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Candida albicans is a commensal microorganism of the human normal microbiota, capable of turning pathogenic, and one of the leading causes of human fungal infections with mortality rates as high as 50%. Based on this problem, it is imperative to routinely characterize this pathogen, not only phenotypically but also genotypically, to identify the genomic traits responsible for disease, drug resistance, adaptability to ecological niches, and unravel the genetic diversity among distinct isolates. As so, in this study, a collection of 76 C. albicans strains collected from blood, vaginal and oral samples, and samples from medical devices was characterized by whole genome sequencing and bioinformatics analysis. Their genome sequence was explored to discriminate and epidemiologically contextualize strains globally, identify genes with single nucleotide polymorphisms (SNPs) and contribute to the knowledge on the C. albicans variome. The isolates genome analysis showed that one of the isolates had been misidentified as C. albicans, being C. glabrata. A higher number of SNPs than usual was identified, possibly due to the high number of homozygous SNPs. Genes with SNPs common to all isolates, with SNPs exclusive of isolates from each sample type, and with SNPs common to all isolates of each origin were identified. Often, the frequency of genes with missense SNPs involved in molecular functions and biological processes was significatively higher when compared to the reference strain frequency in those gene ontology sets. Candida albicans é um microrganismo comensal que pertence à microbiota normal humana, capaz de se tornar patogénico, e é uma das principais causas de infeções fúngicas em humanos, com taxas de mortalidade até 50%. Com base neste problema, é imperativo caracterizar este patógeno rotineiramente, não só fenotipicamente, mas também genotipicamente, identificar características genómicas responsáveis pela doença, resistência a fármacos, adaptabilidade a nichos ecológicos e desvendar a diversidade genética dos isolados causadores de infeções. Assim, neste estudo, uma coleção de 76 estirpes de C. albicans recolhidas de amostras de sangue, vaginais, orais e de dispositivos médicos foi caracterizada através da sequenciação do genoma total e análises de bioinformática. Explorou-se as sequências genómicas dos isolados para discriminar e contextualizar epidemiologicamente as estirpes, identificar genes com polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e contribuir para o conhecimento do varioma de C. albicans. A análise do genoma dos isolados mostrou que um dos isolados foi anteriormente mal classificado como C. albicans, sendo C. glabrata. Foi identificado um número de SNPs maior do que o habitual, possivelmente devido ao número elevado de SNPs homozigóticos. Foram identificados genes com SNPs comuns a todos os isolados, com SNPs exclusivos de isolados de cada tipo de amostra, e com SNPs comuns a todos os isolados de cada origem. A frequência de genes com SNPs missense envolvidos em funções moleculares e processos biológicos foi muitas vezes significativamente superior à frequência na estirpe de referência para os mesmos conjuntos de ontologia genética. Mestrado em Microbiologia

A análise de dados ganhou relevância significativa no mundo atual. À medida que aumenta a quantidade de dados gerados, aumenta também a necessidade de compreender toda essa informação. Ferramentas clássicas, como folhas de cálculo, não permitem lidar com grandes quantidades de dados nem suportar procedimentos estatísticos complexos. Para realizar essa análise, é frequentemente necessário um software específico e aplicado. Os softwares com mais flexibilidade analítica requerem proficiência em programação. A linguagem R é muito popular para análise de dados, no entanto, pode ser difícil de aprender, especialmente por alguém sem nenhuma experiência de programação. O objetivo deste trabalho é construir uma aplicação web baseada em R Shiny que permita ao utilizador realizar análises estatísticas complexas sem requerer conhecimentos de programação. The analysis of data has gained significant relevance in the world of today. As the amount of data generated increases, so does the need for understanding and make sense of such information. Classical tools such as spreadsheets cannot handle large amounts of data nor support complex statistical procedures. In order to perform such analysis, often a specific and applied software is required. Most of those softwares require some level of programming proficiency. The R language has been very popular for data analysis, however, it can be hard to learn, especially if the learner lacks previous programming experience. The purpose of this work is to construct an R-based web application with Shiny that allows the user to perform complex statistical analysis without requiring any programming knowledge. Mestrado em Estatística Médica

Com o aumento da esperança média de vida, estudar o envelhecimento saudável tem vindo a tornar-se mais relevante. Muitas das perdas funcionais relacionadas com a idade ocorrem através dos danos oxidativos e um dos biomarcadores mais utilizados para estudar estes danos, também usado como preditor da idade biológica, é a quantidade de 8-oxo-2´-deoxoguanosina (8- OHdG). Este composto corresponde à versão oxidada mais frequente das guaninas do DNA, e a sua disponibilidade e estabilidade a longo prazo é superior à de outros biomarcadores. As técnicas utilizadas para a medição do stresse oxidativo no DNA, em sua maioria, apresentam diversas desvantagens, para além de degradarem a amostra, apresentam um custo elevado e envolvem procedimentos demorados ou necessitam de serem complementadas com outras técnicas. Para tentar ultrapassar estas limitações este trabalho propõe o uso de espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) para a medição de níveis de 8-OhdG em amostras humanas com DNA. Esta técnica foi utilizada devido à sua sensibilidade, ao reduzido tempo de análise, ao baixo risco de contaminação das amostras, ao facto de necessitar pouca amostra e ter baixo custo. No presente estudo recorreu-se a ELISA como método de validação, que se comparou como FTIR, para a quantificação do analito 8-OhdG, em amostras de urina e de DNA extraído e purificado. Apesar de não ter sido possível obter uma boa correlação entre os resultados obtido por ambas as técnicas analíticas, foi possível tanto a deteção quanto a quantificação deste composto, por FTIR, em ambos os tipos de amostras. Com este trabalho foi possível definir as condições experimentais necessárias para a utilização do FTIR na quantificação de 8-OHdG tendo-se estabelecido um protocolo laboratorial, que deverá ser utilizado como ponto de partida em estudos futuros. Para além disso, os espectros provenientes do FTIR foram explorados para testar a sua utilidade na determinação de outros biomarcadores relevantes em simultâneo. With the increase in average life expectancy, studying healthy aging has become more relevant. Many of the age-related functional losses occur through oxidative damage and one of the most used biomarkers to study these damages, also used as a predictor of biological age, is the amount of 8-oxo-2´- deoxoguanosine (8-OHdG). This compound corresponds to the most frequent oxidized version of DNA guanines, and its availability and long-term stability is superior to that of other biomarkers. The techniques used to measure oxidative stress in DNA, for the most part, have several disadvantages, in addition to degrading the sample, presenting a high cost and involving lengthy procedures or need to be complemented with other techniques. In order to try to overcome these limitations this work proposes the use of infrared spectroscopy with Fourier transform (FTIR) to measure 8-OhdG levels in human samples with DNA. This technique was used due to its sensitivity, the reduced analysis time, the low risk of contamination of the samples, together with the fact that it requires little sample and has a low cost. In the present study, ELISA was used as a validation method, and results were compared to those from FTIR, for the quantification of the 8-OhdG analyte, in both urine and extracted DNA samples. Although it was not possible to obtain a good correlation between the results obtained by both analytical techniques, it was possible to detect and quantify this compound, by FTIR, in both types of samples. With this work it was possible to define the experimental conditions necessary for the use of FTIR in the quantification of 8-OHdG, and a laboratory protocol was established, which should be used as a starting point in future studies. In addition, the spectra from the FTIR were explored to test their usefulness in determining other relevant biomarkers at the same time. Mestrado em Biologia Molecular e Celular

Candida species are the most common agents of fungal infection, being responsible for both superficial and systemic infections. In recent years, there has been an increase in antifungal-resistant Candida strains, which complicates the treatment of these infections. In order to characterize 10 clinical isolates of Candida, based on their sequence-type, single nucleotide polymorphisms, and antifungal resistance, the genome sequence of the isolates was obtained with MinION (Oxford Nanopore Technologies, UK), and the antifungal susceptibility profile was obtained through broth microdilution techniques and Etest (bioMérieux, France). The analysis of the genome of the isolates showed that one of the isolates did not correspond to C. albicans, being C. glabrata. SNPs were identified in genes that were exclusive for vaginal exudate samples, as well for samples originated from the oral cavity. The frequency of genes with missense SNPs involved in molecular processes and biological functions was significantly enriched to the background frequency in those gene ontology sets. All isolates were susceptible to all antifungals tested, and had none of the resistance-associated polymorphisms found in literature, so there was an agreement between genotype and phenotype. Os organismos do género Candida são os agentes de infeção fúngica mais comuns, sendo responsáveis por infeções superficiais e sistémicas. Nos últimos anos, verificou-se um aumento de estirpes de Candida resistentes a antifúngicos, o que complica o tratamento destas infeções. Com o objetivo de caracterizar 10 isolados clínicos de Candida, com base na sua sequência-tipo, polimorfismos de nucleotídeo único, e resistência a antifúngicos, obteve-se a sequência do genoma dos isolados com o MinION (Oxford Nanopore Technologies, UK), e o perfil de suscetibilidade a antifúngicos através de técnicas de microdiluição em caldo e Etest (bioMérieux, França). A análise do genoma dos isolados permitiu perceber que um dos isolados não correspondia a C. albicans, sendo C. glabrata. Foram identificados SNPs em genes que eram exclusivos para amostras provenientes de exsudatos vaginais, bem como para amostras com origem na cavidade oral. A frequência de genes com SNPs nãosinónimos (missense) envolvidos em processos moleculares e funções biológicas era significativamente superior à frequência base para os mesmos conjuntos de ontologia genética. Todos os isolados eram suscetíveis a todos os antifúngicos testados, e não possuíam nenhum dos polimorfismos associados a resistência descritos na literatura, havendo assim concordância entre o genótipo e o fenótipo. Mestrado em Biomedicina Molecular

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Carla Jesus (cjesus@ua.pt) on 2018-02-05T10:59:36Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Maria_Luísa_Brito.pdf: 3937005 bytes, checksum: 7b3e1966d3cb95931d3b4835ead9e76b (MD5) Made available in DSpace on 2018-02-05T10:59:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Maria_Luísa_Brito.pdf: 3937005 bytes, checksum: 7b3e1966d3cb95931d3b4835ead9e76b (MD5) Previous issue date: 2018-01-04

Mestrado em Biomedicina Molecular Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a multifactorial and heterogeneous disease which impacts differently on patients with similar grades. This suggests that factor others than lung function may affect patients experience of the disease. Patient-reported outcomes (PROs) are a set of measures that allow to assess patients’ self-perception and experience of the disease. Recent studies have reported associations between specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) and PROs, however not much is known about these associations and their meanings. Thus, this study had as main objective to explore possible associations between specific genetic variants and clinical measures, including PROs. It also sought to contribute for a characterization of the genotypes from patients with COPD in Portugal. A cross-sectional study was conducted in a total number of 60 patients with COPD. The PROs assessed were: 1) self-reported frequency of exacerbations, 2) dyspnoea with modified Medical Research Council and Borg scales , 3) fatigue with Borg scale, 4) anxiety and depression with Hospital Anxiety and Depression scale; 5) impact of the disease with COPD Assessment Test and 6) health-related quality of life (HRQOL) with St. George Respiratory questionnaire; Additionally, several surrogate outcomes were also assessed i. e., lung function, peripheral muscle strength with digital dynamometer, respiratory muscle strength with the respiratory pressure assessment and functional capacity through the 1 minute and 5 time sit-to-stand. Both oropharyngeal swabs and saliva samples were collected from the patients for genotyping. Significant associations were found between genetic variants and dyspnoea (rs1143634, rs1042717, rs1138272 and rs12504628), fatigue (rs1042714, rs1138272), anxiety (rs1051303, rs1800450 and rs1131620), impact of the disease (rs10461985 and rs11172113) and HRQOL (rs11172113, rs1042713, rs1138272 and rs12504628). Significant associations were also found between genetic variants and lung function (rs1042713, rs1042717, rs5030737), respiratory muscle strength (rs1130866), peripheral muscle strength (rs1042713, rs1042717, rs11172113, rs11556218) and functional capacity (rs12899618, rs11046966 and rs1138272). This was an exploratory study and more investigations are necessary to confirm the results obtained and to explore deeply the associations and interpretations between genetics and COPD trajectory. A Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC) é uma doença multifatorial e heterogénea que apresenta impactos diferentes em pacientes com estadios da doença semelhantes. Isto sugere que outros fatores para além da função pulmonar podem afetar a forma como o paciente experiencia a sua doença. As medidas reportadas pelo paciente (PROs) são um conjunto de variáveis que permitem avaliar a autoperceção e experiência dos doentes em relação à sua doença. Estudos recentes reportaram a existência de associações entre polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) e PROs, mas pouco ainda se sabe sobre estas associações e seu significado. Assim, este estudo teve como objetivo principal explorar possíveis associações entre variantes genéticas específicas e medidas clínicas, entre as quais PROs. Pretendeu também contribuir para a caracterização dos genótipos dos doentes com DPOC em Portugal. Realizou-se um estudo transversal com 60 doentes com DPOC. As PROs avaliadas foram 1) frequência de exacerbações autoreportadas pelos doentes, 2) dispneia com a modified medical Research Council Scale e Borg, 3) fadiga com a Borg, 4) ansiedade e depressão através da escala de ansiedade e depressão hospitalar, 5) impacto da doença com o teste de avaliação da DPOC e 6) qualidade de vida relacionada com a saúde (QVRS) com questionário do hospital de St. George na doença respiratória. Adicionalmente, outras medidas clínicas também foram avaliadas, i. é., função pulmonar, força muscular periférica com dinamometria digital, força dos músculos respiratórios com a medição das pressões respiratórias e capacidade funcional através do teste de levantar e sentar cinco vezes e 1 minuto. Zaragatoas orofaríngeas e amostras de saliva foram recolhidas de todos os pacientes para genotipagem. Foram encontradas associações significativas entre variantes genéticas e dispneia (rs1143634, rs1042717, rs1138272 e rs12504628), fadiga (rs1042714 e rs1138272), ansiedade (rs1051303, rs1800450 e rs1131620), impacto da doença (rs10461985 e rs1172113) e QVRS (rs11172113, rs1042713, rs1138272 e rs12504628). Também foram encontradas variantes significativamente associadas à função pulmonar (rs1042713, rs1042717 e rs5030737), força dos músculos respiratórios (rs1130866), força muscular periférica (rs1042713, rs1042717, rs11172113 e rs11556218) e capacidade funcional (rs12899618, rs11046966 e rs1138272). Este foi um estudo exploratório e mais investigações são necessárias para confirmar os resultados obtidos e para explorar mais profundamente a associação e interpretação entre a genética e a trajetória da DPOC.

Mestrado em Biomedicina Molecular A Candida cylindracea constitui um caso particular do grupo de leveduras CTG-clade - apresenta uma total conversão do codão CUG de leucina (standard) em serina, em vez de o fazer de forma ambígua como os restantes membros do grupo. Para além disso, após a sequenciação e anotação do seu genoma completo e do seu mRNA, verificou-se que a Candida cylindracea possuí uma frequência consideravelmente elevada de genes iniciados pelos codões alternativos CTG e TTG relativamente às outras espécies filogeneticamente próximas, cuja grande maioria dos genes é iniciada por ATG (standard). Durante este trabalho foi validada a anotação do genoma desta espécie de modo a descartar possíveis artefactos, utilizando o MAKER como ferramenta. As sequências anotadas foram introduzidas na plataforma ANACONDA para desvendar algumas das principais características do genoma e do transcriptoma desta espécie. A análise destes dados basou-se em encontar diferenças significativas entre os diferentes tipos de sequências, de acordo com o seu codão de iniciação, tanto no genoma como no transcriptoma. A notória diferença entre a frequencia dos codões de iniciação das sequências de DNA e RNA, por sua vez, abriu portas à especulação acerca da presença de fenómenos de RNA editing. Ao reunir as peças deste puzzle tão singular, espera-se conseguir dar um passo em frente na compreensão do funcionamento do genoma de acordo com a relevância deste fenómeno. Resta para isso entender de que forma estas diferenças poderão estar conectadas e influenciar o genoma. Estudos posteriores com recurso a novas técnicas da era ómica poderão fornecer novos discernimentos nesta materia. Candida cylindracea yeast is a peculiar case within the CTG clade – its total conversion of the CUG leucine codon into serine contrasts with the ambiguous way that the rest of the yeasts belonging to this group decode the CUG codon. Furthermore, after the sequencing and annotation of its complete genome and its mRNA sequences, it was yet ascertained that Candida cylindracea has a substantial frequency of alternative initiation codons, when compared to other phylogenetically close species, where the majority of the genes is started with the standard ATG codon. MAKER was used as annotation tool to validate the previous annotation of Candida cylindracea’s genome and transcriptome in order to forgo possible artifacts. The sequences produced were introduced in the ANACONDA platform to unveil some of the main features of the genome and transcriptome of this species. The analysis of this data was based in finding the significant differences between the distinct types of sequences according to their initiation codon, in both genome and transcriptome levels. The considerable differences between the DNA and the RNA sequences regarding their initiation codon allowed instigating the presence of RNA editing phenomena. Putting it all together, these singular events are expected to yield a better comprehension of the genome functioning. It is, therefore, necessary to understand in which ways these differences may be connected and if they influence the genome. Posterior studies resorting to new techniques of the omics era can provide new insights on this matter. .

Mestrado em Biomedicina Molecular Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2017-04-04T14:25:09Z No. of bitstreams: 1 Tese de Mestrado - Carolina Lobato - Biomedicina Molecular - UA.pdf: 1916505 bytes, checksum: 50ac7e0ef097a90ce500af9b55c8d666 (MD5) Made available in DSpace on 2017-04-04T14:25:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Mestrado - Carolina Lobato - Biomedicina Molecular - UA.pdf: 1916505 bytes, checksum: 50ac7e0ef097a90ce500af9b55c8d666 (MD5) Previous issue date: 2016

Mestrado em Biotecnologia Molecular Um conhecimento alargado sobre o impacto de erros de tradução do mRNA pode ajudar a compreender a biologia do stress proteotóxico. A inserção de um tRNA ambíguo (tRNACAG Ser) em Saccharomyces cerevisiae permitiu obter um sistema celular modelo para o estudo do impacto de uma elevada taxa de erro de tradução em células eucarióticas. Estes erros estão associados à acumulação de proteínas agregadas que destabilizam a homeostase celular. Neste trabalho estudaram-se 6 estirpes diferentes de Saccharomyces cerevisiae, submetendo-as a diferentes tipos de stress externos e testando vários parâmetros celulares, nomeadamente: o nível de ROS intracelular, alterações de ploidia e expressão genética. Estes erros não conferiram aumento de resistência a stresses ambientais e verificou-se que em geral provocaram aumento de stress oxidativo. A nível da ploidia foram registadas alterações, apresentando-se o estado diplóide como o mais estável nestas estirpes. No que toca ao estudo expressão genética, conseguiu-se encontrar uma resposta comum entre estirpes. Com este trabalho surgiram novas questões sobre o impacto dos erros da síntese proteica na célula, sendo necessários mais testes para caracterizar a resposta ao stress proteotóxico induzido por erros de tradução. The study of mRNA mistranslation may is likely to contribute to elucidate the biology of the proteotoxic stress. The insertion of an ambiguous tRNA (tRNACAG Ser) in Saccharomyces cerevisiae produced a model system for studying the impact of proteic synthesis errors in eukaryotic cells. In this work, we have studied 6 different strains of Saccharomyces cerevisiae, by subjecting them to several stressors and testing several cellular parameters, namely: intracellular ROS, ploidy changes and gene expression. Mistranslation did not confer an increased resistance to environmental stresses but an increase in oxidative stress was common to all strains. Mistranslation increased ploidy turning N to 2N with the production of aneuploidy cells. The genomic effects of mistranslation were similar to all strains. New questions have arisen about the impact of mistranslation on the cell and additional studies are required to fully characterize the stress response induced by mistranslation.

Mestrado em Biomedicina Molecular Epigenetics can be defined as changes in the genome that are inherited during cell division, however without direct modify the DNA sequence. These genomic changes are supported by three major epigenetic mechanisms: DNA methylation, histone modification and small RNAs. Different epigenetic marks function by regulating gene transcription, because when these processes are altered, this triggers various diseases such as cancer. Thus, one main objective was to study the epigenetics signals in the human genome, meaning, whether there is dependence observed between the context and the occurrence of epigenomic marking. For this purpose we used histone epigenomes available in the NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium database that contains various types of cells and various types of tissues. The present study employed different statistical methodologies, namely, statistical tests, effect size measures, residue analysis and hierarchical classification. With this analysis, we compared genomic contexts of epigenetic marking among chromosomes and among epigenomes. Complementing the analysis with a control scenario, without marking and factoring the CG content. As a result of this study, it was possible to identify one dependency between the context and the occurrence of epigenetic marking and we were able to identify specific genomic contexts in histone modifications. A epigenética pode ser definida pela ocorrência de modificações no genoma, que são herdadas durante a divisão celular, não havendo no entanto modificações directas na sequência do DNA. Estas modificações genómicas são apoiadas em três grandes mecanismos epigenéticos: metilação do DNA, modificação de histonas e pequenos RNAs. Estas diferentes marcas epigenéticas podem ter como função regular a transcrição genética, pois quando existe algum tipo de alteração nestes processos, pode desencadear-se em diversas patologias como o cancro. Assim, o objectivo principal deste trabalho é estudar os sinais epigenéticos no genoma humano, ou seja, observar se existe dependência entre o contexto e a ocorrência da marcação epigenómica. Para esse efeito foram utilizados os epigenomas das histonas disponíveis na base de dados do NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium que contêm vários tipos de células e vários tipos de tecidos. No presente estudo são empregues diferentes metodologias estatísticas, nomeadamente testes estatísticos, medidas do tamanho do efeito, análise de resíduos e classificação hierárquica. Com esta análise, comparam-se contextos genómicos da marcação epigenética entre cromossomas e entre epigenomas. Complementando a análise com um cenário de controlo, sem marcação e factorizando pelo teor de CG. Foi possível identificar uma dependência entre o contexto e a ocorrência de marcação epigenética, sendo possível identificar contextos genómicos específicos para as modificações das histonas.

Mestrado em Biotecnologia Molecular Submitted by Nuno Cruz (nuno@ua.pt) on 2013-07-08T11:42:34Z No. of bitstreams: 1 dissertação.pdf: 2822200 bytes, checksum: ed56bbd3253be8a11210d5eb59728cf3 (MD5) Made available in DSpace on 2013-07-08T11:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação.pdf: 2822200 bytes, checksum: ed56bbd3253be8a11210d5eb59728cf3 (MD5) Previous issue date: 2012-12-17