this protein is a heterodimer composed of two subunits called alpha and beta, with an apparent molecular mass of 20 and 22 kDa, respectively. HMLp showed stability up to 100 ºC of temperature, stability in the pH range of 6.0 to 9.0 and specificity for N-glycans. HMLp was classified as phycoerythrin from peptide sequencing data using mass spectrometry with MALDI ionization source. These preliminary tests suggest that HMLp may be a potential tool in studies as an insecticidal agent in other biological models. A agricultura no século XXI busca produzir mais alimentos para suprir a necessidade de uma população crescente com uma força de trabalho rural menor. Esse aumento populacional está acompanhado com os crescentes investimentos na produção agrícola e, consequentemente, no uso de inseticidas que visam garantir o controle de pragas que possam afetar esse investimento, que são cada vez mais potentes e perigosas. O grande problema do uso de pesticidas químicos está nos danos causados ao ambiente e à vida humana, seu uso pode interferir diretamente na diminuição da biodiversidade de espécies ou mesmo contribuir para o aparecimento de espécies resistentes que causam prejuízos irreversíveis ao ambiente. Há um grande esforço para reduzir o risco da exposição humana à pesticidas, alguns estudos, inclusive, focam em inseticidas mais seguros e mais seletivos para pragas naturais. A demanda de inseticidas com novos modos de ação e formulações estão sendo desenvolvidos e registrados com base em regulamentos rígidos, levando em consideração a segurança do meio ambiente e de espécies não-alvo. Estudar outras moléculas capazes de exercerem atividade inseticida é um papel da comunidade científica, pois torna possível a utilização de alternativas menos agressivas ao ambiente e ao próprio ser humano. Nesse sentido, foi avaliada a atividade inseticida de uma ficobiliproteína, a HMLp, purificada de Hypnea musciformis, contra células de insetos de Drosophyla melanogaster linhagem S2 e Choristoneura fumiferana linhagem CF1. A proteína apresentou atividade de inibição do crescimento celular da linhagem S2 de Drosophila melanogaster após 48 horas de incubação. Com relação a Choristoneura fumiferana linhagem CF1, a HMLp não inibiu o crescimento das células quando comparada com o controle. A caracterização bioquímica de HMLp mostrou que essa proteína é um heterodímero composto de duas subunidades denominadas alfa e beta, apresentando massa molecular aparente de 20 e 22 kDa, respectivamente. A HMLp apresentou estabilidade até 100 ºC de temperatura, estabilidade na faixa de pH de 6,0 a 9,0 e especificidade por N-glicanos. HMLp foi classificada como ficoeritrina a partir de dados de sequenciamento de peptídeos utilizando espectrometria de massas com fonte de ionização MALDI. Esses ensaios preliminares sugerem que HMLp pode ser uma potencial ferramenta em estudos como agente inseticida em outros modelos biológicos.

Oral cancer is a serious public health problem in Brazil. The most common histological type of malignancy in the oral cavity (90 to 95% of cases) is squamous cell carcinoma (SCC) an invasive and aggressive epithelial neoplasia and low survival mainly due to late diagnosis. Eventually, lesions that precede the appearance of malignant neoplasias, called potentially malignant lesions (PML), may occur, being oral leukoplakia (OL) the most common. There is a growing interest in the analysis of saliva through proteomics since this is a noninvasive and rich source of information and can provide not only an early diagnosis, but also a prognosis and monitoring of the treatment. Salivary proteomic analysis can be hampered by the presence of high abundance proteins that mask or reduce the sensitivity of separation. Lectins have been widely used to remove high abundance glycoproteins that could potentially undermine proteome analysis. This study aimed to evaluate for the first time proteins present in saliva of patients with OL and oral SCC in Ceará State, when compared to a group control, through proteomic techniques (one and two-dimensional electrophoresis followed by mass spectrometry) and molecular biology (Western Blot). A chromatographic column immobilized with the lectin isolated from the red algae Bryothamnion triquetrum (BTL) was used to remove high abundance protein from saliva (mucin). In parallel bioinformatics methodologies were used (modelling and molecular docking) to the comprehension of oral SCC molecular pathogenesis. Saliva pools were collected from 5 patients from each group with a diagnosis of CCE and LO, confirmed by histopathological exams and the protein profile of the groups compared to each other. The present study demonstrated for the first time the increase in the levels of ZG16B in the saliva pool of patients with Oral SCC when compared to the pool of the OL and control groups, it was also verified the increase of cytokeratin 1 in the SCC pool. Through bioinformatics assays ZG16B is structurally similar to the Artin M lectin and binds strongly to complex glycans by the mannide moiety. The study may contribute to the discovery of potentials salivary biomarkers in SCC, which may assist in the development of diagnostic and prognostic tools, directly influencing the patients survival and reduction of public health expenses. O câncer oral constitui um sério problema de saúde pública no Brasil. O tipo histológico de tumor maligno mais comum em cavidade oral (90 a 95% dos casos) é o Carcinoma de células escamosas (CCE) uma neoplasia epitelial invasiva e agressiva e de sobrevida baixa principalmente pelo diagnóstico tardio. Eventualmente, pode ocorrer o aparecimento de lesões que precedem o surgimento de neoplasias malignas, denominadas de lesões potencialmente malignas (LPM) sendo a leucoplasia oral (LO) a mais comum. Há um interesse crescente pela análise da saliva através de proteômica já que essa é uma fonte não invasiva e rica de informação e que pode propiciar não só um diagnóstico precoce, bem como prognóstico e monitoramento do tratamento. A análise proteômica salivar pode ser dificultada pela presença de proteínas de alta abundância que mascaram ou reduzem a sensibilidade de separação. As lectinas têm sido amplamente utilizadas para remover glicoproteínas de alta abundância que possam eventualmente prejudicar a análise do proteoma. Esse estudo se propôs a avaliar pela primeira vez as proteínas presentes na saliva de pacientes com LO e com CCE oral do estado do Ceará, quando comparados a um grupo controle, através de técnicas proteômicas (eletroforese uni e bidimensional seguida por espectrometria de massas) e de biologia molecular (Western Blot). Para remoção de proteína de alta abundância da saliva (mucina) foi utilizada uma coluna cromatográfica imobilizada com a lectina isolada da alga vermelha Bryothamnion triquetrum (BTL) em paralelo foram utilizadas metodologias de bioinformática (modelagem e docking molecular) para a compreensão acerca da patogênese molecular do CCE de boca. Ao todo foram coletados saliva de 5 pacientes de cada grupo com diagnóstico de CCE e LO comprovados por exames histopatológicos e o perfil proteico dos grupos comparados entre si. O presente trabalho demonstrou pela primeira vez o aumento nos níveis de ZG16B no pool de salivas de pacientes com CCE Oral quando comparado ao pool dos grupos LO e Controle, foi verificado também o aumento de citoqueratina 1 no pool de CCE. Através de ensaios de bioinformática verificou-se que a ZG16B se assemelha estruturalmente a lectina de Artin M e liga-se fortemente a glicanos complexos pela porção manosídica. O estudo pode contribuir para descoberta de potenciais biomarcadores salivares no CCE podendo auxiliar no desenvolvimento de ferramentas diagnósticas e prognósticas, influenciando diretamente na sobrevida do paciente e redução nos gastos em saúde pública.

Guillain-Barré syndrome (GBS) is an acute polyradiculoneuropathy, monophasic, and since the eradication of poliomyelitis is the principal cause of paralysis in the world. This syndrome seems to have an autoimmune component characterized, in part, by molecular mimicry with production of antibodies that causes severe damage to peripheral nerves. Such damage results in symptoms, which include acute flaccid paralysis. About 30% of the cases need respiratory assistance. GBS cases is usually preceded by infection agents, such as Campylobacter jejuni and viral infections. It seems that the pathogenesis of C. jejuni in GBS is associated with anti-gangliosides antibodies, which cross react with gangliosides present in the nerve axolemma, mainly in the peripheral nerves. Hence, the present study aimed to analyze transcriptomic libraries from patients with GBS, diagnosed with the different subtypes (demyelinating, axonal and Miller-Fisher), in order to identify genes and key pathways related to GBS development and potential target for modulation. For this, 24 libraries were obtained from 12 Brazilian cases and a Spanish case. The quality analysis, alignment, assembly, global gene expression and network were performed using FastQC, Bowtie, TopHat, HTSeq, edgeR and RedeR. We idenfy genes were differentially expressed between symptomatic and the recovery phase (p

FRUTUOSO, Mércia Sindeaux. Efeito adjuvante da lectina de Canavalia brasiliensis no tratamento de Leishmaniose cutânea experimental. 2016. 117 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. The leishmaniases are importante public health problem, comprising a very wide spectrum of clinical presentations. The host protection and cure, depend on his or her capacity to mount an imune response type Th1, and IFN-γ is a key molecule on this protective response. The drugs of first choice for the treatment are the pentavalent antimonials, which cause several side effects and the most concerning side effect is the cardiotoxic ones. On the search for alternative treatment, fluconazole has shown promising results, however it has to be given for a longer time and in higher doses to achieve a better response. The Canavalia brasiliensis lectin (ConBr) has been described as a potent immune modulator, as it induces lymphocytic proliferation, with the production of IFN-γ. Based on these data we studied, if ConBr would potentiate the effect of fluconazole on the treatment of experimental cutaneous leishmaniasis, caused by L. braziliensis. To evaluate this, BALB/c mices (n=40) were infected with L. braziliensis and were divide randomly 10 days post-infection, in 5 groups, with the following treatments: 1- fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os); 2- Glucantime® (60mg/Kg/day/10days, intramuscular); 3- ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 4- Fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os) plus ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 5- Saline solution per os. The parameters evaluated on the 200 day post infection were: the thickness of the lesion every third day; parasite load on the draining lymph node; production of IFN-γ, IL-10, and TGF-β in cell culture of the draining lymph node supernatant, stimulated in vitro with promastigotes of L. braziliensis; relative liver and spleen weight and histopathological analysis of the lesions. Animals that were treated with the association of fluconazole and ConBr, when compared with those treated with saline solution, presented a significant reduction on the parasite load on the draining lymph nodes (p=0,006), reduction in lesion size (p=0,03) and higher production of IFN-γ on the supernatant of cell culture of regional lymph nodes (p=0,03). Similar data were observed on the group treated with Glucantime®, and all together, demonstrate that the association of fluconazole and ConBr was capable of inducing a therapeutic response similar to the one seen in the group treated with Glucantime®, which is considered the gold standard in the treatment for leishmaniasis. As leishmanioses constituem grande problema de saúde pública, compreendendo um amplo espectro de síndromes clínicas que pode ter manifestações diversas. Proteção e cura do hospedeiro se correlacionam com o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1, e IFN-γ é considerada uma molécula chave nesta resposta protetora. A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses é o antimonial pentavalente, que possui vários efeitos colaterais, especialmente seu efeito cardiotóxico. Na busca de novas alternativas de tratamento, o fluconazol vem apresentando dados promissores, porém necessita de um maior tempo de tratamento ou de doses mais elevadas para apresentar uma melhor resposta. A lectina de Canavalia brasilienses (ConBr) tem sido descrita como potente imunomodulador, pois induz proliferação linfocitária com produção de IFN-γ. Com base nesses dados, buscou-se avaliar se ConBr potencializaria o efeito do Fluconazol no tratamento da leishmaniose cutânea experimental por Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isso, camundongos BALB/c (n=40) foram infectados com L. braziliensis e divididos aleatoriamente, após 10 dias de infecção, em cinco grupos, com os seguintes tratamentos: 1- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral); 2- Glucantime® (60mg/Kg/dia/10dias, por via intramuscular); 3- ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, por via intramuscular); 4- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral) associado com ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, intramuscular); 5- solução salina por via oral. Os parâmetros avaliados no 20o dia pós-infecção foram: a espessura das lesões a cada três dias; a carga parasitária no linfonodo de drenagem; secreção de IFN-γ, IL-10, TGF-β no sobrenadante de culturas de células do linfonodo de drenagem reestimulados in vitro com promastigotas de L. braziliensis; peso relativo do fígado e do baço e análise histopatológica das lesões. Os animais que foram tratados com a associação Fluconazol-ConBr, quando comparados com o grupo tratado com salina, apresentaram uma redução significativa da carga parasitária do linfonodo de drenagem (p=0,006), redução no tamanho da lesão (p=0,03) e maior síntese de IFN-γ no sobrenadante das culturas de células do linfonodo regional (p=0,03). Dados semelhantes foram observados no grupo tratado com Glucantime®, o que em conjunto, demonstra que a associação Fluconazol-ConBr foi capaz de induzir uma resposta terapêutica semelhante ao tratamento com Glucantime®, considerado padrão ouro.

Presenting important carbohydrate binding properties, lectins are proteins able to decipher the glycocode, and as such, they can be used in bioassays involving, for example, cell-cell communication and cell signaling, as well as protein targeting. In this study, a new mannosespecific lectin from Canavalia villosa seeds (Cvill) was isolated by a single affinity chromatography step in a Sephadex® G-50 column. SDS-PAGE showed the lectin to be composed of three bands, and similar to the other lectins of the subtribe Diocleinae, analysis by mass spectrometry indicated that the lectin C. villosa has three chains (α, β and γ) with masses of 25,647; 12,966 and 12,685 Da, respectively, similarly to the profile of ConA-like lectins specific to mannose. A two-dimensional electrophoresis analysis showed the presence of five isoforms and isoelectric point around pH 5.0. The lectin strongly agglutinated rabbit erythrocytes native and treated with proteolytic enzymes, and presented sugar specificity to α-methyl-D-mannoside and D-mannose, in addition to high stability within a broad range of pH (pH 5,0 a 7,0) and temperature (up to 70 °C). Partial sequence of the protein was obtained by MS-MALDI TOF/TOF covering approximately 41% of the sequence. The protein was crystallized by vapor diffusion method in the presence of α-methyl-D-mannoside. The lectin also showed average toxicity against artemia nauplii and induced paw edema and hypernociception in mice with the participation of the carbohydrate binding site. In tests on C6 lineage of Rattus norvegicus glioma cells, Cvill showed ability to reduce viability and changes in morphology in the cells tested. Com importantes propriedades de ligação a carboidratos, lectinas são proteínas capazes de decifrar o glicocódigo e, como tal, podem ser utilizadas em bioensaios que envolvem, por exemplo, a comunicação célula-célula e sinalização celular, bem como o direcionamento de proteínas. Neste estudo, uma nova lectina específica a manose foi isolada de sementes de Canavalia villosa por um único passo de cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex® G-50. SDS-PAGE mostrou que a lectina é composta de três bandas e a análise por espectrometria de massas indicou que a lectina de C. villosa possui três cadeias (α, β e γ) com massas de 25.647, 12.966 e 12.685 Da, respectivamente, similar ao perfil de lectinas ConAlike específicas a manose. A análise em eletroforese bidimensional mostrou a presença de cinco isoformas e ponto isoelétrico em torno de pH 5,0. A lectina aglutinou fortemente eritrócitos de coelho nativos e tratados com enzimas proteolíticas e foi inibida por D-manose e α-metil-D-manosídeo. A atividade hemaglutinante da Cvill é máxima nos pH 5,0 a 7,0, e estável até a temperatura de 70 °C. A sequência parcial da lectina foi obtida por MS-MALDI TOF/TOF com cobertura de aproximadamente 41% da sequência. A proteína foi cristalizada pelo método de difusão de vapor na presença do ligante α-metil-D-manosídeo. Essa lectina mostrou alta toxicidade contra náuplios de Artemia sp., induziu edema de pata e hipernocicepção em ratos com participação do sítio de ligação a carboidratos e mostrou efeitos citotóxicos em células de glioma da linhagem C6 com uma potente atividade na redução da viabilidade celular e alteração na morfologia celular.

A native lectin (nPELa), purified from seeds of the species Platypodium elegans, Dalbergieae tribes, was crystallized and structurally characterized by methodologies such as X-ray diffraction crystallography and bioinformatics tools. The obtained crystals (of orthorhombic type) were diffracted with quality and nPELa structure was solved with excellence through molecular substitution, with resolution of 1.6 Å. The nPELa monomer showed an N-glycosylation site at the Asn119 residue, therefore, confirming the literature prediction. In addition, nPELa has a metal binding site and a conserved carbohydrate recognition domain, in a similar way to what was shown by other Dalbergieae tribe lectins, such as PAL (Pterocarpus angolensis) and CTL (Centrolobium tomentosum). As molecular docking analysis suggests high affinity of this lectin for different mannosides, mainly trimanosides, formed by α-1,3 or α-1,6 glycosidic bond, as evidenced by the obtained scores. In addition, molecular dynamics simulations were performed as a way of demonstrating the structural behavior of nPELa in aqueous solution, as isolated lectin or associated with specific ligands. The results demonstrated a high stability of nPELa in solution, and structural modifications presented at its carbohydrate recognition site allow the interaction between the lectin and the different ligands tested. Different modifications were observed during simulations for each one of the glycans tested, which included different number of hydrogen bonds and hydrophobic interactions, through changes in residues involved. In addition, nPELa was evaluated for its nociceptive activity in rats and was reported as a first lectin of the Dalbergieae tribe which exhibited hypernociceptive activity in a manner dependent on the carbohydrate recognition site. Uma lectina nativa (nPELa), purificada a partir de sementes da espécie Platypodium elegans, tribo Dalbergieae, foi cristalizada e estruturalmente caracterizada, através de metodologias como a cristalografia por difração de raios X e ferramentas de bioinformática. Os cristais obtidos (do tipo ortorrômbico) foram difratados com qualidade e a estrutura de nPELa foi resolvida com excelência através de substituição molecular, em uma resolução de 1,6 Å. O monômero de nPELa apresentou um sítio de N-glicosilação no resíduo Asn119, assim confirmando a predição da literatura, antes baseada apenas em dados de sequência primária. Além deste, nPELa apresenta um sítio de ligação a metais e um domínio de reconhecimento a carboidratos conservados, semelhantes ao demonstrado para outras lectinas da tribo Dalbergieae, como PAL (Pterocarpus angolensis) e CTL (Centrolobium tomentosum). As análises de docking molecular sugerem a alta afinidade desta lectina por diferentes manosídeos, principalmente trimanosídeos, formados por ligações do tipo α-1,3 ou α-1,6, evidenciado através dos escores obtidos. Além disso, simulações de dinâmica molecular foram realizadas, como forma de demonstrar o comportamento estrutural de nPELa em solução aquosa, sendo a lectina isolada ou associada a ligantes específicos. Os resultados obtidos demonstraram a alta estabilidade de nPELa em solução e as modificações estruturais apresentadas em seu sítio de reconhecimento a carboidratos permitem a interação entre a lectina e os diferentes ligantes testados. Diferentes modificações foram observadas durante as simulações para cada um dos glicanos testados, que incluíram variações no número de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, através de mudanças nos resíduos envolvidos. Além disso, nPELa foi avaliada quanto a sua ação nociceptiva em ratos, sendo relatada como a primeira lectina da tribo Dalbergieae que apresentou atividade hipernociceptiva, de uma maneira dependente do sítio de reconhecimento a carboidratos.

OLIVEIRA, Messias Vital. Determinação estrutural de uma lectina pró-inflamatória de sementes de Vaitarea guianensis (Aublet). 2017. 56 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. Widely distributed in nature, lectins comprise a heterogeneous group of proteins of nonimmune origin, having at least one non-catalytic domain capable of selectively recognizing carbohydrates, and interacting reversibly to free sugars or glycans present in glycoproteins or glycolipids, without altering Structures. The most studied lectins are of vegetable origin, mainly of the family Leguminosae. Within this family stand out the tribes Phaseoleae, Vicieae and Dalbergieae belonging to the subfamily Papilionoideae. Among the lectins of the Dalbergieae tribe, we can highlight a lectin with binding affinity to N-acetyl-D-galactosamine / D-galactose extracted from Vatairea guianensis (VGL) seeds that presented vasodilator effect in vitro with mechanism involving nitric oxide. Some lectins from this same tribe are already characterized biochemically, but only the lectins of Pterocarpus angolensis, Centrolobium tomentosum, Platypodium elegans, Arachis hypogaea and Vatairea macrocarpa have their structures. Structural studies of lectins are used as tools to understand how these proteins behave in the various physiological processes. For lectins that do not yet have their crystallographic structures resolved, Bioinformatics is highlighted using methodologies that predict the three-dimensional structure of these proteins in complex with their ligands. Considering that structural studies with these proteins are still few, the present work had the objective to predict the structure, to study the affinity and the interactions of the lectin of Vatairea guianensis seeds in complex with different glycans applying techniques of bioinformatics, like homology modeling and docking Molecular, in addition to investigating its inflammatory effect in vivo. The VGL model was obtained by homology with Vatairea macrocarpa (VML) lectin and demonstrated common characteristics of legume lectins and the analysis of protein-linker interaction revealed favorable interactions with N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose and sugars. As well as various biologically relevant N- and O-glycans. The in vivo paw edema test revealed that VGL induces the edematogenic effect involving prostaglandins, interleukins and the lectin carbohydrate recognition domain. Together, these data corroborate with work already reported in which VGL interacts with N-or O-glycans of target molecules, particularly those with galactosides in their structure, contributing to the inflammatory effect of the lectin. Amplamente distribuídas na natureza, as lectinas compreendem um grupo heterogêneo de proteínas de origem não imune, que possuem pelo menos um domínio não catalítico capaz de seletivamente reconhecer carboidratos, e interagir de maneira reversível a açúcares livres ou glicanos presentes em glicoproteínas ou glicolipídeos, sem alterar suas estruturas. As lectinas mais estudadas são de origem vegetal, principalmente da família Leguminosae. Dentro desta família destacam-se as tribos Phaseoleae, Vicieae e Dalbergieae pertencentes à subfamília Papilionoideae. Dentre as lectinas da tribo Dalbergieae, podemos destacar uma lectina com afinidade de ligação a N-acetil-D-galactosamina/D-galactose extraída de sementes de Vatairea guianensis (VGL) que apresentou efeito vasodilatador in vitro com mecanismo envolvendo óxido nítrico. Algumas lectinas desta mesmo tribo já estão caracterizadas bioquimicamente, mas apenas as lectinas de Pterocarpus angolensis, Centrolobium tomentosum, Platypodium elegans, Arachis hypogaea e Vatairea macrocarpa têm suas estruturas. Os estudos estruturais de lectinas são utilizados como ferramentas para compreender de que forma essas proteínas se comportam nos vários processos fisiológicos. Para as lectinas que ainda não possuem suas estruturas cristalográficas resolvidas, a Bioinformática ganha destaque utilizando metodologias que realizam uma predição da estrutura tridimensional destas proteínas em complexo com os seus ligantes. Considerando que estudos estruturais com estas proteínas ainda são poucos, o presente trabalho teve por objetivo predizer a estrutura, estudar a afinidade e as interações da lectina de sementes de Vatairea guianensis em complexo com diferentes glicanos aplicando técnicas de bioinformática, como modelagem por homologia e docking molecular, além de investigar o seu efeito inflamatório in vivo. O modelo de VGL foi obtido por homologia com a lectina de Vatairea macrocarpa (VML) e demonstrou características comuns das lectinas de leguminosas e a análise da interação proteína-ligante revelou interações favoráveis com N-acetil-D-galactosamina, D-galactose e açúcares relacionados, bem como vários N- e O-glicanos, biologicamente relevantes. O teste in vivo edema de pata revelou que a VGL induz o efeito edematogênico envolvendo prostaglandinas, interleucinas e o domínio de reconhecimento a carboidratos da lectina. Conjuntamente, esses dados corroboram com trabalhos já reportados em que VGL interage com N- ou O-glicanos de moléculas alvo, particularmente nos que apresentam galactosídeos em sua estrutura, contribuindo para o efeito inflamatório da lectina.

The ability to express and purify desired recombinant proteins in large quantities allows its biochemical characterization and use in industrial processes. Numerous plant lectins have been produced in heterologous systems, especially in Escherichia coli. By recognizing and specifically binding to carbohydrates, these molecules can perform various biological functions, such as cell-cell recognition, cell adhesion, fertilization, and defense mechanisms. Among plant lectins, leguminous lectins have been extensively investigated. The lectin of Canavalia brasiliensis, isolated by the first time in 1984 by Moreira and Cavada is a widely studied protein and has shown an immunostimulatory, andidepressive, antinociceptive, neroptotective, and antiproliferative effect in human leucemia cells, among onther biological activities tested. The biological properties, however, of many lectins have been attributed to isolectin blends, since it is difficult to separate isoforms using standard techniques. In this study the recombinant lectin (α chain) of Canavalia brasiliensis was produced from the synthetic gene inserted in the vector pET28a e. The strains DH5α and BL21 (DE3) were used for cloning and expression, respectively. The rConBr was expressed under all conditions tested and the condition of 16oC, 16 hours and 1,0 mM IPTG (isopropil-β-D-galatosídeo) was chosen for protein production. The protein was purified, being obtained in its active form. Lectin was active when tested against rabbit erytrocytes and was inhibited by mannose and α-methyl-mannopyranoside. The activity of rConBr is optimum at pH 4.0 to 7.0, remains stable up to 60 ° C and is not dependent on divalent cations. In addition, rConBr was not toxic against Artemia sp. and showed no cytotoxic effect on glioma cells C6 lineage. A capacidade de expressar e purificar a proteína recombinante desejada em grande quantidade permite a sua caracterização bioquímica e o uso em processos industriais. Numerosas lectinas vegetais têm sido produzidas em sistemas heterólogos, especialmente em Escherichia coli. Por reconhecer e se ligar especificamente a carboidratos, essas moléculas podem desempenhar diversas funções biológicas, como o reconhecimento célula-célula, adesão celular, fertilização e mecanismos de defesa. Dentre as lectinas vegetais, lectinas de leguminosas têm sido extensivamente investigadas. A lectina de Canavalia brasiliensis, isolada pela primeira em 1984 por Moreira e Cavada, é uma proteína amplamente estudada e mostrou efeito imonuestimulatório, antidepressivo, antinociceptivo, antiproliferativo em linhagens celulares de leucemia humana e efeito neuroprotetor, dentre outras atividades biológicas testadas. Entretanto, as propriedades biológicas de muitas lectinas têm sido atribuídas a misturas de isolectinas, uma vez que é difícil separar isoformas utilizando técnicas convencionais. Neste estudo foi produzida a lectina recombinante (cadeia α) de Canavalia brasiliensis a partir do gene sintético inserido no vetor pET28a. As cepas DH5α e BL21 (DE3) foram utilizadas para clonagem e expressão, respectivamente. A rConBr foi expressa em todas as condições testadas e foi escolhida a condição de 16oC, 16 horas e 1,0 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) para produção da proteína. A proteína foi purificada, sendo obtida na sua forma ativa. A lectina mostrou-se ativa quando testada contra eritrócitos de coelho e foi inibida por manose e α-metil-manopiranosídeo. A atividade da rConBr é ótima em pH 4,0 a 7,0, mantém-se estável até 60°C e não é dependente de cátion divalentes. Além disso, a rConBr não foi tóxica contra náuplios de Artemia sp. e não mostrou efeito citotóxicos em células de glioma linhagem C6.

BARRETO, Adolph Annderson Gonçalves Costa. Caracterização físico-química, modelagem molecular e investigação da ação da lectina CRLII em processos inflamatórios e do potencial antitumoral das lectinas CRLII e CRLI. 2016. 99 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. Lectins are proteins of non-immune origin that have at least one non-catalytic site capable of recognizing carbohydrates in a specific and reversible manner without altering the structure of these molecules. These proteins are widely distributed in nature being found in microorganisms, invertebrate and vertebrate animals and in plants. In vegetables, lectins may be present in roots, stems, leaves, fruits and in seeds, where they are generally expressed in higher concentration. The most studied vegetable lectins are those found in the legume family in which is worth mentioning the subtribe Diocleineae, whose lectins present a peculiar post-translational processing, is characterized by an alpha chain formed by the junction and inversion of the beta and gamma fragments. The literature reports many biotechnological applications for different plant lectins, for example antimicrobial activity, antidepressive, pro and anti-inflammatory, induction of proliferation and cell death, anticancer activity among others. It is important to note that, although lectins are extremely structurally related, they behave very differently when compared in terms of potency in the evaluation of a given biological activity. In this way, investigating new lectins and their biotechnological potential is of enormous value in the discovery of new tools that can be used in different biological models, in the diagnosis and/or therapeutics in the various diseases that afflict human, vegetal and animal health. In this context, this work aimed to characterize physicochemically, to determine the three-dimensional structure and to evaluate the proinflammatory, anti-inflammatory and antiglioma activities of the specific lectin lactose Cymbosema roseum (CRLII), as well as to evaluate the antiglioma activity of the lectin specific mannose of Cymbosema roseum (CRLI) isolated from this plant seeds. CRLII presented optimum hemagglutinating activity (A.H.) in buffer solution with pH between 6 and 8, thermostability up to 40 ° C and the three-dimensional modeled structure presented similarity with the lectin from Vatairea macrocarpa (VML). Regarding the biotechnological potential in inflammation, CRLII showed anti-inflammatory activity via carbohydrate recognition domain (CRD) showing greater effect in the fourth hour. CRLII did not present pro-inflammatory activity. In tests on C6 lineage of Rattus norvegicus glioma cells, CRLII showed no ability to reduce viability, migration or cause changes in morphology and physiology in the cells tested, unlike CRLI which reduced the viability and migration of C6 lineage of Rattus norvegicus glioma cells line evidencing necrosis and apoptosis as mechanisms of cell death. New investigations must be carried out in order to better explain these effects and to establish structure / function correlations. Lectinas são proteínas de origem não-imune que possuem pelo menos um sítio não catalítico capaz de reconhecer carboidratos de forma específica e reversível sem alterar a estrutura dessas moléculas. Essas proteínas estão vastamente distribuídas na natureza sendo encontradas em micro--organismos, animais invertebrados e vertebrados e em plantas. Em vegetais, as lectinas podem estar presentes em raízes, caules, folhas, frutos e sementes, onde são geralmente expressas em maior concentração. As lectinas vegetais mais bem estudadas são aquelas encontradas na família das leguminosas, merecendo destaque a subtribo Diocleineae, cujas lectinas apresentam um processamento pós-traducional peculiar, caracterizado por uma cadeia alfa formada pela junção e inversão dos fragmentos beta e gama. A literatura relata muitas aplicações biotecnológicas para diferentes lectinas vegetais, por exemplo atividade antimicrobiana, antidepressiva, pró e antiinflamatória, indução de proliferação e morte celular, atividade anticancerígena, dentre outras. É importante ressaltar que, embora existam lectinas extremamente relacionadas estruturalmente, elas se comportam de maneira muito diferente quando comparadas em termos de potência na avaliação de uma dada atividade biológica. Dessa forma, investigar novas lectinas e seu potencial biotecnológico é de enorme valia no que diz respeito à descoberta de novas ferramentas que possam ser utilizados em diferentes modelos biológicos, no diagnóstico e/ou terapêutica nas diversas enfermidades que afligem a saúde humana, vegetal e animal. Neste contexto, este trabalho objetivou caracterizar físico-quimicamente, determinar a estrutura tridimensional e avaliar as atividades pró-inflamatória, anti-inflamatória e antiglioma da lectina lactose específica Cymbosema roseum (CRLII), bem como, avaliar a atividade antiglioma da lectina manose específica de Cymbosema roseum (CRLI) purificadas a partir das sementes dessa planta. CRLII apresentou atividade hemaglutinante (A.H.) ótima em solução tampão com pH entre 6 e 8, termoestabilidade até 40◦C e estrutura tridimensional modelada apresentou semelhança com a lectina de Vatairea macrocarpa (VML). Quanto ao potencial biotecnológico em inflamação, CRLII apresentou atividade anti-inflamatória via sítio de reconhecimento de carboidratos (CRD) mostrando maior efeito na quarta hora. CRLII não apresentou atividade pró-inflamatória. Nos testes em células de glioma de Rattus norvegicus da linhagem C6, CRLII não demonstrou capacidade de reduzir a viabilidade, a migração ou causar alterações na morfologia e fisiologia nas células testadas, ao contrário de CRLI que reduziu a viabilidade e migração das células de glioma de Rattus norvegicus da linhagem C6 evidenciando necrose e apoptose como mecanismos de morte celular. Novas investigações devem ser realizadas a fim de melhor explicar esses efeitos e de se estabelecer correlações estrutura/função.

In recent years, researchers have focused their effort to the development of techniques with an interest in diagnostic strategies. To understand the onset and progression of various diseases before the action of any drug is necessary to evaluate the interactions of biological molecules in various cellular processes, this can be done by the use of biomarking strategies. Quantum dots (QDs) are fluorescent inorganic semiconductor compounds, which exhibit quantum confinement in three dimensions and unique optical properties and may be used in the imaging and detection of diagnostic signals. Lectins, proteins/glycoproteins that interact reversibly to specific carbohydrates, are already applied in several studies of biological activities due to its recognition properties. In view of this, the objective of this work was the bioconjugation of quantum dots ZnCdTe with the lectin of Canavalia brasiliensis (ConBr), the physicochemical characterization, evaluation of fluorescence properties and hemagglutination the formed system. The ZnCdTe synthesized nanoparticles were functionalized with a glutaraldehyde linker and then, submitted to bioconjugation reaction with the lectin. The obtained system ZnCdTe-ConBr was subjected to various analyzes such as particle size by Dynamic Light Scattering (DLS); evaluation of optical properties by UV/Visible Spectroscopy Absorption (UV/Vis) and photoluminescence spectroscopy; chemical evaluation of bioconjugation by Infrared Spectroscopy (FT-IR); assessment of morphology and microcomposition by Scanning Electron Microscopy (SEM); topographical evaluation, mechanical and physicochemical properties by Atomic Force Microscopy (AFM); and evaluation of lectin carbohydrate binding site integrity for haemagglutinating activity (H.A.). The results suggest that ZnCdTe-ConBr system was covalently conjugated after the reaction. It was also observed an increase in particle size and a greater homogeneity compared to non-conjugated quantum dots. The optical and functional properties of ZnCdTe-ConBr system was kept displaying a degree of high colloidal stability and functional over a period of 60 days. It was concluded that the system obtained here can be used as a biotechnological tool for use in diagnostic imaging technique. Nos últimos anos, pesquisadores da área da saúde têm somado esforços voltados para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas biotecnológicas com um interesse especial em estratégias de diagnósticos. Para compreender o surgimento e a progressão de várias doenças diante de qualquer fármaco é necessário compreender a interação espaço-temporal das moléculas biológicas em vários processos celulares com o uso de estratégias de biomarcação para o monitoramento. Os pontos quânticos (PQs) são compostos inorgânicos semicondutores fluorescentes, que apresentam confinamento quântico em três dimensões e propriedades ópticas únicas e podem ser empregados na geração de imagens e detecção de sinais em diagnósticos. As lectinas, proteínas/glicoproteínas que interagem de forma reversível a carboidratos específicos, já são aplicadas em diversos estudos de atividades biológicas por esta propriedade de reconhecimento. Diante disto, o presente trabalho objetiva a bioconjugação de pontos quânticos de ZnCdTe com a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr), a caracterização físico-química e avaliação das propriedades de fluorescência e hemaglutinação do sistema formado. As nanopartículas de ZnCdTe foram obtidas do Laboratório de Quimica Biologica e Materiais (Quibiom) do Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (UFS), funcionalizadas com um linker de glutaraldeído, e em seguida foram submetidas à reação de bioconjugação com a lectina. O sistema obtido ZnCdTe-ConBr foi submetido a diversas análises como: tamanho de partícula por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS - Dynamic light scattering); avaliação das propriedades óticas por Espectroscopia de Absorção Ultravioleta/Visível (UV/Vis) e Espectroscopia de Fotoluminescência; avaliação química da bioconjugação por Espectroscopia no Infravermelho (FT-IR - Fourier Transform InfraRed); avaliação da morfologia e microcomposição por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); avaliação topográfica, propriedades mecânicas e físico-químicas por Microscopia de Força Atômica (AFM - Atomic Force Microscopy); e avaliação da integridade do sítio de ligação à carboidratos por Atividade Hemaglutinante (A.H.). Os resultados obtidos sugerem que o sistema ZnCdTe- ConBr foi conjugado covalentemente após a reação. Observou-se também um aumento do tamanho de partícula e uma homogeneidade maior comparado aos pontos quânticos não-conjugados. As propriedades óticas e funcionais (hemaglutinação) do sistema ZnCdTe-ConBr foram mantidas apresentando uma certa estabilidade coloidal e funcional durante um período de até 60 dias. Conclui-se então que o sistema aqui obtido pode ser utilizado como uma nova ferramenta biotecnológica para o desenvolvimento de uma técnica de diagnóstico por imagem.

Lectins with lactose binding specificity isolated from seeds of phylogenetically close plant species of Diocleinae sub-tribe present different characteristics when compared to the extensively studied mannose/glucose-specific lectins. In this study, a new lactose-specific lectin from Dioclea reflexa seeds (DrfL II) was isolated by a two-step chromatography in Sephadex® G-50 and lactose-Sepharose columns. The SDS-PAGE showed that the pure lectin is composed of a single band, slightly lower than 30 kDa, presenting a different profile from ConA-like mannose/glucose specific lectins. Partial sequence of the protein was obtained by electrospray ionization mass spectrometry covering 30% of the total sequence. DrfL II presented sugar specificity to α-lactose, and high stability at wide range of pH. DrfL II showed no toxicity against Artemia nauplii and induced acute inflammation (paw edema and hipernociception) in mice with the participation of the lectin domain and nitric oxide. Thus, it is important to further determine the complete sequence and tridimensional structure of this new type of lactose-binding lectin in order to be able to compare it with mannose/glucose lectins and their biotechnological applications. Lectinas específicas a lactose isoladas de sementes de espécies filogeneticamente próximas da sub-tribo Diocleinae apresentam diferentes características das extensivamente estudadas lectinas específicas a glicose-manose. Nesse estudo, uma nova lectina específica a lactose extraída a partir de sementes de Dioclea reflexa (DrfL II) foi isolada por dois passos cromatográficos em colunas de Sephadex G-50 e sepharose-lactose. A SDS-PAGE apresentou a lectina como uma banda única em torno de 29 kDa, resultado que difere do perfil já conhecido de lectinas ConA-like específicas a glicose/manose. A sequencia parcial da lectina foi obtida por espectrometria de massa com fonte ionizadora eletrospray cobrindo cerca de 30% da sequencia total da proteína. DrfL II apresentou especificidade à L-lactose e alta estabilidade a um vasto intervalo de pH. DrfL II mostrou não ser toxica em teste de toxicidade contra Artemia nauplii e induziu inflamação aguda (edema de pata e hipernocicepção) em camundongos com a participação do domínio da lectina e oxido nítrico. Poucas informações, no entanto, foram publicadas a respeito de lectinas lactose específicas de Diocleinae, se fazendo necessário, portanto, que o estudo seja continuado com a determinação completa da estrutura primaria e tridimensional da lectina, visando sua comparação com os dados existentes de lectinas ConA-like e lactose específicas.

Lectins with lactose binding specificity isolated from seeds of phylogenetically close plant species of Diocleinae sub-tribe present different characteristics when compared to the extensively studied mannose/glucose-specific lectins. In this study, a new lactose-specific lectin from Dioclea reflexa seeds (DrfL II) was isolated by a two-step chromatography in Sephadex® G-50 and lactose-Sepharose columns. The SDS-PAGE showed that the pure lectin is composed of a single band, slightly lower than 30 kDa, presenting a different profile from ConA-like mannose/glucose specific lectins. Partial sequence of the protein was obtained by electrospray ionization mass spectrometry covering 30% of the total sequence. DrfL II presented sugar specificity to α-lactose, and high stability at wide range of pH. DrfL II showed no toxicity against Artemia nauplii and induced acute inflammation (paw edema and hipernociception) in mice with the participation of the lectin domain and nitric oxide. Thus, it is important to further determine the complete sequence and tridimensional structure of this new type of lactose-binding lectin in order to be able to compare it with mannose/glucose lectins and their biotechnological applications. Lectinas com afinidade de ligação a lactose isoladas de sementes de espécies vegetais filogeneticamente próximas da sub-tribo Diocleinae apresentam diferentes características quando comparadas à outras lectinas extensivamente estudadas com afinidade de ligação a glicose-manose. Nesse estudo, uma nova lectina específica a lactose extraída a partir de sementes de Dioclea reflexa (DrfL II) foi isolada por dois passos cromatográficos em colunas de Sephadex G-50 e Sepharose-lactose. A SDS-PAGE revelou uma lectina como uma banda única em torno de 29 kDa, diferindo do perfil já conhecido de lectinas ConA-like específicas a glicose/manose. A sequência parcial da lectina foi obtida por espectrometria de massa com fonte ionizadora eletrospray cobrindo cerca de 30% da sequência total da proteína. DrfL II apresentou especificidade à α-lactose e alta estabilidade a um vasto intervalo de pH. DrfL II mostrou ausência de toxicidade contra Artemia nauplii e induziu inflamação aguda (edema de pata e hipernocicepção) em camundongos com a participação do domínio da lectina e óxido nítrico. Visto que poucas informações têm sido publicadas a respeito de lectinas lactose específicas de Diocleinae, se faz necessário, portanto, que o estudo seja continuado visando a determinação completa da estrutura primária e tridimensional da lectina, para comparação com os dados existentes de lectinas ConA-like e lactose específicas

PINTO JÚNIOR, Vanir Reis. Análise estrutural de uma lectina de sementes de Diocle lasiophylla Mart. ex Benth e avaliação do seu efeito vasorelaxante, inflamatório e nociceptivo. 2016. 111 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, 2016. Lectins are (glyco)proteins of non-immune origin, capable of reversibly binding to specific mono or oligosaccharides, via a non-catalytic domain. The legume family is the most well-studied group, with many lectins purified, structurally characterized and applied in biological and biotechnological activities. The subtribe Diocleinae presents lectins that have high structural similarity, but different effects on biological activity assays. This variability is due to small differences which may be analyzed by structural studies. In context, this study aims to structurally characterize and analyze the effect on contractility, inflammation and nociception studies, of a lectin present in Dioclea lasiophylla Mart. ex Benth seeds, species of the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Phaseoleae tribe, Diocleinae subtribe. The lectin (DlyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 matrix. The primary sequence of DlyL was determined by tandem mass spectrometry (MS/MS) and sequencing of the gene encoding to the lectin, showing high similarity with others lectins from species of the same genus. The three-dimensional structure of DlyL complexed with X-Man was predicted in silico by homology modelling. DlyL presented vasorelaxant effect on smooth muscle of rat’s endothelialized aortas as well as inflammatory activity in the rat paw edema model. The lectin presented hipernociceptive effect associated with inflammation, determined by Von Frey method. Lectinas são (glico)proteínas de origem não imune, capazes de se ligarem reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos, através de um domínio não catalítico. A família das leguminosas representa o grupo mais bem estudado, com muitas lectinas purificadas, caracterizadas estruturalmente e aplicadas em atividades biológicas e biotecnológicas. A subtribo Diocleinae apresenta lectinas que possuem alta similaridade estrutural, porém apresentam diferentes efeitos em ensaios de atividade biológica. Esta variabilidade é devido a pequenas diferenças que podem ser analisadas em estudos estruturais. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo caracterizar estruturalmente, bem como analisar o efeito em modelos de contratilidade, inflamação e nocicepção, de uma lectina presente em sementes de Dioclea lasiophylla Mart., espécie pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina (DlyL) foi purificada em uma única etapa através de cromatografia de afinidade em matriz Sephadex G-50. A sequência primária de DlyL foi determinada por espectrometria de massas em tandem (MS/MS) em conjunto com o sequenciamento do gene que codifica para a lectina, que apresentou alta similaridade com outras lectinas de espécies da mesma subtribo. A estrutura tridimensional de DlyL complexada com X-Man foi predita in silico através de modelagem por homologia. DlyL apresentou efeito vasorelaxante em músculo liso de aortas endotelizadas de rato, como também atividade inflamatória no modelo de edema de pata em rato. A lectina apresentou efeito hipernociceptivo associado a inflamação, determinado pelo método Von Frey.

Seaweeds are a rich reserve of substances with biotechnological interest, among these substances it is possible to highlight the phycobiliproteins. These molecules are water-soluble proteins covalently linked to pigments with linear tetrapyrrole structure called bilin, also known as accessory pigment. Thus, the phycobiliproteins form a complex named phycobilisomes, which is a primary structure of light-gathering, showing photosynthetic function. These structures are found in red and Cyanophyceae seaweed. Phycobiliproteins isolated and purified, when structuraly analised, present subunits characterized as alpha, beta and gamma. These proteins can be used as colorants and stabilizers for food, markers of biomolecules, antioxidants and anti-inflammatory agents. In view of the importance of these molecules, this work aimed to isolate, purify and determine the partial primary structure of the beta chain phycobiliprotein present in the red marine algae Hypnea musciformis. The phycobiliprotein (HMp) was isolated by precipitation of proteins with ammonium sulphate and purified by ion-exchange chromatography. The polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the HMp has two chains around 20 kDa and 22 kDa. The 22 kDa chain was excised from the gel and digested with proteolytic enzyme trypsin. The peptides from digestion underwent fragmentation in mass spectrometer. The generated fragments were used for sequencing peptides and have identified in databases. Primers were designed to amplify the beta chain gene bhmp from the genomic DNA of the algae. The amplified gene was sequenced and the tool Phred/Phrap/Consed processed the raw data. The final gene sequence has been translated to obtain the partial primary structure of bHMp. The translation resulted in a sequence with 87 amino acid residues and HMp presented identity with various phycoerythrins of red algae. As algas marinhas constituem uma rica reserva de substância de interesse biotecnológico, dentre essas substâncias podemos destacar as ficobiliproteínas. Essas moléculas são proteínas solúveis em água ligadas covalentemente a pigmentos com estrutura tetrapirrólica linear denominado bilina, também conhecido como pigmento acessório. Dessa forma, as ficobiliproteínas formam um complexo denominado ficobilissomos, que constitui uma estrutura primordial de captação de luz, apresentando função fotossintética. Essas estruturas são encontradas nas algas marinhas vermelhas e cianofíceas. Ficobiliproteínas isoladas e purificadas, quando caracterizadas, apresentaram subunidades estruturais, como subunidades alfa, beta e gama. Quanto a suas aplicações, essas proteínas foram utilizadas como corantes e estabilizantes de alimentos, marcadores de biomoléculas, agentes antioxidantes e anti-inflamatórios. Tendo em vista a importância destas moléculas, este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e determinar a estrutura primária parcial da cadeia beta de uma ficobiliproteína presente na alga marinha vermelha Hypnea musciformis. A ficobiliproteína (HMp) foi isolada através da precipitação do extrato proteico com sulfato de amônio e purificada por cromatografia de troca iônica. A eletroforese em gel de poliacrilamida revelou que a HMp possui duas bandas proteicas em torno de 20 kDa e 22 kDa. A banda de 22 kDa foi excisada do gel e digerida com a enzima proteolítica tripsina. Os peptídeos oriundos da digestão foram submetidos à fragmentação em espectrômetro de massas. Os fragmentos gerados foram utilizados para sequenciar os peptídeos e estes na identificação de proteínas a partir dos bancos de dados existentes. A partir dessas informações, iniciadores foram desenhados para amplificar o gene da cadeia beta da ficobiliproteína de Hypnea musciformis (bhmp) a partir do DNA genômico da alga. O gene amplificado foi sequenciado e os dados brutos foram processados pela ferramenta Phred/Phrap/Consed. A sequência processada foi traduzida para obtenção da estrutura primária parcial de bhmp. A tradução resultou em uma sequência de 87 resíduos de aminoácidos e HMp apresentou identidade com diversas ficoeritrinas de algas vermelhas.

BARI, Alfa Umaro. Lectinas de sementes de Parkia panurensis e de Parkia biglobosa: estudos físico-químicos e estruturais. 2015. 78 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. Lectins are proteins of non-immune origin with at least one non-catalytic domain that reversibly binds to specific mono or oligo saccharides and are widely distributed in the plant kingdom. These lectins are presented as valuable tools for biotechnological byplay important biological functions such as recognition of cancer cells, mitogenic agents, immune suppressants among others. In this work, it was isolated lectin from Parkia panurensis seed (Ppal) specifies to mannose and glucose by combining the techniques of ammonium sulfate fractionation and affinity chromatography on a sepharose-mannose column. The analysis of the physicochemical properties showed that Ppal can maintain its hemagglutination activity at a wide range of temperature and pH and also was dependent of metal ions Ca2+and especially Mn2+. By the electrophoresis (SDS-PAGE) analysis, the Ppal showed an electrophoretic profile composed of dual band, higher molecular weight approximately 45kDaand a smaller molecular weight of approximately30kDa. Studies to determine the three-dimensional structure of Parkia biglobosa seed lectin (PBL) showed the complete crystal structure of PBL complexed withα-methyl-manosídeo consists of a monomer in the asymmetric unit consists of threeβ-prism domains with homologous amino acid sequences arranged in tandem. The structure of the monomer has three carbohydrate binding sites, each binding site to carbohydrates is located in one of theβ-prism domains. All ligands showed different patterns of interaction with the residues of the carbohydrate binding site. Lectinas são proteínas de origem não imune com no mínimo um domínio não catalítico que se liga de forma reversível a mono ou oligossacarídeos específicos e encontram-se largamente distribuídas no reino vegetal. As lectinas de sementes apresentam-se como valiosas ferramentas biotecnológicas por desempenharem importantes funções biológicos tais como reconhecimento de células cancerígenas, agentes mitogênicos, imunossupressores entre outras. Neste trabalho foi isolada uma lectina de sementes de Parkia panurensis (PpaL) específica por manose e glicose pela combinação das técnicas de fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-manose. A análise das propriedades físico-química demonstrou que PpaL consegue manter a sua atividade hemaglutinante a ampla faixa de temperatura e pH. PpaL é uma proteína dependente dos íons metálico Ca2+ e principalmente o Mn2+. Pela analise de eletroforese (SDS-PAGE) PpaL apresentou um perfil eletroforético composto por dupla banda, uma maior com peso molecular de aproximadamente 45 kDa e outra menor com peso molecular de aproximadamente 30 kDa. Estudos para determinação de estrutura tridimensional de lectina de sementes de Parkia biglobosa demonstrou que a estrutura cristalina completa da PBL complexado com α-metil-manosídeo consiste de um monômero na unidade assimétrica formado por três domínios β-prisma com as sequências de aminoácidos homologas arranjado na forma de tandem. A estrutura do monômero apresenta três sítios de ligação a carboidratos, cada sitio de ligação a carboidratos está localizado em um dos domínios β-prisma. Todos os ligantes apresentaram diferentes padrões de interação com os resíduos do sitio de ligação a carboidrato.

Marine sponges are a rich reserve of natural substances, many of them of immense biotechnological interest. They comprise a promising group in providing bioactive compounds for humanity. Thus, research on new drugs from natural sources suggest that marine sponges have important bioactive compounds ponteciais: pharmacological, antimicrobial; antitumor; antiviral; anti-inflammatory; immunosuppressive; cardiovascular; neurosupressor; muscle relaxant and pollution biomarker. Analysis of expressed proteins is an important approach to determine the function of these molecules in a given organism. This study aimed to bioprospect proteins expressed by the marine sponge Aaptos sp. collected in Icarai de Amontada, Ceará, who may have biotechnological potential. For the realization of this approach were used as strategies the two-dimensional electrophoresis (2-DE) and bioinformatics. The 2-DE is a tool used to separate proteins from different organisms. Knowing the proteins expressed in the study sponge can be established Protein patterns characteristic of the species under study. Based on the above, this study used 2DE to investigate the expressed protein Aaptos sp. In order to make the extraction of total proteins was performed using 400 mg of the marine sponge Aaptos sp. For qualitative and quantitative analysis of proteins was used the method of Bradford and SDS-PAGE, respectively. From the total protein extract was determined the two-dimensional reference map for marine sponge in the study. The adjustment of images of two-dimensional gels, the protein spot detection and evaluation of data to determine apparent molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) of the spots was made by the ImageMaster software 7. Expressed proteins were identified using the values of pI and MM spot against a UniProt protein database available on the ExPASy server. The average number of protein spots of replicas of the gels 2DE was 124. The highest abundance proteins was observed in 2DE gels in the pH range of 4 to 6.7 and with MM between 13 to 119.67 kilodalton (kDa). From the 2DE reference gel was identified 122 proteins of which 61, 46 and 15 belong to the Cnidaria taxon deuterostomia and Porifera, respectively. The proteins identified Porifera belong to functional category: ATP binding, structural component of the ribosome, catalytic activity, GTP binding, calcium ion binding and disulfide oxidoreductase activity. The functional category binding of ATP and GTP with more spots. Adicionadamente, was expressed proteins with important molecular functions already hued in the literature but not in Aaptos sp., thus indicating the importance of these marine sponges as a source of protein information that may be studied in the future for their potential use as biotechnological tools in several areas and can be used in studies to elucidate the metabolic pathways and the development of drugs against possible pathologies. As esponjas marinhas constituem uma rica reserva de substâncias naturais, muitas delas de imenso interesse biotecnológico. Elas compreendem um grupo promissor no fornecimento de compostos bioativos para a humanidade. Desta forma, pesquisas de novas drogas de fontes naturais sugerem que as esponjas marinhas possuem importantes compostos bioativos com ponteciais: farmacológico, antimicrobiano; antitumoral; antiviral; antiinflamatório; imunossupresor; cardiovascular; neurosupressor; relaxante muscular bem como biomarcador de poluição. A análise de proteínas expressas é uma abordagem importante para determinar a função dessas moléculas em um determinado organismo. Esse trabalho teve como objetivo bioprospectar proteínas expressas pela esponja marinha Aaptos sp. coletada no Icaraí de Amontada, Ceará, que possam apresentar potencial biotecnológico. Para a realização dessa abordagem, foram utilizadas como estratégias a eletroforese bidimensional (2-DE) e a bioinformática. A 2-DE é uma ferramenta utilizada para separar proteínas de diversos organismos. Conhecendo-se as proteínas expressas na esponja estudada pode-se estabelecer padrões protéicos característicos da espécie em estudo. Com base no exposto, neste estudo foi utilizado 2DE para investigar as proteínas expressas de Aaptos sp. A fim de fazer a extração de proteínas totais foi realizada a partir de 400 mg da esponja marinha Aaptos sp. Para análise quantitativa e qualitativa das proteínas foi utilizado o método de Bradford e SDS-PAGE, respectivamente. A partir das proteínas totais extraídas foi determinado o mapa bidimensional de referência para a esponja marinha em estudo. O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação massa molecular aparente (MM) e ponto isoelétrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster 7. Proteínas expressas foram identificadas utilizando os valores de pI e MM do spot contra um banco de dados de proteínas UniProt disponível no servidor ExPASy. O número médio de spots protéicos das replicas dos géis 2DE foi de 124. A maior abundância de proteínas foi observada nos géis 2DE na faixa de pH de 4 a 6,7 e com MM entre 13 a 119,67 quilodalton (kDa). A partir do gel 2DE de referencia foi identificado 122 proteínas das quais 61, 46 e 15 pertencem aos táxon cnidária, deuterostomia e porífera, respectivamente. As proteínas identificadas de porífera pertencem a categoria funcional: ligante de ATP, componente estrutural do ribossomo, atividade catalítica, ligante de GTP, ligante de íon de cálcio e atividade dissulfeto oxidoredutase. Sendo a categoria funcional ligante de ATP e de GTP com maior número de spots. Adicionadamente, houve proteínas expressas com importantes funções moleculares já relada na literatura, porém não em Aaptos sp., assim indicando a importância destas esponjas marinhas como fonte de informação proteica que poderão ser estudadas no futuro quanto ao seu potencial uso como ferramentas biotecnológicas em diversas áreas, podendo ser empregadas em estudos que possam elucidar as vias metabólicas bem como o desenvolvimento de fármacos contra possíveis patologias.

CORREIA, Jorge Luis Almeida. Purificação, caracterização parcial e potencialidade biotecnológica de três lectinas de sementes de espécies de Leguminosae da subtribo Diocleinae. 2015. 101 f. Tese (Doutorado em biotecnologia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. Leguminosae is recognized by the large amount of isolated and characterized lectins, especially seeds. In this group stand out proteins extracted from species belonging to subtribe Diocleinae, the number of studies in different areas of knowledge. Lectins can be defined as proteins or glycoproteins which are not originated from a body's immune response and have the ability to recognize and bind reversibly to mono or oligosaccharides particular without, however, altering their chemical structures. Different works in our group are structurally haracterizing these proteins as well as elucidating some possible biotechnological applications for these molecules. In this sense, the objective of this study was to isolate and characterize lectins of different species of Leguminosae of Diocleinae subtribe and test them for toxicity to Artemia sp. naupilos, The effect on the smooth muscle of blood vessels and the detention lectin matrix agarose previously activated with cyanogenic bromide (CNBr). Were isolated and characterized the lectin Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa and Dioclea lasiophylla. Were also made circular dichroism studies on lectin Dioclea sclerocarpa and Dioclea lasiocarpa. The lectin Dioclea lasiophylla was tested against Artemia sp. order to assess their toxicity and was also immobilized on agarose matrix. We evaluated the effect of lectin Dioclea lasiocarpa in the smooth muscle of blood vessels. The knowledge gained from the three scientific articles published in this thesis is a major breakthrough in this promising field of study that has been continuously growing for biotechnological applications. A família Leguminosae é reconhecida pela grande quantidade de lectinas isoladas e caracterizadas, especialmente de sementes. Neste grupo se destacam as proteínas extraídas de espécies pertencentes a subtribo Diocleinae, pela quantidade de estudos em diferentes áreas do conhecimento. Lectinas podem ser definidas como proteínas ou glicoproteínas que não são originadas a partir de uma resposta imunológica do organismo e possuem a capacidade de reconhecer e se ligar reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos sem, no entanto, alterar suas estruturas químicas. Diferentes trabalhos no nosso grupo vêm caracterizando estruturalmente essas proteínas, bem como elucidando algumas possíveis aplicações biotecnológicas para essas moléculas. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar lectinas de diferentes espécies de Leguminosae da subtribo Diocleinae e testa-las com relação à toxicidade para naupilos de Artemia sp., o efeito na musculatura lisa de vasos sanguíneos e a imobilização de lectina em matriz de agarose previamente ativada com brometo cianogênico (CNBr). Foram isoladas e caracterizadas as lectinas de Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa e Dioclea lasiophylla. Também foram feitos estudos de dicroísmo circular na lectina de Dioclea sclerocarpa e Dioclea lasiocarpa. A lectina de Dioclea lasiophylla foi testada contra Artemia sp.de forma a avaliar sua toxicidade e também foi imobilizada em matriz de agarose. Foi avaliado o efeito da lectina de Dioclea lasiocarpa na musculatura lisa de vasos sanguineos. O conhecimento acumulado a partir dos três artigos científicos publicados nesta tese constitui um grande avanço no neste campo promissor de estudo que vem em contínuo crescimento para aplicação biotecnológica.

NASCIMENTO, A. S. F. Lectinas recombinantes das algas marinhas vermelhas Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamouroux e Bryothamnion triquetrum (S. G. Gmelin) M. Howe: produção heteróloga e caracterização bioquímica. 2014. 260 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into differents vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Å. Os genes sintéticos das lectinas das algas marinhas vermelhas Hypnea musciformis (HML) e Bryothamnion triquetrum (BTL) foram clonados em diferentes vetores e transformados em diferentes células bacterianas de expressão. As lectinas recombinantes foram obtidas a partir da fração solúvel das culturas bacterianas de Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) para rHML e BL21 (DE3) para rBTL. Os testes de hemaglutinação mostraram que rHML e rBTL são capazes de aglutinar eritrócitos de coelho tratados com diferentes enzimas proteolíticas. As propriedades hemaglutinantes de rHML e de rBTL confirmam o enovelamento correto e o estado funcional das proteínas. A caracterização da especificidade de ligação a carboidratos da HML, BTL e da rBTL por glycan array mostrou uma especificidade restrita por oligossacarídeos complexos contendo o núcleo de fucosilação (α1-6), com uma preferência particular por N-glicanos não bisectados, bi e tri-antenados de cadeia curta. A presença de ácido siálico na extreminada não-redutora dos glicanos favorece o reconhecimento. Essa foi a primeira caracterização de lectinas de algas vermelhas por glycan array. Experimentos de STD-RMN com a BTL mostraram uma interação com um octassacarídeo contendo o núcleo de fucosilação (α1-6). A atividade tóxica das lectinas selvagens e recombinantes foi avaliada contra Artemia sp. e contra células de adenocarcinoma de pulmão (A549). Nos ensaios de citotoxicidade, HML, rHML, BTL e rBTL não mostraram nenhuma toxicidade contra Artemia sp. e somente HML e rHML mostraram uma baixa toxicidade contra células de adenocarcinoma de pulmão (A549). O primeiro cristal de rBTL foi obtido a um nível de microescala com a ajuda de um robôt de cristalização e difratou a 15 Å de resolução.

Atualmente vivemos em uma acirrada competição na pesquisa de desenvolvimento de novos produtos biotecnológicos, o ambiente marinho pode ser visto como uma fonte de materiais biotecnológicos funcionais. Recentemente, estudos demostram que dentro do ambiente marinho as algas se destacam como organismos com grande potencial biotecnológico por possuirem em sua composição várias moléculas bioativas que apresentam diversas e intensas atividades biológicas. Dentre todos os grupos algais, neste trabalho enfatizamos o das algas vermelhas, a qual a espécie de estudo é a alga marinha vermelha Hypnea musciformis (Wulfen). J. V. Lamouroux pertence à ordem Gigartinales e a família Hypneaceae, abundante no litoral do Ceará. Trabalhos biotecnológicos e científicos são realizados com esta espécie, neste sentido o objetivo principal deste trabalho e identificar e caracterizar proteínas existente neste organismo através de uma abordagem proteômica, que é uma área recente na ciência, que permite bioprospectar um conjunto de proteínas presentes num organismo através do uso de ferramentas analíticas, pois, em condições fisiológicas específicas, o funcionamento do sistema biológico pode ser refletido por análise do proteoma do mesmo, e assim a sua expressão gênica funcional. Considerando a carência de estudos sobre proteômica em algas marinhas e em especial da carragenófita Hypnea musciformis, o presente trabalho tem como objetivo principal desenvolver metodologias de separação de proteínas de extrato protéico de Hypnea musciformis e identificar as proteínas expressas pelo organismo. Neste trabalho conseguimos estabelecer uma metodologia de separação de proteínas deste organismo a partir de um extrato fracionado com sulfato de amônio e através de espectrometria de massas, identificar algumas proteínas da alga marinha. Desta forma, sendo de fundamental importância para o enriquecimento na literatura de proteomica de macroalgas marinhas. Os resultados deste trabalho que estão de acordo com o nosso objetivo foi a identificação de 3 proteínas por técnica de espectrometria de massas utilizando ionização do tipo eletrospray da fração protéica 20-40% e a identificação de algumas proteínas através do Mascot We currently live in a fierce competition in the research development of new biotechnology products, the marine environment can be seen as a source of functional biotechnological materials. Recent studies show that within the marine environment algae stand out as organisms with great biotechnological potential by having in its composition various bioactive molecules that have diverse and intense biological activities, among all algal groups in this study emphasize the of red algae, which the kind of study is red seaweed Hypnea musciformis (Wulfen). JV Lamouroux belongs to the order Gigartinales and Hypneaceae family, abundant on the coast of Ceará. Biotechnological and scientific works are carried out with this species, in this sense, the main objective of this work is to identify and characterize proteins existing in this organism through a proteomics approach, is a new area in science that allows bioprospect a set of proteins in an organism by using analytical tools because under specific physiological conditions the biological functioning of the system can be reflected by the proteome analysis of the same, and thus the functional gene expression. Considering the lack of studies on proteomics in seaweed and in particular the carragenófita Hypnea musciformis, this paper aims to develop methods for separating proteins from protein extract of Hypnea musciformis and identify the proteins expressed by the organism. In this work we have established a methodology for separating proteins of this organism from a fractionated extract with ammonium sulfate and by mass spectrometry to identify proteins of some kelp, thus being of fundamental importance for the enrichment of macroalgae in the proteomics literature marine. The results of this work are consistent with our objective was the identification of three proteins by mass spectrometry using electrospray ionization type protein fraction of 20-40% and the identification of some proteins by Mascot

Moreira, C. G. Isolamento, purificação e caracterização físico-química parcial de uma lectina presente em sementes de andira pisonis mart. 2013. 56 f. Dissertação (mestrado em Biotecnologia)Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. Lectins are ubiquitous proteins in nature, of non-immune origin, which have at least one non-catalytic domain that binds carbohydrates specifically and reversibly. They can be found in vegetables leaves, stems and seeds. The Dalbergieae tribe has lectins which have specificity for different carbohydrates and also have several biological activities such as induction of rat paw edema, release of chemotactic mediators by macrophages, vasorelaxant effect in rat aortas, and others. This study aimed to isolate, purify and physiochemically characterize a lectin found in seeds of Andira pisonis (Dalbergieae tribe). Andira pisonis seeds were ground into a fine powder and subjected to total protein extraction in 1 M ammonium sulfate. Soluble proteins were subjected to hemagglutination activity, quantification by the Bradford method and essays of hemagglutination inibition activity by sugar. The lectin from Andira pisonis (APL) was purified by affinity chromatography on Sepharose- Mannose matrix eluted in 0.1 M glycine buffer pH 2.6 with 0.15 M NaCl. The eluted fraction was dialyzed against distilled water, lyophilized and subjected to ion exchange chromatography on HiTrap SP XL 01. APL was eluted on 20 mM sodium acetate buffer pH 4.5 gradient of 0-1M NaCl. APL hemagglutinated rabbit erythrocytes (enzymatically treated) and other lectins from the tribe Dalbergieae and showed specificity for mannose (25 mM). SDS-PAGE analysis showed that APL is composed of a major 34 kDa double band and a minor 8 and 9 kDa double band. APL showed thermostability at 60° C. Further studies are required in order to better physicochemically characterize this protein. Lectinas são proteínas ubíquas na natureza, de origem não imune, que possuem ao menos um domínio não catalítico que se liga de forma específica e reversível a carboidratos. Em vegetais estão distribuídas em folhas, caules e sementes. A tribo Dalbergieae apresenta lectinas que mostram especificidade por diferentes carboidratos e apresentam atividades biológicas diversas como indução de edema em pata de rato, liberação de mediadores quimiotáticos por macrófagos, atividade vasorelaxante em aortas de ratos, dentre outras. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e caracterizar físico-quimicamente uma lectina presente em sementes de Andira pisonis (tribo Dalbergieae). Sementes de Andira pisonis foram trituradas até obtenção de fino pó e as proteínas totais foram extraídas em sulfato de amônio 1M. As proteínas solúveis foram submetidas a atividade hemaglutinante, quantificação pelo método de Bradford e ensaios de inibição da atividade hemaglutinante. A lectina de sementes de Andira pisonis (APL) foi purificada através de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose, eluída em tampão glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M. A fração eluída foi dialisada contra água destilada, liofilizada e submetida a cromatografia de troca iônica em HiTrap SP XL 01. APL foi eluída com tampão acetato de sódio 20mM pH 4,5 em gradiente de NaCl 0-1M. APL hemaglutinou eritrócitos de coelho (tratados enzimaticamente), assim como outras lectinas da tribo Dalbergieae e apresentou especificidade por manose (25mM). Análise em PAGE-SDS mostrou que APL é composta por uma banda de 34 kDA e uma dupla banda de 8 e 9 kDA. APL apresentou termoestabilidade até 60°C. São necessários mais estudos de caracterização físico-química para melhor caracterizar esta proteína.

MARTINS, M.G.Q. Biodegradação de ácido 2,4 - Diclorofenoxiacético por burkholderia sp. 2012. 113 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. Bacteria of the genus Burkholderia have the capacity to degrade various toxic and recalcitrant compounds. Based on the foregoing, this study used real-time PCR (qRT-PCR) and two-dimensional electrophoresis (2DE) to investigate the gene expression profiles tfdB related to biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and differentially expressed proteins qualitative and qualitative, respectively in the presence of 2,4-D Burkholderia sp. SMF07. In order to make the extraction of RNA and protein total bacterial growth was carried out in two TY culture media (Tryptone-Yeast Medium), a control and the other being supplemented with 1 mg / mL 2,4-D, both were incubated at 28 ° C. RNA extraction and total proteins was done after addition of the pollutant in time of 15 minutes, 1, 2, 3 and 5 hours and during the log phase bacterial growth, respectively. The quality of total RNA was measured by the integrity of the fragments of ribosomal RNA (rRNA) checked by electrophoresis on 1.2% agarose gel and the ratio between the absorbances at 260 nm and 280 nm. For quantitative and qualitative analysis of proteins, the method of Bradford and SDS-PAGE, respectively. The synthesis of complementary DNA (cDNA) was determined from the total RNA using the enzyme reverse transcriptase (Superscript III, Invitrogen) using random primers and 6-mer (Invitrogen). Relative expression of the gene was performed using tfdB qRT Power-PCR using SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) and using the 16S rRNA gene as housekeeping. The synthesized cDNA was used as template DNA. Comparative analysis of qRT-PCR was performed by 2-ΔΔCT method. The total proteins extracted from the two-dimensional map was determined for each reference condition. The adjustment of the two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots and evaluate data to determine quantitative and qualitative variations, molecular mass (MM) and isoelectric point (pI) of the spots was done by the program ImageMaster®. Proteins differentially expressed quantitatively and qualitatively in the presence of 2,4-D were identified using the values of pI and MM of the spot against a database of proteins available in UniProt ExPASy server. According to this work, the gene expression tfdB significantly increased 200% over the control after one hour of induction of the abovementioned herbicides. The mean number of spots of replication of protein was 836 2DE gel (control) and 803 (treatment). The greater abundance of proteins was observed in the 2DE gels in pH range 5-6 with MM between 20 and 40 quilodalton (kDa). It was verified in 2DE gels differentially expressed proteins quantitatively and qualitatively to the stress condition in response to bacterial 2,4-D compared to control. Most of these identified proteins belong to molecular function: hydrolase or transferase, expressed different quantitative and qualitative. For these reasons, the strain of Burkholderia sp. SMF07 introduced tfdB also the gene expression level was increased and it was possible to detect differentially expressed proteins qualitatively and quantitatively to grow in medium containing 2,4-D, indicating the importance of these bacteria on the biodegradation of the pollutant. In accordance with these data, we conclude that strain Burkholderia sp. SMF07 tfdB introduced gene, which demonstrated high expression in a medium containing 2,4-D. Adicionadamente, were differentially expressed proteins in medium supplemented above, indicating the importance of these bacteria as a biotechnological tool for the biodegradation potential of this pollutant Bactérias do gênero Burkholderia apresentam capacidade de degradar diversos compostos tóxicos e recalcitrantes. Com base no exposto, neste estudo foi utilizado PCR em tempo real (qRT-PCR) e eletroforese bidimensional (2DE) para investigar os perfis de expressão do gene tfdB relacionado a biodegradação de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e proteínas diferencialmente expressas qualitativa e qualitativa, respectivamente na presença de 2,4-D por Burkholderia sp. SMF07. A fim de fazer a extração de RNA e proteínas totais foi realizado o crescimento bacteriano em dois meios de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), sendo um controle e o outro suplementado com 1 mg/mL de 2,4-D, ambos foram incubados a 28 ºC. A extração de RNA e proteínas totais foi feita após a adição do poluente no tempo de 15 minutos, 1, 2, 3 e 5 horas e durante a fase log do crescimento bacteriano, respectivamente. A qualidade do RNA total foi mensurada pela integridade dos fragmentos de RNA ribossômico (rRNA) verificado por eletroforese em gel de agarose 1,2% e pela relação entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm. Para análise quantitativa e qualitativa das proteínas foi utilizado o método de Bradford e SDS-PAGE, respectivamente. A síntese do DNA complementar (cDNA) foi realizada a partir do RNA total extraído utilizando a enzima de transcrição reversa (Superscript III, Invitrogen) e empregando iniciadores randômicos 6-mer (Invitrogen). A expressão relativa do gene tfdB foi feita através qRT-PCR utilizando Power SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) e empregando o gene 16S rRNA como housekeeping. O cDNA sintetizado foi empregado como DNA template. A análise comparativa da qRT-PCR foi feita pelo método 2-ΔΔCT. A partir das proteínas totais extraídas foi determinado o mapa bidimensional de referência para cada condição. O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação de variações quantitativas e qualitativas, massa molecular (MM) e ponto isoelétrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster®. Proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente na presença de 2,4-D foram identificadas utilizando os valores de pI e MM do spot contra um banco de dados de proteínas UniProt disponível no servidor ExPASy. De acordo com esse trabalho, a expressão do gene tfdB aumentou significativamente 200% em relação ao controle após 1 hora de indução com o supracitado herbicida. O número médio de spots protéicos das replicas dos géis 2DE foi de 836 (controle) e 803 (tratamento). A maior abundância de proteínas foi observada nos géis 2DE na faixa de pH de 5-6 com MM entre 20 e 40 quilodalton (kDa). Foi possível verificar nos géis 2DE proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente para a condição de estresse bacteriano em reposta ao 2,4-D em relação ao controle. A maioria dessas proteínas identificadas pertence às funções moleculares: transferase ou hidrolase, diferentes expressas quantitativas e qualitativas. De acordo com os presentes dados, conclui-se que a cepa de Burkholderia sp. SMF07 apresenta o gene tfdB, o qual demostrou seu nível de expressão aumentado em meio contendo 2,4-D. Adicionadamente, houve proteínas diferencialmente expressas no referido meio suplementado, indicando a importância desta bactéria como ferramenta biotecnológica potencial para a biodegradação deste poluente.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process. A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGTΔ-LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vAgEGTΔ-LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPVMP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vAgEGTΔ-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vAgEGTΔ-LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vAgEGTΔ-LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5