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La perturbation de la barrière hémo-encéphalique et la migration des lymphocytes de la périphérie vers le système nerveux central (SNC) sont des événements précoces dans la formation des lésions cérébrales de sclérose en plaques (SEP). Dans ce contexte, les lymphocytes passent au travers des barrières hémo-encéphalique ou hémo-méningée pour atteindre le SNC et sont des contributeurs importants dans l’inflammation et les dommages tissulaires. Pour migrer à travers les barrières du SNC, les lymphocytes pathogéniques expriment des molécules d’adhérence. Identifier les acteurs clés à la migration des lymphocytes pathogéniques en estimant la contribution des molécules d’adhérence dans ce processus est la prochaine étape pour le développement de thérapies pour traiter la SEP. L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle de deux molécules d’adhérence que sont ALCAM (de l’anglais : activated leukocytes cell adhesion molecule) et DICAM (de l’anglais : dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule) dans la migration des lymphocytes pathogéniques vers le SNC pendant la SEP. Notre objectif principal se subdivise en deux sous-objectifs. En premier, notre but est de caractériser le rôle d’ALCAM dans le passage des lymphocytes B à travers les barrières du SNC dans un contexte neuroinflammatoire. En second, nous explorons le rôle de DICAM dans la migration des lymphocytes T auxiliaires 17 (TH17) vers le SNC en neuroinflammation. Nous faisons l’hypothèse qu’ALCAM contribue à la migration des lymphocytes B vers le SNC et que DICAM est impliqué dans la migration des lymphocytes TH17 à travers la barrière hémo-encéphalique pendant la SEP. Ces molécules d’adhérence seraient alors impliquées dans la pathogenèse de la SEP et seraient de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter cette maladie. Nous avons d’abord utilisé une combinaison de spectrométrie de masse, PCR quantitative, cytométrie de flux et microscopie afin d’explorer l’expression de chacune de ses deux molécules d’adhérence sur les lymphocytes d’intérêt périphériques ex vivo ou différenciés in vitro. Des analyses en cytométrie en flux et microscopie nous ont permis de caractériser leur expression dans le sang périphérique et dans les lésions cérébrales de personnes atteintes de SEP. Ensuite, les expériences d’adhérence en flux et de migration in vitro effectuées en déplétant la molécule d’adhérence d’intérêt ont permis de mettre en évidence leur rôle dans différentes étapes de la migration des lymphocytes à travers les cellules endothéliales des barrières du SNC. Pour finir, le traitement de plusieurs modèles murins de SEP, appelés EAE (de l’anglais : experimental autoimmune encephalomyelitis), avec des anticorps bloquant anti-ALCAM ou anti-DICAM ont permis d’explorer le potentiel effet de tels traitements sur la sévérité de la maladie. Dans la première étude, nos résultats montrent qu’ALCAM est préférentiellement exprimée par les lymphocytes B pro-inflammatoires, mémoires et effecteurs au potentiel pathogénique. En tant que molécule d’adhérence, ALCAM contribue à leur migration à travers les cellules endothéliales des barrières hémo-encéphalique et hémo-méningée chez la souris et l’humain. De plus, nos expériences ont permis de montrer que la fréquence de lymphocytes B ALCAM+ est augmentée dans le sang périphérique des personnes atteintes de SEP et ces cellules sont aussi présentes dans les lésions et les infiltrats méningées en SEP. Finalement, bloquer ALCAM in vivo réduit la sévérité de la maladie EAE en diminuant l’infiltration des lymphocytes B au SNC. Dans la seconde étude, nous avons montré que parmi les sous-types de lymphocytes TH, DICAM est préférentiellement exprimée par les lymphocytes TH17. Dans les lésions de SEP, DICAM et son ligand αVβ3 co-localisent avec des marqueurs de cellules endothéliales suggérant que ces deux molécules pourraient être présentées à la lumière des vaisseaux aux lymphocytes TH17 circulants. Dans le sang périphérique, la fréquence de lymphocytes T CD4+ exprimant DICAM est augmentée chez les personnes atteintes de SEP et cette augmentation corrèle avec l’activité de la maladie. Nos expériences ont montré que DICAM est impliquée dans l’adhérence, l’arrêt et la diapédèse des lymphocytes TH17 à travers les cellules endothéliales de la barrière hémo-encéphalique in vitro et in vivo. Finalement, le traitement de souris EAE avec un anticorps bloquant DICAM permet de réduire la sévérité de la maladie et diminue la migration des lymphocytes TH17 vers le SNC. Nos résultats indiquent un rôle d’ALCAM dans la migration des lymphocytes B et que DICAM, préférentiellement exprimé par les TH17, médie leur migration vers le SNC. Bloquer ALCAM ou DICAM sont deux stratégies permettant de réduire l’accès au SNC de différents sous-types de cellules pathogéniques pendant la neuroinflammation. Ainsi, elles sont toutes deux de potentielles cibles thérapeutiques pour réduire la sévérité et la progression de la SEP., Disruption of the blood-brain barrier and migration of lymphocytes from the periphery to the central nervous system (CNS) are early events in lesion formation during multiple sclerosis (MS). Lymphocytes readily cross the blood-brain barrier (BBB) and the blood-meningeal barrier (BMB) to infiltrate the CNS and are important contributors to inflammation and tissue damage. To migrate through the brain barriers, pathogenic lymphocytes express adhesion molecules. Identifying key players in lymphocyte migration by understanding the role of adhesion molecules is the next step to develop novel therapies to treat MS. The objective of this project is to explore the role of two distinct adhesion molecules ALCAM (activated leukocytes cell adhesion molecule) and DICAM (dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule) in pathogenic lymphocytes migration to the CNS during MS. This thesis subdivides in two main objectives. First, we aim to characterize ALCAM role in B lymphocyte migration to the CNS during neuroinflammation. Second, we aim to explore DICAM role in T helper 17 (TH17) lymphocytes migration to the CNS in neuroinflammation. We hypothesized that ALCAM plays a role in B lymphocytes migration to the CNS during MS and that DICAM is involved in TH17 lymphocytes migration through the blood-brain barrier during MS. Those adhesion molecules might be involved in MS pathogenesis and therefore could become new therapeutic targets to treat MS. We first used mass spectrometry, quantitative PCR, flow cytometry and confocal microscopy to explore expression profiles of ALCAM and DICAM by peripheral lymphocytes subpopulations ex vivo and differentiated in vitro. Flow cytometry and confocal microscopy analysis also revealed how those adhesion molecules are expressed by lymphocytes in peripheral blood and brain lesions of people living with MS. Then, we performed flow adhesion and migration assay of lymphocytes depleted for the adhesion molecule of interest allowing us to address their role in multitstep migration process through brain barriers endothelial cells. Finally, using five distinct murine experimental autoimmune encephalomyelitis models (EAE), we explored how blocking ALCAM or DICAM in vivo could affect lymphocytes migration to the SNC and disease severity. In the first manuscript, we described that ALCAM is preferentially expressed by B lymphocytes with memory, pro-inflammatory and effector phenotypes. Functionally, ALCAM is involved in B lymphocyte migration through both the BBB and the BMB in mouse and human. Interestingly, we showed that ALCAM expressing B lymphocytes are increased in peripheral blood of people living with MS and they are recovered in meningeal and parenchymal MS lesions. Last, blocking ALCAM in vivo alleviates EAE severity by reducing B lymphocyte infiltration to the CNS. In the second manuscript, we showed that TH17 lymphocytes preferentially express DICAM and can adhere both to DICAM and its ligand αVβ3. Moreover, DICAM and αVβ3 are both overexpressed by inflamed brain endothelial cells. In MS lesions, we described that both molecules colocalize with endothelial cell markers suggesting that it could be presented to the vessel lumen to the circulating TH17 lymphocytes. In peripheral blood, we showed that DICAM+ memory CD4+ T lymphocytes frequency is increased in people living with MS and it correlates with active form of the disease. Then, we described DICAM as a player in TH17 lymphocyte adhesion, arrest and migration through BBB endothelial cells in vitro and in vivo. Last, we showed that treating mice with a neutralizing DICAM antibody in several distinct models of EAE, reduced disease severity and TH17 cell migration to the SNC. Our data provide evidence of the role of ALCAM in memory B lymphocyte migration and that DICAM is preferentially expressed by TH17 cells and mediate their migration to the CNS during neuroinflammation. Collectively, our findings indicate that blocking ALCAM or DICAM are two ways to restrict different pathogenic cells access to the CNS during neuroinflammation and thus potentially to reduce the severity and worsening of a disease like MS.

Protein SUMOylation is a highly dynamic and reversible post-translational modification that targets lysine residues on a wide range of proteins involved in several essential cellular events, including protein translocation and degradation, mitotic chromosome segregation, DNA damage response, cell cycle progression, cell proliferation, and migration. Protein SUMOylation is an ATP-dependent enzymatic process that involves an E1 activating enzyme SAE1/2, a E2 conjugase UBC9, and usually facilitated by SUMO E3 ligases. The SP-RING family is the largest family of SUMO E3 ligases, encompassing seven mammalian protein inhibitor of activated STAT (PIAS) proteins. PIAS family was originally identified as specific inhibitors for signal transducer and activator of transcription (STAT), which involves gene transcriptional regulation. Recent studies showed that PIAS proteins also play important roles in the regulation of protein stability and signal transduction through the SUMOylation of target substrates. In addition, PIAS-mediated protein SUMOylation is also involved in several cellular processes, including DNA damage repair, immune response, cellular proliferation, and motility. Most notably, PIAS proteins are highly expressed in different cancer types and have been implicated in tumorigenesis. Several reports suggest that PIAS proteins could promote cancer cell growth and progression by regulating the SUMOylation of different substrates. To date, a number of substrates of PIAS ligases have been identified from several individual studies, and hundreds of specific SUMO E3 ligase substrates were identified from a human proteome microarray-based activity screen. However, how these substrates are selected, and which SUMOylation sites are targeted by these PIAS are still unknown. To answer these questions, I started my investigation with PIAS1, one of the most well studied SUMO E3 ligases. By changing the expression level of PIAS1 in HeLa cells using gene overexpression or CRISPR/Cas9 gene knockout, I found PIAS1 had a physiological impact on cell proliferation and migration. I took advantage of the previously developed SUMO proteomics workflow to quantitatively profile global SUMOylome changes upon PIAS1 overexpression in a site-specific manner. I identified 983 SUMO sites on 544 proteins, of which 62 proteins were assigned as putative PIAS1 substrates. In particular, Vimentin (VIM), a type III intermediate filament protein involved in cytoskeleton organization and cell motility, was identified as PIAS1 substrates. Two SUMOylation sites mediated by PIAS1 at Lys-439 and Lys-445 residues were further evaluated and found to be necessary for dynamic disassembly and assembly of vimentin intermediate filaments, which further regulates cell migration and motility. In the second study, I extended my investigation to all PIAS ligases and further found that all PIAS proteins impact cell proliferation and migration of breast cancer cell MDA-MB-231 after CRISPR/Cas9 gene knockout. I further optimized my SILAC-based quantitative SUMO proteomics approach and combined it with transcriptomics to gain a system-level understanding of the functional components involved in PIAS regulatory networks. A large subset of proteins/ genes involved in cell proliferation and migration were commonly regulated by all PIAS proteins, suggesting a redundancy of regulation within the PIAS family. In addition, each PIAS regulated a unique pool of substrates/genes involved in different cellular processes, such as DNA damage repair, chromatin remodeling, and SUMO chain formation, suggesting that each PIAS specifically regulates cellular functions. The trans-scale analyses between proteomics and transcriptomics shed light on the comprehensive pictures of the regulation networks by PIAS proteins beyond their direct enzymatic activity. Overall, the quantitative SUMO proteomics approach provided a robust method for identifying substrates of PIAS SUMO E3 ligases. The combination of proteomic and transcriptomic analyzes made it possible to draw up a global portrait of the regulatory mechanisms governed by the PIAS proteins., La SUMOylation des protéines est une modification post-traductionnelle se produisant sur des lysines d’un large éventail de protéines cellulaires. Cette modification est dynamique et régit plusieurs évènement cellulaires essentiels, dont la translocation et la dégradation des protéines, la ségrégation chromosomique mitotique, la réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration. La conjugaison de la protéine SUMO sur son substrat se produit grâce à une triade enzymatique regroupant l’enzyme d’activation E1 SAE 1/2, la conjugase E2 UBC9 et dans la plupart des cas une ligase SUMO E3. Cette cascade enzymatique nécessite une source d’ATP pour son initiation. Parmi la famille des ligases SUMO E3, on retrouve un domaine spécifique nommé SP-RING présent chez une sous population de celles-ci. Parmi ces ligases on retrouve 7 protéines inhibitrices des protéines STAT activées regroupees sous le nom de PIAS. Les ligases PIAS ont été identifiées à l'origine comme des inhibiteurs spécifiques des protéines STAT responsable du signal de transduction et de l’activation de la transcription génique. Des études récentes ont montré que les protéines PIAS jouent également un rôle important sur la stabilité de leurs substrats et la transduction de leur signal. De plus, les substrats SUMOylés par les PIAS sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires, notamment la réparation des dommages à l'ADN, la réponse immunitaire, la prolifération et la motilité cellulaire. Ces divers processus cellulaires peuvent être déréglés et entrainer le développement du cancer. Il s’avère que les protéines PIAS sont fortement exprimées dans divers types de cancer et sont impliquées dans la tumorigenèse. Plusieurs rapports suggèrent que les protéines PIAS pourraient favoriser la croissance et la progression des cellules cancéreuses en régulant le niveau de SUMOylation de plusieurs substrats. Initialement, les substrats des ligases PIAS ont été identifiés à partir de plusieurs études individuelles et plus récemment, des centaines de substrats spécifiques de la SUMO E3 ligase ont été identifiés à partir de criblage de micropuces à protéines interrogeant le protéome humain. Cependant, la manière dont ces substrats sont sélectionnés et quels sont les sites de SUMOylation ciblés par ces PIAS demeurent encore méconnus. Afin d’aborder ces questions, j’ai commencé mon étude avec PIAS1, l'une des ligases SUMO E3 les plus étudiées. Pour ce faire, j’ai varié le niveau d'expression de PIAS1 dans des cellules iv HeLa selon l’approche CRISPR/Cas9. Ainsi, deux modèles ont été construit, soit via une surexpression du gène ou via un knockout du gène. Ces mutants ont permis de constater que PIAS1 avait un impact physiologique sur la prolifération et la migration des cellules. J’ai tiré avantage d’une méthode protéomique précédemment développé sur les peptides SUMO pour déterminer les changements de SUMOylation lors de la surexpression de PIAS1. J’ai identifié 983 sites SUMO sur 544 protéines, dont 62 protéines ont été identifiées comme substrats potentiels de PIAS1. Parmi celles-ci, la vimentine (VIM), une protéine de la famille des filaments intermédiaire de type III impliquée dans l'organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire, a été reconnu comme un substrat de PIAS1. Afin de valider le rôle de la SUMOylation des lysines Lys-439 et Lys-445 de VIM j’ai effectué des études fonctionelles de motilité cellulaire avec les mutants où ces sites ont été substitués en arginine. Ces expériences m’ont permis de constater que la SUMOylation de VIM aux sites Lys-439 et Lys-445 est nécessaire à l’assemblage et désassemblage dynamique des filaments intermédiaires de VIM, lesquels regulent la migration et la motilité cellulaire. Dans la deuxième étude, j’ai élargi mon recherche sur toutes les ligases PIAS et avons découvert que ces dernières avaient toutes un impact sur la prolifération cellulaire et la migration des cellules du cancer du sein MDA-MB-231 suite à un knockout de ces gènes par CRISPR / Cas9. De plus, j’ai optimisé mon approche de protéomique quantitative SUMO via SILAC et l'avons complémenté d’une analyse transcriptomique. Cette combinaison a permis d’acquérir une compréhension des composants fonctionnels impliqués dans les réseaux de régulation PIAS. Il s’avère qu’un grand sous-ensemble de gènes / protéines impliqués dans la migration et la prolifération des cellules sont régulés par tous les membres de la famille PIAS, et suggère une certaine redondance fonctionnelle parmi ces ligases. De plus, chaque PIAS régule un ensemble unique de substrats / gènes impliqués dans plusieurs processus cellulaires différents, tels que la réparation des dommages de l'ADN, le remodelage de la chromatine et la formation de la chaîne SUMO. Ces résultats suggèrent que chacune des PIASs régule de façon spécifique les fonctions cellulaires. La combinaison des analyses protéomiques et transcriptomiques ont permi de dresser un portrait global des mécanismes de régulation régit par les protéines PIAS et ce au-delà de leur activité enzymatique directe.

La morphogenèse cellulaire représente l’ensemble des évènements qui dictent la forme et la structure d’une cellule. Ces changements morphologiques sont importants pour de nombreux mécanismes vitaux, comme le développement embryonnaire, la réaction inflammatoire ou encore la cicatrisation. Pour cela, la morphogénèse cellulaire dépend principalement du remodelage du cytosquelette cellulaire qui, une fois associé à la membrane plasmique, forme l’armature de la cellule. L’ezrine, la radixine et la moésine appartiennent à la famille de protéines ERM et lient la membrane plasmique au cytosquelette d’actine et aux microtubules. De ce fait, les protéines ERM sont impliquées dans différents processus fondamentaux nécessitant un remodelage du cortex cellulaire tels que la mitose et la migration. Dans un contexte pathologique, la surexpression et/ou la sur-activation des protéines ERM corrèlent avec un haut potentiel métastatique et un pauvre pronostic chez les patients. Une meilleure compréhension de la régulation de ces trois protéines pourrait ainsi aider au développement de nouvelles solutions thérapeutiques. L’objectif de mon doctorat portait sur l’identification et la caractérisation de nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM. Dans un premier temps (i), j’ai participé au développement et la caractérisation de sondes BRET2 permettant de suivre l’activité de chaque protéine ERM en temps réel. Ces sondes BRET2 sont d’ailleurs compatibles avec des études à grande échelle ce qui nous permettra de réaliser des cribles génomiques et chimiques dans le but d’identifier, respectivement, de nouveaux régulateurs et inhibiteurs pharmacologiques des protéines ERM. Ensuite (ii), grâce aux sondes BRET2, nous avons identifié les microtubules en tant que nouveaux régulateurs négatifs des protéines ERM. Nous avons alors montré que la dépolymérisation des microtubules d’interphase à l’entrée en mitose participe à l’activation des protéines ERM et à l’arrondissement cellulaire. Enfin (iii), nous avons montré que le récepteur couplé aux protéines G TPα régule l’activité des protéines ERM dans des cellules de cancer du sein triple négatif. Cette régulation est d’ailleurs importante pour la motilité de ces cellules. Pour conclure, en plus d’avoir développé de nouveaux outils utiles pour des études à grande échelle, mon travail de doctorat a permis de mettre en lumière deux nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM au cours de la mitose et la migration cellulaire. Sans compter l’apport de nouvelles informations sur un aspect fondamental, mon travail a apporté de nouvelles pistes de réflexion quant aux rôles des protéines ERM dans le développement des métastases., Cell morphogenesis represents the set of events that dictate the shape and structure of a cell. These morphological changes are important for many vital mechanisms such as embryonic development, inflammatory response, or wound healing. Cell morphogenesis depends mainly on the remodeling of the cell cytoskeleton which forms the framework of the cell when associated with the plasma membrane. Ezrin, radixin and moesin belong to the ERM family and crosslink the plasma membrane to the actin cytoskeleton and microtubules. Therefore, ERMs are involved in various fundamental processes requiring remodeling of the cell cortex such as mitosis and migration. In a pathological context, overexpression and/or overactivation of ERMs correlate with high metastatic potential and poor prognosis in patients. Thus, a better understanding of the regulation of these three proteins could help in the development of new therapeutic solutions. The aim of my PhD work was to identify and characterize novel signaling pathways regulating ERMs. In a first step (i), I participated in the development and characterization of BRET2 biosensors allowing to follow the activity of each ERM protein in real time. These BRET2 biosensors are compatible with large-scale studies which will allow us to perform genomic and chemical screens to identify, respectively, new upstream regulators and pharmacological inhibitors of ERMs. Secondly (ii), based on BRET2-chemical screen, we identified microtubules as new negative regulators of ERMs. We then showed that depolymerization of interphase microtubules at mitosis entry triggers ERM activation and cell rounding. Finally (iii), we showed that the G protein-coupled receptor TPα regulates the activity of ERMs in triple negative breast cancer cells. This regulation is important for the motility of these cells. To conclude, in addition to having developed new tools useful for large-scale studies, my PhD work has uncovered two new signaling pathways regulating ERMs during mitosis and cell motility. In addition to providing new information on a fundamental aspect, my work has provided new insights into the roles of ERMs in the development of metastasis.

This work demonstrates that protocadherin-18a (Pcdh18a), expressed by the stromal cell progenitors, plays important roles in their migration and the subsequent formation of the first niche of definitive hematopoiesis, called the caudal hematopoietic tissue in zebrafish. The genesis of filopodia and migration of stromal cells expressing a Pcdh18a, lacking a major part of its cytoplasmic domain (Pcdh18a-ΔCP106), are compromised and cellular connections are retained for a longer time during cell migration. These results suggest that the cytoplasmic domain of Pcdh18a affects F-actin regulation and is also involved in cell-contact-mediated repulsion. Expression of Pcdh18a-ΔCP106 also leads to a 2-fold decrease in the number of stromal cells, and alters the formation of the venous plexus, the other main component of the niche, resulting in a non-functioning hematopoietic niche. It also induces the overexpression of fibronectin 1b, which probably contributes to the abnormal morphogenesis of the venous plexus. Finally, we found that the four-amino-acid motif REDV present in the extracellular region of Pcdh18a appears required for the attachment of stromal cells onto the vessels and their differentiation in stromal perivascular cells.; Ces travaux de thèse démontrent que la protocadhérine-18a (Pcdh18a), exprimée par les progéniteurs des cellules stromales, joue un rôle important dans leur migration, puis dans la formation de la première niche d’hématopoïèse définitive, appelé tissu hématopoïétique caudal chez le poisson zèbre. La genèse des filopodes et la migration de cellules stromales, exprimant une Pcdh18a tronquée dans sa partie cytoplasmique (Pcdh18a-ΔCP106), sont compromises et les connexions cellulaires sont plus durables au cours de la migration. Cela suggère que le domaine cytoplasmique de Pcdh18a affecte la régulation de l’actine-F et est impliqué dans la médiation de la répulsion cellulaire. L’expression de Pcdh18a-ΔCP106 conduit aussi à une diminution du nombre de cellules stromales, et altère la formation du plexus veineux, composant majeur de la niche, résultant en une niche hématopoïétique non fonctionnelle. Elle induit également la surexpression de la fibronectine 1b, ce qui contribue probablement à la morphogenèse anormale du plexus veineux. Enfin, nous avons découvert qu'un motif à quatre acides aminés REDV présent dans la région extracellulaire de Pcdh18a est requis pour la fixation des cellules stromales sur les vaisseaux et leur différenciation en cellules stromales périvasculaires.

The final positioning of a migrating cell is a crucial step that needs to be precisely achieved. Overmigration or undermigration may lead to abnormal organ formation, diseases and lethality. While most studies address the mechanism and direction of cell migration, often using laboratory-induced mutations, few look at the final position of the cell and the effect of other kinds of perturbations (environmental, stochastic). The degree of sensitivity or resistance to perturbation, also called robustness, is a fundamental property of biological systems. A perturbation may affect the mean or the variance of traits such as the position of cells. The aim of the thesis is to study the robustness and evolution of the final position of a migrating cell. In Caenorhabditis elegans, the QR neuroblast is a cell that migrates anteriorly in the first larval stage, while undergoing three rounds of division. The two daughter cells of QR.pa, QR.paa and QR.pap (called QR.pax), stop their migration in an anterior body position and acquire a neuronal fate. QR.pa migration stops upon expression of the Wnt receptor MIG-1, which is surprisingly not induced by positional clues but by a position-independent timing mechanism (Mentink et al. Dev Cell 2014). During this thesis, I revealed that 1) QR.pax final position is sensitive to environmental perturbation and to body size. 2) There is natural variation for QR.pax final position. 3) A QTL mapping using 200 Recombinant Inbred Lines between two isolates unveiled a region associated with their difference in QR.pax final position. 4) QR.pax final position is in the same range in the Caenorhabditis genus but evolves drastically in the Oscheius genus., La migration cellulaire est un processus clé au cours du développement et tout au long de la vie des individus. Un défaut dans l’arrêt de la migration et du position finale d’une cellule ou d’un groupe de cellules peut entraîner des anomalies dans la formation d’un tissu ou d’un organe. Tandis que la majorité des études interrogent le mécanisme de migration ou sa direction, en utilisant souvent des mutations génétiques induites en laboratoire, peu étudient la position finale de la cellule et l'effet d’autres perturbations (environnementales, expression génique stochastique). Le degré de sensibilité ou résistance d’un système à des perturbations, aussi appelé robustesse, est une caractéristique fondamentale des systèmes biologiques. Une perturbation peut affecter la moyenne ou la variance d’un phénotype, ici la position des cellules. Au cours de ma thèse je me suis intéressé à la robustesse et à l'évolution de la position finale d’une cellule, en m’intéressant à son mécanisme de positionnement particulier. Le neuroblaste QR est une cellule qui migre durant le premier stade larvaire de C. elegans, tout en effectuant deux cycles de division cellulaire. Les cellules filles de QR.pa, QR.paa et QR.pap (appelées par la suite QR.pax), terminent leur migration dans la région antérieure de l'animal et acquièrent une identité neuronale. L’arrêt de la migration de QR.pax est sous le contrôle de l'expression du récepteur Wnt MIG-1, orthologue du récepteur Wnt Frizzled 4 chez les mammifères. La particularité de l'expression de mig-1 dans le neuroblaste QR est qu'elle n’est pas induite par la position de la cellule dans l’organisme mais par une régulation temporelle indépendante de sa localisation. Au cours de ma thèse, j’ai démontré que 1) La position finale de QR.pax est sensible à diverses perturbations environnementales et à la taille de l’animal. 2) Il y a une grande variabilité naturelle entre souches sauvages de C. elegans. 3) Une analyse sur 200 lignées consanguines recombinantes provenant de deux souches sauvages a mis en évidence une région chromosomique associée à une différence de position finale. 4) La position finale de QR.pax évolue peu au sein des Caenorhabditis mais beaucoup au sein des Oscheius.

Tumor cells are exposed to cell-intrinsic and extrinsic perturbations that alter the proper functioning of the endoplasmic reticulum (ER); a cellular condition known as ER stress. This condition engages an adaptive response termed as unfolded protein response (UPR). IRE1 is the most evolutionary conserved ER stress sensor of the UPR. Activation of the IRE1 RNase activity controls the expression of the transcription factor XBP1s and the degradation of mRNA through a process termed RIDD. IRE1 activity has been linked to cell migration and invasion in different types of tumors. However, no evidence regarding the role of IRE1 in melanoma cell migration/invasion has been published. Importantly in 2018 our group described a novel function of IRE1 independent of its catalytic activity, where IRE1 acted as a scaffold favoring cell migration through FLNA, an actin crosslinking protein involved in cell migration. This was demonstrated in non-tumoral cells. Therefore, in this thesis, we initially aimed to uncover the contribution of IRE1/FLNA signaling in cell migration and invasion in melanoma cells, its impact on the metastatic process. By using genetic and pharmacologic approaches, we found that deficiency of IRE1 expression or RNase activity inhibition enhances cell migration and invasion of human metastatic melanoma cell lines, indicating that the IRE1 branch could be acting as a suppressor of cell migration and invasion in metastatic melanoma cells. Notably, we were not able to corroborate the IRE1-dependent phosphorylation of FLNA. Importantly, processes that are known to be regulated by FLNA like actin cytoskeleton and cell adhesion were not affected by IRE1 depletion in human metastatic melanoma cells. These findings suggest that the regulation of cell migration/invasion by IRE1 is an FLNA-independent mechanism. Analyzing a gene expression database of melanoma tumors, we found that tumors identified with high RIDD activity presented a significant decrease in the expression of genes involved in melanoma metastasis. Our findings suggest that IRE1 through RIDD acts as a suppressor of metastatic melanoma cell migration and invasion. The results obtained in this thesis constitute the first approximation on the implication of IRE1 in metastasis-related processes in melanoma, such as cell migration and invasion.; Les cellules tumorales sont exposées à des perturbations intrinsèques et extrinsèques qui altèrent le bon fonctionnement du réticulum endoplasmique (RE); une condition cellulaire connue sous le nom de stress du RE. Cette condition engage une réponse adaptative appelée « Unfolded Protein Response » (UPR). IRE1 est le capteur du stress du RE qui est le plus conservé dans l’évolution. L'activation de l'activité RNase d’IRE1 contrôle l'expression du facteur de transcription XBP1s et la dégradation d’ARNm par un processus appelé RIDD. L'activité IRE1 a été liée à la migration et à l'invasion cellulaires dans différents types de tumeurs. Cependant, aucune preuve concernant le rôle de l'IRE1 dans la migration / l'invasion des cellules de mélanome n'a été publiée jusqu’ici. Il est important de noter qu'en 2018, notre groupe a décrit une nouvelle fonction de l'IRE1 indépendante de son activité catalytique, dans laquelle IRE1 agissait comme un échafaudage favorisant la migration cellulaire via la filamin A (FLNA), une protéine de réticulation de l'actine impliquée dans la migration cellulaire. Cela a été démontré dans des cellules non tumorales. Par conséquent, dans cette thèse, mon objectif initial était de tester et caractériser la contribution de la signalisation IRE1/FLNA dans la migration cellulaire et l'invasion dans les cellules de mélanome, son impact sur le processus métastatique. En utilisant des approches génétiques et pharmacologiques, j’ai constaté que le déficit d'expression d'IRE1 et/ou l'inhibition de son activité RNase augmentent les propriétés de migration et d'invasion des lignées cellulaires de mélanome métastatique humain, indiquant que la branche IRE1 pourrait agir comme un suppresseur de la migration et de l'invasion dans ces cellules. Notamment, nous n'avons pas été en mesure de corroborer la phosphorylation dépendante d’IRE1 de la FLNA. Surtout, les structures et processus connus pour être régulés par la FLNA comme le cytosquelette d'actine et l'adhésion cellulaire ne sont pas affectés par la déplétion de l'IRE1 dans les cellules de mélanome métastatique humain. Ces résultats suggèrent que la régulation de la migration/invasion par IRE1 est un mécanisme indépendant du FLNA. En analysant une base de données d'expression génique de tumeurs de mélanome, nous avons constaté que les tumeurs identifiées avec une activité RIDD élevée présentaient une diminution significative de l'expression des gènes impliqués dans les métastases du mélanome. Nos résultats suggèrent que IRE1 (via le RIDD) pourrait agir comme un suppresseur de la migration et de l'invasion des cellules de mélanome métastatique. Les résultats obtenus dans cette thèse constituent une première étape dans la caractérisation de l'implication d'IRE1 dans les processus liés aux métastases dans le mélanome.

La caractérisation d’échantillons biologiques s’effectue très souvent au microscope optique. Or, il est techniquement difficile d’isoler quelques cellules rares parmi une culture hétérogène en se basant strictement sur des caractéristiques observables au microscope, comme la localisation, la morphologie ou le déplacement, car il n’existe pas nécessairement de marqueur moléculaire unique qui leur sont associés. Afin de répondre à cet enjeux, le laboratoire dans lequel j’ai effectué mon stage de maîtrise a récemment développé la Single Cell Magneto Optical Capture (scMOCa), qui utilise des réactifs communs et un laser de faible puissance pour attacher des billes ferromagnétiques à la membrane plasmique cellulaire et permet d’isoler magnétiquement les cellules d’intérêt. Le présent ouvrage rapporte l’application de la scMOCa à la migration de cellules métastatiques ainsi que les adaptations apportées à la technique nécessaires à la réalisation du projet. Notamment, le volume de cellules uniques capturé a été augmenté d’un facteur d’environ 250 grâce à l’automatisation de la technique et à l’étude du photoblanchiement de la fluorescéine, phénomène à la base de la scMOCa. Brièvement, l’expérience consiste à capturer les cellules uniques présentant les phénotypes migratoires les plus importants, définis par l’analyse de leur trajectoire, parmi une culture hétérogène de cellules métastatique. Les résultats de l’expérience démontrent une conservation des phénotypes migratoires après plusieurs mitoses. Aussi, l’expression génétique relative fait ressortir des gènes et groupes de gènes propres à la migration cellulaire., The characterization of biological samples depends heavily on the optical microscope. However, it is technically challenging to isolate rare cells among a heterogeneous culture solely based on visual inspection at the microscope. Indeed, characteristics like location, morphology or displacement do not necessairly have specific related molecular markers. In order to solve this issue, the laboratory where I accomplished my master internship developped the Single Cell Magneto Optical Capture (scMOCa) wich uses commun reagents and a low powered laser to attach ferromagnetic beads on the cell plasma membrane and isolate the cells of interest with magnetic tools. The present work reports the application of scMOCa to the metastatic cell migration and the implemented adaptations to the technique in order to carry out the project, especially by increasing the number of single cells being isolated by a factor of 250. This adaptation requiered the study of photobleaching, phenomenon at the foundation of scMOCa. Briefly, the experiment consists to capture the cells presenting the most important migratory phenotypes, defined by their track analysis, among a heterogeneous metastatic cell culture. The experimental results show that the migratory phenotypes are preserved after several cell divisions. Also, the relative gene expression highlights some genes and gene groups owned to cellular migration.

La migration cellulaire joue un rôle essentiel dans le développement des organismes multicellulaires et dans certaines pathologies comme le cancer, où elle permet la formation de métastases. Le trafic vésiculaire est un régulateur clé de la migration cellulaire, notamment en contrôlant la localisation de protéines impliquées dans la migration telles que les intégrines, les cadhérines et les récepteurs transmembranaires. En particulier, notre laboratoire a montré que l'endocytose contrôle l'orientation et la communication cellulaire durant la migration cellulaire collective. Notre hypothèse est que d'autres événements du trafic vésiculaire pourraient aussi être impliqués dans ce type de migration. Ainsi, le but de cette thèse a été de déterminer la fonction des petites GTPases Arf, importantes pour la formation de vésicules et le tri de cargo dans ces vésicules et de leurs régulateurs dans la migration cellulaire collective. Un modèle pour étudier la migration cellulaire collective est les chambres d’œufs de Drosophila melanogaster. En effet, lors de l’ovogénèse, des cellules folliculaires appelées cellules de bordure migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Conformément à notre hypothèse, un fort défaut de migration est observé lorsque les Arfs sont déplétées spécifiquement dans les cellules de bordure. De plus, un constat similaire est observé après la déplétion de certains régulateurs des Arfs (ArfGAPs et ArfGEFs). Notamment, nous avons démontré que l’ArfGAP Drongo et sa fonction d'activation de l’activité GTPase sont essentielles pour le détachement initial des cellules de bordure du tissu folliculaire. Drongo promeut le détachement en contrôlant la localisation de la myosine phosphatase afin de réguler l’activité de la myosine II à l’arrière des cellules. De plus, nous avons montré que Drongo agit sur l’Arf de classe III (Arf51F) de manière antagoniste à l’ArfGEF Steppke pour déplacer la myosine phosphatase de l’arrière du groupe de cellules. D’un autre côté, nous avons aussi démontré qu’une autre GAP, ArfGAP1, contrôle la directionnalité de migration. Cette ArfGAP agit potentiellement en régulant la localisation de certains déterminants de la migration tels que l’E-cadhérine et les récepteurs tyrosine kinase. Ainsi, nos recherches ont démontré un rôle essentiel des Arfs ainsi que des rôles spécifiques de deux ArfGAPs dans la migration cellulaire collective., Cell migration is implicated in various important biological processes, notably it is central for the dissemination of cancer cells. Vesicular trafficking is a key regulator of cell migration, notably by controlling the localisation of proteins involved in migration such as integrins, cadherins and transmembrane receptors. In particular, our laboratory has shown that endocytosis controls orientation and cellular communication during collective cell migration. Our hypothesis is that other events of vesicular trafficking might be implicated in collective cell migration. Thus, the purpose of this thesis was to assess the function of small GTPases Arf, important for vesicle formation and cargo sorting into those vesicles, and their regulators in collective cell migration. A powerful model to study collective cell migration is the migration of follicular cells named border cells during oogenesis in Drosophila melanogaster. Border cells (BCs) detach from the follicle epithelium surrounding the egg chambers and form a small cluster of six to ten cells that migrates invasively between the giant nurse cells that compose the center of the egg chamber, toward the oocyte. Accordingly to our hypothesis, a strong migration defect is observed when the Arfs are depleted specifically in the border cells. Moreover, a similar finding is observed after depletion of some Arfs regulators (ArfGAPs and ArfGEFs). In particular, the ArfGAP Drongo and its GTPase-activating function are essential for the initial detachment of the border cell cluster from the basal lamina. We demonstrated through protein localization and genetic interactions that Drongo controls the localisation of the myosin phosphatase in order to regulate myosin II activity at the back of the cluster and promote border cells detachment. Moreover, we showed that Drongo acts on the class III Arf (Arf51F) antagonistically to the guanine exchange factor Steppke to displace myosin phosphatase from the back of the cluster. On the other hand, we have also demonstrated that the GAP ArfGAP1 controls the directionality of migration. This ArfGAP potentially acts by regulating the localization of certain determinants of migration such as E-cadherin and receptors tyrosine kinase. Thus, our research has demonstrated an essential role for Arfs in collective cell migration and specific contributions of two ArfGAPs in this migration process.

Tumor cells are exposed to cell-intrinsic and extrinsic perturbations that alter the proper functioning of the endoplasmic reticulum (ER); a cellular condition known as ER stress. This condition engages an adaptive response termed as unfolded protein response (UPR). IRE1 is the most evolutionary conserved ER stress sensor of the UPR. Activation of the IRE1 RNase activity controls the expression of the transcription factor XBP1s and the degradation of mRNA through a process termed RIDD. IRE1 activity has been linked to cell migration and invasion in different types of tumors. However, no evidence regarding the role of IRE1 in melanoma cell migration/invasion has been published. Importantly in 2018 our group described a novel function of IRE1 independent of its catalytic activity, where IRE1 acted as a scaffold favoring cell migration through FLNA, an actin crosslinking protein involved in cell migration. This was demonstrated in non-tumoral cells. Therefore, in this thesis, we initially aimed to uncover the contribution of IRE1/FLNA signaling in cell migration and invasion in melanoma cells, its impact on the metastatic process. By using genetic and pharmacologic approaches, we found that deficiency of IRE1 expression or RNase activity inhibition enhances cell migration and invasion of human metastatic melanoma cell lines, indicating that the IRE1 branch could be acting as a suppressor of cell migration and invasion in metastatic melanoma cells. Notably, we were not able to corroborate the IRE1-dependent phosphorylation of FLNA. Importantly, processes that are known to be regulated by FLNA like actin cytoskeleton and cell adhesion were not affected by IRE1 depletion in human metastatic melanoma cells. These findings suggest that the regulation of cell migration/invasion by IRE1 is an FLNA-independent mechanism. Analyzing a gene expression database of melanoma tumors, we found that tumors identified with high RIDD activity presented a significant decrease in the expression of genes involved in melanoma metastasis. Our findings suggest that IRE1 through RIDD acts as a suppressor of metastatic melanoma cell migration and invasion. The results obtained in this thesis constitute the first approximation on the implication of IRE1 in metastasis-related processes in melanoma, such as cell migration and invasion., Les cellules tumorales sont exposées à des perturbations intrinsèques et extrinsèques qui altèrent le bon fonctionnement du réticulum endoplasmique (RE); une condition cellulaire connue sous le nom de stress du RE. Cette condition engage une réponse adaptative appelée « Unfolded Protein Response » (UPR). IRE1 est le capteur du stress du RE qui est le plus conservé dans l’évolution. L'activation de l'activité RNase d’IRE1 contrôle l'expression du facteur de transcription XBP1s et la dégradation d’ARNm par un processus appelé RIDD. L'activité IRE1 a été liée à la migration et à l'invasion cellulaires dans différents types de tumeurs. Cependant, aucune preuve concernant le rôle de l'IRE1 dans la migration / l'invasion des cellules de mélanome n'a été publiée jusqu’ici. Il est important de noter qu'en 2018, notre groupe a décrit une nouvelle fonction de l'IRE1 indépendante de son activité catalytique, dans laquelle IRE1 agissait comme un échafaudage favorisant la migration cellulaire via la filamin A (FLNA), une protéine de réticulation de l'actine impliquée dans la migration cellulaire. Cela a été démontré dans des cellules non tumorales. Par conséquent, dans cette thèse, mon objectif initial était de tester et caractériser la contribution de la signalisation IRE1/FLNA dans la migration cellulaire et l'invasion dans les cellules de mélanome, son impact sur le processus métastatique. En utilisant des approches génétiques et pharmacologiques, j’ai constaté que le déficit d'expression d'IRE1 et/ou l'inhibition de son activité RNase augmentent les propriétés de migration et d'invasion des lignées cellulaires de mélanome métastatique humain, indiquant que la branche IRE1 pourrait agir comme un suppresseur de la migration et de l'invasion dans ces cellules. Notamment, nous n'avons pas été en mesure de corroborer la phosphorylation dépendante d’IRE1 de la FLNA. Surtout, les structures et processus connus pour être régulés par la FLNA comme le cytosquelette d'actine et l'adhésion cellulaire ne sont pas affectés par la déplétion de l'IRE1 dans les cellules de mélanome métastatique humain. Ces résultats suggèrent que la régulation de la migration/invasion par IRE1 est un mécanisme indépendant du FLNA. En analysant une base de données d'expression génique de tumeurs de mélanome, nous avons constaté que les tumeurs identifiées avec une activité RIDD élevée présentaient une diminution significative de l'expression des gènes impliqués dans les métastases du mélanome. Nos résultats suggèrent que IRE1 (via le RIDD) pourrait agir comme un suppresseur de la migration et de l'invasion des cellules de mélanome métastatique. Les résultats obtenus dans cette thèse constituent une première étape dans la caractérisation de l'implication d'IRE1 dans les processus liés aux métastases dans le mélanome.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes.; La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes., La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

Mutations in proteins cause diverse developmental disorders, particularly for individuals with rare diseases or for whom a unifying clinical diagnosis is unknown. Cdc42 is one such protein; vital for establishing cell polarity, a crucial step in many biological processes such as cell migration, division and immune responses. Not surprisingly, mutations in Cdc42 cause a range of diseases such as growth dysregulation, facial dysmorphism and neurodevelopmental, immunological, and hematological abnormalities. In vertebrates there are two isoforms of Cdc42. The first being the ubiquitous isoform, has almost exclusively been studied and the role of the second isoform, being the brain isoform, is largely unknown. We have shown that the two isoforms are localized differently in cells. The ubiquitous isoform is mostly found in the cell cytoplasm and at the plasma membrane, while the Brain isoform localizes at the Golgi apparatus and on intracellular vesicles. We have also shown that the two isoforms carry out different functions during cell migration, suggesting that the differences between these two isoforms which only differs by the last 10 amino acids are responsible for their distinct localisation and function. Interestingly, a mutation in the C-ter sequence of Cdc42 ubiquitous isoform alters Cdc42 localisation and causes a generalized pustular psoriasis disease. Two main objectives have been studied in this project 1) the impact of the last amino acids of the protein in Cdc42 localization; and 2) new regulatory mechanisms of Cdc42 responsible for its intracellular localization. These findings will bring a better understanding of pathologies related to Cdc42 mutations.; Les mutations sont responsables de diverses pathologies du développement, en particulier chez les patients atteints de maladies rares ou pour lesquels il n’y a pas de diagnostic clinique clair. Cdc42 est une protéine clé pour la polarité cellulaire, une étape cruciale de nombreux processus cellulaires, comme la migration cellulaire, la division cellulaire ou la réponse immunitaire. Les mutations de Cdc42 entrainent une variété de pathologies, par exemple des dérégulations de la croissance ou de la morphologie faciale ainsi que des anomalies immunologiques, hématologiques et du développement neuronal. Les fonctions de Cdc42 reposent en grande partie sur la localisation de cette protéine dans la cellule. La comparaison des différentes formes de Cdc42 et de certaines formes mutantes montrent que les derniers acides aminés de la protéine jouent un rôle clé dans sa localisation et donc dans sa fonction. Nous avons centré notre étude sur l’identification : 1) des acides aminés essentiels à la localisation de la protéine ; et 2) de nouveaux mécanismes de régulation de Cdc42 responsables de sa localisation intracellulaire. Nous avons aussi montré que les deux isoformes jouent des rôles différents au cours de la migration cellulaire. Ce travail devrait nous permettre de mieux comprendre les pathologies liées aux mutations de Cdc42.

La polarisation des cellules est essentielle à la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la fonction neuronale et le développement embryonnaire. Elle peut se faire par le mécanisme de localisation des ARNm dans des compartiments cellulaires spécifiques. Bien que le mécanisme de localisation des ARNm soit assez bien défini dans tous les types cellulaires, son implication dans le développement du cancer n'a pas été caractérisée. Une étude de séquençage direct de l'ARN, réalisée sur des cellules métastatiques (HCCLM3) du carcinome hépatocellulaire (CHC) a déterminé qu'au niveau de leurs protrusions, certains ARNm y sont enrichis, alors qu'aux protrusions des cellules CHC non-métastatiques SMMC7721, ces ARNm n’y sont pas enrichis. L'ARNm qui encode pour le facteur de transcription STAT3 figure parmi ceux identifiés comme étant enrichis. La technique du smiFISH a été utilisée pour valider l'enrichissement de l'ARNm STAT3 au niveau des protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique. Les résultats obtenus démontrent que l'essai de déplétion de sérum permet d'induire la migration des cellules SMMC7721, HCCLM3 et MHCC97H, qui forment des protrusions de type lamellipode. En parallèle, l'expression de l'α-actinine-GFP a permis de visualiser les régions protrusives et de les délimiter. Les expériences de smiFISH et les mesures d'expression relative par RT-qPCR ont révélé que les cellules métastatiques HCCLM3 et MHCC97H expriment peu d'ARNm STAT3, comparativement aux cellules non-métastatiques SMMC7721. De plus, les quantifications absolues de l'enrichissement démontrent que dans toutes les lignées CHC, les molécules d'ARNm STAT3 uniques localisent majoritairement au niveau des corps cellulaires, et très peu dans les protrusions. Le ratio du nombre de molécules d'ARNm STAT3 uniques localisées dans les protrusions sur le nombre de molécules uniques localisées dans les corps cellulaires est nettement plus petit pour les cellules HCCLM3 et MHCC97H que pour les cellules SMMC7721. La densité de l'ARNm STAT3 / unité de surface dans les protrusions des cellules HCCLM3 et MHCC97H est inférieure à celle des cellules SMMC7721. Ensemble, ces résultats confirment qu'il n'y a pas d'enrichissement de l'ARNm STAT3 aux protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique., Subcellular mRNA localization regulates cell polarization. Asymmetric distribution of transcripts is important in cell division, cell migration, neuronal function and embryonic development. In all cell types, the mechanisms of mRNA localization are well defined, but their involvement in cancer development is still unknown. A recent study has identified protrusion-localized STAT3 mRNA in metastatic hepatocarcinoma cells (HCCLM3). In comparison, the STAT3 mRNA was not found to be enriched in the non-metastatic cells (SMMC7721) protrusions. The enrichment of the STAT3 mRNA at the protrusions of HCC cells associated with a metastatic phenotype was studied by smiFISH. Our results showed that the serum starvation assay induced lamellipodia-based migration in SMMC7721, HCCLM3 and MHCC97H cells. Also, expression of GFP-α-actinin allowed to mark the protrusive regions of migrating HCC cells. The smiFISH results and RT-qPCR quantification revealed that the metastatic cells (HCCLM3 and MHCC97H) express lower levels of STAT3 mRNA compared to the non-metastatic cells (SMMC7721). Absolute quantification of localization and enrichment revealed that STAT3 mRNA mainly localizes in the cell bodies of all HCC cell lines. The ratio of the number of single molecules of STAT3 mRNA localized in the protrusions on the number of single molecules localized in the cell bodies is smaller for the metastatic cells than the non-metastatic cells. In the metastatic cells protrusions, the density of STAT3 mRNA / unit of surface was found the be lower than the non-metastatic cells. Altogether, these results confirm that there is no enrichment of STAT3 mRNA at the protrusions of metastatic HCC cells.

Using an in vitro wound healing assay, De Pascalis et al. show that intermediate filaments (IFs) participate in the dynamics of the acto-myosin network and its association with adhesions in astrocytes during collective migration. Glial IFs control the distribution of forces and the interactions between neighboring cells, ultimately determining the speed and direction of collective migration., Mesenchymal cell migration relies on the coordinated regulation of the actin and microtubule networks that participate in polarized cell protrusion, adhesion, and contraction. During collective migration, most of the traction forces are generated by the acto-myosin network linked to focal adhesions at the front of leader cells, which transmit these pulling forces to the followers. Here, using an in vitro wound healing assay to induce polarization and collective directed migration of primary astrocytes, we show that the intermediate filament (IF) network composed of vimentin, glial fibrillary acidic protein, and nestin contributes to directed collective movement by controlling the distribution of forces in the migrating cell monolayer. Together with the cytoskeletal linker plectin, these IFs control the organization and dynamics of the acto-myosin network, promoting the actin-driven treadmilling of adherens junctions, thereby facilitating the polarization of leader cells. Independently of their effect on adherens junctions, IFs influence the dynamics and localization of focal adhesions and limit their mechanical coupling to the acto-myosin network. We thus conclude that IFs promote collective directed migration in astrocytes by restricting the generation of traction forces to the front of leader cells, preventing aberrant tractions in the followers, and by contributing to the maintenance of lateral cell–cell interactions.

Carcinoma development is a multistep process, in which accumulation of genetic alterations promotes the sustained proliferation and altered differentiation of epithelial cells. Metastasis is a critical step in cancer progression and the major cause of cancer-associated mortality. In colon cancer, twenty-five percent of patients already have metastasis at colorectal cancer diagnosis, and an additional 25-35% will develop metastases during disease progression. The metastatic colonization of distant organs requires the completion of a complex series of biological events. A crucial event in the metastatic cascade is the acquisition of a migratory phenotype by cancer cells. Most solid tumors, including colorectal cancer, are composed of a central differentiated core region and an invasive front forming the interface between tumor and stromal tissue. Although most studies have focused on cancer cell migration in the invasive front, cancer cells from the tumor core can also potentially metastasize. To address cell motility in the tumor core, we studied the behavior of cancer cells in densely packed regions at the tumor core using a mouse model of genetically-induced aggressive intestinal carcinoma. We developed a method to image tumor explants in real time using two-photon microscopy. We found that cancer cells in the tumor core are remarkably dynamic and exhibit correlated migration patterns, giving rise to local "currents" and large-scale tissue dynamics. The direction of these local currents appears to be influenced by collagen structures in the tumor core. Although cells exhibit stop-and-start migration with intermittent pauses, pausing does not appear to be required during division. Our model opens new avenues for studying the dynamics of cells in the tumor core and more generally of tumor progression., Le développement de carcinomes est un processus graduel, pendant lequel l'accumulation de modifications génétiques promeut la prolifération et la différenciation aberrante des cellules épithéliales. Le processus métastatique est la cause majeure de décès dus au cancer. Dans le cancer du côlon, vingt-cinq pourcent des patients présentent déjà des métastases au diagnostic de la maladie, et 25-35% en développent à la progression de la maladie. La colonisation métastatique d'organes distants requiert la réalisation d'une série complexe d'événements. L'acquisition d'un phénotype migratoire par les cellules cancéreuses est un événement crucial dans le processus métastatique. La plupart des tumeurs solides, y compris le cancer du côlon, sont composées par un cœur tumoral différencié et par un front invasif qui forme l'interface entre la tumeur et le tissu stromal. Bien que de nombreuses études ont porté sur la migration des cellules cancéreuses dans le front invasif, les cellules du cœur tumoral peuvent également potentiellement métastaser. Nous avons étudié la migration des cellules cancéreuses dans le cœur tumoral grâce à un modèle murin de tumorigenèse intestinale génétiquement induite. Nous avons développé une technique d'imagerie pour suivre en temps réel la migration cellulaire dans des explants tumoraux en utilisant la microscopie biphotonique. Nous avons trouvé que les cellules cancéreuses dans le cœur tumoral sont remarquablement dynamiques et suivent les schémas de migration coordonnées, ce qui donne naissance à des « courants » cellulaires et à des dynamiques à large échelle. La direction de ces courants est influencée par des structures de collagène dans le cœur tumoral. Bien que les cellules s'arrêtent de migrer de façon intermittente, les pauses dans la migration ne sont pas nécessaires au moment de la division cellulaire. En conclusion, notre modèle ouvre une nouvelle voie d'étude de la dynamique des cellules cancéreuses dans le cœur tumoral et plus largement de la progression tumorale.

Le carcinome séreux de haut grade (HGSC) de l'ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. Bien que les découvertes récentes aient fait progresser notre compréhension de l'agressivité du HGSC, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de ce cancer demeurent peu clairs. L'une des principales caractéristiques des tumeurs agressives est leur capacité à métastaser. En général, les cancers épithéliaux de l'ovaire se propagent par extension locale, invasion lymphatique et implantation intrapéritonéale. Des études ont suggéré que la protéine LIV-1, un transporteur de zinc, joue un rôle important dans la formation de métastases dans différents tissus. Néanmoins, aucune étude ne rapporte le rôle de LIV-1 dans les métastases du HGSC. Nous avons donc étudié l’impact de LIV-1 sur le potentiel invasif et migratoire des cellules HGSC. Nous avons observé des niveaux d'expression variables du gène et de la protéine LIV-1 dans 14 lignées cellulaires du HGSC. Bien qu'une corrélation positive ait été observée entre l'expression du gène et les quantités de protéine LIV-1, cette corrélation n'était pas forte et non significative. Nous avons par ailleurs choisi cinq lignées cellulaires pour effectuer des tests biologiques, en fonction de leurs niveaux protéiques: TOV3133G et TOV2295(R) (haute), TOV2978G (moyenne), et TOV1369 et OV866 (2) (faible). Nous avons trouvé qu'il y avait une forte et significative corrélation positive entre les niveaux de LIV-1 et le potentiel invasif de ces cellules HGSC (R2 = 0.8666, p = 0.0216), mais une faible corrélation négative (non significative) avec le potentiel de migration (R2 = 0.4514, p = 0.2142). Des expériences d'ARNi ont montré qu'une expression réduite de la protéine LIV-1 inhibe la capacité invasive. Cependant, aucune différence significative n'a été observée en ce qui concerne la capacité de migration. Nos résultats suggèrent que LIV-1 joue un rôle positif dans la progression tumorale de HGSC. Nous avons démontré que LIV-1 est impliqué dans l'invasion in vitro mais pas dans la migration des cellules HGSC, et que son expression est associée aux formes les plus avancées du cancer de l'ovaire, suggérant que LIV-1 pourrait être un marqueur potentiel de l'agressivité tumorale, High-grade serous carcinoma (HGSC) of the ovary is the most lethal gynecological cancer. Although recent progress has advanced our understanding in the aggressiveness of HGSC, the molecular mechanisms involved in the development of this cancer remain unclear. One of the main features of aggressive tumours is their ability to metastasize. In general, epithelial ovarian cancers (EOCs) spread through local extension, lymphatic invasion, and intraperitoneal implantation. Studies have suggested that the zinc transporter LIV-1 protein has an important role in tumour metastasis in different tissues. However, there are no reports on the role of LIV-1 in HGSC metastasis. We investigated the role of LIV-1 in the invasive and migration potential of HGSC cells. We observed variable expression levels of the LIV-1 gene and protein in 14 HGSC cell lines. Although a positive correlation was observed between the gene expression and the quantities of LIV-1 protein, this correlation was not strong and not significant; thus, we chose five cell lines to perform biological assays, based on their protein levels: TOV3133G and TOV2295(R) (high), TOV2978G (medium), and TOV1369 and OV866(2) (low). We found that there was a strong and significant positive correlation between LIV-1 levels and the invasive potential of these HGSC cells (R2 = 0.8666, p = 0.0216), but a weak and negative correlation (not significant) with their migration potential (R2 = 0.4514, p = 0.2142). RNAi experiments demonstrated that reduced LIV-1 expression inhibits invasive capacity; however, no significant differences were observed in regard to migration capacity. Our results suggest that LIV-1 has a positive role in favouring the tumour progression of HGSC. We have demonstrated that LIV-1 is involved in the in vitro invasion but not migration of HGSC cells, and that its expression is associated with more aggressive ovarian cancers,suggesting LIV-1 as a potential marker for tumour aggressiveness.

Over the past two decades, studies have been conducted to measure the mechanical forces exerted by living cells on their environment. This has led to the development of a variety of ingenious techniques that have been primarily developed to understand how cells exert forces during their migration on 2D substrates. However, in vivo, cells migrate through three-dimensional (3D) environments and the mechanisms used to migrate in 3D differ significantly from those of 2D migration. For example, confined cells in 3D encountering constrictions need to deform their nucleus, their largest and most rigid organelle. In 2D, kernels are not limiting factors for migration. It is therefore necessary to develop tools to understand how cells migrate in 3D. In particular, studies need to be conducted to determine how cells apply forces based on the level of containment they encounter. To answer this difficult question, we have developed two types of micro-devices. First, we designed and manufactured a microfluidic device to study the forces generated by cells during a confined migration. This device consists of microchannels of controlled dimensions equipped with micropiliers, serving as force sensors. These force sensors have a sensitivity of the order of 70 pN. We then introduced into the device human macrophages, cells of the immune system, inside the device and evaluated the bending of micropiliers generated by the cellular forces applied during their migration. Through the development of an algorithm for image analysis, we have been able to evaluate the forces generated in different cell areas and reveal that cells are redirecting pressure forces from the inside to the outside as the degree of containment increases. This observation suggests a very specific mode of migration related to spatial confinement that is based on the support without adhesion on the obstacles of the environment. In a second time we made three-dimensional networks obtained by a 3D bi-photonic lithography method. Les motifs de ces réseaux possèdent des dimensions caractéristiques de l'échelle cellulaire (1-10 μm) et sont composés de poutres suspendues qui peuvent être courbés par les cellules vivantes qui migrent au sein du treillis tri-dimensionnel. En enregistrant une séquence vidéo des déformations de l'échafaudage, nous pouvons étudier l'activité mécanique de la cellule dans l'espace et le temps pendant sa migration 3D. Nos résultats montrent que les macrophages sont capables de pénétrer dans des réseaux de géométrie cubique lorsque la période du réseau est supérieure à 5 μm et que le support de migration lui-même peut être utilisé comme capteur pour mesurer les forces exercées par les cellules. Grâce à la mesure de la rigidité du matériau constituant le treillis 3D et des modélisations de la déformation élastique de la structure 3D, nous avons pu évaluer que la contrainte mécanique globale qu’exerce un macrophage sur son microenvironnement est de l’ordre de 500 kPa. Grâce à la combinaison de la microfabrication, l'imagerie cellulaire et l'analyse automatisée des images, nous sommes parvenus à quantifier les efforts mécaniques cellulaires mis en jeu lors de la migration de macrophages humains au sein d’environnements confinés et nous mettons ainsi en lumière la mécanique spécifique des cellules migrant en 3D., Au cours des deux dernières décennies, des études ont été réalisée pour mesurer les forces mécaniques exercées par des cellules vivantes sur leur environnement. Cela a conduit au développement de diverses techniques ingénieuses qui ont principalement été réalisées pour comprendre la façon dont les cellules exercent des forces pendant leur migration sur des substrats bidimensionnels (2D). Cependant, in vivo, les cellules migrent à travers des environnements tridimensionnels (3D) et les mécanismes utilisés pour migrer en 3D diffèrent significativement de ceux de la migration 2D. A titre d'exemple, les cellules confinées en 3D rencontrant des constrictions ont besoin de déformer leur noyau, leur organelle le plus grand et le plus rigide. En 2D, les noyaux ne sont pas des facteurs limitants pour la migration. Il est donc nécessaire de développer des outils pour comprendre comment les cellules migrent en 3D. En particulier, des études doivent être menées pour déterminer comment les cellules appliquent des forces en fonction du niveau de confinement auquel elles se trouvent confrontées. Pour répondre à cette question difficile, nous avons développé deux types de micro-dispositifs. Tout d'abord, nous avons conçu et fabriqué un dispositif de microfluidique pour étudier les forces générées par les cellules pendant une migration confinée. Ce dispositif est constitué de microcanaux de dimensions contrôlées équipés de micropiliers, servant de capteurs de forces .Ces capteurs de forces présentent une sensibilité de l’ordre de 70 pN. Nous avons ensuite introduit dans le dispositif des macrophages humains, cellules du système immunitaire, à l'intérieur du dispositif et évalué la flexion des micropiliers engendrée par les forces cellulaires appliquées lors de leur migration. Grâce au développement d’un algorithme permettant l’analyse des images, nous avons pu évaluer les forces générées dans différentes zones cellulaires et révéler que les cellules redirigent les forces de pression de l'intérieur vers l'extérieur lorsque le degré de confinement augmente. Cette observation suggère un mode de migration très spécifique lié au confinement spatial qui est basé sur l’appui sans adhésion sur les obstacles de l’environnement. Dans un deuxième temps nous avons fabriqué des réseaux tri-dimensionnels obtenus par une méthode de lithographie bi-photonique 3D. Les motifs de ces réseaux possèdent des dimensions caractéristiques de l'échelle cellulaire (1-10 μm) et sont composés de poutres suspendues qui peuvent être courbés par les cellules vivantes qui migrent au sein du treillis tri-dimensionnel. En enregistrant une séquence vidéo des déformations de l'échafaudage, nous pouvons étudier l'activité mécanique de la cellule dans l'espace et le temps pendant sa migration 3D. Nos résultats montrent que les macrophages sont capables de pénétrer dans des réseaux de géométrie cubique lorsque la période du réseau est supérieure à 5 μm et que le support de migration lui-même peut être utilisé comme capteur pour mesurer les forces exercées par les cellules. Grâce à la mesure de la rigidité du matériau constituant le treillis 3D et des modélisations de la déformation élastique de la structure 3D, nous avons pu évaluer que la contrainte mécanique globale qu’exerce un macrophage sur son microenvironnement est de l’ordre de 500 kPa. Grâce à la combinaison de la microfabrication, l'imagerie cellulaire et l'analyse automatisée des images, nous sommes parvenus à quantifier les efforts mécaniques cellulaires mis en jeu lors de la migration de macrophages humains au sein d’environnements confinés et nous mettons ainsi en lumière la mécanique spécifique des cellules migrant en 3D.

In the developing brain, cortical interneurons undergo a long distance migration to reach the cortex where they integrate into cortical networks and regulate their activity in the adult. Different chemical factors have been involved in the guidance of these cells, but the influence of the physical parameters of the environment in which they navigate remains unclear. It has been shown that topographical cues are able to influence and guide the migration of several cell types, a process called contact guidance. This work therefore aimed at testing and understanding the influence of the topography of the environment in the migration of cortical interneurons. By using an experimental system of microstructured substrates, we demonstrated for the first time the existence of contact guidance for these cells. By testing two types of micron-sized pillars, we showed that a change in the shape of the structures could greatly impact cell orientation, morphology, cytoskeleton organization and dynamic behavior. In particular, most interneurons migrating in between square pillars adopt an elongated, unbranched morphology associated with a slow and directed movement, whereas the majority of cells among round pillars exhibit a short and branched morphology associated with a dynamic but wandering movement. Overall, we show that micron-sized topography provides global spatial constraints promoting the establishment of different morphological and migratory states in vitro, highlighting the potential importance of these types of cues in vivo., Dans le cerveau en développement, les interneurones corticaux effectuent une longue migration avant de se positionner dans le cortex et s’intégrer dans les réseaux corticaux dont ils régulent l’activité. Différents facteurs chimiques ont été impliqués dans le guidage de ces cellules, mais l’influence des propriétés physiques de l’environnement dans lequel ils naviguent reste peu connue. Il a été montré que les indices topographiques peuvent guider le mouvement de nombreux types cellulaires, un processus appelé guidage par contact. Mes travaux de thèse ont ainsi cherché à tester et comprendre l’influence de la topographie de l’environnement sur la migration des interneurones corticaux. En utilisant un système expérimental de substrats microstructurés, nous avons mis en évidence pour la première fois l’existence du guidage par contact pour ces cellules. En testant deux types de micro-plots, nous avons établi qu’un changement de forme des structures influence de manière importante l’orientation, la morphologie, l’organisation du cytosquelette et le comportement dynamique des cellules. En particulier, les interneurones en migration entre des plots carrés adoptent majoritairement une morphologie allongée et peu branchée, associée à un mouvement lent et dirigé. A l’inverse, des cellules entre des plots ronds sont plus courtes et montrent un branchement important associé à un mouvement dynamique mais aléatoire. Plus généralement, nous montrons in vitro que la topographie génère des contraintes spatiales globales qui promeuvent la mise en place de différents états cellulaires morphologiques et dynamiques, soulignant ainsi la potentielle importance de ce type d’indices in vivo.

In the developing brain, cortical interneurons undergo a long distance migration to reach the cortex where they integrate into cortical networks and regulate their activity in the adult. Different chemical factors have been involved in the guidance of these cells, but the influence of the physical parameters of the environment in which they navigate remains unclear. It has been shown that topographical cues are able to influence and guide the migration of several cell types, a process called contact guidance. This work therefore aimed at testing and understanding the influence of the topography of the environment in the migration of cortical interneurons. By using an experimental system of microstructured substrates, we demonstrated for the first time the existence of contact guidance for these cells. By testing two types of micron-sized pillars, we showed that a change in the shape of the structures could greatly impact cell orientation, morphology, cytoskeleton organization and dynamic behavior. In particular, most interneurons migrating in between square pillars adopt an elongated, unbranched morphology associated with a slow and directed movement, whereas the majority of cells among round pillars exhibit a short and branched morphology associated with a dynamic but wandering movement. Overall, we show that micron-sized topography provides global spatial constraints promoting the establishment of different morphological and migratory states in vitro, highlighting the potential importance of these types of cues in vivo.; Dans le cerveau en développement, les interneurones corticaux effectuent une longue migration avant de se positionner dans le cortex et s’intégrer dans les réseaux corticaux dont ils régulent l’activité. Différents facteurs chimiques ont été impliqués dans le guidage de ces cellules, mais l’influence des propriétés physiques de l’environnement dans lequel ils naviguent reste peu connue. Il a été montré que les indices topographiques peuvent guider le mouvement de nombreux types cellulaires, un processus appelé guidage par contact. Mes travaux de thèse ont ainsi cherché à tester et comprendre l’influence de la topographie de l’environnement sur la migration des interneurones corticaux. En utilisant un système expérimental de substrats microstructurés, nous avons mis en évidence pour la première fois l’existence du guidage par contact pour ces cellules. En testant deux types de micro-plots, nous avons établi qu’un changement de forme des structures influence de manière importante l’orientation, la morphologie, l’organisation du cytosquelette et le comportement dynamique des cellules. En particulier, les interneurones en migration entre des plots carrés adoptent majoritairement une morphologie allongée et peu branchée, associée à un mouvement lent et dirigé. A l’inverse, des cellules entre des plots ronds sont plus courtes et montrent un branchement important associé à un mouvement dynamique mais aléatoire. Plus généralement, nous montrons in vitro que la topographie génère des contraintes spatiales globales qui promeuvent la mise en place de différents états cellulaires morphologiques et dynamiques, soulignant ainsi la potentielle importance de ce type d’indices in vivo.

Parmi les principaux modèles de la migration cellulaire associée à l’inflammation, notons : 1. la migration des neutrophiles en réponse à des signaux de danger et 2. la migration de cellules cancéreuses d’une tumeur primaire vers un site métastatique. Dans les deux cas, la façon par laquelle les cellules traitent l’information des signaux de l’environnement est un facteur clé à la régulation des processus inflammatoires. Ce travail repose sur l’hypothèse selon laquelle la biophotonique, tels la fonctionnalisation de substrat et le traitement d’image, contribue à la compréhension de la migration cellulaire, particulièrement la plasticité des phénotypes migratoires chez les neutrophiles et les cellules cancéreuses. L’objectif du projet était donc d’étudier la migration cellulaire en appliquant les méthodes innovantes de fonctionnalisation de substrat par laser et des algorithmes de suivi des trajectoires. Dans un premier temps, le but était de déterminer la réponse des neutrophiles aux gradients de molécules chimiotactiques fonctionnalisées sur un substrat de culture. La micro-ingénierie laser de gradients moléculaires sur substrat permet de fabriquer différentes géométries et donc d’étudier in vitro la migration par haptotaxie, reproduisant les signaux perçus in vivo. J’ai développé un essai d’haptotaxie novateur en modifiant un essai classique de chambre de migration sous agarose ainsi qu’en filmant les neutrophiles à un débit permettant une analyse subtile et automatisée des mouvements des cellules. Dans un deuxième temps, j’ai appliqué les algorithmes automatisés d’analyse de trajectoires à la caractérisation de phénotypes de neutrophiles associés aux tumeurs. Cette analyse a permis d’identifier des signaux protumoraux sécrétés par l’environnement métastatique propre à un phénotype particulier de neutrophile. Dans un troisième temps, j’ai adapté la méthode de fonctionnalisation de substrats par laser, cette fois en modifiant directement la surface des cellules migrantes. Pour cette application, le marquage des membranes cellulaires permet d’identifier visuellement et fonctionnellement des cellules ayant un profil migratoire particulier. Cette thèse met en évidence l’apport des technologies émergentes, telles que la fonctionnalisation de substrats et l’analyse d’images par des algorithmes automatisés, à la compréhension des mécanismes de migration cellulaire. À travers même le contexte de l’inflammation, j’ai démontré la plasticité des phénotypes dans la réponse cellulaire aux différents signaux de l’environnement. Finalement, j’ai aussi démontré des applications potentielles de la fonctionnalisation membranaire de cellules migrantes à l’étude de différents phénotypes migratoires., Amongst the major models of cell migration in the context of inflammation, two are of interest in this thesis: 1. Neutrophil migration in response to danger signals and 2. Migration of cancer cells from a tumour site to a metastatic niche. In both cases, information processing of environmental signals is key to inflammation regulation. The hypothesis supporting this work is that biophotonics, such as substrate functionalization and image processing, contributes to the understanding of cell migration, especially plasticity in migratory phenotypes in neutrophils and cancer cells. Following this, the object of this thesis was to study cell migration applying new methods of substrate functionalization by laser and cell tracking algorithms. The first objective is to determine the neutrophils response to substrate-bound chemotactic gradients. Laser microengineering of cell culture surfaces with chemotactic cues leads to fabrication of varying gradient shapes and thus, studying in vitro haptotaxie processes, closely mimicking in vivo signals. I developed a novel migration assay by modifying the classic under-agarose assay and acquiring time-lapse imaging data set to perform subtle automated cell tracking algorithms. In the second part of this thesis, I apply an automated cell tracking algorithm to the characterization of neutrophil phenotypes associated with cancer. This analysis revealed new cues secreted by the metastatic niche to which only a subtype of neutrophil responds to. In the last part of the thesis, I adapted the substrate functionalization by laser to directly modify the surface of migrating cells. For this application, functionalizing cell membranes allows to visually and functionally mark cells with outstanding migratory profiles. This thesis shows the impact of emerging technologies such as substrate functionalization and image processing on the field on cell migration. In the context of inflammation processes, I showed the extent of cell plasticity in response to chemotactic cues. Finally, I also demonstrated potential applications of cell functionalization in studying specific migratory phenotypes

The cell motility (or migration), capacity of the cell to generate its own movement, plays an important role on numerous biological process like embryogenesis, but also in the development of pathologies like cancer. The aim of this work is to model and better understand the impact and the role of microtubules, which are dynamics elements of the cytoskeleton, on migration. To our knowledge, the action of microtubules on migration has never been studied by mathematical models. The work for this phd thesis is splitted into two parts. The first one is dedicated to the development of a model that takes into account microtubules action and second part dedicated to the development and implementation of the numerical schemes needed to solve the equations of the model. The approach that has been used couple a biomechanical model and a biochemical one proposed by Edelstein and al in 2011. The biochemical part of our model describe both the action of a Rho-GTPase protein on migration and the action of the dynamic instability of microtubules on these protein. The system proposed thus couple Stokes equations describing biomechanical aspects, reaction-diffusion equations on a moving domain for the proteins and ODE for the MT dynamics. We use a Level-Set method to describe the displacement of this moving domain. In order to use a large diversity of meshes and mostly locally refined grids, we choose to use Discrete Duality Finite Volume (DDFV). If the DDFV discretization of Stokes equations has already been studied, the resolution of transport equations induced by the Level-Set method has led to the development of a DDFV approach for WENO schemes. A description of the scheme and numerical simulations allowing to highlight its convergence and robustness are proposed. A splitting method for the diffusion on a moving domain has been improved, allowing to handle large deformations. The implementation of the schemes has been done with Fortran 90, only using previous codes allowing the computation of geometrical information for a DDFV mesh. The calibration of the parameters has been done with biological data of the literature and those obtained by the group of S. Honoré in the CRO2 lab in the hospital La Timone. The first numerical results concerning the impact of the vincristine, a drug that destabilize microtubules, on migration are presented and illustrate the using of the model.; La motilité (ou migration) cellulaire, capacité des cellules à générer un mouvement, joue un rôle important dans de nombreux processus biologiques comme l'embryogenèse, mais aussi dans le développement de pathologies telles que le cancer. L'objectif de ce travail est de modéliser et de mieux comprendre l'impact et le rôle des microtubules, éléments très dynamiques du cytosquelette, sur cette migration. A notre connaissance, l'action des microtubules sur la migration n'a pas encore été abordée à l'aide de modèles mathématiques. L'essentiel du travail effectué durant cette thèse s'est concentré en deux parties, une partie de modélisation afin de développer un modèle de migration répondant à nos attentes et une partie numérique afin de mettre en place les schémas numériques nécessaires à la résolution des équations du modèle. Le modèle qui a été développé est basé sur une description couplant un modèle biomécanique et un modèle biochimique proposé dans la littérature et décrivant l'action de la protéine Rac sur la migration. Les microtubules impactant directement cette protéine, nous avons pu enrichir ce modèle pour prendre en compte leur action. Le système proposé couple des équations de Stokes décrivant les aspects biomécanique de la migration et des équations de réactions diffusion sur domaine mobile pour les aspects biochimiques. Le suivi d'interface de ce domaine mobile est quant à lui réalisé à l'aide d'une méthode Level-Set. La modélisation numérique du problème a nécessité la mise en place et le développement d'outils numériques adaptés. Celle-ci a été effectuée en Fortran 90 depuis la création de structures de maillages jusqu'à l'implémentation de tous les différents schémas numériques. Des codes préexistants permettant de calculer les informations géométriques d'un maillage DDFV ont été utilisés. Afin de pouvoir utiliser une grande variété de maillages différents et principalement des maillages localement raffinés, notre choix s'est porté vers des méthodes de discrétisation de type Discrete Duality Finite Volume (DDFV). Si la discrétisation DDFV des équations de Stokes a déjà fait l'objet d'études, la résolution des équations de transport induites par la méthode Level-Set a conduit au développement d'une approche DDFV pour des schémas WENO. Une description du schéma et des simulations numériques permettant de mettre en avant sa convergence et sa robustesse sont proposées. Une méthode de splitting pour la diffusion sur domaine mobile a été améliorée permettant notamment la gestion de grande déformations. Enfin, la calibration des paramètres a été effectuée à l'aide de données biologiques présentes dans la littérature et d'autres obtenues par le groupe de S.Honoré menées au laboratoire CRO2 à la Timone. Les premier résultats numériques concernant l'impact sur la migration de la vincristine, agent déstabilisant les microtubules, sont présentés et illustrent l'utilité du modèle.

Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination; La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique

Microglia are blood-borne cells but take up residence in the central nervous system (CNS) during embryonic development to constitute the resident pool of immune cells. They are crucial mediators of the healthy development and maintenance of neural networks in the CNS. Many aspects of the physiology of microglia and the mechanisms underpinning their tasks during embryonic brain development are still unresolved. This doctoral dissertation focuses on migration of microglial cells during embryonic cortical development. All together, this dissertation brings forwards three major conclusions. (1) In situ embryonic microglia are highly dynamic cells that adapt their phenotype to their local environment. (2) Microglial migration speed ex vivo is dependent on β1 integrins that exert both migration promoting and inhibiting functions which are age-specifically regulated. (3) Microglia likely play a role in the etiology of neurodevelopmental disorders, but further research should focus on microglia dysfunction rather than classical microglial immune activation.; Les microglies sont des cellules hématogène mais prennent place dans le système nerveux central (SNC) au cours du développement embryonnaire pour constituer la population résidente des cellules immunitaires. Elles sont les médiateurs crucials du bon développement et de l'entretien des réseaux de neurones dans le SNC. De nombreux aspects de la physiologie microgliale et les mécanismes qui sous-tendent leurs fonctions au cours du développement embryonnaire du cerveau sont encore largement méconnues. Cette thèse de doctorat porte sur la migration des cellules microgliales au cours du développement embryonnaire du cortex et elle débouche sur trois grandes conclusions. (1) Les cellules microgliales embryonnaires in situ sont très dynamiques et adaptent leur phénotype à leur environnement local. (2) La vitesse de migration des microglies ex vivo dépend des intégrines beta1 qui exercent des fonctions à la fois inhibitrices et promotrices sur la migration selon l'âge embryonnaire. (3) Les microglies jouent probablement un rôle dans l'étiologie des troubles du développement neurologique, mais il faudrait que les futures recherches se concentrent sur le dysfonctionnement des microglies plutôt que sur leur activation immunitaire classique.

La kinase ERK3 est un membre atypique de la famille des MAP Kinases. Contrairement aux MAP Kinases conventionnelles qui peuvent phosphoryler une grande variété de substrats, et dont les fonctions sont bien définies, les déterminants moléculaires des fonctions de ERK3 restent peu caractérisés. Les études de la régulation de ERK3 font ressortir plusieurs particularités qui sont uniques au sein de la famille des MAP Kinases. ERK3 semblent être phosphorylée de manière constitutive sur sa boucle d’activation. De plus, ERK3 est une protéine hautement instable, qui est dégradée constitutivement par le système ubiquitine-protéasome. Cette régulation de la stabilité de ERK3 est un processus dynamique, car il peut être modulé par certains stimuli physiologiques. Il semble donc que la stabilité de la protéine ERK3 est un des régulateurs majeurs de son activité biologique. Toutefois, les composantes du système ubiquitine-protéasome qui contrôlent la stabilité de ERK3 restent à identifier. La première étude présentée décrit l’identification de la déubiquitinase USP20 comme un régulateur positif de la stabilité et de l’expression protéique de ERK3. Nos résultats indiquent que USP20 est une déubiquitinase de ERK3, en démontrant la relation enzymatique directe entre les deux protéines. Finalement, nous avons identifié une nouvelle fonction pour ERK3 dans le contrôle de la migration cellulaire et déterminé que USP20 est un régulateur positif de cette fonction cellulaire. Dans la deuxième étude nous décrivons la réalisation d’un crible fonctionnel pour identifier les ubiquitines ligases et conjugases qui régulent la dégradation de ERK3. Nos résultats décrivent la mise au point d’un système rapporteur de la stabilité protéique, utilisable dans les études automatisées à haut débit. Parmi les régulateurs identifiés, nos efforts se sont concentré sur l’ubiquitine ligase E6AP, dont nous avons démontré la fonction régulatrice de la stabilité et de l’expression protéique de ERK3. Finalement nous avons démontré que E6AP contrôle l’ubiquitination de ERK3. En conclusion, nos travaux ont permis d’identifier certains régulateurs de la stabilité de ERK3 et d’en caractériser des nouvelles fonctions. De plus, nos études fournissent des pistes d’études pour mieux comprendre les fonctions biologiques de ERK3, qui restent à l’heure actuelle encore peu définies., ERK3 kinase is an atypical member of the MAP Kinase family. Conventional MAP Kinases phosphorylate a wide array of substrates and have well characterized functions whereas ERK3 biological activity is still poorly described. ERK3 regulations are unique among MAP Kinase family. Indeed, ERK3 seems constitutively phosphorylated on its activation loop. Moreover, ERK3 is a highly unstable protein, constitutively degraded by the ubiquitin-proteasome system. These observations suggest that ERK3 stability is a key regulator of its biological activity. Nonetheless, components of the ubiquitin-proteasome machinery regulating ERK3 turnover remain to be identified. The first part of my work identifies and characterizes USP20 deubiquitinase as a positive regulator of ERK3 protein expression and stability. By means of a direct enzymatic activity experiment, our results indicate that UPS20 is a bona fide deubiquitinase of ERK3. Finally, we identified a novel function of ERK3 in the control of cell migration and we determined the involvement of USP20 as an upregulator of this cellular function. The second part of my research illustrates the product of a functional screen that identifies ubiquitin ligases and conjugases regulating ERK3 degradation. Our results discuss the development of a reporter system of protein turnover, suitable for high-throughput experiments. Among the identified regulators, we focused on E6AP ubiquitin ligase, for which we showed a function in the regulation of ERK3 protein abundance and turnover. Ultimately, we demonstrated the E6AP controls ERK3 ubiquitination. In conclusion, our work permits the identification of regulators of ERK3 protein stability and characterization of new cellular functions. Moreover, this study provides innovative avenues to better understand the biological activity of ERK atypical MAP Kinase.

Malignant and stromal cells are strong producer of the chemokine CCL2 in most human cancers. The chemokine axis CCR2/CCL2 is thus a key marker of cancer development, but is also associated with relapse following therapy. Tumour associated macrophages (TAM) and regulatory T cells (Treg) display robust immunosuppressive capacities and contribute to tumour growth. My thesis work focused on the function of the expression of the chemokine receptor CCR2 by these cell types in the context of anticancer therapies. We have shown that CCR2 controls the migration of Treg in tumoral context, in both human and mice, and that the expression of this receptor by Treg could serve as a biomarker of the response to chemotherapy. Our study indicate a novel function of CCR2, defining at the same time a new Treg subset implicated in the regulation of antitumor immunity.We have also demonstrated that pulmonary metastases are composed of both tissue resident and recruited macrophages. The presence of resident macrophages within tumours could contribute to the heterogeneity of the microenvironment of different tumour types. CCR2 is largely implicated in the relapse phase following chemotherapy, indicating a limited role for resident macrophages in this phenomenon. Meanwhile, we have demonstrated that VEGF plays a direct role in TAM survival. The combination of chemotherapy with an anti-VEGF antibody targets both resident and recruited TAM, thereby enhancing the efficacy of chemotherapy. Finally, we have shown that the CCR2/CCL2 axis is implicated in the response to radiotherapy by enhancing the recruitment of both Treg and TAM. This work provides evidences for a central role of the CCR2/CCL2 axis in mediating Treg and TAM co-localization in response to anticancer therapy, this axis could also contribute to establishment of immunosuppressive networks in tumours. Our results provide a better understanding of the immune mechanism implicated in resistance to anticancer therapies., Une forte production de la chimiokine CCL2 par les cellules malignes et les cellules stromales a été démontrée dans la plupart des cancers humains. Ainsi, l’axe chimiokinique CCR2/CCL2 est un important marqueur du développement des cancers ; ce même axe est associé à la récurrence de tumeurs après thérapie anticancéreuses. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Treg) ont des capacités immunosuppressives robustes et contribue à la croissance tumorale. Durant cette thèse, je me suis intéressé à la fonction de l’expression du récepteur de chimiokine CCR2 par ces cellules dans le contexte de thérapies anticancéreuses. Nous avons montré que le récepteur de chimiokines CCR2 contrôle la migration des Treg en contexte tumoral, chez l’homme et la souris, et que son expression par les Treg peut servir de biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie. Notre étude indique une nouvelle fonction de CCR2 et définie un nouveau sous-type de Treg impliqué dans la régulation de l’immunité antitumorale. En parallèle, nous avons pu mettre en évidence que les métastases pulmonaire sont composées à la fois de macrophages résident du tissu et de macrophages recrutés via l’axe CCR2. La présence de macrophages résidents au sein des tumeurs pourrait contribuer à l’hétérogénéité des microenvironnements de diffèrent type de tumeurs. Le récepteur CCR2 est important pour le la phase de rechute après chimiothérapie, indiquant un rôle limité des macrophages résidents dans ce phénomène. De plus, nous avons montré que le VEGF joue un rôle direct dans la survie des TAM. Ainsi, la combinaison de la chimiothérapie avec un anticorps anti-VEGF cible simultanément les TAM résidents et recrutés et permet d’augmenter l’efficacité de la chimiothérapie.

Curcumin is a phenolic compound that exhibits beneficial properties for cardiometabolic health. We previously showed that curcumin reduced the infiltration of immune cells into the vascular wall and prevented atherosclerosis development in mice. This study aimed to investigate the effect of curcumin on monocyte adhesion and transendothelial migration (TEM) and to decipher the underlying mechanisms of these actions. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were exposed to curcumin (0.5-1μM) for 3h prior to their activation by Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α). Endothelial permeability, monocyte adhesion and transendothelial migration assays were conducted under static condition and shear stress that mimics blood flow. We further investigated the impact of curcumin on signaling pathways and on the expression of genes using macroarrays. Pre-exposure of endothelial cells to curcumin reduced monocyte adhesion and their transendothelial migration in both static and shear stress conditions. Curcumin also prevented changes in both endothelial permeability and the area of HUVECs when induced by TNF-α. We showed that curcumin modulated the expression of 15 genes involved in the control of cytoskeleton and endothelial junction dynamic. Finally, we showed that curcumin inhibited NF-κB signaling likely through an antagonist interplay with several kinases as suggested by molecular docking analysis. Our findings demonstrate the ability of curcumin to reduce monocyte TEM through a multimodal regulation of the endothelial cell dynamics with a potential benefit on the vascular endothelial function barrier.

Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination, La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique

Proteoglycans (PGs) play important roles in many physiological processes, including cell proliferation, differentiation and migration. PGs are composed of linear heteropolysaccharide chains, called glycosaminoglycans (GAGs), which are covalently attached to a core protein through a tetrasaccharide linkage. The addition of the third residue (galactose) of the linkage is catalyzed by ß1,3-galactosyltransferase 6 (ß3GalT6), a key glycosyltransferase in GAG initiation. Recently, mutations of ß3GalT6 have been associated to Ehlers-Danlos Syndrome (EDS), a group of rare and severe genetic connective tissue disorders. However, the role of ß3GalT6 defects in EDS pathogeny remains unknown. In my thesis, we showed that ß3GalT6 defective dermal fibroblasts of affected patients exhibited a marked reduction in GAG anabolism associated to a significant delay in wound closure compared to control cells. The ß3GalT6 gain- and loss-of-function studies demonstrated that B3GALT6 gene deletion in control fibroblasts affects the synthesis of GAGs chains. Interestingly, GAG anabolism and cell migration were restored when ß3GalT6 is overexpressed in patient fibroblasts, which could be the starting point to the development of therapeutic strategies against the loss of GAG synthesis and defect of cell migration observed in EDS. This work provides a better understanding of the crucial role of ß3GalT6 in EDS pathogeny, Les protéoglycanes (PGs) jouent un rôle important dans de multiples processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires. Les PGs sont constitués d’une protéine porteuse sur laquelle sont fixées de façon covalente des chaînes hétéropolyssacharidiques de glycosaminoglycanes (GAGs). L’initiation de la biosynthèse des GAGs sur les PGs implique une glycosyltransférase, la ß1,3-galactosyltransférase 6 (ß3GalT6) qui catalyse l’addition d’un résidu galactose sur un disaccharide accepteur (Gal-Xyl) fixé au niveau de motifs d’ancrage des GAGs sur la protéine porteuse du PG. Des mutations de la ß3GalT6 ont été récemment associées à une forme pléiotropique du syndrome d’Ehlers-Danlos (SED), un groupe hétérogène de maladies génétiques rares touchant les constituants matriciels des tissus conjonctifs. L’implication de la ß3GalT6 dans la pathogénie du SED n’est cependant pas encore connue à ce jour, point qui sera exploré au cours de ce travail de thèse. Nous avons montré que la mutation du gène B3GALT6 conduit à une diminution de la biosynthèse des GAGs matriciels et membranaires, associée à une réduction de la capacité migratoire des fibroblastes de derme humain issus de patients atteints de SED par rapport aux fibroblastes contrôle, non porteurs de l’altération génétique. Une étude “gain et perte de fonction” a montré que l’extinction du gène B3GALT6 dans des fibroblastes contrôle impacte la biosynthèse des GAGs. De façon complémentaire, la restauration de l’expression de la ß3GalT6 dans les fibroblastes des patients a eu pour conséquences une augmentation du taux de synthèse des GAGs matriciels et membranaires, associée à une augmentation significative de la capacité de migration des cellules équivalente à celle des cellules non déficientes. Les résultats obtenus nous permettent de mieux comprendre le rôle de la ß3GalT6 dans la pathogénie du SED. Ces travaux ciblant la ß3GalT6 peuvent ouvrir la perspective de proposer des stratégies thérapeutiques visant à s’opposer à la perte d’anabolisme des GAGs et au défaut de migration observés dans le SED.

Collective or individual cell displacements are essential in fundamental physiological processes (immune response, embryogenesis) as well as in pathological developments (tumor metastasis). The intracellular processes responsible for cell motion have a complex self-organized activity spanning different time and space scales. Highlighting general principles of migration is therefore a challenging task.In a first part, we build stochastic particular models of migration. To do so, we describe key intracellular processes as discrete in space by using stochastic population models. Then, by a renormalization in large population, infinitesimal size and accelerated dynamics, we obtain continuous stochastic equations for the dynamics of interest, allowing a relation between the intracellular dynamics and the macroscopic displacement.First, we study the case of a leukocyte carried by the blood flow and developing adhesive bonds with the artery wall, until an eventual stop. The binding dynamics is described by a stochastic Birth and Death with Immigration process. These bonds correspond to resistive forces to the motion. We obtain explicitly the mean stopping time of the cell.Then, we study the case of cell crawling, that happens by the formation of protrusions on the cell edge, that grow on the substrate and exert traction forces. We describe this dynamics by a structured population process, where the structure comes from the protrusions' orientations. The limiting continuous model can be analytically studied in the 1D migration case, and gives rise to a Fokker-Planck equation on the probability distribution for the protrusion density. For a stationary profile, we can show the existence of a dichotomy between a non motile state and a directional displacement state.In a second part, we build a deterministic minimal migration model in a discoïdal cell domain. We base our work on the idea such that the structures responsible for migration also reinforce cell polarisation, which favors in return a directional displacement. This positive feedback loop involves the convection of a molecular marker, whose inhomogeneous spatial repartition is characteristic of a polarised state.The model writes as a convection-diffusion problem for the marker's concentration, where the advection field is the velocity field of the Darcy fluid that describes the cytoskeleton. Its active character is carried by boundary terms, which makes the originality of the model.From the analytical point of vue, the 1D model shows a dichotomy depending on a critical mass for the marker. In the subcritical and critical cases, it is possible to show global existence of weak solutions, as well as a rate-explicit convergence of the solution towards the unique stationary profile, corresponding to a non-motile state. Above the critical mass, for intermediate values, we show the existence of two additional stationary solutions corresponding to polarised motile profiles. Moreover, for asymmetric enough initial profiles, we show the finite time apparition of a blowup.Studying a more complex model involving activation of the marker at the cell membrane permits to get rid of this singularity.From the numerical point of vue, numerical experiments are led in 2D either in finite volumes (Matlab) or finite elements (FreeFem++) discretizations. They allow to show both motile and non motile profiles. The effect of stochastic fluctuations in time and space are studied, leading to numerical simulations of cases of responses to an external signal, either chemical (chemotaxis) or mechanical (obstacles).; Les déplacements cellulaires, collectifs ou individuels, sont essentiels pour assurer des fonctions fondamentales de l'organisme (réponse immunitaire, morphogenèse), mais jouent également un rôle crucial dans le développement de certaines pathologies (invasion métastatique).Les processus cellulaires à l'origine du déplacement forment une activité complexe, auto-organisée et fortement multi-échelle en temps mais aussi en espace. Mettre en évidence des principes généraux de la migration est donc un enjeu majeur. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la construction de modèles de migration individuelle qui prennent en compte ce caractère multi-échelle de manière minimale.Dans une première partie, nous nous intéressons à des modèles particulaires. Nous décrivons des processus intracellulaires clés de la migration de manière discrète au moyen de processus de population. Puis, par une renormalisation en grand nombre d'individus, taille infinitésimale et dynamique accélérée, nous obtenons des équations de dynamique continue et stochastique, permettant de faire le lien entre la dynamique intracellulaire et le déplacement macroscopique.Nous nous confrontons d'abord à la situation d'un leucocyte se déplaçant dans une artère, et développant des liaisons de différentes natures avec les molécules de la paroi, jusqu'à éventuellement s'arrêter. La dynamique de formation de liaisons est décrite par un processus stochastique de type Naissance et Mort avec Immigration. Ces liaisons correspondent à des forces de résistance au mouvement. Nous obtenons explicitement le temps d'arrêt moyen de la cellule.Puis, nous nous intéressons à la reptation cellulaire, qui se produit grâce à la formation d'excroissances au bord de la cellule, appelées protrusions, qui avancent sur le substrat et exercent des forces de traction. Nous modélisons cette dynamique au moyen d'un processus de population structurée par l'orientation de la protrusion. Le modèle continu limite obtenu peut être étudié pour la migration 1D, et donne lieu à une équation de Fokker-Planck sur la distribution de probabilité de la population de protrusion. L'étude d'une configuration stationnaire permet de mettre en avant une dichotomie entre un état non motile et un état de déplacement directionnel.Dans une seconde partie, nous construisons un modèle déterministe minimal de migration dans un domaine discoïdal non déformable. Nous nous basons sur l'idée selon laquelle les structures responsables de la migration renforcent la polarisation de la cellule, ce qui favorise en retour un déplacement directionnel. Cette boucle positive passe par le transport d'un marqueur moléculaire dont la répartition inhomogène caractérise un état polarisé.Le modèle comporte un problème de convection-diffusion sur la concentration en marqueur, où le champs d'advection correspond à la vitesse d'un fluide de Darcy modélisant le cytosquelette. Son caractère actif est porté par des termes de bord, ce qui fait l'originalité du modèle.Du point de vue analytique, le modèle 1D présente une dichotomie face à une masse critique. Dans les cas sous-critique et critique, il est possible de montrer l'existence globale de solutions faibles, ainsi que la convergence à taux explicite vers l'unique état stationnaire correspondant à un état non polarisé. Au delà de la masse critique et pour des masses intermédiaires, nous mettons en évidence deux états stationnaires supplémentaires correspondant à des profils polarisés. De plus, pour des conditions initiales assez asymétrique, nous démontrons l'apparition d'un blow-up en temps fini.Du point de vue numérique, des tests numériques en 2D sont effectués en volumes finis (Matlab) et éléments finis (FreeFem++). Ils permettent de mettre en évidence à nouveau des états motiles et non motiles. L'effet de perturbations stochastiques est étudié, permettant d'aborder des cas de réponse à des signaux extérieurs chimique (chimiotactisme) ou mécanique (obstacle).

During development, cells are progressively separated into distinct territories, delimited by embryonic boundaries. The first segregation event occurs during gastrulation, when the embryo is organised in three germ-layers, the ectoderm, the mesoderm and the endoderm. The molecular and cellular mechanisms ensuring this segregation have not yet been elucidated. During my PhD thesis, I have focused on the endoderm internalisation in the zebrafish embryo. Based on in vitro results, it has been suggested that germ-layer progenitors would be segregated by a passive cell sorting. Combining cell transplantation, live confocal microscopy and functional analyses, I have shown that endodermal cell internalisation actually results from an active migration process dependent on Rac1 and its effector Arp2/3, a direct regulator of actin. Strikingly, endodermal cells are not attracted to their internal destination but rather appear to migrate out of their neighbouring cells. This process is dependent on the Wnt/PCP pathway and N-cadherin. Furthermore, N-cadherin is sufficient to trigger the internalisation of ectodermal cells, without affecting their fate. Overall, these results lead to a new model of germ-layer formation, in which endodermal cells actively migrate out of the epiblast to reach their internal position., Au cours du développement, les cellules sont progressivement séparées dans des territoires distincts délimités par des frontières embryonnaires. La première ségrégation a lieu pendant la gastrulation, quand l’embryon s’organise en trois feuillets embryonnaires, l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. Les mécanismes moléculaires et cellulaires assurant cette ségrégation n’ont pas encore été élucidés. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur l’internalisation de l’endoderme chez le poisson-zèbre. À partir de résultats in vitro, il a été suggéré que les progéniteurs de feuillets embryonnaires soient ségrégés par un tri cellulaire passif. En combinant des expériences de transplantation de cellules, une imagerie confocale en temps réel et des analyses fonctionnelles, j’ai montré que l’internalisation des cellules endodermiques est due en réalité à un processus de migration active dépendante de Rac1 et de son effecteur Arp2/3, un régulateur direct de l’actine. De manière surprenante, les cellules endodermiques ne sont pas attirées par leur destination interne, mais semblent plutôt migrer hors de leurs voisines. Ce processus est dépendant de la voie Wnt/PCP et de la N-cadhérine. De plus, la N-cadhérine est suffisante pour induire l’internalisation de cellules ectodermiques, sans modifier leur identité. Dans leur ensemble, ces résultats conduisent à un nouveau modèle de formation des feuillets embryonnaires dans lequel les cellules endodermiques migrent activement hors de l’épiblaste pour atteindre leur position interne dans l’embryon.

Les lésions musculo-squelettiques sont fréquentes chez le cheval. La cicatrisation de ce type de lésion est souvent de mauvaise qualité ce qui entraîne un fort taux de récidive. Par exemple, c’est le cas pour la tendinite ou pour la dégénérescence du cartilage articulaire. Les traitements classiques sont parfois insuffisants pour guérir de telles affections. Ces dernières années, les traitements appartenant à la branche de la médecine régénérative ont fait leur apparition. La thérapie par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a déjà prouvé son efficacité dans le traitement des lésions ostéo-articulaires et l’utilisation des concentrés plaquettaires commence à se démocratiser. Le PRF (fibrine riche en plaquette) est un composé plaquettaire original, composé d’un réseau tridimensionnel de fibrine permettant l’enchevêtrement de plaquettes, leucocytes et facteurs de croissance en grande quantité. L’utilisation conjointe de CSM et de PRF pour répondre au traitement d’affection ostéo-articulaire et l’étude de leurs interactions sont très peu documentées dans la littérature. Nos expériences permettent d’affirmer que les CSM présentent un tropisme pour le PRF et que la migration cellulaire au sein de la fibrine est possible. Cet assemblage pourrait être un biomatériau de comblement idéal notamment pour des tissus dont la cicatrisation est incomplète et/ou de mauvaise qualité.

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer., The Gab1 scaffolding protein allows signaling of multiple Receptors Tyrosine Kinase (RTKs). Among other things, it allows VEGFR2 signaling, an essential RTK to mediate angiogenesis via VEGF in endothelial cells. In response to VEGF, Gab1 is tyrosine phosphorylated, resulting in the formation of a signaling protein complex involved in the remodeling of the actin cytoskeleton and the migration of endothelial cells. Gab1 is a key modulator of angiogenesis in vitro and in vivo. However, despite the importance of Gab1 in endothelial cells, the molecular mechanisms involved in mediating its functions remain poorly defined and the participation of the second family member, Gab2, remains unknown. Initially, we demonstrated that as with Gab1, Gab2 is tyrosine phosphorylated, it associates with similar signaling proteins and induces cell migration in response to VEGF in endothelial cells. However, Gab2 does not interact with VEGFR2 and is not essential for the activation of Akt and the promotion of cell survival. In fact, we found that the expression of Gab2 attenuates the expression of Gab1 and activation of VEGF-mediated signaling. In light of these results, we propose that in endothelial cells stimulated with VEGF, Gab2 acts as a negative regulator of pro-angiogenic signals induced by Gab1. Cell migration is a crucial step in angiogenesis, though, few studies have investigated the involvement of Gab1 in regulating different molecular mechanisms for actin remodeling leading to endothelial cell migration. We demonstrated that Gab1 mediates activation of Rac1 GTPase via the formation and localization of a protein complex including the GEF VAV2, p120 Catenin and Cortactin to lamellipodia of endothelial cells in response to VEGF. Furthermore, we show that the assembly of this complex correlates with the ability of VEGF to induce endothelial cell invasion and capillary sprouting, phenomena essential to the angiogenic process. RhoGTPases are also regulated by specific inactivators, "Rho GTPase activating proteins" or GAPs. The involvement of GAPs in promoting angiogenesis is relatively poorly described. Here we describe for the first time the role of the GAP CdGAP in endothelial cells and demonstrate its importance in mediating VEGF signaling via tyrosine phosphorylation of Gab1 and activation of Rac1 and Cdc42 RhoGTPases. Due to its importance in the activation of signaling pathways critical in VEGF signaling, CdGAP is thus an important protein for the regulation of various essential biological activities such as cell migration, sprouting and therefore in vitro and ex vivo angiogenesis. In addition, embryos of CdGAP knock-out mice exhibit vascular defects, excessive branching vessels, haemorrhages and edema which may be responsible for the 44% mortality seen in CdGAP knock-out mice expected. Our studies contribute to a better understanding of the molecular mechanisms induced by VEGF and demonstrate the central involvement of Gab1 and regulators of RhoGTPases in promoting angiogenesis. This understanding could lead to the identification of new targets and therapeutic approaches to improve the treatment of patients with uncontrolled neovascularization associated with diseases such as cancer.

In this document I present my results on numerical simulations of single and collective cell migration and osteogenesis since my PhD.

Extracellular matrix is a complex meshwork of various macromolecules that have a tight relationship with the surrounding cells. Bidirectional interactions between cells and the microenvironment control their respective behaviors and fate. The biochemical diversity of matrix molecular components, their biophysical properties, their architecture but also their dynamic represent as many regulator signals. Among the components of the matrix, fibronectin (FN) is a major structural and functional glycoprotein involved in numerous physiological and pathological processes. These various functions are directly linked to the structural dynamic of this protein and its ability to interact with others matrix components, in particular with itself. Found as a soluble protein in biological fluids, FN is also incorporated in insoluble matrix as supramolecular assemblies, mainly fibrils but also aggregates. These assemblies could be involved in distinct physiological and pathological processes.If the study of the assembly of the FN is possible with the help of in vitro models, the mechanism of polymerization and the effects of defined assemblies on the cell behavior still have to be better defined.Therefore, this work consisted in elaborating FN assemblies, in characterizing the mechanisms and structures involved in their polymerization and in studying their influence on behaviors of a model of ovarian cancer cells. Besides, preliminary comparative studies have been performed with a plant analogous of FN.We show that irreversible thermal unfolding of FN triggers amyloid-like aggregation. Two states of aggregates could coexist in solution. FN aggregation correlates with a decrease of gelatin-binding domain and RGD sequence accessibility, and a decrease of the incorporation in the matrix network. Moreover, if aggregates are not cytotoxic for the studied cells, conformation change of FN promotes their single-cell and random migration.These results raise questions about the role of FN aggregates in pathological processes like tumor development., La matrice extracellulaire est un réseau enchevêtré de macromolécules variées, en étroite relation avec les cellules qu'elle environne. Les interactions bidirectionnelles qui s'établissent entre les cellules et leur microenvironnement matriciel régulent mutuellement leur comportement et devenir. La diversité biochimique des constituants moléculaires de la matrice, leurs propriétés biophysiques, leur architecture tout comme leur dynamique représentent autant de signaux régulateurs. Parmi les constituants de la matrice, la fibronectine (FN) est une glycoprotéine structurale et fonctionnelle majeure intervenant dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ces fonctions diverses sont directement liées à la dynamique structurale de cette protéine et à sa capacité à interagir avec les autres molécules matricielles, dont elle-même. Retrouvée sous forme soluble dans les fluides biologiques, la FN est incorporée dans les matrices insolubles sous forme d'assemblages supramoléculaires principalement fibrillaires mais aussi sous forme d'agrégats. Ces assemblages sembleraient être impliqués dans des processus physiologiques et pathologiques distincts.Si l'étude des assemblages de FN est rendue possible par l'élaboration de modèles in vitro, les mécanismes de polymérisation et l'effet d'assemblages de structures définies sur le comportement cellulaire restent cependant à mieux élucider et constituent le cœur de ce travail.Les travaux ont donc consisté à élaborer des assemblages de FN, à caractériser les mécanismes et structures impliqués dans leur polymérisation, et à étudier leur influence sur un modèle de cellules cancéreuses ovariennes. D'autre part, des études préliminaires comparatives ont été menées avec un analogue végétal de la FN.L'irréversibilité de la dénaturation thermique de la FN entraîne la formation d'agrégats de type amyloïde. Deux populations d'agrégats coexistent en solution. Cette agrégation est corrélée à une diminution de l'accessibilité des sites de liaison à la gélatine et des sites RGD, et à une diminution de l'incorporation dans les réseaux matriciels. De plus, si la FN sous sa forme agrégée n'est pas cytotoxique pour les cellules étudiées, la modification de la conformation de la FN favorise leur migration isolée et aléatoire.Ces résultats soulèvent la question de l'implication de ces agrégats de FN dans des processus pathologiques tels que le développement tumoral.

Cell migration has two opposite faces; necessary for many physiological processes such as immune response, it can also lead to the organism death by allowing metastatic cells to invade new organs. In vivo migration often occurs in complex 3D environments which impose high cellular deformability. Recently, cellular deformability during 3D migration has been shown to be limited by the nucleus (Wolf et al. JCB, 2013). For instance, cell migration can be increased by decreasing nuclear stiffness. However, below a given nuclear stiffness 3D cell migration can be reduced as a result of impaired cell survival (Harada et al. JCB, 2014). Cancer cells which display slow migration and have rather stiff nuclei have been shown to overcome the physical limits of 3D migration through adhesion combined to matrix degradation or high actomyosin contraction (Wolf et al. JCB, 2013). Immune cells such as neutrophils which are fast moving cells with soft nuclei have been reported to die at sites of infection. Interestingly, dendritic cells function as antigen presenting cells requires high migratory ability as well as high survival. They thus constitute an interesting model for studying nuclear deformation in fast moving and long lived cells. During my PhD, I studied the mechanism by which dendritic cells deform their nuclei to achieve proper migration in highly confining space while preserving a high survival rate. I used an original micro fabricated experimental set up (Heuzé et al. MMB, 2011) consisting of microchannels with constrictions to mimic cellular transmigration. Those channels combined with genetic manipulation and live cell imaging followed by image processing were used to assess the mechanism dendritic cells use to deform their nucleus, which we found to be specific and not required for cell motility per se. I showed that dendritic cells overcome the physical limitation imposed by nuclear deformation through small gaps by nucleating an Arp2/3 based actin network around the nucleus. Surprisingly, the formation of this actin network is independent of myosin II based contraction. This actin accumulation around the nucleus co-localized with sites of nuclear Lamin A/C breakage. Moreover, Lamin A/C depletion in dendritic cells leads to the disappearance of this actin ring and the release of the need for Arp2/3 for nuclear deformation. We thus propose a new mechanism of nuclear squeezing through narrow gaps based on an Arp2/3 nucleated actin meshwork which, by transiently breaking the Lamin A/C network, releases the nuclear surface tension and allows nuclear thus cell passage through micrometric constrictions. Lamin A/C repolymerization around the nucleus at the exit of constrictions would then restore nuclear stiffness, allowing cell survival. Interestingly, this actin accumulation around the nucleus was also observed in vivo in migrating macrophages but not in HL-60 derived neutrophils. Taken together, our data suggest that the Arp2/3 based nuclear squeezing mechanism would be a general feature of highly migratory cells which need to survive long enough to accomplish their functions., La migration cellulaire possède deux volets antagonistes ; nécessaire à plusieurs processus physiologiques tels que la réponse immunitaire, elle peut également induire la mort d’un organisme en permettant les cellules cancéreuses d’envahir des organes sains. In vivo, la migration s’effectue dans des milieux complexes et confinés qui imposent une forte déformabilité aux cellules migratoires. Récemment, divers études ont montré que le noyau impose la limite de la déformabilité cellulaire lors de la migration en 3D (Wolf et al. JCB, 2013; Harada et al. JCB, 2013). Il a, en effet, été montré que la migration cellulaire peut être augmentée en diminuant la rigidité nucléaire (Wolf et al. JCB, 2013). Cependant, il existe une limite de rigidité nucléaire en dessous de laquelle la migration cellulaire peut être inhibée via l’inhibition de la survie cellulaire (Harada et al. JCB, 2013). Les cellules cancéreuses qui migrent à des vitesses relativement faibles (µm/heure) et ont des noyaux rigides surmontent la limite imposée par la déformation nucléaire en dégradant et élargissant le milieu extracellulaire. Les cellules immunitaires telles que les neutrophiles qui migrent rapidement (10 µm/mn) et ont des noyaux mous sont connus pour mourir aux sites d’infections. Les cellules dendritiques, de la famille des cellules immunitaires, ont une fonction de présentation d’antigènes qui requiert à la fois une grande capacité migratoire et de survie. Elles représentent donc un modèle cellulaire intéressant pour l’étude de la déformation nucléaire chez les cellules qui migrent rapidement et survivent longtemps. Durant mon doctorat, j’ai étudié le mécanisme grâce auquel les cellules dendritiques déforment leurs noyaux afin de migrer de manière efficace en milieux confinés tout en préservant un haut taux de survie. J’ai utilisé un système expérimental nouveau et original consistant en des microcannaux avec des constrictions (Heuzé et al. MMB, 2011). Ces canaux, combinés à des manipulations génétiques et de la video microscopie nous ont permis de montré que les cellules dendritiques possèdent un mécanisme spécifique, indépendant de celui utilisé pour leur migration, leur permettant de déformer leurs noyaux tout en migrant dans des milieux hautement confinés. Ce mécanisme est basé sur la génération d’un réseau d’actin, autour du noyau, nucléé par Arp2/3 et indépendant du moteur Myosin II. Ce réseau d’actine co-localise avec des sites de rupture de la Lamin A/C. De plus, réduire la quantité de Lamin A/C dans les cellules dendritiques inhibe la formation de ce réseau d’actin perinucléaire. Basés sur ces résultats, nous avons proposé un nouveau mécanisme de déformation du noyau lors de la migration en milieux confinés basé sur Arp2/3 qui, en nucléant un réseau d’actine autour du noyau permet de casser la lamin A/C diminuant ainsi la tension de surface nucléaire et permettant le passage noyau.

In this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks., Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaire.

Les chimiokines et leurs récepteurs sont responsables de la chimiotaxie des cellules dans l’organisme. Cette mobilité est nécessaire au bon fonctionnement du système immunitaire. Elle est aussi impliquée dans la dissémination métastatique de cancers. Le récepteur de chimiokines CXCR4 et son ligand SDF-1 sont tenus responsables de la chimiotaxie des cellules hématopoïétiques. Toutefois, l’étude de l’axe CXCR4-SDF-1 a récemment été complexifiée par la découverte d’un second récepteur de SDF-1, le récepteur CXCR7. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les observations faites sur le couple SDF1-CXCR4. Le rôle de CXCR7 dans la chimiotaxie demeure incompris, mais il est possible que CXCR7 agisse en tant que régulateur sur l’axe CXCR4/SDF1. Nous avons alors étudié les effets du niveau d’expression de CXCR7 sur les fonctions de CXCR4 lors de la chimiotaxie. Grace à des techniques de migration in vitro et à la mesure des niveaux d’expression de CXCR4 et CXCR7, nos résultats suggèrent que CXCR7 serait un régulateur de l’axe CXCR4/SDF-1., Chemokines and their receptors are responsible for the chemotaxis of cells in humans. This directed cellular mobility is a key part of the immune system, but is also involved in the metastatic dissemination of cancerous cells. The chemokine receptor CXCR4 and its ligand SDF-1 are responsible for the chemotaxis of hematopoietic stem cells. However, the study of the CXCR4/SDF-1 axis was complicated by the identification of CXCR7, a second receptor for SDF-1. The two receptors are generally expressed on the same cell types, and as a consequence, the regulation mechanism of the chemotaxis toward SDF-1 must be re-evaluated with this new information. We have studied the consequence of CXCR7 expression on chemotaxis. Using in-vitro migration techniques and measuring expression levels of CXCR4 and CXCR7 our results support the hypothesis that CXCR7 acts as a regulator of the CXCR4/SDF-1 axis, contributing to the better understanding of the role of CXCR7 in chemotaxis.

Numerous bacterial pathogens secrete multiple effectors to modulate host cellular functions. These effectors may interfere with each other to efficiently control the infection process. Bartonellae are Gram-negative, facultative intracellular bacteria using a VirB type IV secretion system to translocate a cocktail of Bartonella effector proteins (Beps) into host cells. Based on in vitro infection models we demonstrate here that BepE protects infected migratory cells from injurious effects triggered by BepC and is required for in vivo dissemination of bacteria from the dermal site of inoculation to blood. Human endothelial cells (HUVECs) infected with a Delta bepE mutant of B. henselae (Bhe) displayed a cell fragmentation phenotype resulting from Bep-dependent disturbance of rear edge detachment during migration. A Delta bepCE mutant did not show cell fragmentation, indicating that BepC is critical for triggering this deleterious phenotype. Complementation of Delta bepE with BepE(Bhe) or its homologues from other Bartonella species abolished cell fragmentation. This cyto-protective activity is confined to the C-terminal Bartonella intracellular delivery (BID) domain of BepE(Bhe) (BID2.E-Bhe). Ectopic expression of BID2.E-Bhe impeded the disruption of actin stress fibers by Rho Inhibitor 1, indicating that BepE restores normal cell migration via the RhoA signaling pathway, a major regulator of rear edge retraction. An intradermal (i.d.) model for B. tribocorum (Btr) infection in the rat reservoir host mimicking the natural route of infection by blood sucking arthropods allowed demonstrating a vital role for BepE in bacterial dissemination from derma to blood. While the Btr mutant Delta bepDE was abacteremic following i.d. inoculation, complementation with BepE(Btr), BepE(Bhe) or BIDs.E-Bhe restored bacteremia. Given that we observed a similar protective effect of BepE(Bhe) on infected bone marrow-derived dendritic cells migrating through a monolayer of lymphatic endothelial cells we propose that infected dermal dendritic cells may be involved in disseminating Bartonella towards the blood stream in a BepE-dependent manner.