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The incidence of multiple antibiotic resistance is a global public health threat that can lead to a therapeutic impasse in the treatment of bacterial infections. The World Health Organization (WHO) has established a list of priority pathogens (ESKAPE) due to the emergence of multi-resistant strains. This list was designed to guide and promote the research and development of new antibiotics to counter antibiotic resistance. The identification of the bacterium and the characterization of its resistance profile are essentials informations in order to set up as quickly as possible a targeted antibiotic therapy. The overall objective of this thesis work, carried out within the ANABIO-MS team of the Institute of Analytical Sciences, was to evaluate the potential of bottom-up targeted proteomic analysis to identify a pathogen and/or characterize its virulence and antibiotic resistance mechanisms. The first part of the thesis work, conducted in the framework of a collaboration with the Centre International de Recherche en Infectiologie (CIRI), was dedicated to the development of a method for the relative quantification of Staphylococcus aureus virulence factors using the targeted acquisition mode, MRM (Multiple Reaction Monitoring). The optimization of the time required for sample preparation was one of the main objectives of this development. In particular, by using a modified ultrasound system to simultaneously perform bacterial lysis and enzymatic trypsin hydrolysis of proteins at a thermo-regulated temperature. The temperature, the lysis/digestion time and the influence of glass microbeads were evaluated in order to obtain an optimized protocol of 10 min lysis/digestion at 50°C. A large number of parameters influencing the quantification and reprocessing of the data were also evaluated in order to ensure maximum robustness of the method. The method was then deployed to quantify 50 virulence factors in a cohort of 300 clinical strains of S. aureus (VIRSTA and PHRC cohort, investigator Pr. F. Vandenesch) in order to identify predictive markers of infection severity. The second part of the PhD work was focused on the exploitation of a brand new targeted acquisition mode called Scout-MRM, to design a real-time decision tree for the monitoring of specific transitions of reporter peptides necessary for the identification (ID) of the pathogen as well as for the characterization of its antibiotic resistance profile. In order to achieve this first proof of concept, a Scout-MRM method has been developed using in a first transition group the genus or species specific ribosomal peptides (ESKAPE group) of bacteria as orientation nodes triggering new transition groups integrating reporter peptides of resistance mechanisms (MecA; VIM; NDM; Oxa-48; TEM; KPC; CTX-M; OXA-10; AmpC) and others allowing the confirmation of the genus and species. In addition, particular attention was paid to the optimization of a rapid and robust sample preparation and analysis protocol to provide a complete diagnosis in less than one hour, directly from a positive blood culture aliquot. The results obtained show a specificity score of 100% for species and genus identification and 95% for the different antibiotic resistance mechanisms. The promising results from this thesis work combined with those obtained by other members of the team are being pursued with a view to having, by mid-2021, a Scout-MRM method targeting the most frequent species in blood infections as well as the most critical associated antibiotic resistance mechanisms. The interest of the proposed method for diagnosis (specificity, sensitivity, classification of the level of resistance) will be evaluated against standardised methods by analysing routine hospital samples, L’incidence des résistances multiples aux antibiotiques est un problème de santé publique mondial qui peut conduire à une impasse thérapeutique lors du traitement des infections bactériennes. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a établi une liste de pathogènes prioritaires (ESKAPE) du fait de l’apparition de souches multi-résistantes. Cette liste a été dressée dans le but d’orienter et de promouvoir la recherche et le développement de nouveaux antibiotiques pour lutter contre la résistance aux antibiotiques. L’identification de la bactérie et la caractérisation de son profil de résistance sont des informations essentielles pour la mise en place la plus rapide possible d’une antibiothérapie ciblée. L’objectif global de ce travail de thèse mené au sein de l’équipe ANABIO-MS de l’Institut des Sciences Analytiques était d’évaluer les potentialités de l’analyse protéomique ciblée ascendante (« bottom-up ») pour identifier un pathogène et/ou caractériser ses mécanismes de virulence et de résistance aux antibiotiques. La première partie des travaux de la thèse, réalisée dans le cadre d’une collaboration avec le Centre International de Recherche en Infectiologie (CIRI), a été dédiée au développement d’une méthode de dosage relatif des facteurs de virulence de Staphylococcus aureus à l’aide du mode d’acquisition ciblé, MRM (Multiple Reaction Monitoring). L’optimisation du temps requis pour la préparation d’échantillon a été un des objectifs principaux de ce développement. Notamment grâce à l’utilisation d’un système à ultrasons modifié afin d’effectuer simultanément la lyse des bactéries et l’hydrolyse enzymatique par la trypsine des protéines, à une température thermo régulée. La température, le temps de lyse/digestion ainsi que l’influence de microbilles de verre ont été évalués pour aboutir à un protocole optimisé de 10 min de lyse/digestion à 50°C. Un grand nombre de paramètres influençant la quantification et le retraitement des données ont également été évalués dans le but d’assurer une robustesse maximale à la méthode. La méthode a ensuite été déployée pour quantifier 50 facteurs de virulence au sein d’une cohorte de 300 souches cliniques de S. aureus (Cohorte VIRSTA et PHRC, investigateur Pr. F. Vandenesch) afin d’identifier des marqueurs prédictifs de la sévérité de l’infection. La seconde partie des travaux de thèse s’est focalisée sur l’exploitation d’un tout nouveau mode d’acquisition ciblée appelé Scout-MRM, pour concevoir un arbre de décision en temps réel du suivi des transitions spécifiques des peptides rapporteurs nécessaires à l’identification (ID) du pathogène ainsi qu’à la caractérisation de son profil de résistance aux antibiotiques. Afin de réaliser cette première preuve de concept, une méthode Scout-MRM a été développée utilisant dans un premier groupe de transition les peptides ribosomaux spécifiques du genre ou de l’espèce (groupe ESKAPE) des bactéries comme nœuds d’orientation déclenchant de nouveaux groupes de transitions intégrant des peptides rapporteurs de mécanismes de résistances (MecA ; VIM ; NDM ; Oxa-48 ; TEM ; KPC ; CTX-M ; OXA-10 ; AmpC) et d’autres permettant la confirmation du genre et de l’espèce. Par ailleurs, une attention particulière a été portée à l’optimisation d’un protocole de préparation de l’échantillon et d’analyse qui soit tout à la fois rapide et robuste pour procéder en moins d’une heure à un diagnostic exhaustif, et ce directement à partir d’un aliquot d’hémoculture positive. Les résultats obtenus montrent un score de spécificité de 100 % pour l’identification de l’espèce et du genre ainsi que de 95 % pour les différents mécanismes de résistances aux antibiotiques. Les résultats prometteurs issus de ces travaux de thèse combinés à ceux obtenus par d’autres membres de l’équipe se poursuivent dans la perspective de pouvoir disposer, d’ici mi-2021, d’une méthode Scout-MRM ciblant les espèces les plus fréquentes dans les infections du sang

International audience; The emergence of antibiotic-resistant bacteria strains is seriously threatening human life, as recently underlined by the World Health Organization. The case of Staphylococcus aureus, S.a. is of particular concern, whose forms resisting to vancomycin or methicillin caused numerous patients death in Hospitals. It is also crucial to better understand how mutations of the bacterial genome induce the emergence of new resistant strains. The sensitivity and multiplexing possibilities of mass spectrometric (MS) approaches appears particularly relevant to tackle such problems. We thus developed a targeted assay covering 90 key proteins involved in S.a. virulence and antibiotic resistance using a novel and a highly multiplexed targeted-MS approach, Scout-MRM. The virulome assay has been implemented for deciphering the proteogenomic links across a clinical collection of 230 S.a. strains.

This work is interested in the photo-dynamics of photochromism of salicylidene aniline (SA) in solution aiming at proposing a general mechanism. As the photochormism of SA involves an ultrafast intramolecular proton transfer, the experimental study consisted mainly in femtosecond transient absorption spectroscopy at different excitation wavelengths. The observation of ultrafast photo-induced processes by pump-probe spectroscopy techniques requires measuring and taking into account the instrumental response function. Indeed some physical effects affect the structure of spectrokinetic data, some distortions may be observed, as well as convolution limiting the time resolution of the measurement. The first part of this work dealt with an adaptation of multivariate chemometric tools, to take into account these specificities. The proposed approach implements a dedicated kinetic constraint into the multivariate curve resolution-alternating least squares method (MCR-ALS). The methodological developments were validated on simulated data and then being applied to the spectroscopic study of SA. The main points are: 1) the intramolecular proton transfer, which was estimated at 60 fs, 2) the existence of a competitive rotation mechanism which was characterized, 3) the excitation wavelength dependence of quantum yields values. Finally, a complete characterization of the photo-induced processes of SA, i.e. the reaction rates and the spectra of all the transient species, was provided and discussed.; Cette thèse s'intéresse à la photo-dynamique du photochromisme du salicylidène aniline (SA) en solution afin d'en proposer un mécanisme général. Le photochromisme du SA faisant intervenir un transfert de proton intramoléculaire ultra-rapide, l'étude expérimentale a été principalement conduite par spectroscopie d'absorption transitoire femtoseconde à différentes longueurs d'onde d'excitation. L'observation de processus photo-induits ultra-rapides par les techniques de spectroscopie de type pompe-sonde requiert la mesure et la prise en compte de la fonction de réponse instrumentale. En effet, des effets physiques peuvent affecter la structure des données spectrocinétiques, voire provoquer certaines distorsions, et la convolution limite la résolution temporelle des acquisitions. La première étape de ce travail a donc été d'adapter des méthodes chimiométriques de résolution des données multivariées à cette spécificité. L'approche proposée a consisté à implémenter une contrainte cinétique adaptée dans une résolution multivariée de courbes par moindres carrés alternés (MCR-ALS). Les développements méthodologiques ont été validés sur des données simulées avant d'être appliqués à l'étude spectroscopique du SA. Les principaux résultats obtenus concernent 1) le transfert de proton intramoléculaire, qui a été estimé à 60 fs, 2) la compétition avec un mécanisme de rotation qui a pu être caractérisé, 3) la dépendance des rendements quantiques avec la longueur d'onde d'excitation. Cette thèse propose ainsi une caractérisation complète des processus photo-induits pour le SA, c'est-à-dire les vitesses de réaction et les spectres de toutes les espèces transitoires.

Par Nicolas Mouton Curé d'Oppagne au Diocese de Liege Vorlageform des Erscheinungsvermerks: A Liege, Chez Guillaume Henry Streel, Imprimeur de S. A. S. M. DC. LXXI.