Search

Table S1. Release criteria of clinical-grade batches of BM-MSC from two independent GMP-compliant facilities. Release criteria defined on MSC phenotype. Figure S1. Gating strategy used in flow cytometry analysis to determine HLA-DR expression in BM-MSC. Represented in blue IgG isotype control for unspecific staining. The interval gate was established with a value of HLA-DR+ of isotype control positivity below 1%. Figure S2. Comparison of HLA-DR covariance between batch release and after standardization of the analysis of cytometric data from Barcelona and Helsinki. Statistically not significant (p value 0.2997). Figure S3. Percentage of MSC expressing HLA-DR along culture passaging. Figure S4. Osteogenic and chondrogenic potential of cells cultured in the presence of activating and non-activating sera supplements. Scale bars = 200 μm. (DOCX 16212 kb)

Complications of microocclusions have been reported after intra-arterial delivery of mesenchymal stromal cells. Hence, quantification and efficient limitation of cell clumps in suspension before transplantation is important to reduce the risk. We used a flow cytometry-based pulse-width assay to assess the effects of different cell suspension concentrations (0.2-2.0 × 106/mL), storage solutions (complete growth medium, Dulbecco's phosphate-buffered saline, and normal saline), storage time in suspension (0-9 h), and freeze-thawing procedure on the clumping of rat bone marrow derived mesenchymal stromal cells (BMMSCs) and also evaluated cell viability at the same time. Surprisingly, increasing the cell concentration did not result in more cell clumps in vitro. Freshly harvested (fresh) cells in normal saline had significantly fewer cell clumps and also displayed high viability (>90%). A time-dependent reduction in viability was observed for cells in all three storage solutions, without any significant change in the clumping tendency except for cells in medium. Fresh cells were more viable than their frozen-thawed counterparts, and fresh cells in normal saline had fewer cell clumps. In conclusion, cell clumping and viability could be affected by different cell preparation procedures, and quantification of cell clumping can be conducted using the flow cytometry-based pulse-width assay before intra-arterial cell delivery.

Mesenchymal stromal cells (MSC) are a potential tool for cell-based therapies subject to intensive investigation. MSCs display immunomodulatory functions and a broad differentiation capacity, and thus have several potential therapeutic applications, such as treatment of immunological disorders and correction of tissue defects. MSCs have been widely studied and utilized in treatment of Graft-versus-Host disease, a severe complication of stem cell transplantation, and have also been evaluated in treatment of Crohn’s disease, multiple sclerosis, and chronic inflammation. The repair of bone and cartilage defects is another application of significant interest. MSCs are classified as advanced therapy medicinal products (ATMPs), which are manufactured under supervision by regulatory authorities. The aim of regulation is to produce safe and effective medicinal products, and therefore safety risks and sources of alterations or impairment of functionality should be evaluated carefully. MSCs are somatic cells, which can be isolated from various sources, such as from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord. For production of medicinal products, MSCs are usually expanded extensively in cell cultures. Culture conditions are known to affect to the characteristic and functionality of MSCs. Animal-derived components during culture such as bovine serum are to be avoided if possible, due to risks of immune reactions and zoonotic infections. Therefore, animal serum-free culture medium is considered safe option for MSC cultures. This thesis focuses on determining optimal expansion and differentiation conditions for clinical-grade bone marrow-derived MSCs by using platelet-derived culture medium supplements to replace bovine serum. This study also aimed to improve quality of MSCs products by introducing an imaging-based screening method to detect aging-related morphological changes in MSC cultures. Finally, we investigated how additional freezing steps during the manufacturing process affect the basic manufacturing parameters and alter the cellular aging process. We found in this study that platelet lysate with two freeze-thaw cycles effectively supported MSC expansion and maintained their functionality in ambient oxygen concentration. Platelet lysate also promoted osteogenic differentiation at least equally with bovine serum in two-dimensional plate culture and slightly better if a three-dimensional matrix was used. We were able to detect and quantify aging-related morphological changes from MSCs cultures and found that a rapid increase in cell size reflects the expression of aging markers. We found that freezing at early phases of cell cultures did not alter the characteristics or functionality of the MSC. This study has yielded insights into the establishment and scaling up of animal-serum free MSC cultures. In addition, our screening method for aged cells could be implemented into the clinical-grade manufacturing of MSCs to monitor cell quality during processing. Mesenkymaaliset stroomasolut (MSC) ovat olleet vilkkaan tutkimuksen kohteina johtuen niiden kyvystä vaimentaa immuunireaktioita ja erilaistua erilaisiksi solutyypeiksi, kuten luu- ja rustosoluiksi. MSC:n ominaisuudet tekevät niistä merkittävän potentiaalisen työkalun erilaisten sairauksien, kuten immunologisten häiriöiden tai kudospuutosten, hoitoon. MSC:ja on laajasti käytetty ja tutkittu akuutin käänteishyljinnän, Crohnin taudin ja kroonisten tulehdustilojen yhteydessä sekä luu- ja rustopuutosten hoidossa. MSC:t luokitellaan kehittyneen terapian lääkevalmisteiksi, joiden tuotantoa säädellään tiukasti lailla ja joiden valmistusta valvovat lääkevalvontaviranomaiset. Sääntelyn tarkoituksena on taata potilaalle turvallinen ja tehokas lääkevalmiste. MSC:t ovat somaattisia soluja, joita voidaan eristää erilaisista lähteistä, kuten terveen luovuttajan luuytimestä, rasvakudoksesta tai napanuorasta. Eristettyjä soluja on viljeltävä laboratoriossa laajamittaisesti soluvalmistetta varten. Viljelyolosuhteiden tiedetään muokkaavan solujen ominaisuuksia ja toimintaa. Hoitoon tarkoitettujen soluvalmisteiden tuotannossa tulisi myös pyrkiä eroon eläinperäisten materiaalien kuten nautaseerumin käytöstä niihin liittyvien taudinaiheuttajien ja immuunireaktioiden riskin vähentämiseksi. Tämän vuoksi MSC:n viljelyssä tulisi käyttää ihmisperäisiä rikasteita, kuten verihiutaleista valmistettua lysaattia. Tässä väitöstutkimuksessa keskityttiin kehittämään optimaalisia nautaseerumivapaita viljelyolosuhteita MSC:n laajamittaista viljelyä ja luuksi erilaistamista varten. Tutkimuksessa selvitettiin myös keinoja tunnistaa MSC ikääntymiseen liittyviä morfologian muutoksia kuvantamistekniikkaan perustuvaa seulontamenetelmää hyödyntäen. Tutkimme myös, miten MSC:n viljelyprosessin aikana tehtävät solujen pakastusvaiheet vaikuttavat niiden ominaisuuksiin ja ikääntymiseen. Havaitsimme, että kahdesti pakastettu ja sulatettu verihiutalelysaatti tuki MSC:n jakautumista ja erilaistumista luuksi ja ylläpiti solujen toiminnalliset piirteet viljelyn ajan. Verihiutalelysaatin havaittiin myös tukevan luuksi erilaistumista vähintään samalla tavoin kuin nautaseerumilla kaksiulotteisessa maljaviljelmässä ja hieman paremmin silloin, kun soluja viljeltiin käyttämällä kolmiulotteista matriisia. Onnistuimme havaitsemaan solujen ikääntymiseen liittyviä muutoksia solujen muodossa ja osoitimme, että solujen koon nopea muutos heijastaa myös ikääntymismarkkerien esiintymistä soluissa. Lopuksi havaitsimme, että tuotantoprosessin aikana tehdyt pakastamisvaiheet eivät vaikuta solujen toimintaan haitallisesti eivätkä muuta solujen normaalia ikääntymisprosessia. Tämä väitöstutkimus on tuottanut uutta tietoa eläinseerumivapaan MSC viljelmän optimoinnista ja laajentamisesta sekä esittää kuvantamiseen perustuvan menetelmän, jolla solujen laatua voitaisiin tutkia tuotantoprosessin aikana.

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are multipotent cells that can be found in various tissues. These cells have the capacity to differentiate into bone, adipose, and cartilage. They also have the capacity to suppress immune reactions and the capacity to support angiogenesis. The utilization of these cells in cell based therapies has therefore been intensively studied. There are several clinical studies on going to demonstrate the therapeutic potential of these cells. The utilization of MSCs has been studied in for example graft-versus-host-disease (a severe complication after hematopoietic stem cell transplantation), stroke, myocardial infarction, and cartilage lesions. The frequency of MSCs is variable in different tissues. The number of these cells in tissues is so low that these cells need to be cultured outside of the body, in vitro, to obtain adequate numbers of MSCs for cell therapy purposes. It has been demonstrated that different in vitro culture conditions have effects on the properties of MSCs. Traditionally cells are cultured in growth medium containing fetal bovine serum (FBS). There is a great interest to find alternative supplements to replace FBS for clinical grade production of MSCs to avoid the patients to become predisposed to xenogenic infectious agents or antigens. Platelet-derived supplements might be one potential alternative for FBS. An efficient method to culture MSCs from cord blood was established in this thesis. Additionally a method to produce clinical-grade bone marrow MSCs in platelet-derived supplement containing culture medium was established. Different culture conditions were demonstrated to have an effect on proliferative and immunosuppressive capacity of MSCs as well as on their capacity to support angiogenesis. In this thesis it is also indicated that MSCs can suppress immunoreactions producing an immunosuppressive molecule, adenosine, via a cell surface enzyme, CD73. The knowledge of the impact of culture conditions on the properties of cells as well as understanding the functional mechanisms of the cells is a prerequisite to produce safe and efficacious cell therapy products. Mesenkymaaliset kantasolut (mesenkymaaliset stroomasolut) ovat soluja, joita pystytään eristämään monista eri kudoksista. Nämä solut ovat kykeneviä erilaistumaan luuksi, rasvaksi ja rustoksi ja niillä on kyky hillitä vaikeita immunologisia reaktioita sekä kyky tukea verisuonten muodostumista. Näiden ominaisuuksien perusteella mesenkymaaliset kantasolut ovat hyvin kiinnostavia uusien soluterapioiden kannalta. Lukuisia kliinisiä kokeita on käynnissä solujen terapeuttisten vaikutusten selvittämiseksi. Mesenkymaalisilla kantasoluilla pyritään löytämään parannuskeinoja mm. veren kantasolusiirron jälkeiseen komplikaatioon (käänteishyljintä), aivohalvaukseen, sydänkohtaukseen ja rustovaurioihin. Mesenkymaalisten kantasolujen määrä on vaihteleva eri kudoksissa. Näiden solujen määrä on niin vähäinen, että soluhoitoihin riittävän solumäärän saaminen vaatii solujen viljelyä elimistön ulkopuolella keinotekoisissa olosuhteissa. Erilaisten viljelyolosuhteiden on todettu vaikuttavan eri tavoin mesenkymaalisten kantasolujen ominaisuuksiin. Perinteisesti soluviljelyt toteutetaan ravintoliuoksessa, jossa on mukana naudan seerumia. Kliiniseen käyttöön menevien solujen viljelyssä on pyritty löytämään korvaavia vaihtoehtoja naudan seerumille, jotta potilaat eivät altistuisi eläinperäisille taudinaiheuttajille tai antigeeneille. Mahdolliseksi vaihtoehdoksi on osoittautunut verihiutaleista valmistettu uute. Tämän työn tuloksena löydettiin tehokas menetelmä viljellä mesenkymaalisia kantasoluja istukkaverestä. Lisäksi pystytettiin kliinisiin tarkoituksiin käytettäville luuytimen mesenkymaalisille kantasoluille verihiutaleista valmistettuun uutteeseen pohjautuva viljelymenetelmä. Erilaisten viljelyolosuhteiden, todettiin vaikuttavan eri tavoin solujen kykyyn jakautua, hillitä immunologisia reaktioita ja tukea verisuonten kasvua. Tutkimuksessa osoitettiin myös, että mesenkymaaliset kantasolut kykenevät hillitsemään immuunipuolustusta tuottamalla elimistön puolustussolujen aktiivisuutta hillitsevää adenosiinia solunpinnalla olevan CD73 entsyymin avulla. Viljelyolosuhteiden soluihin kohdistuvien vaikutusten tunteminen ja solujen toiminnallisten mekanismien ymmärtäminen on edellytys turvallisten soluterapiatuotteiden valmistukselle.