Search

RhoA és una proteïna GTPasa amb un paper rellevant en importants processos cel·lulars. Els nivells d’expressió de RhoA i/o la seva activitat es troben alterats en molts tipus de càncer, però curiosament s’han trobat mutacions recurrents i específiques de tumor en càncer gàstric de tipus difús (CGD), carcinoma de cèl·lules escamoses de cap i coll (CCECC), limfoma de Burkitt, leucèmia/limfoma T de l’adult i limfoma T angioimmunoblàstic, suggerint un paper diferent y depenent de tumor per cada proteïna mutant. En aquest treball hem caracteritzat a nivell funcional set de les mutacions recurrents en RHOA. Els nostres resultats indiquen que, alguns dels mutants exhibeixen una disminució en l’estabilitat de la proteïna i una localització predominant al nucli en comparació amb la proteïna RhoA nativa. A més, l’avaluació dels efectes de la sobreexpressió de les formes de RhoA mutades en l’organització del citoesquelet va mostrar una reducció general en la formació de filaments d’actina i una major capacitat d’adhesió a substrat. Finalment, la majoria dels mutants estudiats mostraren una senyalització depenent de les vies NFkB i del factor de resposta sèrica reduïda. Per conèixer els mecanismes moleculars desregulats per les mutacions de RhoA, s’avaluà l’interactoma. La capacitat d’unió de les diferents proteïnes mutants de RhoA a Rhotekina resultà ser depenent de la seva estabilitat proteica. A més, l’avaluació de la interacció entre les diferents proteïnes RhoA i els seus efectors més comuns mitjançant un sistema de doble híbrid en llevat, demostrà la incapacitat de tots els mutants de DGC estudiants d’unir PKN1. Tanmateix, el mutant de CCECC RhoA E40Q resultà deficient en la unió a NET1 y kinectina. El CCECC és un grup molt heterogeni de càncers. Les mancances en la millora de la supervivència i en els tractaments personalitzats han promogut la investigació activa dels mecanismes moleculars associats al seu desenvolupament. Encara que RHOA està mutat en només l’1,5% dels pacients de CCECC, més del 60% d’aquestes mutacions succeeixen a E40Q, el que suggereix un paper determinant en el procés de carcinogènesi. L’avaluació immunohistoquímica dels nivells de RhoA en mostres de teixit de CCECC va indicar que l’expressió de RhoA s’associa amb una pitjor supervivència en pacients amb tumors de laringe específicament. Per estudiar el paper de RhoA nativa a CCECC, es van generar línies cel·lulars isogèniques deplecionades de RHOA mitjançant ARN d’interferència (RHOA KD) i inactivació genètica mitjançant la tecnologia CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Els resultats van mostrar un alentiment del creixement cel·lular in vitro i in vivo, així com una disminució del potencial de migració in vitro en línies cel·lulars tumorals derivades de llengua i laringe. Aquests resultats confirmen que RHOA actua com un oncogèn a CCECC. Seguidament, es va avaluar el paper de la mutació E40Q en sistemes cel·lulars de sobreexpressió de RhoA de manera induïble amb doxiciclina. Sorprenentment, la sobreexpressió de RhoA nativa o E40Q en cèl·lules de faringe va reduir el creixement cel·lular in vitro. Per tant, vam decidir reintroduir RhoA nativa o E40Q en els sistemes cel·lulars de llengua i laringe RHOA KD i RHOA KO generats prèviament. Curiosament, la reintroducció de RhoA nativa i E40Q no va afectar el creixement cel·lular ni les capacitats de migració de les cèl·lules. En conjunt, la complexitat del patró mutacional de RHOA sense precedents, específic del tipus de tumor, i els nostres resultats, mostren que els diferents mutants de RhoA presenten diferents papers oncogènics. A més, demostrem que RhoA a CCECC proporciona un avantatge de creixement per a les cèl·lules tumorals que donen suport al possible paper oncogènic en aquest tipus tumoral. RhoA es una proteína GTPasa con un papel relevante en importantes procesos celulares. Los niveles de expresión de RhoA y/o su actividad se encuentran alterados en muchos tipos de cáncer, pero curiosamente, se han encontrado mutaciones recurrentes y específicas de tumor en cáncer gástrico de tipo difuso (CGD), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), linfoma de Burkitt, leucemia/linfoma T del adulto y linfoma T angioinmunoblástico, sugiriendo un papel distinto y dependiente de tumor para cada proteína mutante. En este trabajo hemos caracterizado a nivel funcional siete de las mutaciones recurrentes en RHOA. Nuestros resultados indican que, algunos de los mutantes exhiben una disminución en la estabilidad de la proteína y una localización predominante en el núcleo en comparación con la proteína RhoA nativa. Además, la evaluación de los efectos de la sobreexpresión de las formas de RhoA mutadas en la organización del citoesqueleto mostró una reducción general en la formación de filamentos de actina, y una mayor capacidad de adhesión a sustrato. Finalmente, la mayoría de los mutantes estudiados mostraron una señalización dependiente de las vías NFkB y del factor de respuesta sérica reducida. Para conocer los mecanismos moleculares desregulados por las mutaciones de RhoA, se evaluó su interactoma. La capacidad de unión de las diferentes proteínas mutantes de RhoA a Rhotekina resultó ser dependiente de su estabilidad proteica. Además, la evaluación de a interacción entre las diferentes proteína RhoA y sus efectores más comunes mediante un sistema de doble híbrido en levadura, demostró la incapacidad de todos los mutantes de DGC estudiados de unir a PKN1. Sin embargo, el mutante de CCECC RhoA E40Q resultó deficiente en la unión a NET1 y kinectina. El CCECC es un grupo muy heterogéneo de cánceres. Las carencias en la mejora de la supervivencia y en los tratamientos personalizados han promovido la investigación activa de los mecanismos moleculares asociados su desarrollo. Aunque RHOA está mutado sólo en el 1,5% de los pacientes de CCECC, más del 60% de estas mutaciones ocurren en E40Q, lo que sugiere un papel determinante en el proceso de carcinogénesis. La evaluación inmunohistoquímica de los niveles de RhoA en muestras de tejido de CCECC indicó que la expresión de RhoA se asocia con una peor supervivencia en pacientes con tumores de laringe específicamente. Para estudiar el papel de RhoA nativa en CCECC, se generaron líneas celulares isogénicas deplecionadas de RHOA mediante ARN de interferencia (RHOA KD) e inactivación genética mediante la tecnología CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Los resultados mostraron una ralentización del crecimiento celular in vitro e in vivo, así como una disminución del potencial de migración in vitro en líneas celulares tumorales derivadas de lengua y laringe. Estos resultados confirman que RHOA actúa como un oncogén en CCECC. Seguidamente, se evaluó el papel de la mutación E40Q en sistemas celulares de sobreexpresión de RhoA de manera inducible con doxiciclina. Sorprendentemente, la sobreexpresión de RhoA nativa o E40Q en células de faringe redujo el crecimiento celular in vitro. Por consiguiente, decidimos reintroducir RhoA nativa o E40Q en los sistemas celulares de lengua y laringe RHOA KD y RHOA KO generados previamente. Curiosamente, la reintroducción de RhoA nativa y E40Q no afectó el crecimiento celular ni las capacidades de migración de las células. En conjunto, la complejidad del patrón mutacional de RHOA sin precedentes, específico del tipo de tumor, y nuestros resultados muestran que los distintos mutantes de RhoA presentan diferentes papeles oncogénicos. Además, demostramos que RhoA en CCECC proporciona una ventaja de crecimiento para las células tumorales que apoyan el posible papel oncogénico en este tipo tumoral. RhoA is a small GTPase with an important role in key cellular processes. RhoA expression levels and/or activity are altered in multiple cancers, but interestingly, recurrent and tissue-specific hotspot mutations have been recently identified in diffuse gastric cancer (DGC), head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), Burkitt lymphoma, adult T-cell leukemia/lymphoma and angioimmunoblastic T-cell lymphoma, suggesting a distinctive and tumor-dependent role of each mutant protein. In this work, seven recurrent RHOA mutations have been functionally characterized. Our results indicate that some RhoA mutants display lower protein stability and a predominant nuclear localization compared to the wild-type (wt) RhoA. Moreover, the evaluation of the effects of mutant RhoA overexpression on the cytoskeleton organization showed a general reduction in the formation of actin filaments, and a higher cell adhesion capacity. Finally, we observed a reduced NFkB and serum response factor signaling in most of the hotspot RhoA mutants studied. To dissect the molecular mechanisms deregulated due to RhoA mutations, we investigated the protein interactome. Binding of the different RhoA mutants to Rhotekin effector protein trough a pull-down assay was dependent on RhoA protein levels. A yeast-two-hybrid system approach between RhoA forms and the most common RhoA effector proteins, evidenced that all the studied DGC mutants were unable to bind to PKN1; whereas, the HNSCC hotspot mutant RhoA E40Q failed to bind to NET1 and kinectin. HNSCC is a very heterogeneous group of cancers. The lack of survival improvement and personalized treatments has promoted an active research into the molecular mechanisms of HNSCC. RHOA is mutated only in around of 1.5% of the HNSCC cases, but interestingly, more than 60% of these mutations occur in E40Q, suggesting a possible active role in the tumorigenic process. Immunohistochemical analysis of RhoA expression in HNSCC tissue microarray indicated that RHOA expression is associated with shorter survival outcomes in patients with larynx tumors. To study the role of wt RhoA in HNSCC, we engineered isogenic cell line systems downregulated for RHOA through the directed targeting of RHOA by shRNA (RHOA KD) and by CRISPR/Cas9 technology (RHOA KO). Results showed an impairment of cell growth in vitro and in vivo, as well as a decrease of the migration potential in vitro, both in tongue and larynx-derived tumor cell lines. These results confirm that RHOA acts as an oncogene in HNSCC. Next, the role of E40Q hotspot mutation was evaluated in doxycycline-inducible RhoA overexpressing cell systems. Surprisingly, RhoA wt or E40Q overexpression in pharynx cells reduced cell growth in vitro. Hence, we decided to re-introduce RhoA wt or E40Q in tongue and larynx cell lines RHOA KD and RHOA KO cell systems. Intriguingly, the reintroduction of RhoA wt and E40Q did not affect cell growth and migration capabilities of the cells. Altogether, the unprecedented tumor-type-dependent complexity in the mutational landscape of RhoA and our results indicate that the different RhoA hotspot mutations exhibit different oncogenic roles. Furthermore, specifically in HNSCC we demonstrate that RhoA provides a growth advantage for the cancer cells supporting a possible oncogenic role of RhoA in this tumor type. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

La identificació de canvis en la seqüència o l'estructura de l'ADN pot conduir a determinar la causa que hi ha darrera de l'aparició d'una malaltia genètica. Diferents tècniques d'anàlisis de l'ADN han esdevingut rutinàries en la majoria de centres hospitalaris i centres de recerca per a l'estudi simultani dels gens que conté el genoma humà. Aquest tipus de tecnologia s'anomena seqüenciació massiva o Seqüenciació de Nova Generació (NGS) i s'utilitza habitualment en l'àmbit de les malalties minoritàries junt amb la tècnica d'array d'Hibridació Genòmica Comparativa (a-CGH). L'objectiu d'aquest projecte és integrar els resultats d'aquestes diverses tecnologies tot creant una plataforma on es puguin volcar, estructurar, visualitzar i analitzar les dades genètiques del Servei de Medicina Genètica i Molecular de l'Hospital Sant Joan de Déu per tal de poder fer un seguiment de les diferents patologies identificades per departament i fenotip, aconseguint així millorar i accelerar el diagnòstic genètic de pacients amb malalties rares. Així mateix, mitjançant la plataforma es podran caracteritzar les variants detectades en els pacients que s'hagin estudiat amb ambdues tecnologies fent comparatives de sensibilitat i especificitat. La identificación de cambios en la secuencia o estructura del ADN puede conducir a determinar la causa que hay detrás de la aparición de una enfermedad genética. Diferentes técnicas de análisis del ADN se han convertido en rutinarias en la mayoría de centros hospitalarios y centros de investigación para el estudio simultáneo de los genes que contiene el genoma humano. Este tipo de tecnología se llama secuenciación masiva o Secuenciación de Nueva Generación (NGS) y se utiliza habitualmente en el ámbito de las enfermedades minoritarias junto con la técnica de array de Hibridación Genómica Comparativa (a-CGH). El objetivo de este proyecto es integrar los resultados de estas diversas tecnologías creando una plataforma donde se puedan volcar, estructurar, visualizar y analizar los datos genéticos del Servicio de Medicina Genética y Molecular del Hospital Sant Joan de Déu. de poder realizar un seguimiento de las diferentes patologías identificadas por departamento y fenotipo, consiguiendo así mejorar y acelerar el diagnóstico genético de pacientes con enfermedades raras. Asimismo, mediante la plataforma se podrán caracterizar las variantes detectadas en los pacientes que se hayan estudiado con ambas tecnologías realizando comparativas de sensibilidad y especificidad. The identification of changes in the sequence or structure of DNA can lead to determining the cause behind the occurrence of a genetic disease. Different DNA analysis techniques have become routine in most hospitals and research centers for the simultaneous study of the genes contained in the human genome. This type of technology is called massive sequencing or Next Generation Sequencing (NGS) and is commonly used in the field of minority diseases together with the array technique of Comparative Genomic Hybridization (a-CGH). The objective of this project is to integrate the results of these different technologies by creating a platform where genetic data from the Genetic and Molecular Medicine Service of the Hospital Sant Joan de Déu can be dumped, structured, visualized and analyzed. The aim is to be able to monitor the different pathologies identified by department and phenotype, thus improving and accelerating the genetic diagnosis of patients with rare diseases. Likewise, the platform will allow characterization of the variants detected in patients who have been studied with both technologies, making comparisons of sensitivity and specificity.

Current tools for motif discovery search patterns that are over-represented in DNA sequences but do not use DNA curvature or cofactors associated with the protein bind. We developed a tool that searches for motifs with a variable gap between patterns. The search is done using a genetic programming algorithm that searches for possible models that could be the motif and tries to fit them in a set of positive sequences with the motif against a control dataset. To evaluate the fitness of the organisms we have created an energy model for each component of the regulated bacterial promoters. The final genetic algorithm is able to find hidden motifs in synthetic sequences and real biological sequences. Les eines actuals per al descobriment de motius busquen patrons que estan sobre-representats a les seqüències d'ADN, però no utilitzen la curvatura de l'ADN o cofactors associats a la unió de la proteïna. Hem desenvolupat una eina que busca motius amb un espaiador variable entre patrons. La cerca es fa mitjançant un algorisme de programació genètica que busca possibles models que podrien ser el motiu i intenta encaixar-los en un conjunt de seqüències positives que inclouen el motiu envers un conjunt de seqüències de control. Per avaluar l'encaix dels organismes hem creat un model d'energia per a cada component dels promotors reguladors bacterians. L'algorisme genètic final és capaç de trobar motius ocults a seqüències sintètiques i seqüències reals. Las herramientas actuales para el descubrimiento de motivos buscan patrones que están sobrerepresentados en las secuencias de ADN, pero no usan la curvatura del ADN o cofactores asociados a la unión de la proteína. Hemos desarrollado una herramienta que busca motivos con un espaciado variable entre patrones. La búsqueda se hace mediante un algoritmo de programación genética que busca posibles modelos que podrían ser el motivo y los intenta encajar en un conjunto de secuencias positivas que incluyen el motivo contra un conjunto de secuencias de control. Para evaluar el encaje de los organismos, hemos creado un modelo de energía para cada componente de los promotores reguladores bacterianos. El algoritmo genético final es capaz de encontrar motivos ocultos en secuencias sintéticas y secuencias reales.

Universitat Pompeu Fabra. Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud., Mutation is an essential process for evolution, while being also a landmark for cancer and disease. Mutations do not accumulate uniformly across the genome, and their presence is affected by multiple determinants. The mutation distribution in the human germline is very different from the distribution in human cancers. In this work, we analyzed the mutation distribution in the germline of healthy non-human great ape populations, and we observed a striking similitude between chimpanzees and gorillas and human cancers. We hypothesize that the differences in the human germline are caused by demographic events exclusive to the human lineage. However, the similitudes between non-human great apes germlines and human cancers are driven by the same mechanisms of mutation causing variation in healthy somatic cells.

Síndrome de Lynch; Panell de gens del càncer; Epimutació Síndrome de Lynch; Panel de genes del cáncer; Epimutación Lynch syndrome; Cancer genes panel; Epimutation The causal mechanism for cancer predisposition in Lynch-like syndrome (LLS) remains unknown. Our aim was to elucidate the constitutional basis of mismatch repair (MMR) deficiency in LLS patients throughout a comprehensive (epi)genetic analysis. One hundred and fifteen LLS patients harboring MMR-deficient tumors and no germline MMR mutations were included. Mutational analysis of 26 colorectal cancer (CRC)-associated genes was performed. Pathogenicity of MMR variants was assessed by splicing and multifactorial likelihood analyses. Genome-wide methylome analysis was performed by the Infinium Human Methylation 450K Bead Chip. The multigene panel analysis revealed the presence of two MMR gene truncating mutations not previously found. Of a total of 15 additional MMR variants identified, five -present in 6 unrelated individuals- were reclassified as pathogenic. In addition, 13 predicted deleterious variants in other CRC-predisposing genes were found in 12 probands. Methylome analysis detected one constitutional MLH1 epimutation, but no additional differentially methylated regions were identified in LLS compared to LS patients or cancer-free individuals. In conclusion, the use of an ad-hoc designed gene panel combined with pathogenicity assessment of variants allowed the identification of deleterious MMR mutations as well as new LLS candidate causal genes. Constitutional epimutations in non-LS-associated genes are not responsible for LLS. This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and cofunded by FEDER funds -a way to build Europe- (grants SAF2012-33636, SAF2015-68016-R and SAF2016-80888-R), CIBERONC, RTICC Network (RD12/0036/0031 and RD12/0036/0008), the Spanish Association Against Cancer (AECC) (080253), the Government of Catalonia (grant 2014SGR338, 2017SGR1282 and PERIS SLT002/16/0037), Fundación Mutua Madrileña (grant AP114252013). We thank CERCA Programme for institutional support. ED was supported by a grant from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness. The AECC fellowship to MG-A. AF was supported by a grant from the Catalonian Health Department (SLT002/16/00409). FM was supported by CIBERONC. The Mexican National Council for Science and Technology (CONACyT) fellowship to GV.

El desarrollo de las técnicas biológicas actuales, como: secuenciación y alineamiento, ha provocado que tengamos a nuestra disposición una cantidad ingente de datos. Esto ha puesto de relieve la necesidad de organizarlos y realizar un estudio exhaustivo y automático que nos permita entender mejor los datos obtenidos y, con ello, descubrir las relaciones hasta ahora ocultas entre ellos. La aparición de las técnicas de machine learning abre la posibilidad de abordar este camino para, por ejemplo, detectar mutaciones patológicas y proporcionar información biomédica que posibilite el desarrollo de terapias. El objetivo del TFM es desarrollar una aplicación que explore las bondades y limitaciones de este tipo de algoritmos, exponiendo gráfica y documentalmente los resultados alcanzados mediante una ejecución completa del ciclo del dato, desde su importación y tratamiento hasta el resultado final dejando constancia del rendimiento del proceso. The development of the current biological techniques, such as sequencing and alignment, has provided us with a huge amount of data. This has highlighted the need to organize them and carry out an exhaustive and automatic study. A study that would allow us to better understand the obtained data and, as a result, discover the relationships that were hidden among them. The emergence of Machine Learning techniques opens up new possibilities like the detection of pathological mutations, as well as provide biomedical information that enables the development of therapies. The objective of this Master's Thesis is to develop an application to explore the benefits and limitations of this type of algorithms. It will display graphically and in a documented way the results achieved through a complete execution of the data cycle that will go from its import to the final result, tracking the performance throughout the process. El desenvolupament de les tècniques biològiques actuals, com: seqüenciació i alineament, ha provocat que tinguem a la nostra disposició una quantitat ingent de dades. Això ha posat en relleu la necessitat d'organitzar-les i realitzar un estudi exhaustiu i automàtic que ens permeti entendre millor les dades obtingudes i, amb això, descobrir les relacions fins ara amagades entre elles. L'aparició de les tècniques de machine learning, obre la possibilitat d'abordar aquest camí per, per exemple, detectar mutacions patològiques i proporcionar informació biomèdica que possibiliti el desenvolupament de teràpies. L'objectiu del TFM és desenvolupar una aplicació que explori les bondats i limitacions d'aquest tipus d'algoritmes, exposant gràficament i documentalment els resultats aconseguits mitjançant una execució completa del cicle de la dada, des de la seva importació i tractament, fins al resultat final, deixant constància del rendiment del procés.

El cáncer de páncreas presenta una alta tasa de mortalidad en la población mundial. Se caracteriza por presentar en el 90% de los casos, la presencia de una mutación en la proteína KRAS. En el presente trabajo se realiza un análisis descriptivo y un estudio poblacional de las secuencias de pacientes con carcinoma de páncreas y otro tipo de carcinomas, para valorar las mutaciones que presentan en el exón 2, del codón 12, del cromosoma 12 del gen KRAS. Se realiza un estudio con 95 secuencias de ADN. 26 de estas secuencias pertenecen a carcinoma de páncreas y 69 a otro tipo de carcinomas. Todas las secuencias son descargadas de los bancos de datos genómicos.Los resultados demuestran que las medias de las mutaciones en carcinoma de páncreas son superiores a los carcinomas de otra índole, obteniendo unas diferencias estadísticamente significativas en los pacientes con carcinoma de páncreas a través del tanto por cierto de las mutaciones según su longitud en la secuencia. A través del estudio filogenético, se observan como se agrupan por enfermedades, apreciando la unión entre las muestras pancreáticas sin mutaciones y la dispersión en el árbol de las demás secuencias pancreáticas. Principalmente, se ponen de manifiesto mutaciones de repetición en las muestras pancreáticas, merecedoras de futuros estudios, para poder observar su potencial influencia para desarrollar cáncer pancreático. Se observan resultados de mutaciones de repetición interesantes para estudios posteriores. El estudio de estos cambios genéticos podría ayudar en el diagnóstico temprano, nuevas terapias más efectivas y mejora del pronóstico de los pacientes con carcinoma de páncreas. Pancreas cancer has a high mortality rate among the world population. In 90 % of the cases appears as a consequence of the mutation in the KRAS protein. In this work, a descriptive analysis a population study of the sequences of patients with pancreas carcinomas and other types of carcinomas have been carried out in order to evaluate the mutations that appear in the 2nd exon chromosome´s 12 codon 12 the KRAS gene. A study has been done with of DNA where 26 of these sequences belong to pancreatic carcinoma and 69 belong to other types of carcimomas. All the sequences are discharged from the bank of genomics information. The results show that the averages of the mutations in pancreas carninomas are higher than in other kinds of carcinomas obtaining statistically significant differences The results show that the averages of the mutations in pancreas carninomas are higher than in other kinds of carcinomas obtaining statistically significant differences in patients with pancreatic carcinoma through a percentage of the mutations depending on the length of the sequence. In the phylogenetic study, the mutations are grouped by diseases, appreciating the union between the pancreatic samples without mutations and the dispersion in the tree of the other pancreatic sequences, where there is more diversity in genetic changes. Repetitive mutations are shown mainly in pancreatic samples. These results demonstrate their potential influence to develop pancreatic cancer worthy of further studies. The study of these genetic changes could help in early diagnosis, new more effective therapies and improve the prognosis of patients. El càncer de pàncrees presenta una alta taxa de mortalitat en la població mundial. Es caracteritza per presentar en el 90% dels casos, la presència d'una mutació en la proteïna KRAS. En el present treball es realitza una anàlisi descriptiva i un estudi poblacional de les seqüències de pacients amb carcinoma de pàncrees i un altre tipus de carcinomes, per a valorar les mutacions que presenten en l'exó 2, del codó 12, del cromosoma 12 del gen KRAS. Es realitza un estudi amb 95 seqüències d'ADN. 26 d'aquestes seqüències pertanyen a carcinoma de pàncrees i 69 a un altre tipus de carcinomes. Totes les seqüències són descarregades dels bancs de dades genómicos.Els resultats demostren que les mitjanes de les mutacions en carcinoma de pàncrees són superiors als carcinomes d'una altra índole, obtenint unes diferències estadísticament significatives en els pacients amb carcinoma de pàncrees a través del punt per cert de les mutacions segons la seva longitud en la seqüència. A través de l'estudi filogenètic, s'observen com s'agrupen per malalties, apreciant la unió entre les mostres pancreàtiques sense mutacions i la dispersió en l'arbre de les altres seqüències pancreàtiques. Principalment, es posen de manifest mutacions de repetició en les mostres pancreàtiques, mereixedores de futurs estudis, per a poder observar la seva potencial influència per a desenvolupar càncer pancreàtic. S'observen resultats de mutacions de repetició interessants per a estudis posteriors. L'estudi d'aquests canvis genètics podria ajudar en el diagnòstic primerenc, noves teràpies més efectives i millora del pronòstic dels pacients amb carcinoma de pàncrees.

La reforma del texto fundamental representa una cuestión recurrente, agudizada al albur de la crisis sistémica del capitalismo financiero. Las propuestas se han centrado, sobre todo, en la cuestión de la distribución territorial del poder debido a la situación catalana. Empero, también se han articulado otras consistentes en reforzar la garantía de determinados derechos sociales de prestación o en fortalecer la calidad democrática de los órganos constitucionales. En este sentido, destaca el Acuerdo del Consell sobre la reforma constitucional. El elemento común es la desconexión entre la Constitución formal y las nuevas realidades constitucionales materializada en las dinámicas del poder global de mercado. Siguiendo estas coordenadas, la reflexión sobre la reforma constitucional se centrará en el análisis del conflicto poder de mercado-poder político, sus efectos en la estructura social y en la propia Constitución para, a continuación, valorar algunas de las propuestas formuladas para la mejora de la sistemática social constitucional. La reforma del text fonamental representa una qüestió recurrent, aguditzada a l’albur de la crisi sistémica del capitalisme financer. Les propostes s’han centrat, sobretot, en la qüestió de la distribució territorial del poder a causa de la situació catalana. Empero, també s’han articulat altres consistents a reforçar la garantia de determinats drets socials de prestació o a enfortir la qualitat democràtica dels òrgans constitucionals. En aquest sentit, destaca l’Acord del Consell sobre la reforma constitucional. L’element comú és la desconnexió entre la Constitució formal i les noves realitats constitucionals materialitzada en les dinàmiques del poder global de mercat. Seguint aquestes coordenades, la reflexió sobre la reforma constitucional se centrarà en l’anàlisi del conflicte poder de comprat-poder polític, els seus efectes en l’estructura social i en la pròpia Constitució per a, a continuació, valorar algunes de les propostes formulades per a la millora de la sistemàtica social constitucional. Este trabajo se enmarca en el proyecto de investigación, Estado económico, capitalismo financiarizado, Constitución, Gobernanza (DER 2017-84562-P). Investigador principal: Miguel Ángel García Herrera.

Qualsevol canvi en el DNA d’un organisme pot afectar tots els aspectes de la seva vida, fins el punt de comprometre-la. Per tal de superar aquesta situació, les cèl·lules han evolucionat fins adquirir sofisticades maquinàries de reparació del dany causat al DNA. Degut a això, el nostre DNA conté la informació necessària per tal de produir proteïnes que participen en el reconeixement al dany, la unió, l’excisió i el restabliment de la informació correcta a les heures de DNA. Una d’aquestes proteïnes és l’endonucleasa XPF, la qual constitueix la subunitat catalítica de l’heterodímer estable XPF-ERCC1, capacitada per dur a terme una incisió a l’extrem 5’ de diferents danys al DNA. Aquesta proteïna essencial està codificada pel gen ERCC4 i participa en múltiples rutes de manteniment del genoma incloent-hi la ruta de reparació per excisió de nucleòtids (NER), la ruta de reparació dels enllaços entrecreuants (ICL), en diverses subrutes de reparació dels trencaments de doble cadena (DSB) com la unió d’extrems mitjançant microhomologies (MMEJ) i la hibridació de cadena simple (SSA), i se li han atorgat possibles funcions de suport en la reparació del dany oxidatiu i en el manteniment de telòmers a més de participar en la resposta de la quimioteràpia al càncer. Si es tenen en compte le seves implicacions en la reparació del DNA, no sorprèn que mutacions en XPF estiguen associades amb un ampli rang de malalties humanes incloent-hi la Xeroderma Pigmentosum (XP), la Progèria Segmental (XFE), la Síndrome de Cockayne (CS) i diversos casos que combinen la Xeroderma i la síndrome de Cockayne (XPCSCD). Una millor comprensió de (i) la correlació entre les mutacions patogèniques i els fenotips dels pacients i (ii) els mecanismes essencials de reparació del DNA proporcionarà un avenç en el desenvolupament dels possibles tractaments. En aquest treball es presenta un resum detallat dels estudis funcionals duts a terme amb un conjunt de cèl·lules que contenien mutacions patogèniques en XPF sobre un fons genèticament homogeni. Els mutants de XPF seleccionats, ubicats en diferents dominis de la proteïna, i les síndromes humanes associades van ser les següents: XPFR153P (XFE), XPFI225M (XP), XPFL230P (FA), XPFC236R (CS), XPFR589W (XP/XPCSCD), XPFR689S (FA), XPFR799W (XP/XFE-CS). Els estudis funcionals detallats inclouen els anàlisis de la ruta NER (sensibilitat a UVC, UDS i RRS) i la ruta ICLR (sensibilitat a ICL, aturada en G2/M induïda per ICL i fragilitat cromosòmica induïda per ICL). Els nostres resultats emfasitzen en la importància d’altres factors, més enllà de la posició de la variant en la proteïna, per tal d’associar qualsevol mutant de XPF a un fenotip clínic determinat. En aquest marc, i amb el propòsit d’incrementar el nostre coneixement sobre les interaccions de XPF que poden regular la seva funció en les diferents rutes de reparació del DNA, vam investigar l’interactoma de XPF. La implementació de les tècniques proteòmiques més avançades incloent la purificació en tàndem per afinitat, co-immunoprecipitacions i SILAC, acoblada a l’espectrometria de masses ens va conduir a la identificació d’un nou interactor de XPF involucrat en el manteniment del genoma: USP11, una deubiquitinasa coneguda per regular l’activitat de proteïnes relacionades funcionalment com BRCA2 o XPC. Aquí nosaltres demostrem que la interacció de XPF-USP11 és independent del DNA i ocorre independentment del dany d’aquest. Així mateix, demostrem que USP11 regula la reparació dels DSB per SSA i possiblement la NER però no està involucrada en HR o ICLR., A change in an organism’s DNA can affect all the aspects of its life, until the point of compromising it. To overcome this, cells have evolved sophisticated machineries of DNA damage repair. Thus, our DNA contains the necessary information to produce proteins that participate in damage recognition, binding, excision and in the reestablishment of correct genetic information. One of these proteins is the XPF endonuclease, which is the catalytic subunit of the stable heterodimer XPF-ERCC1, able to incise at the 5’ side at different DNA damages. This essential protein is encoded by ERCC4 gene and participates in multiple genome maintenance pathways including nucleotide excision repair (NER), interstrand crosslink (ICL) repair, double strand break (DSB) repair pathways such as microhomology-mediated end joining (MMEJ) and single strand annealing (SSA). XPF has also been suggested to have possible backup roles in repairing oxidative damage and in telomere maintenance besides to have a role in the response of cancer cells to chemotherapy. Considering its wide involvement in multiple DNA repair pathways, it is not surprising that ERCC4 mutations are associated to a range of human diseases including Xeroderma Pigmentosum (XP), Segmental Progeria (XFE), Fanconi Anemia (FA), Cockayne Syndrome (CS) and several cases combined diseases of Xeroderma and Cockayne syndromes (XPCSCD). A better understanding of (i) the correlation between the pathogenic mutations and patients’ phenotype and (ii) the essential DNA repair mechanisms is expected to promote a faster development of possible treatments. Here we report a detailed overview of functional studies performed with a set of cells containing pathogenic XPF mutations in a genetically homogeneous background. The selected XPF mutants, located in different domains of the protein, and the resulting human syndromes, were the following: XPFR153P (XFE), XPFI225M (XP), XPFL230P (FA), XPFC236R (CS), XPFR589W (XP/XPCSCD), XPFR689S (FA), XPFR799W (XP/XFE-CS). Detailed functional studies include the analyses of NER pathway (UVC sensitivity, UDS and RRS) and ICLR pathway (ICL sensitivity, ICL-induced G2/M arrest and ICL-induced chromosome fragility). Our results emphasize the importance of other factors, beyond protein position of the variant, such as protein levels, cell localization and the molecular interactions, in order to associate any XPF mutant to a clinical phenotype. In this framework, and to increase our knowledge about XPF interactions that can regulate XPF functions in the distinct DNA repair pathways, we investigated the XPF interactome. The implementation of the most advanced proteomic technics including tandem affinity purification, co-immunoprecipitation and SILAC, coupled to mass spectrometry led us to identify a new XPF interactor involved in genome maintenance: USP11, a deubiquitinase that is known to regulate the activity of functionally related proteins such as BRCA2 or XPC. Here we prove XPF-USP11 interaction occurs irrespective of DNA damage and is DNA–independent. We also demonstrate that USP11 regulates DSB repair by SSA and possibly NER but is not involved in HR or ICLR.

La relevancia del impacto de las nuevas mutaciones sobre la variabilidad genética infinitesimal queda fuera de toda duda. No obstante, los mecanismos biológicos implicados en la generación de esta fuente de variabilidad genética están poco estudiados, incluso cuando algunos factores como la edad de los progenitores pueden ser de crucial importancia. Desafortunadamente, carecemos de métodos analíticos adecuados para abordar esta problemática, sobretodo cuando nos alejamos de los diseños experimentales típicos. Dentro de este contexto, la presente tesis doctoral se ha centrado precisamente en desarrollar una metodología de análisis específica, sobre la base de los modelos mixtos lineales. Esta metodología permite estimar la base genética de los caracteres cuantitativos diferenciando entre la variabilidad genética aditiva preexistente en la generación de individuos fundadores, y la nueva variabilidad genética originada por las mutaciones acaecidas en las distintas generaciones de la genealogía. Además, el componente mutacional se subdivide en función de su origen paterno o materno, permitiendo que la variabilidad genética mutacional se incremente (o reduzca) en función de la edad de cada progenitor. Para validar la utilidad de esta metodología analítica se han analizado dos bases de datos independientes, una centrada en el peso al destete de 12.644 ratones de la estirpe C57BL/6J y la otra considerando el peso al nacimiento de 8.130 terneros de la raza Bruna de los Pirineos. Con el objetivo de validar las distintas estructuras posibles del modelo de análisis se han implementado dos métodos estándar de comparación de modelos, el deviance information criterion y el factor de Bayes, ambos implementados dentro de un contexto de inferencia Bayesiana. Los análisis en ambas especies revelaron un comportamiento muy parecido en términos de varianza genética mutacional. Las dos poblaciones revelaron varianzas mutacionales tanto paternas como maternas pequeñas pero distintas de cero, claramente inferiores a la varianza genética aditiva presente en los fundadores. Aunque la varianza mutacional paterna se sugería ligeramente superior a la materna, los modelos de análisis no alcanzaron a detectar diferencias a nivel estadístico entre ambas fuentes de variación. Donde si se reportó un comportamiento claramente diferencial fue en la posibilidad de evolucionar con la edad de los progenitores. Tanto para los ratones C57BL/6J como para los terneros de raza Bruna de los Pirineos, la varianza mutacional paterna se incrementó de manera linear con la edad del padre, llegando incluso a incrementos de casi el 50% durante el primer año de vida. Por el contrario, el componente mutacional materna no se vió afectado por la edad de la madre, manteniéndose constante durante toda su vida reproductiva. En conjunto, estos resultados deben verse como un avance significativo dentro del marco de investigación del fenómeno mutacional en mamíferos, con importante implicaciones tanto para las especies ganaderas como para las de animales, The relevance of new mutations on the infinitesimal genetic variability remains out of any doubt. Nevertheless, biological mechanisms underlying this source of genetic variance are poorly understood, even when some factors such as parents' age may play a key role. Unfortunately, we lack of appropriate analytical approaches to investigate these phenomena, this shortage being specially dramatic when departing from standard experimental designs. This Ph.D. dissertation precisely focuses on the development of a statistical methodology for mutation analysis within the context of mixed linear models. This approach accounts for the genetic background of quantitative traits by making inference on two independent compounds, the additive genetic variability holding in the founder generation, and the new additive genetic variability originated by new mutations across the whole pedigree. Moreover, the mutational component differentiates between paternal and maternal origins, and may increase (or decrease) depending on parents' age. In order to validate this methodology, two different data sets were analyzed. The first accounted for weaning weight from 12,644 C57BL/6J mice, whereas the other one relied on the birth weight of 8,130 beef calves of the Bruna dels Pirineus breed. The different parameterizations were compared on the basis of two well known comparison criteria within the context of Bayesian inference, the deviance information criterion and the Bayes factor. The analyses revealed a very similar behavior in mice and calves. Both paternal and maternal variance component were small and different from zero. Although paternal mutational variance seemed slightly bigger than the maternal one, the analyses did not reveal statistical departures. Nevertheless, clearly different patterns were observed when considering parents' age. Both C57BL/6J mice and Bruna dels Pirineus calves evidenced a relevant gain of the parental mutation variance with sire's age, even reaching a 50% increase during the first age of life. On the contrary, the maternal mutational variance was not influenced by mother's age and kept stable along reproductive life. As a whole, these results must be viewed as a relevant advance within the research framework of mutations in mammals, they contributing remarkable implications for both

Parkinson's disease (PD) can be divided into familial (Mendelian) and sporadic forms. A number of causal genes have been discovered for the Mendelian form, which constitutes 10-20% of the total cases. Genome-wide association studies have successfully uncovered a number of susceptibility loci for sporadic cases but those only explain a small fraction (6-7%) of PD heritability. It has been observed that some genes that confer susceptibility to PD through common risk variants also contain rare causing mutations for the Mendelian forms of the disease. These results suggest a possible functional link between Mendelian and sporadic PD and led us to investigate the role that rare and low-frequency variants could have on the sporadic form. Through a targeting approach, we have resequenced at 49× coverage the exons and regulatory regions of 38 genes (including Mendelian and susceptibility PD genes) in 249 sporadic PD patients and 145 unrelated controls of European origin. Unlike susceptibility genes, Mendelian genes show a clear general enrichment of rare functional variants in PD cases, observed directly as well as with Tajima's D statistic and several collapsing methods. Our f This work was supported by Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain (SAF2011-29239 to E.B. and BFU2012-38236 to A.N.), by Direcció General de Recerca, Generalitat de Catalunya (2009SGR-1101 and 2014SGR-866), by the Spanish National Institute of Bioinfomatics of the Instituto de Salud Carlos III (PT13/0001/0026), CIBERNED and by FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional)/FSE (Fondo Social Europeo).

The elegance and temperament of the Arab horse has been fascinating people for decades and turned the Arabian into a very popular breed. The value of these horses is not only of economic but also emotional importance since these horses are outstanding companions for every horse owner. This work will give an insight into the genetic disorders that endanger the sound breeding of Arabian purebreds and will show the most recent developments in managing, and hopefully eradicating, genetic related diseases of the Arab horse.

El VIH o virus de la inmunodeficiencia humana tiene un gran impacto sanitario, social y económico; las terapias actuales permiten controlar la infección pero no se ha encontrado tratamiento curativo ni vacuna efectiva. Para conseguir estos objetivos, debe tenerse en cuenta la gran variabilidad genética y rápida evolución del VIH, asociadas, por ejemplo, a la aparición de variantes de resistencia a fármacos o de cambios antigénicos.

Protein kinase D (PKD) is a serine-threonine kinase which can be found in a variety of cell types at various subcellular locations and it has a wide substrate specificity. Consequently, it is implicated in the regulation of a remarkable array of fundamental biological processes, such as transcription, cell proliferation and differentation, Golgi vesicle fission and transport, cell motility, immune signaling, survival after oxidative stress, inflammation, cardiac hypertrophy and various cancers. In neuronal cells, PKD plays an important role in cell polarity and development and arborization of dendrites. However, there is no data avaible on PKD functions in synapses. We studied the morphological changes in dendritic spines of pyramidal cells in the hippocamapl CA1 region, caused by the suspension of PKD function in kinase dead (kd) PKD-EGFP transgenic mice. We made sections from the brains of the animals, and then we visualized the kdPKD-EGFP protein expressing neurons by anti-GFP peroxidase immunohistochemistry. Subsequently, we examined the areas containig immunolabelled pyramidal cells in transmission electron microscope. We measured the postsynaptic profile areas, perimeters, profile circularity and postsynaptic density (PSD) lenghts and compared them to data collected from wild type (WT) animals. We found that the mean synaptic profile areas, perimeters and PSD lenghts were significantly decreased in transgenic animals compared to WT mice. In addition, the correlation between spine size and PSD lenght was markedly decreased in kdPKD mice. Thus we suggest that normal PKD activity is required for the optimal regulation of synaptic morphology. PKD likely controls the synaptic morphology through regulating the spine cytoskeleton (spinoskeleton), since various actin binding proteins (ABPs) are responsible for maintainig the spinoskeletal structure and PKD is known to phosphorilate many of these proteins, and cosequently has an influence on their functions.

There are more than 5000 genetic diseases of humans and from 1990 to 2003, the Human Genome Project changed the world of genetics forever by mapping the human genome. The Horse Genome Project, a result of the Human Genome Project, was born in 1995 when 70 scientists from 20 countries met to make a plan for doing the same thing with the horse’s genome. During the course of the project, the genetic basis for several inherited diseases as well as simple genetic traits in horses were discovered, and molecular genetic tests could be developed. In January 2007 the work of sequencing and mapping the horse genome was completed. Researchers are now able to develop genetic tests with drastically decreased costs, time and samples needed, and a new frontier in equine genetics has been opened. The United States of America has for many years been in the lead of scientific research. The American Quarter Horse Association in particular are using vast sums of money in the research field of the breed, and for this reason much more is known about the genetic diseases in these horses. In addition, the Quarter horse is the most popular breed in the USA and the population is one of the largest in the world. The Arabian Horse Association has nonetheless established its own task force to focus on genetic diseases, and so we can only hope that this is the beginning of a new tendency for an increasing interest in genetic diseases.

[spa] En este trabajo de tesis hemos identificado la presencia de marcadores polimórficos dentro del gen F8 que han permitido identificar el alelo portador de la mutación en el 91% de las mujeres portadoras de hemofilia A en estudio en nuestro laboratorio. Además, hemos descrito 31 mutaciones nuevas responsables de la HA, de las cuales, 20 fueron mutaciones missense. El análisis estructural de dichas mutaciones proporciona un mejor entendimiento de la enfermedad, además ha permitido predecir el impacto que dichos cambios ocasionan en la estructura de la proteína, así como las consecuencias funcionales de las mutaciones en dicho gen, sugiriendo nuevas áreas del FVIIIa involucradas en la unión a otras macromoléculas, tales como el FIXa y el sustrato del complejo Xasa, el FXa. Por otro lado, demostramos que el uso de nuevas técnicas de cuantificación de dosis génica como la PCR a tiempo real y el MLPA junto con el estudio indirecto por marcadores son una buena herramienta para la detección de mutaciones como las deleciones y duplicaciones de uno o más exones del gen F8, en varones y mujeres portadoras de HA que con la PCR cualitativa no era posible detectar. Y por último, proponemos un algoritmo de trabajo práctico de análisis para optimizar el diagnóstico molecular de pacientes con HA y las portadoras de su familia.

Background Mitochondrial DNA (mtDNA) mutations account for at least 5% of cases of postlingual, nonsyndromic hearing impairment. Among them, mutation A1555G is frequently found associated with aminoglycoside-induced and/or nonsyndromic hearing loss in families presenting with extremely variable clinical phenotypes. Biochemical and genetic data have suggested that nuclear background is the main factor involved in modulating the phenotypic expression of mutation A1555G. However, although a major nuclear modifying locus was located on chromosome 8p23.1 and regardless intensive screening of the region, the gene involved has not been identified. Methods With the aim to gain insights into the factors that determine the phenotypic expression of A1555G mutation, we have analysed in detail different genetic and genomic elements on 8p23.1 region (DEFA3 gene absence, CLDN23 gene and MRPS18CP2 pseudogene) in a group of 213 A1555G carriers. Results Family based association studies identified a positive association for a polymorphism on MRPS18CP2 and an overrepresentation of DEFA3 gene absence in the deaf group of A1555G carriers. Conclusion Although none of the factors analysed seem to have a major contribution to the phenotype, our findings provide further evidences of the involvement of 8p23.1 region as a modifying locus for A1555G 12S rRNA gene mutation.

Nowadays are living in a global extinction period consequence of human activities that are altering biosphere-level processes. Microalgal populations are being exposed to by-products of human activities for the first time and little is known about their mechanisms of adaptation. Cyanobacteria and microalgae could to adapt to novel environments through selection on spontaneous mutations or through individual responses (i.e. resistant organisms arising by mutations occurring randomly prior to selective agent exposure or by direct and specific adaptation in response to selective agent). We are working on mechanisms of adaptation of these organisms to catastrophic environmental changes coming from residual materials of water pollution. Fluctuation analysis is the procedure to study this adaptive process. Cyanobacteria and microalgal species exposed to several pollutants (herbicides, antibiotics, heavy metals, sulphureous waters and others) showed resistant variants arise from rare spontaneous pre-selective mutations occurring prior to pollutant exposition. Spontaneous mutations seem to be enough to assure the adaptation of large microalgal populations. However, resistant mutants show diminished growth and photosynthesis. Estamos en un periodo de extinción global consecuencia de las actividades humanas y que están alterando los procesos de la biosfera. Las poblaciones de microalgas estan siendo expuestas por primera vez a estos productos fruto de la actividad antropogénica y sus mecanismos de adaptación son muy poco conocidos. Las cianobacterias y microalgas pueden adaptarse a nuevas condiciones ambientales a través de mutaciones espontáneas o a través de respuestas individuales (p.e. los organismos resistentes se pueden producir por mutaciones que ocurren antes de la exposición al agente selectivo, o por una respuesta específica y directa al contaminante). Nosotros hemos trabajado en los mecanismos de adaptación de estos organismos al cambio ambiental brusco debido a contaminantes del agua. El análisis de fluctuación es el procedimiento adecuado para el estudio del proceso adaptativo. Las especies de cianobacterias y microalgas expuestas a distintos contaminantes (herbícidas, antibióticos, metales pesados, aguas sulfurosas y otros…) muestran variantes resistentes que se producen por raras mutaciones espontáneas que ocurren antes de la exposición al contaminante. Estos mutantes resistentes mostraron una disminución del crecimiento y de la fotosíntesis respecto a la población sensible. Las mutaciones espontáneas pueden ser suficientes para asegurar la adaptación en las enormes poblaciones de microalgas.

El gen K-ras, és molt important clínicament ja que es troba mutat en un 40% dels casos de carcinomes colorectals i en un 90% dels casos de carcinomes de pàncreas, que constitueixen la segona i quarta causa de mort per càncer en països desenvolupats i juga un paper important en el desenvolupament dels sarcomes. Degut a la importància clínica del gen K-ras, un model que millori el seu coneixement en l'àmbit molecular, ajudarà a predir el comportament biològic del tumor abans de decidir el tractament més adequat per un pacient concret. Aquests coneixements, poden portar a una millora substancial des del punt de vista terapèutic. Les mutacions activants de l'oncogen K-ras, s'han localitzat al codó 12 o 13 del mateix. Prèviament, s'ha associat la presència de mutacions al codó 13 amb un fenotip tumoral menys agressiu que quan aquestes es localitzen al codó 12. Concretament, la mutació al codó 13 s'associa amb menor capacitat invasiva local i metastàsica. L'objectiu d'aquesta tesi es trobar una explicació molecular al diferent comportament clínic descrit amb anterioritat en tumors humans segons si la mutació activant es troba al codó 12 o al codó 13 del gen K-ras. També es preten trobar una explicació molecular a la transformació produïda pel gen normal sobrexpressat, que prèviament s'havia descrit que en determinats models era tumorogènic. Aquest estudi s'ha realitzat en un model in vitro (fibroblasts NIH3T3 de ratolí), transfectats establement amb el gen K-ras humà amb les distintes mutacions i en un modelo in vivo, injectant subcutàniament els transfectants en ratolins atímics i estudiant els sarcomes generats.Les conclusions d'aquest treball són que en el nostre model d'estudi, la mutació al codó 12 de K-ras confereix un fenotip més transformant que la mutació al codó 13 o que la sobreexpresió del gen normal. La causa principal d'aquestes diferències en transformació és la major activació de la via de supervivència cel·lular PI3K/AKT als transfectants amb mutació al codó 12 que els confereix major resistència a l'apoptosi, tant en el model in vitro com in vivo. Per últim, la posició del codó mutat en K-ras confereix especifitat histològica als tumors generats que de manera coherent amb el seu origen mesenquimàtic (NIH3T3) són sarcomes. Els tumors generats amb mutació al codó 12 del gen K-ras constitueixen un possible model de fibrosarcoma i els generats amb mutació al codó 13 del gen K-ras constitueixen un possible model d'histioctioma fibrós maligne; dos tipus de sarcomes humans., K-ras gene is the most frequently mutated ras gene in human tumors. It's mutated in 40% of cases of colorectal carcinomas and 90% of pancreatic adenocarcinomas. These are the second and fourth causes of cancer death in developed countries. K-ras play also an important role in development of sarcomas. A model that improve knowledge of K-ras in a molecular way will help to decide the right treatment to a specific patient.K-ras became oncogenic by single point mutations at codon 12 or 13. Several lines of evidence suggest that the malignant potencial of tumor cells may be influenced not only by the presence or absence of K-ras mutations, but by its molecular nature. Codon 13 mutations have been associated with less aggressive tumoral phenotype than codon 12 mutations in K-ras gene. Codon 13 mutation is associated with less invasive and metastasic capacity.In this thesis, is tested whether K-ras codon 12 mutation would confer upon the cell a more oncogenic phenotype than a K-ras codon 13 mutation and try to find a molecular explanation for these differences. It is also tested the transformation capacity of the K-ras proto-oncogene and molecular explanation of this effect.To this end, NIH3T3 cells (mouse fibroblasts) are transfected with a plasmid containing human K-ras with point mutations at codon 12 or at codon 13 or containing the K-ras proto-oncogene; selected stable transfectants; and evaluated the possible changes in different functions contributing to transformation. It's tested also in vivo model. We subcutaneously injected transfectants in nude mice and generated tumors were compared morphocally, functionally, and molecularly.The conclusion of this work is that K-ras with point mutations at codon 12 confer a more aggressive transforming phenotype, increasing the thresfold of apoptotic induction. In contrast, mutations at codon 13 or the overexpression of K-ras proto-oncogene reduce this thresfold. Increased activation of cellular survive pathway PI3K/AKT confer to K-ras with point mutations at codon 12 resistance to apoptosis, in vitro and in vivo model.And last; the position of mutated codon in K-ras gene confer histologic specificity to generated tumors.Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 12 constitute a possible animal model of human fibrosarcoma. Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 13 constitute a possible animal model of human malignant fibrous histiocytoma.

Des del descobriment de la insulina per Banting i Best el 1922 s'ha fet un gran progrés en el coneixement i la comprensió de la seva química, fisiologia i mode d'acció (1). Totes les accions que du a terme aquesta hormona pancreàtica, tant les metabòliques com les mitogèniques, es donen a través del seu receptor. Aquest és un receptor de membrana, constituït per dues subunitats a que són extracel·lulars i que uneixen la insulina, i dues subunitats b, amb una regió transmembrana i una regió intracel·lular que té activitat tirosina quinasa intrínseca (2). Ja que el receptor és el primer pas en la senyalització iniciada per la insulina, ha estat considerat com un candidat a patir mutacions que serien les responsables de la disrupció del senyal de la insulina i conseqüentment donarien lloc a la resistència a la insulina.S'han descrit tres síndromes genètiques de resitència a la insulina associades a mutacions en el gen del receptor d'insulina: Síndrome de Leprechaunisme, Síndrome de Rabson-Mendenhall i Síndrome de Resistència Tipus A a la insulina, encara que també s'han descrit algunes mutacions en alguns pacients afectes de Lipodistròfia i Obesitat.En el present treball s'han estudiat 18 pacients amb síndromes associades a resistència a la insulina. L'estudi molecular dels receptors mitjançant amplificació per PCR i seqüenciació automàtica, va permetre detectar tres noves mutacions en heterozigosi en tres pacients afectes de resistència a la insulina Tipus A (A1 Leu140/acceptor d'spicing-1239Aturada, A2 acceptor d'spicing-1239Aturada i A3 Val1028), dues mutacions prèviament descrites en un pacient afecte de la Síndrome de Rabson-Mendenhall (RM1 Lys15 i Aturada1000), i una variació en un individu control (Val985Met), a més de diferents polimorfismes. L'estudi funcional dels receptors portadors de les noves mutacions va concloure que la mutació Leu140 s'expressa menys que els receptors WT, en conseqüència uneix menys insulina i presenta una activitat tirosina quinasa disminuïda. La mutació Val1028 afecta a la seqüència consens d'unió de l'ATP i per tant aboleix l'activitat tirosina quinasa. Per últim la mutació d'splicing-1239Aturada dóna com a resultat dos mRNAs anòmals i deferents, però que al ser traduïts donen lloc a la mateixa proteïna: al receptor li manca l'extrem C-terminal (l'exó 22). Aquest receptor mutat s'expressa normalment, uneix un 50% d'insulina comparat amb els WT i no presenta activitat tirosina quinasa.Per tant es pot concloure que la resistència a la insulina que pateixen els pacients portadors d'aquestes mutacions, és deguda a l'efecte que les mutacions exerceixen sobre la funcionalitat dels receptors., Insulin was discovered by Banting & Best in 1922, since then a great progress has been made in the knowledge and comprehension of its chemicals, physiology and function (1). All the insulin actions, including the metabolic and mitogenic ones, take place through its receptor. Insulin receptor is a heterotetrameric membrane protein with two extracellular a subunits that bind insulin, and two transmembrane b subunits. The intracellular portions of these b subunits have an intrinsic enzymatic tyrosine kinase activity (5).Insulin binding to its receptor is the first step in insulin signalling and it has been considered that insulin receptor mutations are responsible for disrupting the insulin signal and consequently giving rise to insulin resistance.There are three insulin resistant genetic syndromes associated with insulin receptor mutations: Leprechaunism, Rabson-Mendenhall syndrome and Type A Insulin Resistance syndrome, although some mutations in obese and Lipodystrophic patients have been described.Eighteen insulin resistant patients have been studied in the present work. The molecular study of its insulin receptor gene by means of PCR and automatic sequencing revealed three novel mutations in heterozigote state in three Type A insulin resistant patients (A1 patient Leu140/splicing acceptor-1239Stop, A2 patient splicing acceptor-1239Stop/WT and A3 patient Val1028/WT). Two previously described mutations in a Rabson Mendenhall patient (Lys15/Stop1000), and a variation in a control subject (Val985Met), as well as some polymorphisms. Functional studies of the mutant receptors showed that the Leu140 receptor expresses less than the Wt receptor, binds less insulin and has a decreased tyrosine kinase activity. Val1028 mutation affects the consensus sequence for ATP binding and abolishes tyrosine kinase activity. The splicing acceptor-1239Stop mutation gives rise to two abnormal and different mRNAs, but the resultant protein of both is the same: the receptor lacks the C-terminal domain (exon 22). This mutant receptor expresses as a WT receptor, binds a 50% less insulin than WT and lacks tyrosine kinase activity.In conclusion we can say that the insulin resistance of the patients is due to the mutations present in their insulin receptors.

Aquest treball és una contribució als estudis de diversitat del genoma humà i pretén estudiar la variació genètica existent a nivell mundial en dos gens, causants de malaltia, el gen CFTR i el gen GBA, en cromosomes d'individus sans. Mutacions en aquests gens produeixen la fibrosi quística i la malaltia de Gaucher respectivament. La fibrosi quística és la malaltia autosòmica recessiva més comuna en poblacions europees. La malaltia de Gaucher és la malaltia lisosòmica d'acumulació lipídica més freqüent. L'estudi analitza la variació genètica en diferents polimorfismes d'ambdós gens; reconstrueix els haplotips i analitza la seva distribució geogràfica; i analitza l'extensió i distribució geogràfica del desequilibri de lligament entre loci. Pel gen GBA, hem ampliat la regió, abastant fins al gen PKLR (que codifica per a la piruvat quinasa). A més a més, pel cas de CFTR, pot ajudar a entendre l'origen de les mutacions més freqüents causants de fibrosi quística., This work is a contribution to human genome diversity studies and it aims to study the world-wide genetic variation that exists in two disease genes, CFTR and GBA gene, in healthy chromosomes. Mutations in these genes are known to cause cystic fibrosis and Gaucher disease respectively. Cystic fibrosis is the most common severe autosomal recessive disease in patients of European descent. Gaucher disease is the most frequent lysosomal storage disorder. The study analyzes the genetic variation in CFTR and GBA polymorphisms; estimates haplotype frequencies and describes their geographic distribution; and measures linkage disequilibrium between loci. For GBA gene, we have extended the analysis covering PKLR gene (that encodes for a pyruvate kinase). Moreover, for CFTR gene, we have tried to understand the origin of the most common cystic fibrosis causing mutations.