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Para estudiar el efecto de una subnutrición gestacional inducida por una menor oferta de campo natural sobre la miogénesis y la producción cárnica en corderos se realizaron dos experimentos. En el primero ovejas Corriedale se alimentaron con ofertas de campo natural contrastantes (23 días antes de la concepción hasta el día 122 de gestación) y se evaluó la miogénesis en fetos de 70 días y neonatos. En el segundo ovejas similares se alimentaron con ofertas de campo natural contrastantes (día 30 de gestación hasta el parto) y se evaluó el desempeño productivo, la cantidad y calidad de carne y las características musculares en corderos de 200 días. Una menor oferta de forraje afectó la miogénesis fetal (menos fibras secundarias) y se asoció con menor actividad mitótica y de fusión mioblástica en algunos músculos. En neonatos, la subnutrición materna afectó la histología muscular, las propiedades contráctiles y biológicas fibrilares (MyHC-I y GLUT-4). Asimismo, la subnutrición redujo fuertemente el IGF-1 muscular pudiendo comprometer la compensación hipertrófica neonatal. Por otra parte, la subnutrición materna desde el día 30 hasta el parto afectó el crecimiento, la calidad de la canal y los pesos musculares a los 200 días, aunque estos efectos fueron fundamentalmente sexo-dependientes, siendo los machos los más afectados. La subnutrición materna afectó la composición fibrilar (más actividad oxidativa) en todos los músculos a los 200 días. Las características bioquímicas y de calidad de carne también se afectaron, aunque estos efectos dependieron tanto del músculo como del sexo. En síntesis, una menor oferta de forraje gestacional afectó negativamente la miogénesis fetal y las características musculares neonatales (peores capacidades hipertróficas), e indujo efectos de programación fetal sobre la masa y las características musculares a los 200 días. Esto implica que, independientemente de las condiciones posnatales, las alteraciones intrauterinas inducen cambios musculares, que pueden relacionarse con la habilidad para crecer y la calidad de la carne producida. Asimismo, nuestros resultados destacan la importancia de considerar el sexo del animal y el músculo a la hora de estudiar estos efectos.

[eng] With the most absolute purpose of understanding what the “simple” concept of “growth regulation” implies, the present thesis is a compilation of original works that aims to deepen in how the growth and metabolism of fish, and most concretely, its muscle, behaves in different metabolically challenging conditions. Hopefully, the knowledge generated in these works and integrated in this multi-perspective thesis, can contribute to somehow help to improve the Aquaculture sector in the Mediterranean Sea and abroad. This ambitious goal is structured in different objective: 1) To establish the regulation of the ghrelinergic system in bream through the fasting and feedback model: a) Characterization of the sequences of Preproghrelin, Ghsr1a and Ghsr1b in gilthead sea bream (Article 1). b) Characterizing Preproghrelin and its two receptors in acute and long-term feeding responses and its interaction with the Gh/Igf1 axis (Article 1). 2) To deepen in the beneficial effects of exercise on growth and its modulation through changes in the dietary protein/lipid ratio: a) Determining how this dietary modification alters different growth parameters, muscular proximal composition and reserves turnover (Article 3). b) Determining how the mitochondrial proteins in red and white muscle and in the liver respond to this dietary modification in order to infer changes in the nutritional efficiency and growth improvement (Article 3). 3) To make a comparative study about the response of the main musculoskeletal growth regulation systems under two different challenging experimental models, the fasting and refeeding and the sustained exercise under two different diets. a) Studying the gene expression of specific proteins of the ontogenetic and growth pathways (myogenesis and osteogenesis), as well as the degradation pathways (proteolysis and osteoclastogenesis) in white muscle and bone (Articles 2 and 4). b) Determining its effects on white muscle growth (myogenesis/proteolysis balance) and meat quality (Article 4). 4) To complete the characterization of the new Myomaker and Myomixer fusogens in rainbow trout and gilthead sea bream and its involvement in the myogenic process in vivo and in vitro and in the in vivo muscle regeneration. a) Characterization of the sequence of Myomixer in rainbow trout (Article 5) and Muomaker and Myomixer in gilthead sea bream (Article 6). b) To study the involvement of Myomaker (in gilthead sea bream) and Myomixer (in rainbow trout and gilthead sea bream) in the myogenic process in vivo and in vitro as well as during the muscle regeneration in vivo (Article 5 and 6).

Resumo Os peixes teleósteos são organismos que, geralmente, apresentam limite de crescimento indeterminado e estão presentes em diferentes biomas com diversas características ambientais. Os teleósteos possuem até 80% de sua composição corporal formado por tecido muscular, composto por fibras musculares e células satélites indiferenciadas, formando um tecido muscular complexo cuja forma é muito variada em função das espécies que compõem este grupo de animais. Um ponto importante a ser considerado é que o crescimento muscular dos peixes é influenciado pelas condições ambientais em que estão inseridos. Esta influência ocorre à nível molecular afetando a transcrição e funcionalidade de diferentes transcritos relacionados à miogênese em diferentes fases do desenvolvimento dos peixes. Esta revisão tem o objetivo de discutir alguns dos pontos chave sobre a influência dos fatores ambientais sobre o desenvolvimento e crescimento muscular dos peixes. Abstract Teleost fish are organisms that generally show an indeterminate growth limit and are present in different biomes with different environmental conditions. Approximately up to 80% of the body composition of fish is formed by muscle tissue. Muscle tissue is composed of muscle fibers and undifferentiated satellite cells, forming a complex tissue that shows a widely varied shape depending on the species which form this group of animals. An important point to be considered is that the muscle growth of the fish is influenced by the environmental conditions in which they are inserted. This influence occurs at the molecular level, affecting the transcription and functionality of different transcripts related to myogenesis at different stages of fish development. This review aims to discuss some of the key aspects about the influence of environmental factors on the development and muscle growth of teleost fish. Resumen Los peces teleósteos son organismos que generalmente tienen un límite de crecimiento indeterminado y están presentes en diferentes biomas con diferentes características ambientales. Los teleósteos poseen hasta el 80% de su composición corporal compuesta de tejido muscular, compuesto por fibras musculares y células satélite indiferenciadas, formando un tejido muscular complejo cuya forma es muy variada dependiendo de las especies que componen este grupo de animales. Un punto importante por considerar es que el crecimiento muscular de los peces está influenciado por las condiciones ambientales en que están inseridos. Esta influencia ocurre a nivel molecular, afectando la transcripción y la funcionalidad de diferentes transcripciones relacionadas con la miogénesis en diferentes etapas del desarrollo de los peces. Esta revisión tiene como objetivo discutir algunos de los puntos clave sobre la influencia de los factores ambientales en el desarrollo y el crecimiento muscular de los peces.

The aim of the study was, through a literature review, to evaluate the effects of nutrition of beef cows during pregnancy on the quality and performance of the progeny after birth. In recent years, numerous studies have been carried out to assess the effects of maternal nutrition during pregnancy (fetal programming) on ​​progeny productivity. In view of the results presented, it is clearly elucidated that the nutritional conditions of the pregnant uterus alter health, physiology, metabolism and, consequently, the postpartum performance of the progeny in several ways. These changes may vary according to the degree and intensity of the nutritional challenge, the moment of this challenge during pregnancy and the adaptive capacity of pregnant cows to partition nutrients to the fetus. The literature suggests that the effects of fetal programming are more easily seen in the initial months of the offspring's life, disappearing with advancing age, however, the nutritional restriction of the cow during pregnancy can also lead to the formation of an individual with greater capacity to adaptation and better prepared to survive in more challenging environments in postnatal life. In addition, the formation of an “economic” phenotype may result in a compensatory performance during the adult life of cow calves that have undergone nutritional challenges during pregnancy. El objetivo del estudio fue, a través de una revisión de la literatura, evaluar los efectos de la nutrición de las vacas de carne durante la gestación sobre la calidad y desempeño de la progenie después del nacimiento. En los últimos años se han realizado numerosos estudios para evaluar los efectos de la nutrición materna durante la preñez (programación fetal) sobre la productividad de la progenie. A la vista de los resultados presentados, se aclara claramente que las condiciones nutricionales del útero gestante alteran la salud, fisiología, metabolismo y, en consecuencia, el desempeño posparto de la progenie de varias formas. Estos cambios pueden variar según el grado y la intensidad del desafío nutricional, el momento de este desafío durante la preñez y la capacidad de adaptación de las vacas gestantes para repartir los nutrientes al feto. La literatura sugiere que los efectos de la programación fetal se ven más fácilmente en los primeros meses de vida de la descendencia, desapareciendo con el avance de la edad, sin embargo, la restricción nutricional de la vaca durante la gestación también puede conducir a la formación de un individuo con mayor capacidad para adaptación y mejor preparada para sobrevivir en entornos más desafiantes en la vida posnatal. Además, la formación de un fenotipo “económico” puede resultar en un desempeño compensatorio durante la vida adulta de los terneros que han sufrido desafíos nutricionales durante la preñez. O objetivo do estudo foi, por meio de uma revisão de literatura, avaliar os efeitos da nutrição de vacas de corte durante a gestação sobre a qualidade e o desempenho da progênie após o nascimento. Nos últimos anos, inúmeras pesquisas foram desenvolvidas para avaliar os efeitos da nutrição materna durante a gestação (programação fetal) sobre a produtividade da progênie. Diante dos resultados apresentados, está claramente elucidado que as condições nutricionais do útero grávido alteram de várias maneiras a saúde, a fisiologia, o metabolismo e, consequentemente, o desempenho pós-parto da progênie. Estas alterações podem variar de acordo com o grau e intensidade do desafio nutricional, momento deste desafio no decorrer da gestação e capacidade adaptativa das vacas gestantes em particionar os nutrientes ao feto. A literatura sugere que os efeitos da programação fetal são mais facilmente constatados nos meses iniciais de vida dos descendentes, desaparecendo com o avançar da idade, porém, a restrição nutricional da vaca durante a gestação também pode levar à formação de um indivíduo com maior capacidade de adaptação e mais preparado para sobreviver em ambientes mais desafiadores na vida pós-natal. Além disso, a formação de um fenótipo “econômico” poderá resultar em um desempenho compensatório durante a vida adulta dos bezerros de vacas que passaram por desafios nutricionais durante a gestação.

Taenia solium es un cestodo endémico en el Perú que infecta a cerdos y humanos. Dos de sus estadios son: larva metacestode y gusano adulto. La larva se aloja en los tejidos blandos, formando un quiste que contiene al escólex y cuello invaginados del parásito. El gusano adulto se desarrolla en el intestino humano: a partir del cuello se forma un estróbilo de proglótides que producen huevecillos, convirtiéndose en el estadio diseminativo del parásito. La metamorfosis del estadio larval al adulto implica cambios transcripcionales que originan modificaciones morfológicas, principalmente la evaginación del escólex y la generación del estróbilo. Ambos procesos son críticos en el desarrollo del parásito, pero los genes involucrados en estos eventos han sido poco explorados en T. solium. Estudios en otros platelmintos han identificado elementos transcripcionales que regulan el crecimiento y la regeneración. Entre ellos se encuentra myoD, un factor de transcripción que induce y dirige la diferenciación de las células musculares. Como se conocen ortólogos en urocordados y equinodermos, myoD resulta ser un regulador universal de la miogénesis en animales bilaterales. En planarias, myoD induce la formación de los músculos longitudinales, indispensables para iniciar la regeneración. En Hymenolepis microstoma, myoD presenta una mayor expresión en el cuello y escólex del estadio adulto. Esto sugiere que el gen cumple un papel en el desarrollo muscular de ambos platelmintos. Sin embargo, no se ha definido ni caracterizado la expresión de genes reguladores de miogénesis en T. solium, siendo este proceso esencial en el cuello para la extensión continua del estróbilo. Por ello, se propone evaluar la expresión de myoD en larvas y parásitos evaginados in vitro y usar una técnica de silenciamiento para comprobar si este gen regula el desarrollo muscular del cuello y, por lo tanto, participa en la metamorfosis de larva a adulto de T. solium. Taenia solium is an endemic cestode in Peru that infects pigs and humans. Two of its stages are: metacestode larva and adult worm. The larva lodges in soft tissues, forming a cyst that contains the invaginated scolex and neck of the parasite. The adult worm develops in the human intestine: a strobilus of proglottids that produce eggs is formed from the neck, becoming the disseminative stage of the parasite. The metamorphosis from the larval to the adult stage implies transcriptional changes that originate morphological modifications, mainly the evagination of the scolex and the generation of the strobilus. Both processes are critical in the development of the parasite, but the genes involved in these events have been scarcely explored in T. solium. Studies in other flatworms have identified transcriptional elements that regulate growth and regeneration. Among them is myoD, a transcription factor that induces and directs muscle cell differentiation. As orthologs are present in urochordates and echinoderms, myoD turns out to be a universal regulator of myogenesis in bilateral animals. In planarians, myoD induces the formation of longitudinal muscles, essential to initiate regeneration. In Hymenolepis microstoma, myoD has a higher expression in the neck and scolex of the adult stage. This suggests that the gene plays a role in the muscle development of both flatworms. However, the expression of myogenesis regulatory genes in T. solium has not been defined or characterized, despite the fact that myogenesis is an essential process in the neck for the continuous extension of the strobilus. Therefore, it is proposed to evaluate the expression of myoD in larvae and evaginated parasites in vitro and to use a silencing technique to confirm if this gene regulates the muscular development of the neck and, hence, participates in the metamorphosis from the larval to the adult stage of T. solium.

Durante el desarrollo embrionario, estructuras transitorias llamadas somitos dan lugar al dermomiotomo epitelial, origen de los precursores de la musculatura esquelética del tronco. Las células progenitoras musculares multipo- tentes (MPC) que expresan Pax3 surgen del dermomiotomo y adquieren su identidad definitiva a través de los factores reguladores miogénicos (MRF) Myf5, Mrf4 y MyoD. Además, las células madre musculares (células satélite) del cuerpo y las extremidades también surgen de somitos, en común con el músculo con el que están asociadas. Evidencias previas han revelado que el factor de transcripción Pitx2 podría ser un factor clave dentro de las vías moleculares que controlan el destino de los progenitores musculares derivados de somitos. Sin embargo, la posición jerárquica ocupada por Pitx2 dentro de la cascada genética que controla la miogénesis derivada de los somitos sigue sin resolverse. Para obtener información sobre este problema, hemos generado dos ratones mutantes condicionales para inactivar específicamente Pitx2 en progenitores musculares multipotentes Pax3+ (Pax3Cre+/Pitx2loxp/loxp) y en los progenitores comprometidos miogénicos (Myf5Cre+/Pitx2loxp / loxp). Nuestros análisis revelaron que la inacti- vación de Pitx2 en los precursores de Pax3+ conduce a una miogénesis deteriorada, mientras que la pérdida de Pitx2 en las células miogénicas Myf5+ tiene un impacto en el número de células madre satélite musculares que alcanzan su nicho en el músculo adulto con graves consecuencias en la regeneración muscular.During embryonic development, transitory structures called somites give rise to an epithelial dermomyotome, the source of skeletal muscles precursors of the trunk. Multipotent muscle progenitor cells (MPCs) that express Pax3 arise from the dermomyotome and acquire their definitive identity via the myogenic regulatory factors (MRFs) Myf5, Mrf4, and MyoD. Moreover, the muscle stem cells (satellite cells) of the body and limbs also arise from somites, in common with the muscle that they are associated with. Previous evidences have revealed that the transcription factor Pitx2 might be a player within the molecular pathways controlling somite-derived muscle progenitors’ fate. However, the hierarchical position occupied by Pitx2 within the genetic cascade that control somite-derived myogenesis remain unsolved. To get insight into this issue, we have differentially generated two conditional Pitx2 mutant mice to specifically inactivate Pitx2 in multipotent Pax3+ muscle progenitors (Pax3Cre+/Pitx2loxp/loxp mice) and in myogenic committed progenitors (Myf5Cre+/Pitx2loxp/loxp mice). Our analyses revealed that Pitx2 inactivation in Pax3+ precursors lead to impaired myogenesis while the loss of Pitx2 in Myf5+ myogenic cells have an impact in the number of muscle satellite stem cells that reach their niche in the adult muscle with severe consequences in muscle regeneration. Tesis Univ. Jaén. Departamento de Biología Experimental

Epigenetics is the study of changes in gene expression that cannot be explained by direct modifications in the DNA sequence and whose molecular basis is cytosine methylation and histone modification. Epigenetic regulation is a powerful discovery that allows a rational explanation to the phenomenon of phenotypic plasticity, that is, to the fact that certain environmental stimuli can alter the phenotype of an animal, generating an adaptive response without its genome being modified. Senegalese sole (Solea senegalensis) is a species that has established itself strongly in the diversification of the fish product market, thanks to its generally good adaptation to captivity and its relatively simple zootechnical management. However, there are weaknesses that notably delay the growth of its productivity, such as the reproductive dysfunction of individuals born in captivity or the high incidence of infectious diseases with high mortality. In this review, it is proposed that a greater understanding of the epigenetic regulation of the senegalese sole may help to resolve these problems. Therefore, the main objective of the work is to collect and integrate the information available in this field and apply it to the cultivation of the species. In summary, the main advances have been obtained in 3 areas. The first of these is the muscle development of sole, of which it has been shown that the myogenin locus (myog), involved in the differentiation of myoblasts, is regulated by the methylation levels of its proximal promoter, which increase with temperature. With regard to sex determination, the results suggest that in senegalese sole gonadal differentiation depends on the culture temperature during the early stages of larval development, which induces methylation in the gonadal aromatase gene (cyp19a1a) and skews the sexual ratio towards males. Finally, it has been shown that early stimulation to stress, by way of training, alters the methylation of the major histocompatibility complex Ia (mhc1a), increasing its expression and improving the animal's immunocompetence. As can be seen, the lack of epigenetic studies on the main problems of the cultivation of this species stands out, which have been approached from other points of view that have partially solved them. The future of aquaculture production of senegalese sole depends on the reorientation of research towards the molecular bases of phenotypic plasticity, in which epigenetics occupies the place par excellence., La epigenética es el estudio de los cambios en la expresión génica que no pueden ser explicados por modificaciones directas en la secuencia del ADN y cuya base molecular es la metilación de citosinas y la modificación de la histonas. La regulación epigenética es un potente descubrimiento que permite dar una explicación racional al fenómeno de la plasticidad fenotípica, es decir, al hecho de que ciertos estímulos ambientales puedan alterar el fenotipo de un animal, generando una respuesta adaptativa, sin que su genoma se vea modificado. El lenguado senegalés (Solea senegalensis) es una especie que se ha establecido con fuerza en la diversificación del mercado de productos piscícolas, gracias su buena adaptación en general al cautiverio y su relativamente sencillo manejo zootecnico. Sin embargo, existen puntos débiles que retrasan notablemente el crecimiento de su productividad, como son la incapacidad reproductiva de los individuos nacidos en cautiverio o la alta incidencia de patologías infecciosas de alta mortalidad. En la presente revisión bibliográfica, se propone que una mayor comprensión de la regulación epigenética del lenguado senegalés puede ayudar a la resolución de estas problemáticas. Por lo tanto, el objetivo principal del trabajo es el de recopilar e integrar la información disponible en este campo y aplicarla al cultivo de la especie. En síntesis, los principales avances se han obtenido en 3 áreas. La primera de ellas es el desarrollo muscular del lenguado, del cual se ha comprobado que el locus miogenina (myog), implicado en la diferenciación de los mioblastos, está regulado por los niveles de metilación de su promotor proximal, que aumentan con la temperatura. Con respecto a la determinación del sexo, los resultados apuntan a que en el lenguado senegalés la diferenciación gonadal depende de la temperatura de cultivo durante las primeras etapas del desarrollo larvario, la cual induce metilación en el gen aromatasa gonadal (cyp19a1a) y sesga el ratio sexual hacia los machos. Por último, se ha evidenciado que la estimulación temprana al estrés, a modo de entrenamiento, altera la metilación del complejo mayor de histocompatibilidad Ia (mhc1a), aumentando la expresión del mismo y mejorando la inmunocompetencia del animal. Como se aprecia, destaca la carencia de ensayos epigenéticos sobre las problemáticas troncales al cultivo de esta especie, que han sido abordadas desde otros puntos de vista que las han solucionado parcialmente. El futuro de la producción acuícola del lenguado senegalés pasa por la reorientación de las investigaciones hacia las bases moleculares de la plasticidad fenotípica, en las cuales la epigenética ocupa el lugar por excelencia.

Epigenetics is the study of changes in gene expression that cannot be explained by direct modifications in the DNA sequence and whose molecular basis is cytosine methylation and histone modification. Epigenetic regulation is a powerful discovery that allows a rational explanation to the phenomenon of phenotypic plasticity, that is, to the fact that certain environmental stimuli can alter the phenotype of an animal, generating an adaptive response without its genome being modified. Senegalese sole (Solea senegalensis) is a species that has established itself strongly in the diversification of the fish product market, thanks to its generally good adaptation to captivity and its relatively simple zootechnical management. However, there are weaknesses that notably delay the growth of its productivity, such as the reproductive dysfunction of individuals born in captivity or the high incidence of infectious diseases with high mortality. In this review, it is proposed that a greater understanding of the epigenetic regulation of the senegalese sole may help to resolve these problems. Therefore, the main objective of the work is to collect and integrate the information available in this field and apply it to the cultivation of the species. In summary, the main advances have been obtained in 3 areas. The first of these is the muscle development of sole, of which it has been shown that the myogenin locus (myog), involved in the differentiation of myoblasts, is regulated by the methylation levels of its proximal promoter, which increase with temperature. With regard to sex determination, the results suggest that in senegalese sole gonadal differentiation depends on the culture temperature during the early stages of larval development, which induces methylation in the gonadal aromatase gene (cyp19a1a) and skews the sexual ratio towards males. Finally, it has been shown that early stimulation to stress, by way of training, alters the methylation of the major histocompatibility complex Ia (mhc1a), increasing its expression and improving the animal's immunocompetence. As can be seen, the lack of epigenetic studies on the main problems of the cultivation of this species stands out, which have been approached from other points of view that have partially solved them. The future of aquaculture production of senegalese sole depends on the reorientation of research towards the molecular bases of phenotypic plasticity, in which epigenetics occupies the place par excellence. La epigenética es el estudio de los cambios en la expresión génica que no pueden ser explicados por modificaciones directas en la secuencia del ADN y cuya base molecular es la metilación de citosinas y la modificación de la histonas. La regulación epigenética es un potente descubrimiento que permite dar una explicación racional al fenómeno de la plasticidad fenotípica, es decir, al hecho de que ciertos estímulos ambientales puedan alterar el fenotipo de un animal, generando una respuesta adaptativa, sin que su genoma se vea modificado. El lenguado senegalés (Solea senegalensis) es una especie que se ha establecido con fuerza en la diversificación del mercado de productos piscícolas, gracias su buena adaptación en general al cautiverio y su relativamente sencillo manejo zootecnico. Sin embargo, existen puntos débiles que retrasan notablemente el crecimiento de su productividad, como son la incapacidad reproductiva de los individuos nacidos en cautiverio o la alta incidencia de patologías infecciosas de alta mortalidad. En la presente revisión bibliográfica, se propone que una mayor comprensión de la regulación epigenética del lenguado senegalés puede ayudar a la resolución de estas problemáticas. Por lo tanto, el objetivo principal del trabajo es el de recopilar e integrar la información disponible en este campo y aplicarla al cultivo de la especie. En síntesis, los principales avances se han obtenido en 3 áreas. La primera de ellas es el desarrollo muscular del lenguado, del cual se ha comprobado que el locus miogenina (myog), implicado en la diferenciación de los mioblastos, está regulado por los niveles de metilación de su promotor proximal, que aumentan con la temperatura. Con respecto a la determinación del sexo, los resultados apuntan a que en el lenguado senegalés la diferenciación gonadal depende de la temperatura de cultivo durante las primeras etapas del desarrollo larvario, la cual induce metilación en el gen aromatasa gonadal (cyp19a1a) y sesga el ratio sexual hacia los machos. Por último, se ha evidenciado que la estimulación temprana al estrés, a modo de entrenamiento, altera la metilación del complejo mayor de histocompatibilidad Ia (mhc1a), aumentando la expresión del mismo y mejorando la inmunocompetencia del animal. Como se aprecia, destaca la carencia de ensayos epigenéticos sobre las problemáticas troncales al cultivo de esta especie, que han sido abordadas desde otros puntos de vista que las han solucionado parcialmente. El futuro de la producción acuícola del lenguado senegalés pasa por la reorientación de las investigaciones hacia las bases moleculares de la plasticidad fenotípica, en las cuales la epigenética ocupa el lugar por excelencia.

The present study evaluated the effects of maternal undernutrition induced by a lower natural pasture allowance during gestation on the histological characteristics of fetal, neonatal and adult Semitendinosus ovine muscle. Two experiments were carried out.In experiment 1, ewes were assigned to two nutritional treatments from 23 days before conception until day 123 of gestation: High pasture allowance (HPA) ewes grazed on natural grasslands at 10-12 kg dry matter (DM)/100 kg of live weight (LW)/day, while low pasture allowance (LPA) ewes grazed at 5-8 kg DM /100 kg of LW/day. In experiment 2, ewes were assigned to two natural pasture allowances between days 30 and 143 of gestation: HPA ewes grazed on 14-20 kg of DM/100kg of LW/day; while LPA ewes grazed on 6?10 kg of DM/100 kg of LW/day.In experiment 1, samples were taken from 70-day old fetuses and newborn lambs to evaluate muscle histology, while in experiment 2 samples were taken from 200-day old heavy-lambs which were equally ad libitum fed from lambing until slaughtering. Maternal undernutrition reduced the number of secondary fibers and the number of nuclei/ fasciculi in fetal muscles. Maternal undernutrition reduced the mean fiber diameter and the number of nuclei per fiber and increased the proportion of non-muscle tissue in newborn lambs. Furthermore, maternal undernutrition reduced the weight and increased the proportion of oxidative fibers in the Semitendinosus of heavy-lambs. Our results suggest that a lower maternal pasture allowance during gestation affects myogenesis with possible future effects over meatproducing performance.

La búsqueda y validación de agentes terapéuticos está viviendo en la actualidad una época dorada. Las posibilidades que ofrece la nueva Biomedicina, conjugando técnicas de Biología Molecular, Biología Celular, Ingeniería Genética y Señalización Celular, hacen que las bases moleculares de la acción de numerosos agentes terapéuticos pueda ser elucidada de una manera inequívoca. Las etapas que conducen a la aprobación de un agente terapéutico como medicamento son largas y muy costosas, lo que hace que en definitiva sólo puedan ser abordados por la industria farmacéutica unos pocos de ellos. No obstante, las etapas iniciales de búsqueda y validación de dianas moleculares para el desarrollo de medicamentos y los primeros pasos de selección de candidatos sí se encuentran al alcance de numerosos laboratorios tanto del ámbito académico como del industrial. Aquellos candidatos más prometedores tendrán que seducir, es decir, ser licenciados a una gran empresa farmacéutica para seguir su desarrollo posterior. A este nivel la competencia es feroz ya que muchos son los llamados y pocos los elegidos. Dentro de las áreas de interés de la industria y el mercado farmacéutico, aquellas enfermedades asociadas con el envejecimiento y deterioro en general de la población occidental desarrollada ocupan una posición prioritaria dado el número de posibles pacientes y su poder adquisitivo. Así, patologías asociadas al tándem obesidad‐diabetes tipo 2, sarcopenia y pérdida de masa muscular asociada a la enfermedad, envejecimiento o sedentarismo, y neurodegeneración debida al propio proceso de envejecimiento, a patologías cardiovasculares o bien a enfermedades específicas como Parkinson o Alzheimer son uno de los principales focos de atención de la industria farmacéutica en la actualidad. Todas estas enfermedades tienen además un condicionante único que es el desarrollo de la patología a muy largo plazo, decenas de años al menos, por lo que tratamientos preventivos e incluso el desarrollo de alimentos funcionales que conduzcan al retraso de la aparición de los síntomas son uno de los objetivos más buscados. Además, si alguno de los candidatos tiene un efecto global en el conjunto de todas estas patologías ocupará una posición prevalente para su desarrollo ya que se trata normalmente de patologías multiasociadas en los pacientes. El estudio de las vías intracelulares de señalización (cell signalling) es esencial hoy día tanto para la búsqueda de dianas moleculares como para el diseño de agentes terapéuticos. La existencia de anticuerpos comerciales frente a las quinasas clave de las cascadas de señalización en su forma fosforilada o no, así como la existencia de sistemas de genes reporteros para cada uno de los factores de transcripción implicados en la señalización celular ha hecho que haya revivido este campo de investigación en el desarrollo de medicamentos., Tesis Univ. Granada. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II

En la presente Tesis Doctoral se muestra el estudio de la proteína Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) en el linaje miogénico durante el desarrollo y en la edad adulta. El gen ANKK1 ha sido ampliamente relacionado con trastornos neuropsiquiátricos y endofenotipos dopaminérgicos en el cerebro. Sin embargo, la función de su proteína es todavía desconocida. La localización del gen ANKK1 en un clúster genómico conservado a lo largo de la evolución que podría estar implicado en neurogénesis, y la expresión de su proteína en progenitores neurales y su relación con el ciclo celular, han relacionado este gen con el neurodesarrollo. ANKK1 pertenece a la familia Receptor-Interacting Proteins (RIP), cuyos miembros participan en la diferenciación de diversos tejidos, incluyendo el muscular. La observación de ANKK1 en miotúbulos embrionarios murinos nos llevó a plantearnos la hipótesis de la posible participación de esta proteína en el origen, el desarrollo y la regeneración muscular. Nuestros resultados muestran que ANKK1 es una proteína que participa en la biología muscular. Se localiza en precursores miogénicos durante el desarrollo embrionario murino y en las células satélite del músculo adulto. Además, los estudios in vitro utilizando mioblastos murinos y humanos muestran un patrón específico de la dinámica de sus isoformas: las isoformas ANKK1 quinasa (ANKK1-k) y ANKK1 completa (ANKK1-fl) se expresan en mioblastos y células satélite (SCs) quiescentes, mientras que sólo ANKK1-fl está presente en miotúbulos y SCs activadas. El transporte núcleo-citoplasmático de ANKK1 en mioblastos durante la diferenciación temprana se bloquea mediante la adición de leptomicina B, lo que indica que su salida del núcleo está mediada por exportinas. En el músculo adulto ANKK1 se expresa en las fibras de contracción rápida tipo II de metabolismo glicolítico. La activación de la vía glicolítica en mioblastos murinos incrementa la expresión de Ankk1. Todo ello confirma la relación entre la expresión de ANKK1 y el metabolismo glicolítico y explica la localización específica de la proteína en fibras musculares de contracción rápida. También se ha investigado la localización de ANKK1 en músculos de pacientes con diferentes distrofias musculares. Los mioblastos de pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) presentan una expresión alterada de ANKK1. La disminución de ANKK1 nuclear en estos mioblastos se asocia con un estadio celular más indiferenciado, definido por el incremento de expresión de PAX7. Paralelamente, en biopsias procedentes de pacientes con diferentes distrofias musculares, la expresión de ANKK1 se asocia con poblaciones celulares regenerativas, es decir, SCs y fibras regenerativas. En cuanto al estudio de su función, se ha investigado la participación de ANKK1 en el ciclo celular. La sobreexpresión de las variantes polimórficas de ANKK1 (A1-A2) en células HeLa incrementa la velocidad de progresión del ciclo celular, mientras que la sobreexpresión de la isoforma catalíticamente inactiva (K51R) la disminuye. En todos los casos, el porcentaje de células que alcanza la mitosis está reducido. Todo esto indica que la expresión de ANKK1 afecta tanto a la progresión del ciclo celular como al número de células que completan el ciclo. Finalmente, hemos estudiado la actividad quinasa de ANKK1. En las condiciones estudiadas, no se ha detectado esta actividad in vitro. Sin embargo, dado que es una RIP quinasa y su dominio quinasa es homólogo al resto de los miembros de la familia RIP, no podemos descartar que ANKK1 presente dicha actividad. En resumen, este Tesis Doctoral muestra por primera vez la participación de la proteína ANKK1 en la biología muscular desde el desarrollo embrionario hasta el músculo del adulto. Sin duda, ANKK1 es una proteína candidata a ser estudiada como biomarcador de enfermedad muscular., The present Doctoral Thesis shows the study of the Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) protein in the myogenic lineage during development and in adulthood. The ANKK1 gene has been widely related to neuropsychiatric disorders and dopaminergic endophenotypes in the brain. However, the function of its protein is still unknown. The location of ANKK1 gene in a genomic cluster conserved throughout the evolution thay may be involved in neurogenesis, and the expression of its protein in neural progenitors and its relationship with the cell cycle, have linked ANKK1 gene to neurodevelopment. ANKK1 belongs to the Receptor-Interacting Proteins family (RIP), whose members participate in the differentiation of several tissues, including muscle tissue. The finding of the location of ANKK1 in murine embryonic myotubes led us to consider the hypothesis of the possible participation of this protein in muscles origin, development and regeneration. Our results show that ANKK1 is a protein that participates in muscle biology. It is located in myogenic precursors during murine embryonic development and in adult muscle satellite cells. In addition, in vitro studies using murine and human myoblasts show a specific pattern of the dynamics of its isoforms: the isoforms ANKK1 kinase (ANKK1-k) and ANKK1 full-length (ANKK1-fl) are expressed in myoblasts and quiescent satellite cells (SCs), whereas only ANKK1-fl is present in myotubes and activated SCs. The nuclear-cytoplasmic shuttle of ANKK1 in myoblasts during early differentiation is blocked by the addition of leptomycin B, which indicates that its exit from the nucleus is mediated by exportins. In the adult muscle ANKK1 is expressed in the Fast-Twitch muscle fibers type II with glycolytic metabolism. The activation of the glycolytic pathway in murine myoblasts increases Ankk1 expression. All this confirms the relationship between the expression of ANKK1 and the glycolytic metabolism and explains the specific location of the protein in Fast-twitch muscle fibers. The location of ANKK1 in the muscles of patients with different muscular dystrophies has also been investigated. The myoblasts of patients with Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) present an altered expression of ANKK1. The decrease in nuclear ANKK1 in these myoblasts is associated with a more undifferentiated cell stage, defined by the increase in the expression of PAX7. In parallel, in biopsies from patients with different muscular dystrophies, the expression of ANKK1 is associated with regenerative cell populations, that is to say, SCs and regenerating fibers. Regarding the study of its function, we have investigated the participation of ANKK1 in the cell cycle. The overexpression of the polymorphic variants of ANKK1 (A1-A2) in HeLa cells increases the rate of progression of the cell cycle, while overexpression of the catalytically inactive isoform (K51R) decreases it. In all cases, the percentage of cells that reach mitosis is reduced. All this indicates that the expression of ANKK1 affects both the progression of the cell cycle and the number of cells that complete the cycle. Finally, we have studied the kinase activity of ANKK1. Under the conditions studied, this activity has not been detected in vitro. However, given that it is a RIP kinase and its kinase domain is homologous to the rest of the members of the RIP family, we cannot rule out that ANKK1 does not present this activity. In summary, this Doctoral Thesis shows for the first time the participation of the ANKK1 protein in muscle biology from embryonic development to adult muscle. Thus, we propose ANKK1 as a candidate protein to be studied as a biomarker of muscular disease., En la present tesi doctoral es mostra l'estudi de la proteïna Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) en el llinatge miogènic durant el desenvolupament i en l'edat adulta. El gen ANKK1 ha estat àmpliament relacionat amb trastorns neuropsiquiàtrics i endofenotips dopaminèrgics en el cervell. No obstant això, la funció de la seua proteïna és encara desconeguda. La localització del gen ANKK1 en un clúster genòmic conservat al llarg de l'evolució que podria estar implicat en neurogènesi, i l'expressió de la seua proteïna en progenitors neurals i la seua relació amb el cicle cel¿lular, han relacionat aquest gen amb el neurodesenvolupament. ANKK1 pertany a la família Receptor-interacting Proteins (RIP), els membres de la qual participen en la diferenciació de diversos teixits incloent el muscular. L'observació d'ANKK1 en miotúbuls embrionaris murins ens va portar a plantejar-nos la hipòtesi de la possible participació d'aquesta proteïna en l'origen, el desenvolupament i la regeneració muscular. Els nostres resultats mostren que ANKK1 és una proteïna que participa en la biologia muscular. Es localitza en precursors miogènics durant el desenvolupament embrionari murí i en les cèl¿lules satèl¿lit del múscul adult. A més, els estudis in vitro utilitzant mioblasts murins i humans mostren un patró específic de la dinàmica de les seues isoformes: les isoformes ANKK1 quinasa (ANKK1-k) i ANKK1 completa (ANKK1-fl) s'expressen en mioblasts i cèl¿lules satèl¿lit (SCs) quiescents, mentre que només ANKK1-fl està present en miotúbuls i SCs activades. El transport nucli-citoplasmàtic d'ANKK1 a mioblasts durant la diferenciació primerenca es bloqueja mitjançant l'addició de leptomicina B, el que indica que la seua eixida del nucli està mediada per exportines. En el múscul adult ANKK1 s'expressa en les fibres de contracció ràpida tipus II de metabolisme glicolític. L'activació de la via glicolítica en mioblasts murins incrementa l'expressió d'Ankk1. Tot això confirma la relació entre l'expressió d'ANKK1 i el metabolisme glicolític i explica la localització específica de la proteïna en fibres musculars de contracció ràpida. També s'ha investigat la localització d'ANKK1 en músculs de pacients amb diferents distròfies musculars. Els mioblasts de pacients amb distròfia muscular de Duchenne (DMD) presenten una expressió alterada d'ANKK1. La disminució d'ANKK1 nuclear en aquests mioblasts s'associa amb un estadi cel¿lular més indiferenciat, definit per l'increment d'expressió de PAX7. Paral¿lelament, en biòpsies procedents de pacients amb diferents distròfies musculars, l'expressió d'ANKK1 s'associa amb poblacions cel¿lulars regeneratives, és a dir, SCs i fibres regeneratives. En quant a l'estudi de la seua funció, s'ha investigat la participació d'ANKK1 en el cicle cel¿lular. La sobreexpressió de les variants polimòrfiques d'ANKK1 (A1-A2) en cèl¿lules HeLa incrementa la velocitat de progressió del cicle cel¿lular, mentre que la sobreexpressió de la isoforma catalíticament inactiva (K51R) la disminueix. En tots els casos, el percentatge de cèl¿lules que arriba a la mitosi està reduït. Tot això indica que l'expressió d'ANKK1 afecta tant la progressió del cicle cel¿lular com al nombre de cèl¿lules que completen el cicle. Finalment, hem estudiat l'activitat quinasa d'ANKK1. En les condicions estudiades, no s'ha detectat aquesta activitat in vitro. No obstant això, atès que és una RIP quinasa i el seu domini quinasa és homòleg a la resta dels membres de la família RIP, no podem descartar que ANKK1 presente aquesta activitat. En resum, aquesta tesi doctoral mostra per primera vegada la participació de la proteïna ANKK1 en la biologia muscular des del desenvolupament embrionari fins al múscul de l'adult. Sens dubte, ANKK1 és una proteïna candidata a ser estudiada com a biomarcador de malaltia muscular.

[eng] HDAC11 is the newest member of the histone deacetylase (HDAC) family and one of the less studied. Its expression was described to be enriched in skeletal muscle tissues from the first moment of its discovery, yet now after 15 years, its roles in myogenesis remain unknown. We started this thesis by analyzing the expression changes of all HDAC’s’ members between proliferation and early differentiation conditions, which constitutes a crucial cell fate point in which cells have to decide whether to continue proliferating or enter to irreversible G0 arrest state to differentiate. With this analysis, we found HDAC11 as the HDAC family member the most upregulated in the skeletal muscle differentiation process. By CRISPR/Cas9 knock-in tagging of endogenous HDAC11, we show that HDAC11 protein levels are absent in proliferating cells and increased through differentiation. The silencing of HDAC11 in proliferation conditions is mediated, at least in part, by class I HDAC’s deacetylation of MYOD. In differentiation conditions, acetylated MYOD and myogenin, the two master regulators of muscle differentiation, bind to HDAC11 promoter regions and trigger its expression. HDAC11 deficient myoblasts did not present major alterations in cell proliferation or differentiation capacities but show reduced fusion ability. Genome-wide transcriptomic analysis of differentiating HDAC11 deficient myoblasts revealed an upregulation of genes involved in proliferation and a decreased expression of genes involved in muscle contraction, suggesting a delayed entry in G0 irreversible arrest state. Our ChIP results suggest that HDAC11 would mediate repression of proliferation related genes by deacetylation of H3 in their promoter regions. Moreover, HDAC11 expression is also highly expressed in additional G0 states, like in reversible arrested quiescent satellite cells. In skeletal muscle tissues, HDAC11 is higher expressed in fast muscles than slow ones, especially in males. The analysis of HDAC11 deficient mice concludes that HDAC11 absence do not cause major alterations in muscle development, adult myofiber growth or fiber type composition in basal conditions. In regeneration conditions, HDAC11 deficient mice show advanced regeneration capacity at 7 days post injury, probably mediated at least in part, by an increased expression of Il-10 by HDAC11 deficient macrophages. Finally, we show that HDAC11 upregulation through differentiation is conserved in human myoblast and its expression is reduced in rhabdomyosarcoma cells, which present impaired differentiation capabilities. Altogether, our results place HDAC11 as a new epigenetic regulator in in vitro an in vivo myogenesis., [cat] HDAC11 és el membre més recentment descobert de la família de deacetilases d'histones (HDAC) i un dels menys estudiats. En el moment del seu descobriment es va veure que estava altament expressada en teixits de múscul esquelètic encara que després de 15 anys, les seves funcions en la miogènesi resten encara desconegudes. Vam començar aquesta tesi analitzant els canvis d'expressió de tots els membres de la família HDAC entre les condicions de proliferació i diferenciació primerenca, un moment crucial on les cèl·lules han de decidir si continuen dividint-se o entren en l'estat d'aturada irreversible G0 per diferenciar-se. Amb aquesta anàlisi vam trobar HDAC11 com el membre de la família HDAC que augmentava més la seva expressió en aquest procés. Amb la tècnica d'enginyeria genètica CRISPR/Cas9 vam aconseguir inserir un epítop en el locus genòmic de HDAC11, que ens permeté demostrar que la proteïna HDAC11 està absent en condicions de proliferació i augmenta amb la diferenciació. El silenciament de l'expressió de HDAC11 durant la proliferació està mitjançada, almenys en part, per la deacetilació de MYOD per part de la classe I de HDACs. Durant la diferenciació, MYOD acetilat i miogenina, els dos reguladors responsables d’iniciar la diferenciació muscular, s'uneixen al promotor de HDAC11 i activen la seva expressió. Els mioblasts deficients en HDAC11 no presenten greus alteracions en la proliferació cel·lular o en la seva capacitat de diferenciar-se però mostren una reduïda capacitat de fusió. L'estudi transcriptòmic a escala global de mioblasts deficients en HDAC11 va revelar una sobreexpressió de gens involucrats en la proliferació cel·lular i una reducció en l'expressió de gens amb funcions en la contracció muscular, suggerint una entrada més tardana en la fase G0 d'aturada irreversible. Els nostres resultats de ChIP suggereixen que HDAC11 podria intervindre en la repressió dels gens involucrats en la proliferació cel·lular mitjançant la deacetilació de les histones H3 dels seus promotors. A més, l'expressió d'HDAC11 també és alta en estats addicionals de G0 com l'arrest reversible de les cèl·lules satèl·lit quiescents. En teixits de múscul esquelètic, HDAC11 està més expressada en músculs ràpids que lents, especialment en mascles. L'anàlisi de ratolins deficients en HDAC11 conclogué que l'absència de HDAC11 no causa greus alteracions en el desenvolupament muscular, el creixement de miofibres adultes o en la composició en tipus de fibres en condicions basals. Durant la regeneració muscular, els ratolins deficients en HDAC11 mostren un avanç en la seva capacitat de regeneració 7 dies després de la lesió, probablement mitjançat en part per un increment en l’expressió de Il-10 per part dels macròfags deficients en HDAC11. Finalment, mostrem que l’augment d’expressió de HDAC11 està conservat en la diferenciació de mioblasts humans i que la seva expressió està reduïda en rabdomiosarcoma, patologia tumoral que presenta un impediment en la diferenciació muscular. En conjunt, els nostres resultats situen HDAC11 com un nou regulador epigenètic en la miogènesi in vitro i in vivo.

Fundamento. Incrementar el potencial miogénico en situaciones lesivas que afectan al músculo esquelético es de gran importancia clínica. Un buen modelo para estudiar el comportamiento de las células implicadas en los fenómenos proplásicos del músculo consiste en modificar el microambiente tisular in vivo, mediante la administración de extractos tisulares. Objetivos. Los objetivos de este estudio se han dirigido, por un lado, a determinar el efecto de diferentes extractos musculares sobre dos tipos de músculo normales, rojo y blanco, y su población de células satélites; de otro, determinar si un extracto de músculo denervado (ExMd) podría estimular la respuesta de las células satélites en músculo denervado. Material y métodos. Utilizamos ratas Wistar que fueron divididas en un grupo control y cuatro experimentales. Cada grupo experimental fue tratado intraperitonealmente durante 10 días consecutivos con un extracto diferente. Estos extractos se obtuvieron a partir de músculo sóleo normal, músculo sóleo denervado, músculo extensor digitorum longus normal y músculo extensor digitorum longus denervado. Se obtuvieron los músculos sóleo y EDL para su estudio en microscopia óptica y microscopia electrónica de transmisión; asimismo se analizaron parámetros morfométricos y se evaluó la respuesta miogénica. Para determinar si ExMd estimula a las células satélites en músculo denervado, ratas normales y denervadas fueron tratadas con ExMd. Los músculos sóleo fueron examinados empleando técnicas inmunohistoquímicas para antígeno de proliferación nuclear (PCNA), desmina y antígeno de diferenciación miogénica MyoD y el análisis cuantitativo y morfométrico de las células satélites en microscopía electrónica. Resultados. Los resultados mostraron que el tratamiento con extractos de músculo sóleo normal y de músculo sóleo denervado provocaron hipertrofia y aumento de la actividad miogénica. Por el contrario, el tratamiento con extractos de músculos extensor digitorum longus normal y denervado tuvieron un efecto diferente dependiendo del músculo analizado. Así en el músculo sóleo se produjo hipertrofia de las fibras tipo I y aumento de la actividad miogénica, mientras que en el músculo extensor digitorum longus se observó atrofia de las fibras tipo II sin cambios en la actividad miogénica. Mientras la denervación provoca la activación de células satélites, DmEx también induce la diferenciación miogénica de células localizadas en el espacio intersticial y la formación de nuevas fibras musculares. Aunque DmEx tuvo un efecto similar sobre músculos inervados como denervados, se observaron diferencias cuantitativas que indican una mayor respuesta del músculo denervado a la acción de este tipo de extracto. Conclusiones. Esto sugiere que la respuesta muscular de atrofia e hipertrofia puede depender de factores diferentes para cada tipo de músculo lo cuales pueden estar en relación con la inervación. Además, nuestro estudio muestra que el tratamiento de ratas denervadas con DmEx potencia la respuesta miogénica en los músculos denervados atróficos. Basis. Enhancement the myogenic potential in injurious situations affecting skeletal muscle is of great clinical interest. A good model to study the cells behavior involved in proplastic muscle phenomena is to modify the tissue microenvironment in vivo, through the administration of tissue extracts. Objectives. The objectives of this study were, on the one hand, to determine the effect of different muscle extracts on two types of normal muscle, red and white, and its population of satellite cells; on the other hand, to determine whether a denervated muscle extract (DmEx) could stimulate satellite cell response in denervated muscle. Material and methods. Wistar rats were used and were divided into a control group and four experimental groups. Each experimental group was treated intraperitoneally during 10 consecutive days with a different extract. These extracts were obtained from normal soleus muscle, denervated soleus, normal extensor digitorum longus, and denervated extensor digitorum longus. Following treatment, the soleus and extensor digitorum longus muscles were obtained for study under optic and transmission electron microscope; morphometric parameters and myogenic responses were also analyzed. To determine whether DmEx stimulates the satellite cells in denervated muscle, normal rats and denervated rats treated with DmEx. The soleus muscles were examined using immunohistochemical techniques for proliferating cell nuclear antigen (PCNA), desmin and myogenic differentiation antigen (MyoD), and electron microscopy for analysis of the satellite cells. Results. The results demonstrated that the treatment with normal soleus muscle and denervated soleus muscle extracts provoked hypertrophy and increased myogenic activity. In contrast, treatment with extracts from the normal and denervated EDL had a different effect depending on the muscle analyzed. In the soleus muscle, it provoked hypertrophy of type I fibers and increased myogenic activity, while in the extensor digitorum longus atrophy of the type II fibers was observed without changes in myogenic activity. While denervation causes activation of satellite cells, DmEx also induces myogenic differentiation of cells localized in the interstitial space and the formation of new muscle fibers. Although DmEx had a similar effect, in nature, on innervated and denervated muscles, this response was of greater magnitude in denervated vs. intact muscles. Conclusions. This suggests that the muscular responses of atrophy and hypertrophy may depend on different factors related to the muscle type which could be related to innervation. Further our study shows that treatment of denervated rats with DmEx potentiates the myogenic response in atrophic denervated muscles.

[cat] Partint de la hipòtesi que la metilació de l’ADN, junt amb altres mecanismes epigenètics i els factors de transcripció, orquestra el programa transcripcional, aquesta tesi ofereix un estudi exhaustiu de les dinàmiques de l'ADN durant la progressió miogènica, aborda les seves possibles implicacions reguladores i identifica regions diferencialment metilades que defineixen la identitat de la cèl·lula muscular. L’anàlisi a escala genòmica els perfils de metilació en diferents estadis de la miogènesi va permetre identificar 1000 regions diferencialment metilades, localitzades principalment en regions intergèniques i intragèniques. La majoria de canvis observats eren guanys de metilació i ocorrien durant la determinació de llinatge. D’altra banda, certes regions amb perfils de cromatina associats a enhancers esdevenien desmetilades, suggerint que la metilació de l’ADN pot estar implicada en la regulació de enhancers específics de teixit. L’estudi de gens específics de múscul va mostrar que la identitat de la cèl·lula muscular requereix la desmetilació de l'ADN de regions reguladores pobres en CpGs, alhora que els gens miogènics amb illes CpG a la regió promotora es troben sempre desmetilats i són regulats per modificacions d’histones. Un exemple de la desmetilació específica de múscul és la regió super-enhancer de Myf5. Els assajos d'immunoprecipitació de la cromatina van demostrar que la unió del factor de transcripció Usf1 al locus Myf5 només es donava quan l’ADN estava desmetilat, reforçant la hipòtesi que la metilació de l'ADN regula l'expressió gènica mitjançant la modulació de l'accessibilitat dels factors de transcripció al seu lloc d’unió. Mitjançant l’estudi el perfil de metilació de l'ADN de gens miogènics en un model miogènic derivat de cèl·lules embrionàries, es va observar el mateix perfil observat en mioblasts primaris, indicant que aquest model és una bona estratègia per obtenir mioblasts in vitro amb finalitats terapèutiques. Finalment, el bloqueig de la deaminasa Apobec2 va afectar severament la diferenciació miogènica i la desmetilació de l'ADN del promotor de la Miogenina, indicant que la deaminasa Apobec2 podria estar implicada en la desmetilació activa de l'ADN., [eng] Myogenesis is the differentiation process which encompasses the formation of skeletal muscle during development, regeneration and tissue homeostasis throughout life. Arising from embryonic or adult stem cells, the myogenic process comprehends the acquisition of a specialized cell identity and the loss of pluri/multipotent and proliferative capacities. Starting with the hypothesis that DNA methylation, together with other epigenetic mechanisms and the transcription factors, orchestrates the transcriptional program, this thesis provides a comprehensive picture of DNA methylation dynamics during murine myogenic progression, addresses their regulatory implications, and identifies relevant differentially methylated regions that define muscle cell identity. Initially, we performed a genome-scale DNA methylation study comparing embryonic stem cells (ESCs), primary myoblasts (MBs), differentiated myotubes (MTs), and mature myofibers (MFs) using AIMS-seq method. We identified 1,000 differentially methylated regions during muscle-lineage determination and terminal differentiation, mainly located in gene bodies and intergenic regions. As a whole, muscle lineage commitment was characterized by a major gain of DNA methylation, while muscle differentiation was accompanied by loss of DNA methylation in CpG-poor regions. Notably, hypomethylated sequences were enriched in enhancer-type chromatin regions, suggesting the involvement of DNA methylation in the regulation of cell-type specific enhancers. Importantly, we detected a demethylated region overlapping the super-enhancer of the cell-identity factor Myf5. We showed that the activation of My5 super-enhancer took place upon DNA demethylation exclusively in muscle-committed cells resulting in gene expression. ChIP analyses showed that the binding of the Upstream stimulatory factor 1 (Usf1) to Myf5 locus was DNA demethylation-dependent in myogenic committed cells. Moreover, Usf1 binding site contained an embedded CpG conserved in humans and demethylated in human MBs but not in human ESCs, altogether reinforcing the hypothesis that DNA methylation regulates gene expression by modulating transcription factor binding accessibility. Next, we analyzed by sodium bisulphite sequencing the DNA methylation state of reported regulatory regions (with and without CpG island) of key genes implicated in myogenesis. After analyzing myogenic and non-myogenic cells we concluded that the muscle cell identity comprehends DNA demethylation of lineage-specific CpG-poor regulatory regions leading to a transcriptionally poised or activated state, while myogenic CpG island promoters are totally unmethylated during myogenesis and are regulated by histone modifications. A collaborative work with Charles Keller’s Lab (Oregon Health & Science University, USA) allowed us to conclude that Rhabdomyosarcoma cell lines present a spurious methylation pattern at usually unmethylated CpG islands, consequently with the aberrant methylation associated to tumorigenesis. Furthermore, the study of pluripotency gene promoters during myogenesis pointed that CpG-poor promoters are repressed during differentiation by DNA methylation and by Polycomb complex at CpG island promoters. Interested in deepen in the DNA demethylation dynamics, we started a collaboration with Rita Perlingeiro’s Lab (University of Minnesota, USA) to study the DNA methylation changes in the myogenic inducible Pax7 ESC-derived model. We showed that the ESC-derived myoblast precursors recreated the DNA methylation signature of in vivo isolated muscle stem cells, supporting this model as a bona fide strategy to generate myogenic precursors in vitro with therapeutic purposes. Finally, we addressed the involvement of an active demethylating mechanism during myogenesis. Apobec2 down-regulation in inducible ESC-derived myoblast precursors with shRNA strategies affected dramatically the myogenic differentiation by impairing DNA demethylation of the Myogenin promoter and abolishing the expression of Myogenin and MHC proteins. Based on these results, we proposed that Apobec2 might be involved in the active muscle specific DNA demethylation along myogenesis.

[spa] La acuicultura constituye una de las actividades productivas de mayor desarrollo en las últimas décadas. Entre los peces de origen marino, la dorada (Sparus aurata) es la especie de mayor producción en España y en Europa. Sin embargo, a pesar del interés en la producción, los recursos genómicos para estudiar el impacto de los nutrientes de la dieta en el metabolismo son limitados. Actualmente, el análisis de expresión génica a nivel de mRNA es una de las principales herramientas utilizadas en estudios de genómica funcional. En este sentido, el estudio del transcriptoma mediante tecnologías de pirosecuenciación de última generación y el desarrollo de microarrays, que determinan perfiles de expresión de decenas de miles de genes, representan un avance para los estudios de la funcionalidad génica. El objetivo de esta tesis doctoral fue realizar un análisis transcriptómico del músculo esquelético de dorada con aplicación para estudios nutricionales, e identificar mediante microarrays, genes biomarcadores de la utilización de nutrientes. Cinco grupos de doradas fueron alimentadas durante 23 días con dietas de diferente composición: HPLLLC, MPHLLC, LPLLHC, MPLLHC, LPHLLC (letras mayúsculas representan niveles de nutrientes [High, Medium and Low], letras en superíndice representan el tipo de nutriente [Protein, Lipid and Carbohydrate]). Adicionalmente, durante un periodo similar, un grupo de doradas se mantuvo en ayuno. Se llevaron a cabo dos diseños experimentales: el experimento 1 fue diseñado para estudiar el transcriptoma del músculo esquelético de dorada y el experimento 2 tuvo como finalidad estudiar el aprovechamiento de los nutrientes de la dieta y el efecto de la composición sobre la digestibilidad, ingesta, parámetros somáticos y metabolismo intermediario. El análisis transcriptómico realizado con RNA de músculo esquelético de doradas, permitió obtener 691433 secuencias de alta calidad, correspondientes a 275,9 megabases. 4799 anotaciones fueron asignadas a categorías de ontología génica (GO). El análisis GO mostró que los procesos biológicos más representados correspondieron a oxidación-reducción, ciclo celular y división celular. Las funciones moleculares más abundantes fueron: unión a proteínas, unión a nucleótidos y actividad transferasa. La información transcriptómica se utilizó para analizar, mediante RT-qPCR, el efecto del estado nutricional sobre la expresión de genes relacionados con la cadena de transporte electrónico, fosforilación oxidativa y translocación de ATP al espacio intermembrana. De los genes analizados, la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B y la caja de unión a ATP subfamilia G mostró una fuerte dependencia de la composición de la dieta, incrementando la expresión de dichos genes en peces alimentados con la dieta de menor contenido proteico y mayor contenido de carbohidratos. La información transcriptómica se utilizó, asimismo, para estudiar el efecto del estado nutricional y la composición de la dieta sobre el patrón global de expresión en músculo mediante microarrays. El análisis GO indicó que el ayuno se asocia a expresión diferencial disminuida en genes con funciones moleculares de actividad antioxidante y de unión a proteínas. Al realizar la comparación entre peces alimentados con dietas de diferente composición, se observó que las dietas de alto/medio contenido en proteína y bajo contenido de carbohidratos promovieron un incremento en la expresión de genes implicados en funciones de crecimiento, regulación y organización del citoesqueleto. Adicionalmente, mediante RT-qPCR, se analizó la expresión de genes implicados en procesos como: regulación de la miogénesis, regulación del crecimiento y vía de señalización Akt/TOR. En esta tesis doctoral, podemos concluir que la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B, caja de unión a ATP subfamilia G, GHRs y MyoD2 podrían resultar de utilidad en estudios biotecnológicos encaminados a optimizar la utilización de los nutrientes en las dietas de doradas en cultivo., [eng] The aquaculture production system is the worldwide fastest growing animal food-producing sector. Gilthead seabream (Sparus aurata) is the leading species for aquaculture production in Spain and, among the marine fish, in Europe. Despite the commercial interest in improving aquaculture production, at present the genomic resources to study the impact of dietary nutrients in fish metabolism and growth are limited.Currently, gene expression analysis at mRNA level represents one of the main tools for functional genomic studies. In this sense, the transcriptomic analysis through pyrosequencing reaction with the 454 sequencing platform and the study of changes in the global pattern of gene expression by means of microarrays, represent a huge progress to determine the control of gene expression and their functions.The aim of this PhD thesis was to perform a transcriptomic analysis in skeletal muscle from gilthead seabream fed submitted to different nutritional conditions in order to identify, using microarrays, potential biomarker genes of interest to improve the use of dietary nutrients. To this end, 5 groups of S. aurata were fed for 23 days the following diets: HPLLLC, MPHLLC, LPLLHC, MPLLHC and LPHLLC. The 5 diets differ in the nutrient composition; capital letters represent macronutrient levels (High, Medium or Low), and superscript letters represent macronutrient (Protein, Carbohydrate or Lipid). Additionally, during the same time period, a group of fish was deprived of food. Two experimental procedures were carried out: experiment 1 was designed to determine the transcriptome in skeletal muscle of gilthead seabream; and experiment 2 allowed us to analyze the metabolic effects of the diet composition on the digestibility, food intake, somatic parameters and expression of key genes related to growth and fish intermediary metabolism.Transcriptomic analysis performed with RNA isolated from S. aurata skeletal muscle, yielded 691433 sequences of high quality, that corresponded to 275.9 megabases. 4799 entries were assigned to different categories of Gene Ontology (GO). GO analysis showed that the most represented biological processes corresponded to oxidation-reduction, cell cycle and cell division processes. Among the most abundant molecular functions were found: protein binding, nucleotide binding and those involving transferase activity. Transcriptomic information was used to design specific primers to analyze, by RT-qPCR, the effects of nutritional status on the expression of genes related to the electron transport chain, oxidative phosphorylation and translocation of ATP to the mitochondrial intermembrane space. From the analyzed genes, the expression of cytochrome C oxidase subunit 5B and ATP binding cassette subfamily G showed a strong dependence on the diet composition; the expression of both genes is upregulated in the fish fed low protein/high carbohydrate diets.In addition, transcriptomic data was used to design oligonucleotide microarrays to allow analysis of changes in gene expression profiling in muscle of fish under different nutritional conditions. GO analysis indicated a decreased expression of genes associated with antioxidant activity and protein binding in muscle of starved fish. Feeding with diets of high/medium protein and low carbohydrate content increased the expression of genes involved in growth and the regulation and organization of the cytoskeleton. Furthemore, RT-qPCR was performed to determined the expressional changes of genes involved in regulation of myogenesis, growth and the Akt/TOR signaling pathway.The results presented in this thesis allowed us to conclude that changes in the expression of cytochrome C oxidase subunit 5B, ATP binding cassette subfamily G, growth hormone receptors and MyoD2 could be useful to develop biotechnological studies to optimize the use of dietary nutrients supplied to gilthead seabream in culture.

L’activitat de la plasmina és clau en el procés de regeneració muscular després d’una lesió. Aquesta proteasa d’ampli espectre de substrat afavoreix l’eliminació de fibrina i col∙lagen extracel∙lulars, i indueix la migració de cèl∙lules del sistema inflamatori a l’àrea danyada, però no es coneix si afecta a les cèl∙lules musculars directament. Estudis previs del grup han identificat l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen en els mioblasts murins i han determinat que la generació i focalització de l’activitat proteolítica de la plasmina a través d’alfa‐enolasa a la superfície dels mioblasts és clau pel procés de miogènesi i regeneració muscular. En aquesta tesi, inicialment s’ha determinat la unió del plasminogen i de la plasmina a la superfície dels mioblasts murins C2C12 i dels cultius primaris de MPCs (Muscle Precursor Cells), i s’ha confirmat la implicació de l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen involucrat. Per fer‐ho s’ha generat un anticòs específic per la isoforma alfa‐enolasa que inhibeix la seva unió al plasminogen. Els estudis realitzats amb aquest nou anticòs, anomenat MAb872, no només han confirmat l’alfa‐enolasa com a principal receptor involucrat en la unió del plasminogen als mioblasts sinó que han demostrat que la inhibició de la unió alfa‐enolasa/plasminogen impedeix la diferenciació i fusió miogènica dels mioblasts murins in vitro i in vivo. Seguidament, s’ha observat que la presència de plasmina unida a la membrana dels mioblasts a través d’alfa‐enolasa indueix l’activació de les vies MAPK/Erk i PI3K/Akt de forma depenent de la seva activitat proteasa. L’alfa‐enolasa no posseeix un domini transmembrana i es desconeix com es localitza a la membrana plasmàtica. La manca de domini intracel∙lular de l’alfa‐enolasa, suggereix la participació de receptors col∙laboradors per poder transduir la senyal a l’espai intracel∙lular. Entre diversos receptors candidats analitzats, observem indicis de la participació de les integrines β1/β3 i l’activació de la via MAPK/Erk a través de Src i FAK. A nivell cel∙lular, la unió de la plasmina als mioblasts provoca canvis en la reorganització del citoesquelet d’actina afavorint la desadherència del substrat i induint la migració cel∙lular. Alhora s’ha demostrat que l’activació de la via PI3K/Akt en presència de plasmina incrementa la supervivència dels mioblasts en situacions d’estrès cel∙lular. Per altra banda, seguint indicis previs del grup que suggerien la participació de EGFR en el procés miogènic, s’ha analitzat l’expressió de EGFR en el múscul esquelètic d’animals wt i animals distròfics mdx, així com durant el procés de regeneració in vivo i el procés de miogènesi in vitro. Els resultats obtinguts mostren una molt baixa expressió i activació de EGFR en el múscul esquelètic adult i un notable increment després d’una lesió muscular o en un múscul adult distròfic. L’anàlisi in vitro ha permès determinar la participació de EGFR en la proliferació i supervivència dels mioblasts i la pèrdua de l’expressió d’aquest receptor a l’inici del procés miogènic. També s’ha observat que la inhibició de l’activitat tirosina quinasa de EGFR estimula la fusió miogènica obtenint més fibres musculars i de major tamany. Aquests resultats suggereixen la inhibició de EGFR com a possible diana terapèutica per estimular els processos miogènics en situacions patològiques, com és el cas de la distròfia muscular de Duchenne. Estudis preliminars de l’administració de AG1478, inhibidor de l’activitat tirosina quinasa de EGFR, en animals mdx indiquen que AG1478 podria millorar el fenotip distròfic d’aquests animals., Plasmin activity is necessary for muscle regeneration process after an injury. This broad‐spectrum protease is the major enzyme responsible for the dissolution of fibrin and most of the components of ECM and it also promote and lead the migration of inflammatory cells to injured area. However, it is unknown if it plays also a role in muscle cells directly. Pervious results of the group identified alpha‐enolase as the major plasminogen receptor in murine myoblast. Our group also described alphaenolase dependent generation and focalization of plasmin on the myoblasts surface as an essential event in myogenesis and muscle regeneration process. Firstly, in this thesis we have analyzed the capacity of murine myoblast (C2C12 and primary culture of Muscle Precursor Cells or MPCs) to bind plasminogen and plasmin in an alpha‐enolase dependent way, as well the participation of alpha‐enolase in myogenic process. In order to address this question we generated a monoclonal antibody (MAb872) that inhibits plasminogen binding to alpha‐enolase. The results using this antibody corroborate the role of alpha‐enolase as a major plasminogen receptor in myoblast and confirm the impairment of satellite‐cells‐derived myoblast differentiation and fusion in vitro and in vivo, when alpha‐enolase/plasminogen interaction is abrogated. We further observed plasmin binding to alpha‐enolase induces MAPK/Erk and PI3K/Akt pathways in a plasmin activity dependent way. It is unknown how alphaenolase reaches the membrane as it lacks transmembrane domain. Moreover, the absence of intracellular domain suggests that alpha‐enolase collaborates with other receptors to transduce plasmin‐dependent signaling. Among several receptors, we have identified the participation of integrins β1/β3 in the plasmin‐induced MAPK/Erk signaling upstream Src and FAK in myoblasts. The cellular effect of plasmin binding to alpha‐enolase is the reorganization of actin filaments promoting cellular migration. Moreover plasmin activation of PI3K protects murine myoblast from apoptosis in stress conditions suggesting a protective role of this protease. Other previous results in our group suggested the participation of EGFR in myogenic process as well. To address this hypothesis we have analyzed the expression of EGFR in skeletal muscle from wt mice, dystrophic mdx mice and in cardiotoxininjured mice, as well as during myogenesis in vitro. Our results show a reduced basal expression and activation of EGFR in adult non‐injured muscle but high levels of active EGFR in injured and dystrophic muscle. In vitro analysis has revealed that EGFR participates in proliferation and surviving of non‐diferentiated myoblasts and the inhibition and downregulation of EGFR at the beginning of differentiation process. Moreover, EGFR inhibition with AG1478 induces myoblasts differentiation and fusion generating bigger muscle fibers. These results point the inhibition of EGFR as a therapeutic tool in deficient myogenic process as in dystrophic muscles. Preliminary work administrating AG1478 in mdx mice suggest a possible therapeutic effect of this EGFR inhibitor.

Introducción: Las células madre son motivo de intensa investigación debido a la posibilidad de su utilización en el tratamiento de numerosas enfermedades, en particular las cardiovasculares. La diferenciación de células madre embrionarias humanas en cardiomiocitos se ha realizado exitosamente in vitro. Se han establecido métodos de cultivo y diferenciación, señales involucradas en la cardiogénesis y los cardiomiocitos generados se han utilizado en modelos de regeneración miocárdica. Sin embargo, aún quedan muchos interrogantes que se están investigando activamente. Objetivo Desarrollar una metodología que permita el cultivo de células embrionarias y su diferenciación en cardiomiocitos. Material y métodos Se utilizaron cuatro líneas de células madre embrionarias humanas. Se cultivaron y diferenciaron a través de los métodos publicados previamente en la bibliografía. El estado indiferenciado y la diferenciación en cardiomiocitos se verificaron por medio de inmunomarcación fluorescente y RT-PCR. Resultados La metodología utilizada permitió cultivar las células y mantenerlas en estado indiferenciado. Aunque con eficacia dispar, se logró la diferenciación en cardiomiocitos de las cuatro líneas celulares utilizadas. La confirmación se realizó por medio de la expresión de factores de transcripción miocárdicos y proteínas estructurales cardíacas. Conclusiones El cultivo y la diferenciación de células madre embrionarias humanas fue posible en nuestro sistema. Estos resultados preliminares nos impulsan a continuar y a desarrollar nuestros métodos con células pluripotentes inducidas. Fil: Scassa, Maria Elida. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina Fil: Fernandez Espinosa, Damian Dario. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina Fil: Questa, María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina Fil: Videla Richardson, Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina Fil: Losino, Noelia Ivana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina Fil: Luzzani, Carlos Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina Fil: Guberman, Alejandra Sonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina Fil: Grancelli, Hugo. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina. Sociedad Argentina de Cardiología; Argentina Fil: Sevlever, Gustavo. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina Fil: Miriuka, Santiago Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina. Sociedad Argentina de Cardiología; Argentina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Meat production capacity is related to muscle fibers number show in newborn animals. The muscle fibers are formed in the myogenesis that takes place during the embryonic development, an event that is controlled in part by the MyoD gene family. The Myogenin gene is a member of this family and rules the expression of muscle specific genes. It has an important because when it is activated, the cells from the muscle tissue stop to multiply and it will be growing only in volume. It is considered than a candidate gene. The objectives of this study were to verify possible alterations in the nucleotide sequences of the Myogenin gene in swine from divergent breeds, and compare the sequence obtained in swine with others species that have this data in the Genbank, to study the evolutionary story of the gene in these species. The strategy used was to divide the gene in seven fragments that contain the three exons, two introns and the 3 and 5 regions of the gene. Two boars of the native breed Piau and 12 commercial sows were sequenciated. The results showed a highly conserved gene, with no polymorphism in the exons regions. The introns sequencing did not shown satisfactory results. Phylogenetic evaluation methods also prove the conservatory state of the gene. It was compared sequences from the species Sus scrofa (swine), Bos Taurus (cows), Ovis aries (sheeps), Homo sapiens (humans), Mus musculus (mice), Rattus norvegicus (rats), Gallus gallus (chickens) and Meleagris gallopavo (turkeys), verifying the nonsynonymous nucleotide substitution rate by the synonymous substitution rate in the sites. The results point out that probably the gene suffered an adaptive evolution in the Ruminantia group (B. Taurus and O. aries) after these species diverged from their common ancestral. In the other species, the gene seems to be evolving in a conservative way. A capacidade de produção de carne está relacionada com o número de fibras musculares apresentadas pelos animais recém nascidos. As fibras musculares são formadas na miogênese que ocorre durante o desenvolvimento embrionário, evento que é em parte controlado pela família de genes MyoD. O gene da Miogenina é membro dessa família e regula a expressão de genes músculo específicos. Ele desempenha uma função importante porque quando é ativado, as células do tecido muscular param de se multiplicar e o tecido passa a crescer apenas em volume. É considerado então um gene candidato. Os objetivos desse trabalho foram investigar possíveis alterações nas seqüências de nucleotídeos no gene da Miogenina em suínos de raças divergentes, e comparar o sequenciamento obtido em suínos com outras espécies que possuem o gene depositado no Genbank, a fim de estudar a história evolutiva do gene nestas espécies. A estratégia usada foi a divisão do gene em sete fragmentos que continham os três exons, os dois introns e as regiões 3 e 5 do gene. Foram seqüenciados dois varrões da raça nativa Piau e 12 matrizes comerciais. Os resultados obtidos mostraram um gene altamente conservado, com nenhum polimorfismo nas regiões exônicas. O sequenciamento dos introns não apresentou resultados satisfatórios. Métodos de avaliação filogenética também comprovaram o estado conservado do gene. Foram comparadas seqüências das espécies Sus scrofa (suínos), Bos taurus (bovinos), Ovis áries (ovinos), Homo sapiens (humanos), Mus musculus (camundongos), Rattus norvegicus (ratos), Gallus gallus (galinhas) e Meleagris gallopavo (perus), verificando as taxas de substituição de nucleotídeos não sinônimas (Ka) pela taxa de substituições sinônimas (Ks) nos sítios. Os resultados indicaram que provavelmente o gene tenha sofrido uma evolução adaptativa nas espécies do grupo Ruminantia (B. taurus e O. aries) após as duas espécies terem divergido do seu ancestral comum. Nas outras espécies, o gene o gene parece estar evoluindo de maneira conservativa.

Se entiende por miogénesis al proceso de determinación y formación de las células del tejido muscular (Gilbert, 2000). Este proceso se sucede originalmente en el embrión yes rememorado en el músculo esquelético maduro para su mantenimiento y reparación.En el embrión, la miogénesis se puede considerar subdividida en varias etapas. Laprimera de ellas es la inducción de las células del dermomiotomo, un somita dorsalque se encuentra debajo del ectodermo (Cossu y Borello, 1999); allí se especifican lascélulas que serán los futuros mioblastos de dos poblaciones: una epiaxial y unahipoaxial . Las células del dermomiotomo estimuladas a ser mioblastos son inducidaspor señales químicas de los tejidos vecinos. Para los que serán mioblastos epiaxiales,son estimulados por moléculas Wnt (parece ser Wnt1) y Shh que culminarán en laexpresión del gen Myf5, en tanto que los hipoaxiales lo serán por la combinaciónespaciotemporal de otra Wnt (al parecer Wnt7a), BMP4 y Nogginy culminaránexpresando el gen MyoD(Cossu y Borello, 1999).