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Resumo Fundamento: A taxa de falha de enxerto de veia safena um ano após a cirurgia de revascularização do miocárdio varia de 10% a 25%. O objetivo deste estudo foi de investigar se a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de células musculares lisas vasculares para inibir a hiperplasia intimal por meio da inibição da via p38 MAPK. Métodos: Quarenta e cinco ratos Sprague-Dawley foram randomizados em três grupos. Trinta ratos foram submetidos à cirurgia de enxerto de veia e randomizados para tratamento com veículo ou atorvastatina; quinze ratos foram submetidos à cirurgia sham. Detectamos a hiperplasia intimal por meio de coloração com hematoxilina-eosina e a expressão de proteínas relacionadas por meio de análise imuno-histoquímica e Western blot. Foram realizadas as comparações por análise de variância de fator único e pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher, com p < 0,05 considerado significativo. Resultados: A íntima analisada pela coloração com hematoxilina-eosina era dramaticamente mais espessa no grupo controle que no grupo atorvastatina e no grupo sham (p < 0,01). Os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA demonstraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA no grupo controle era mais alta que no grupo atorvastatina (p < 0,01). Nós também avaliamos α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina por meio de análise de Western blot e os resultados indicaram que a atorvastatina não levou à redução de p38 MAPK (p < 0,05); no entanto, resultou na inibição da fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01) e reduziu significativamente os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01). Conclusão: Nós demonstramos que a atorvastatina pode inibir o acúmulo de células musculares lisas vasculares por meio da inibição da via p38 MAPK e é capaz de inibir a hiperplasia intimal em modelos de enxerto de veia em ratos. Abstract Background: The rate of saphenous vein graft failure one year after coronary artery bypass grafting ranges from 10% to 25%. The aim of this study was to explore whether atorvastatin can reduce accumulation of vascular smooth muscle cells to inhibit intimal hyperplasia via p38 MAPK pathway inhibition. Methods: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomized to three groups. Thirty rats received a vein graft operation, and they were randomized to be treated with vehicle or atorvastatin; fifteen rats received a sham operation. We detected intimal hyperplasia by hematoxylin-eosin staining and related protein expression by immunohistochemical and Western blot analysis. Comparisons were analyzed by single-factor analysis of variance and Fisher's least significant difference test, with p < 0.05 considered significant. Results: The intima analyzed by hematoxylin-eosin staining was dramatically thicker in the control group than in the atorvastatin group and sham group (p < 0.01). The outcomes of immunohistochemical staining of α-SMA demonstrated that the percentage of α-SMA-positive cells in the control group was higher than in the atorvastatin group (p < 0.01). We also evaluated α-SMA, PCNA, p38 MAPK, and phosphorylation of p38 MAPK after statin treatment by Western blot analysis, and the results indicated that atorvastatin did not lead to p38 MAPK reduction (p < 0.05); it did, however, result in inhibition of p38 MAPK phosphorylation (p < 0.01), and it significantly reduced α-SMA and PCNA levels, in comparison with the control group (p < 0.01). Conclusion: We have demonstrated that atorvastatin can inhibit accumulation of vascular smooth muscle cells by inhibiting the p38 MAPK pathway, and it is capable of inhibiting intimal hyperplasia in a rat vein graft model.

Orientador: Marta Helena Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O hialuronam (ou ácido hialurônico, AR) é um importante componente do espaço matrice1ular, estando presente tanto na matriz extracelular, como na superficie das células. Suas funções são variadas, mas estão sempre associadas à criação de um espaço pouco denso e extremamente hidratado, permitindo a proliferação e migração celular, típicas de processos como a embriogênese, cicatrização e invasão tumoral. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do metabolismo do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos. Numa primeira etapa foi verificado o efeito da castração por 7, 14 e 21 dias sobre. o conteúdo e distribuição do AR, assim como uma avaliação do papel da HA. sintase 2 (HAS2) e da hialuronidase 1 (Hyall). Para tanto, foram empregados ensaios de marcação tecidual de AH com a utilização de sonda marcada com fluoresceína, quantificação deAH por ensaio competitivo, determinação dos tamanhos das cadeias de AH por cromatografia em gel filtração, determinação dos níveis de expressão das enzimas HAS2 e Hyall por Real Time PCR, localização desta expressão por hibridação in situ e localização do receptor CD44 por imunohistoquímica. Na segunda etapa, foram estudadas células musculares lisas (CML) isoladas de ratos e mantidas em cultura, quanto à expressão de marcadores da diferenciação deste tipo celular e quanto à produção de AH, utilizando. imunocitoquímica e RT-PCR para marcadores de CML, imunocitoquímica para o receptor CD44, quantificação de AH por ensaio competitivo e por medida de área de coat. Os resultados demonstram que o AR é encontrado tanto no epitélio quanto no estroma prostático e que há uma redução no conteúdo total de AR na próstata ventral, com um predomínio de cadeias curtas. Além disto, foi verificado que estas modificações são, ao menos em parte, devidas à manutenção da expressão da HAS2 e um aumento na expressão da Hyall. Foi observado também, por outro lado, que ocorre uma diminuição na atividade da hialuronidase lisossomal. Experimentos de hibridação in situ demonstraram a presença da HAS2 no epitélio e em diversas células do estroma, com exceção das células musculares lisas e endoteliais. Com a castração, a expressão da HAS2 e da Hyall aumenta no estroma. Foi demonstrado também que as células musculares lisas prostáticas de rato em cultura mantêm a expressão de marcadores da diferenciação (smoothelin, SM22 e calponina) e que esta expressão não foi dependente de insulina-nemtestosterotta. A concentração de ácido hialurônico no meio de cultura variou nas diferentes passagens (0-8), assim como variou o tamanho do coa! ao redor das células. Surpreendentemente, nas passagens 3 e 4 houve uma queda brusca na síntese de HA Os- resultados demonstram uma modificação no padrão expressão e de distribuição do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos, com o comprometimento de diversos tipos celulares, que resultam na diminuição do conteúdo total. Conclui-se também que células musculares lisas em cultura mantêm-se diferenciadas e que são capazes de sintetizar e formar um coa! na sua superficie Abstract: Hyaluronan (or hyaluronic acid, HA) is an important component ofthe matricellularspace. It is found in both extracelular matrix and at the cell surface. It has many functions, but is always associated with the establishment of a looser and hydrated space, allowing the cells to proliferate and migrate, in processes such as embryogenesis, healing and tumor invasion. In this work, we have studied some aspects ofHA metabolism in the rat ventral prostate. In a firt series of experiments, the effect of castration for 7, 14 and 21 days on the content and distribution of HA, as well as an evaluation of the function of HA synthase 2 (HAS2) and hyaluronidase 1 (Hyall). For this, were done tecidual HA localization with fluorescein probe, measurement of HA content in a competitive binding assay, determination of HA chain size variation using gel filtration cromatography, determination of expression levels ofHAS2 and Hyall enzymes by Real Time PCR, localization ofthese expression by in situ hybridization and CD44 localization by immunohistochemistry. In a second series of experiments, the rat prostatic smooth musc1e cells (SMC) were isolated and maintainedin vitro for the study of the expression of molecular markers of the differentiated state and of the production of HA, using immunohistochemistry e RT-PCR for SMC markers, immunocitochemistry for CD44 receptor, HA quantification by competitive bindingassay and measurement of coat area. The results demonstrate that HA is found in both epitheJium and stroma and that there is a decrease in the total amount of HA in the organ afier castration, with a predominance of short chains. Besides, it was observed that these modifications are, at least in part, due to a sustained expression of HAS2 and an increased expression of Hyall. On the other hand, a reduction in lysosomal hyaluronidase activity was also observed. In situ hybridization showed the presence of HAS2 mRNA in both epithelium and stroma. Different stromal cells, with the exception of SMC and endothelial cells, expressed HAS2. Castration resulted in increased expression of HAS2 and Hyall in the stroma. It was also demonstrated that SMC kept inculture express the differentiation markers smoothelin, SM22 and calponin and that this expression pattern was not dependent on either insulin or testosterone. The concentration of HA in the culture medium and the size of the cell coat varied as cells were subcultured through passages 0-8. Surprisingly; a severe drop in HA synthesis was observed at passages 3 and 4. The results demonstrate a modification in the pattem of expression and distribution of HA in the rat ventral prostate in response to castration, and the involvement of different cell types in the decreasing amount ofHA. lt is also concluded that SMC preserve the differentiated state in culture and that they are able to assemble a HA coat Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O crescimento e função prostática dependem da estimulação androgênica e interação epitélio-estroma. Além dos andrógenos, outros fatores interagem com a próstata e são igualmente importantes para sua fisiologia. Sabe-se que os estrógenos exercem um importante papel no desenvolvimento prostático e que, combinados com andrógenos, podem contribuir para o aparecimento de patologias. A insulina é outro hormônio que afeta a atividade destes hormônios sexuais nos tecidos, inclusive na próstata. Os níveis séricos de esteróides sexuais estão intimamente relacionados com a sensibilidade a insulina, embora esta relação ainda seja pouco esclarecida. No estroma prostático, as células musculares lisas são o tipo celular predominante, influenciando a atividade do epitélio por mecanismos parácrinos e modificando a matriz extracelular em situações de remodelação, como no crescimento, na regressão e na invasão tumoral. Sabe-se que estas células apresentam receptores de andrógeno (AR) e que respondem à privação androgênica, alterando sua morfologia. O presente estudo buscou verificar a influência da testosterona, estradiol e insulina sobre a expressão e localização do AR em células musculares lisas da próstata ventral de ratos Wistar cultivadas in vitro. Os resultados mostraram que o estradiol causou alterações nos níveis protéicos, os níveis de RNAm do AR foram pouco afetados e a localização do AR foi predominantemente nuclear independente da dose de estradiol. Os tratamentos feitos com insulina mostraram que a sua presença causou uma queda da expressão da proteína e uma localização predominante nuclear do AR na situação em que os dois hormônios, insulina e testosterona, foram administrados juntamente. Os resultados permitem sugerir que a expressão do AR pode ser modulada por outros fatores como estrógeno e insulina Abstract: The prostate function and growth depends on the androgenic stimulation and epitheliumstroma interaction. Besides androgens, other factors interact with the prostate and are also important for its physiology. It is known that estrogens exert an important role in prostate development, and combined with androgens they can contribute for the appearance of pathologies. The insulin is another hormone that interacts with these sexual hormones in tissues, and also in the prostate. The serum levels of sexual steroids are closely related with the sensitivity to the insulin, even though this relation is not yet clear. In prostatic stroma, smooth muscle cells are the predominant cell type. They influence the activity of the epithelium through paracrine mechanisms and modify the extracellular matrix in remodeling situations, such as gland growth and regression, and during tumor invasion. It is known that these cells express androgen receptor (AR) and respond to androgen deprivation by modifying its phenotype. The present study was undertaken to verify the influence of testosterone, estradiol and insulin on the expression and localization of the AR in the smooth muscle cells from the Wistar rat ventral prostate cultured in vitro. The results showed that estradiol caused alterations in the AR protein levels, the mRNA level was less affected and AR localization was predominantly nuclear irrespective of the estradiol dose. Insulin treatments caused a decrease in the expression of the protein and a predominant nuclear localization of AR in the presence of testosterone. The results suggest that AR expression and regulation might be modulated by others factors such as estrogen and insulin Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Maria Edwirges Hoffmann, Marta Helena Krieger Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico é uma molécula multifuncional, a qual está envolvida numa extensa variedade de funções fisiológicas, estendendo-se da neurotransmissão, citotoxicidade de macrófagos e modulação das funções fisiológicas do sistema cardiovascular. Devido às ações benéficas do NO nas diversas disfunções vasculares, há um grande interesse no desenvolvimento em dispositivos que possam liberar NO de maneira controlada no sistema cardiovascular e tecido-específica. Por exemplo, 'stents¿ intracoronarianos recobertos por materiais com liberação de NO, podem reduzir a incidência da reestenose e inibir a formação da neoíntima após angioplastia percutânea coronariana. O objetivo deste estudo foi o de estabelecer protocolos para avaliação da citotoxicidade e do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico de formulações eluidoras de NO para aplicações em dispositivos intravasculares. As formulações eluidoras de NO foram avaliadas por meio de: A) citotoxicidade através dos ensaios da redução do MTT e da captação do vermelho neutro (NR) com as linhagens celulares: 3T3 e RASM, B) potencial anti-reestenótico utilizando-se o ensaio de inibição da proliferação celular com células de musculatura lisa de coelho (RASM) e C) potencial anti-trombogênico, utilizando-se plaquetas humanas em ensaios de agregação e adesão plaquetária. Foram testadas S-nitrosoglutationa (GSNO), solução polimérica contendo poli (vinil álcool) PVA e poli (vinil pirrolidona) (PVP), e formulação contendo PVA, PVP, GSNO. O ensaio da captação do vermelho neutro mostrou que a GSNO e GSNO/PVA/PVP não apresentaram citotoxicidade em concentrações até 30 mg/mL de GSNO, em ambas as linhagens celulares. Enquanto que o ensaio de redução do MTT mostrou que apenas a solução contendo GSNO apresentou citotoxicidade com EC50=2,75±0,05 mg/mL em células 3T3. A sensibilidade da linhagem 3T3 foi maior do que =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas. para células RASM, enquanto que células RASM foram mais sensíveis à alteração de permeabilidade de membrana. A GSNO per se promoveu inibição da proliferação celular no ensaio da proliferação celular e este efeito foi potencializado em presença dos polímeros PVA/PVP em concentrações superiores a 22,7 mg/mL. Foi verificada inibição da agregação plaquetária para ambas as soluções, GSNO/PVA/PVP (EC5050 =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifunctional molecule which is involved in a wide variety of physiological functions, ranging ftom neurotransmission, macrophage cytotoxicity, and modulation of physiological functions of the cardiovascular system. Due to NO beneficial action in various vascular pathological conditions, there is a great interest on development in devices that can release NO by a controlled manner and tissue-specific. For example, intracoronary stents coated with NO releasing materials, may reduce the incidence of restenosis and inhibit neo-intima formation after following percutaneous angioplasty. The aim of this study was to establish protocols for evaluation of NO eluting formulations cytotoxicity and antirestenotic and antithrombotic activities which have potential for application in intravascular devices. NO releasing formulations were evaluated regarding to following aspects: A) cytotoxicity measured by MTT reduction and Neutral Red uptake assays with 3T3 and RASM celllines, B) antirestenotic potential by using cell proliferation assay, with rabbit smooth muscle cells ~M), and C) antithrombogenic potential, by using a human platelet aggregation and adhesion assays. S-nitrosoglutathione (GSNO), polymer solutions containing poly(vinyl alcohol) (pV A) and poly(vinyl pyrrolidone) (pVP), and formulation containing GSNO, PV A and PVP were tested. Neutra! Red uptake assays showed that .GSNO and GSNOIPV A/P)'P-solutions presented no cytotoxicity up to 30 mg /mL GSNO, in both celllines. While, MTT reduction assays showed that only the solution of GSNO alone presented cytotoxicity with ECso=2.75± 0,05 mg/rnL, in 3T3 cell line. The sensitivity of3T3 cells to cytotoxicity was higher than that ofRASM cells, while RASM cells were more sensitivity to membrane permeation alterations. GSNO per se presented inhibition in a cell proliferation assay and this effect was potentialized with PV AIPVP in concentrations up 'to 22.7 mglmL. Concentration-dependent inhibition of platelet aggregation was verified for both GSNO/PV AIPVP (ECso of 2.3±0.4 JlglmL), and GSNO alone (ECso of 2.5±0.3 JlglrnL) solutions. Platelet adhesion assay showed that the inhibition above 50% caused by GSNO only in concentration up to 6.72 mglmL was found, but in this concentration range, decrease of viable platelets was presented. The results showed that the methodology adopted was suitable to evaluate antirestenotic and antithrombotic potential, and to establish security margins for the development of new formulations involving GSNO and polymers in solution Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Resumo Fundamento: A taxa de falha de enxerto de veia safena um ano após a cirurgia de revascularização do miocárdio varia de 10% a 25%. O objetivo deste estudo foi de investigar se a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de células musculares lisas vasculares para inibir a hiperplasia intimal por meio da inibição da via p38 MAPK. Métodos: Quarenta e cinco ratos Sprague-Dawley foram randomizados em três grupos. Trinta ratos foram submetidos à cirurgia de enxerto de veia e randomizados para tratamento com veículo ou atorvastatina; quinze ratos foram submetidos à cirurgia sham. Detectamos a hiperplasia intimal por meio de coloração com hematoxilina-eosina e a expressão de proteínas relacionadas por meio de análise imuno-histoquímica e Western blot. Foram realizadas as comparações por análise de variância de fator único e pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher, com p < 0,05 considerado significativo. Resultados: A íntima analisada pela coloração com hematoxilina-eosina era dramaticamente mais espessa no grupo controle que no grupo atorvastatina e no grupo sham (p < 0,01). Os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA demonstraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA no grupo controle era mais alta que no grupo atorvastatina (p < 0,01). Nós também avaliamos α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina por meio de análise de Western blot e os resultados indicaram que a atorvastatina não levou à redução de p38 MAPK (p < 0,05); no entanto, resultou na inibição da fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01) e reduziu significativamente os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01). Conclusão: Nós demonstramos que a atorvastatina pode inibir o acúmulo de células musculares lisas vasculares por meio da inibição da via p38 MAPK e é capaz de inibir a hiperplasia intimal em modelos de enxerto de veia em ratos.

Introduction: Vascular calcification is a common complication of chronic kidney disease. Osteoblast differentiation factor (Cbfa1) is present in histologic sections of arteries from patients with end-stage renal disease. Vascular smooth muscle cells (VSMC) can dedifferentiate to osteoblast-like cells, possibly by up-regulation of Cbfa1. There is evidence that the production of nitric oxide (NO) may have an important role in the regulation of osteoblast metabolism. The aim of this study is to evaluate whether increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC. Methods: VSMC were obtained from renal artery of Wistar male rats, treated for 72 hours with lipopolysaccharide (LPS), ß-glycerophosphate (BGF), a donor of phosphate and aminoguanidine (AG), an inhibitor of iNOS, in the following groups: CTL (control), LPS, BGF, LPS + BGF, and LPS + AG. NO synthesis was determined by chemiluminescence. Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were analyzed by RT-PCR, Cbfa1 protein expression by immunohistochemistry and cellular viability by acridine orange. Results: Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were higher in LPS and LPS+ BGF vs CTL (p < 0.05), and they were lower in LPS+AG vs LPS (p < 0.05). The Cbfa1 in the groups LPS and LPS+BGF also resulted in a higher value compared to CTL (p < 0.05), and in LPS+AG it was lower compared to LPS (p < 0.05). NO was higher in LPS and LPS+BGF compared to CTL group (p < 0.05) and lower in LPS + AG compared to LPS group (p < 0.05). Cellular viability showed no statistical difference among groups. Conclusion: This study showed that increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC. RESUMO Introdução: A calcificação vascular é uma complicação comum da doença renal crônica. O fator de diferenciação osteoblástica (Cbfa1) está presente em cortes histológicos das artérias de pacientes com doença renal em estágio terminal. As células do músculo liso vascular (CMLV) podem desdiferenciar para células do tipo osteoblastos, possivelmente pela regulação positiva da Cbfa1. Há evidências de que a produção de óxido nítrico (NO) pode ter um papel importante na regulação do metabolismo dos osteoblastos. O objetivo deste estudo é avaliar se o aumento da expressão de NO/iNOS causa um aumento na expressão de cbfa1 nas CMLV. Métodos: As CMLV foram obtidas da artéria renal de ratos machos Wistar, tratados por 72 horas com lipopolissacarídeo (LPS), ß-glicerofosfato (BGF), um doador de fosfato e aminoguanidina (AG), um inibidor da iNOS, nos seguintes grupos: CTL (controle), LPS, BGF, LPS + BGF e LPS + AG. A síntese de NO foi determinada por quimioluminescência. As expressões de mRNA de Cbfa1 e iNOS foram analisadas por RT-PCR, a expressão da proteína Cbfa1 por imunohistoquímica e viabilidade celular por laranja de acridina. Resultados: As expressões de mRNA de Cbfa1 e iNOS foram maiores em LPS e LPS + BGF v.s. CTL (p < 0,05) e menores em LPS + AG v.s. LPS (p

Introduction: Vascular calcification is a common complication of chronic kidney disease. Osteoblast differentiation factor (Cbfa1) is present in histologic sections of arteries from patients with end-stage renal disease. Vascular smooth muscle cells (VSMC) can dedifferentiate to osteoblast-like cells, possibly by up-regulation of Cbfa1. There is evidence that the production of nitric oxide (NO) may have an important role in the regulation of osteoblast metabolism. The aim of this study is to evaluate whether increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC. Methods: VSMC were obtained from renal artery of Wistar male rats, treated for 72 hours with lipopolysaccharide (LPS), ß-glycerophosphate (BGF), a donor of phosphate and aminoguanidine (AG), an inhibitor of iNOS, in the following groups: CTL (control), LPS, BGF, LPS + BGF, and LPS + AG. NO synthesis was determined by chemiluminescence. Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were analyzed by RT-PCR, Cbfa1 protein expression by immunohistochemistry and cellular viability by acridine orange. Results: Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were higher in LPS and LPS+ BGF vs CTL (p < 0.05), and they were lower in LPS+AG vs LPS (p < 0.05). The Cbfa1 in the groups LPS and LPS+BGF also resulted in a higher value compared to CTL (p < 0.05), and in LPS+AG it was lower compared to LPS (p < 0.05). NO was higher in LPS and LPS+BGF compared to CTL group (p < 0.05) and lower in LPS + AG compared to LPS group (p < 0.05). Cellular viability showed no statistical difference among groups. Conclusion: This study showed that increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC.

Orientadores: Hernandes Faustino Carvalho, Aline Mara dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A próstata é uma glândula acessória do trato reprodutor masculino responsável pela produção e armazenamento do líquido prostático. Esta glândula é alvo de várias afecções como prostatite, hiperplasia e câncer, doenças que comprometem a saúde e bem-estar do homem e são responsáveis por grande número de mortes. A nível histológico podem ser identificados três compartimentos nesta glândula: o epitelio, o lúmen e o estroma. As células musculares lisas (CMLs) são o principal componente do estroma e apresentam uma modulação fenotípica dependendo de diferentes fatores, sendo que um deles é a matriz extracelular (MEC). Neste trabalho avaliamos o efeito de diferentes componentes de MEC (colágeno, fibrina e Matrigel) na adesão, morfologia, fenótipo e localização da quinase de adesão focal (FAK) nas CMLs de próstata. Os resultados preliminares nos levaram estudar a adesão das células no colágeno e o posterior bloqueio das proteínas Rho GTPases. Por último, estudamos o efeito do TGF'alfa' e TGF'beta' na migração celular. Os resultados mostram que o colágeno favorece uma rápida adesão das CMLs, que fibrina é degradada na presença destas e que no Matrigel elas se agrupam. No colágeno, o citoesqueleto de actina se organiza em grandes fibras de estresse, que não são observadas na fibrina nem no Matrigel. A FAK apresentou uma localização nuclear nas células semeadas no colágeno. Na fibrina e no Matrigel a marcação nuclear estava ausente e sua distribuição no citoplasma estava em forma de agregados. A forma fosforilada da FAK na tirosina 925 apresenta uma maior co-localização com a cadeia pesada da miosina (MYH11) no colágeno. As CMLs na fibrina e no Matrigel apresentaram diminuição nos marcadores do fenótipo contrátil, sugerindo que esses componentes de MEC favorecem o fenótipo sintético. Enquanto aos efeitos da inibição das proteínas Rho GTPases na adesão das CMLs sobre o colágeno, Rac1, Rac3 e Cdc42 são importantes para a adesão das células, enquanto a inibição de ROCK não inibiu a adesão das CMLs ao colágeno e, posteriormente, permitiu a migração ? evento que não acontecia quando as CMLs estavam somente sobre o colágeno. A exposição ao inibidor de ROCK nas CMLs desencadeou alterações na morfologia celular, no citoesqueleto de actina, na distribuição de ?-actinina e na diminuição da expressão de SM-actina e MYH11. Finalmente observamos que o TGF? estimula a migração das CMLs, mesmo em concentrações baixas. Os resultados aqui apresentados demostram que a MEC influencia o comportamento e o fenótipo das CMLs de próstata. As GTPases Rac e Cdc42 são importantes para a adesão das células enquanto que ROCK tem efeito na manutenção do fenótipo contrátil Abstract: The prostate is an accessory gland of the male reproductive tract and is responsible for the production and storage of prostate fluid. This gland is affected by numerous diseases such as prostatitis, hyperplasia and cancer. These diseases compromise men¿s health and well being and are responsible for a large number of deaths, worsening with the advanced age. At histological level three compartments can be identified: epithelium, lumen and stroma. Smooth muscle cells (SMCs) are the main component of the stroma and showing a phenotypic modulation depending on different factors, one of them being the extracellular matrix (ECM). In this work we evaluated the effect of different components of ECM (collagen, fibrin and Matrigel) on adhesion, morphology, phenotype and focal adhesion kinase (FAK) localization in prostate SMCs. Preliminary results led us to study cell adhesion in collagen and subsequent blockade of Rho GTPases proteins. Finally, we study the effect of TGF'alfa' and TGF'beta' on cell migration. The results show that collagen promote a fast adhesion of SMCs, whereas, fibrin is degraded by the cells and that on Matrigel they formed cell clusters. In collagen, the actin cytoskeleton organizes into large stress fibers, which are not observed in fibrin or Matrigel. FAK had a nuclear localization in the cells seeded on collagen. On fibrin and Matrigel nuclear labeling was absent and its distribution in the cytoplasm was in as aggregates. The phosphorylated form of FAK on tyrosine 925 shows a greater co-location with the myosin heavy chain (MYH11) on collagen. SMCs on fibrin and Matrigel decreased markers of contractile phenotype, suggesting that these components of ECM favor the synthetic phenotype. The effects of inhibition of Rho GTPases proteins on the adhesion of CMLs on collagen, Rac1, Rac3 and Cdc42 are important for cell adhesion, while ROCK inhibition did not inhibit adhesion of SMCs to collagen and subsequently allowed migration - an event that did not happen when SMCs were only on collagen. Exposure to ROCK inhibitor triggered changes in cell morphology, actin cytoskeleton, ?-actinin distribution, and decreased expression of SM-actin and MYH11. Finally, we observed that TGF? stimulates the migration of CMLs, even at low concentrations. The results presented here demonstrate that ECM influences the behavior and phenotype of prostate CMLs. Rac and Cdc42 GTPases are important for cell adhesion while ROCK has an effect on the maintenance of contractile phenotype Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2015/03235-4 CAPES 001

Previous studies have demonstrated loss/reduction of dystrophin in cardiomyocytes in both acute and chronic stages of experimental Trypanosoma cruzi (T. cruzi) infection in mice. The mechanisms responsible for dystrophin disruption in the hearts of mice acutely infected with T. cruzi are not completely understood. The present in vivo and in vitro studies were undertaken to evaluate the role of inflammation in dystrophin disruption and its correlation with the high mortality rate during acute infection. C57BL/6 mice were infected with T. cruzi and killed 14, 20 and 26 days post infection (dpi). The intensity of inflammation, cardiac expression of dystrophin, calpain-1, NF-κB, TNF-α, and sarcolemmal permeability were evaluated. Cultured neonatal murine cardiomyocytes were incubated with serum, collected at the peak of cytokine production and free of parasites, from T. cruzi-infected mice and dystrophin, calpain-1, and NF-κB expression analyzed. Dystrophin disruption occurs at the peak of mortality and inflammation and is associated with increased expression of calpain-1, TNF-α, NF-κB, and increased sarcolemmal permeability in the heart of T. cruzi-infected mice at 20 dpi confirmed by in vitro studies. The peak of mortality occurred only when significant loss of dystrophin in the hearts of infected animals occurred, highlighting the correlation between inflammation, dystrophin loss and mortality.

Os tumores mistos de células musculares lisas e do estroma endometrial uterino, caracterizados pela presença de componentes de ambas as linhagens, coexistindo em proporções quase equivalentes, são neoplasmas raros. Possuem potencial biológico incerto e se comportam de acordo com o componente estromal. A imuno-histoquímica é uma grande aliada no diagnóstico microscópico, pois a clínica e os exames de imagem não ajudam a diferenciá-los de outras doenças uterinas. Descrevemos o caso de uma paciente cuja hipótese diagnóstica era de leiomioma uterino e que, após cirurgia, foi diagnosticada pelo estudo anatomopatológico como tumor misto de células musculares lisas e do estroma endometrial uterino. Mixed tumors of uterine smooth muscle and endometrial stromal cells, which are characterized by the presence of components from both cell lineages with similar proportions, are rare neoplasms. Their biological potential is uncertain, and they behave according to the stromal component. Immunohistochemistry is an important ally in microscopic diagnosis, because symptoms and imaging exams do not help in the differentiation from other uterine diseases. We describe a case of a patient who had been previously diagnosed with uterine leiomyoma, and after surgery, the anatomopathological study revealed a mixed tumor of uterine smooth muscle and endometrial stromal cells.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente da parede de bactérias Gram-negativas capaz de induzir respostas inflamatórias sistêmicas pela capacidade de ativar o fator de transcrição nuclear .B (NF-.B). Além do LPS, a presença de citocinas como IFN-., também promovem a ativação do NF-.B. Uma vez que este fator é ativado, inúmeros genes pró-inflamatórios são transcritos, elevando a expressão de citocinas como TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-. e a enzima NOS-2. Um dos mecanismos endógenos anti-inflamatórios mais importantes é a ativação de receptores de glicocorticoides (GR). Utilizando um modelo in vitro baseado em aspectos relevantes da sepse, uma doença de cunho inflamatório, mostrou-se que células musculares lisas (CML) de aorta de rato da linhagem A7r5 são ativadas pelo estímulo LPS/IFN produzindo NO, dosado na forma do seu metabólito, nitrito. De forma inédita, observou-se que a ativação das CML depende de um pulso inicial de NO oriundo de NOS constitutivas, uma vez que a inibição do mesmo diminui substancialmente a ativação celular. Além do pulso de NO, ocorre também uma rápida produção de EROs após estimulação das células com LPS. A caracterização e presença de GR funcionais nestas células permitiram o acompanhamento da sua dinâmica após estimulação com LPS/IFN. Surpreendentemente, a estimulação com LPS/IFN induz um aumento na translocação nuclear destes receptores de forma concomitante com a translocação nuclear do NF-.B, cuja intensidade de translocação é parcialmente regulada pelo NO. Outro fator que parece intermediar a translocação nuclear de GR e NF-.B e exercer um papel fundamental no curso da ativação celular é o peroxinitrito, que pode estar sendo formado imediatamente após a estimulação das células pela reação do pulso de NO com o ânion superóxido. Os resultados mostram que o NO e seus derivados desempenham um papel fundamental no início da ativação celular e na translocação nuclear de GR, contribuindo para o entendimento do início do processo de ativação celular.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os hormônios androgênicos (testosterona e diidrotestosterona) regulam a diferenciação e o crescimento das estruturas penianas via receptor de andrógenos (AR), tendo este função reguladora da transcrição de genes relacionados a aspectos do desenvolvimento de indivíduos do sexo masculino. A presença de receptores de estrógenos no pênis permite assumir que o 17-â-estradiol (E2) e moléculas similares tenham efeito direto sobre sua fisiologia. De forma geral, o estrógeno tem efeito anti-androgênico, atuando sobre o eixo hipotálamo-hipófise e, assim, reduzindo a produção de testosterona pelos testículos. O estrógeno é essencial para funcionamento reprodutivo em machos, no entanto, a exposição ao estrógeno ou xenobióticos durante períodos críticos do desenvolvimento pode ter conseqüências negativas para o trato reprodutivo e para a fertilidade, através de um mecanismo conhecido como imprinting estrogênico. Um dos efeitos do imprinting estrogênico causado por altas doses de estrógeno é o comprometimento do desenvolvimento peniano. Embora seja controverso na literatura, este efeito se daria pela regulação negativa da expressão do AR e reduzida resposta aos andrógenos. Sendo assim, para estudar o efeito do imprinting estrogênico no desenvolvimento do pênis foram administrados 25 µL de óleo de milho contendo E2 a 15 mg/kg (dose alta) (Putz, et al., 2001 a, b) a ratos Wistar, nos dias 1, 3 e 5 após o nascimento e observação dos efeitos nos períodos pré-púbere (28 dias), púbere (49 dias) e adulto (90 dias). Foi feito ainda isolamento de células musculares lisas (CML), cultivadas com e sem T, e endoteliais do órgão. Para cada situação, a expressão do AR foi verificada por Western blotting e a localização por imunocitoquímica. Para o órgão e as células CML, a expressão do RNAm do AR foi analisado por Real-time PCR. Nos animais adultos foram quantificados: colágeno solúvel, hidroxiprolina e glicosaminoglicano (GAG). O tratamento neonatal com E2 resultou na queda do peso corporal, má formação do pênis, menor quantidade de hidroxiprolina e maior quantidade de GAG. A expressão do AR aumentou em animais de 28 dias e reduziu aos 90 dias. Nessas idades a marcação do AR foi menos intensa nos animais estrogenizados em todos os compartimentos penianos. Nas CML, a expressão do AR exibiu padrão diferente quando cultivadas com ou sem T. Nas células endoteliais a expressão não varia com a idade, porém diminui naquelas isoladas de animal tratado. A exposição neonatal ao E2 causa má formação do pênis o que pode estar relacionado à alteração da expressão do AR no órgão, nas CML e endoteliais presentes no mesmo. Abstract: The androgens, testosterone and dihydrotestosterone, regulate the differentiation and growth of penile structures through the androgen receptor (AR), which regulates the transcription of genes associates with several aspects of the development of male individuals. In contrast to the prostate, the AR expression in the penis of the rat falls with age according to the androgen levels reached in the adult. The presence of estrogen receptor in the penis allows the assumption that 17-â- estradiol (E2) and similar molecules have direct effect on its physiology. It is known that estrogen has an anti-androgenic effect acting on the hypothalamic-pituitary axis reducing the production of testosterone by the testes. The estrogen is essential for reproductive function in males, but the exposure to estrogen or xenobiotics during critical periods of the development has negative consequences for the reproductive tract and fertility, through a mechanism known as estrogenic imprinting. One of the effects of estrogenic imprinting caused by high doses of estrogen is defective penile development. Although controversial in the literature, this effect occurs by down regulation of androgens receptors and reduced response to androgens. To study the effect of estrogenic imprinting on penis development, Wistar rats received subcutaneous injections of 25 µL of corn oil containing E2 at a dose of 15 mg/kg body weight (Putz, et al., 2001 a, b) on days 1, 3, and 5 after birth and observation of the effects on 28, 49 or 90 days after birth (prepubertal, pubertal and adulthood stages, respectively). Smooth muscle cells (SMC) and endothelial cells were isolated from the organ. For each situation, AR expression was verified by Western blotting and the localization by immunocitochemstry. Androgen receptor mRNA expression was done for the penis and SMC by Real-time PCR. In adult animals soluble collagen, hydroxyproline and glycosaminoglycans (GAGs) were quantified. Neonatal treatment with E2 resulted in reduction of weight and abnormal development of the penis at all ages, reduction in hydroxyproline and increase in GAGs. The AR expression increased at 28 days, but not at 90 days and in these ages the staining intensity of AR was smaller in all penile compartments. In SMC, AR expression exhibited a different expression pattern when cultured with or without T. In endothelial cells, the AR expression increased on day 28, reducing in the other ages, but without difference in comparison to control, what leds us to believe that endothelial cells do not interfere in the reduction AR expression after sexual maturation. The neonatal treatment with E2 leds to abnormal penile development what may be related to an alteration of AR expression in the organ and in their SMC and endothelial cells. Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2014-02-26T17:28:56Z No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Made available in DSpace on 2014-02-26T17:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T15:21:06Z No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T15:21:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 The effects of partial urethral obstruction on the detrusor muscle of rabbit urinary bladder were investigated using stereological sampling and estimation tools. Twelve female Norfolk rabbits (2.5-3.0 kg body weight) were divided into four groups: 3, 7 and 12 weeks after surgical intervention to produce a standard partial obstruction and unobstructed controls. Following removal, bladder axes (craniocaudal, dorsoventral and laterolateral) and organ weights were recorded. Bladders were prepared for light microscopy by multistage random sampling procedures. Stereological methods were used to estimate the volume of muscle and the packing density and total number of myocyte nuclei in each bladder. We also estimated mean myocyte volume and the mean cross-sectional area and length of myocytes. Group comparisons were made by one-way analysis of variance. Changes in bladder axes were mainly laterolateral and craniocaudal. Mean bladder weight increased roughly six-fold by 3 weeks and 17-fold by 12 weeks and was accompanied, on average, by 12- and 33-fold increases in total muscle volume. These variables did not differ at 3 and 7 weeks post-obstruction. Increases in muscle content were not accompanied by changes in packing densities but were associated with increases in the total numbers of myocyte nuclei (13-fold by 3 weeks, 28-fold by 12 weeks). Mean myocyte volume did not vary significantly between groups but cells in obstructed groups were shorter and wider. These findings support the notion that partial outflow obstruction leads to an increase in the number, but not mean volume, of myocytes. If due solely to myocyte mitosis, the total of 43 x 10(8) cells found at 12 weeks could be generated by the original complement of 15 x 10(7) cells if an average of only 2.1 x 10(6) new cells was produced every hour. In reality, even this modest proliferation rate is unlikely to be achieved because myocyte proliferation rates are very low and it is possible that new myocytes can arise by differentiation of mesenchymal or other precursor cells. Univ São Paulo, Dept Cirurgia, Fac Med Vet & Zootecn, Lab Stereol & Chem Anat,Coll Vet Med, BR-05508000 São Paulo, Brazil Univ Nottingham, Queens Med Ctr, Ctr Integrated Syst Biol & Med, Nottingham NG7 2RD, England São Paulo State Univ, Dept Vet Surg & Anaesthesiol, Vet Med & Zootech Coll, Botucatu, SP, Brazil Univ São Paulo, Coll Anim Sci & Food Engn, Dept Basic Sci, Pirassununga, Brazil São Paulo State Univ, Dept Vet Surg & Anaesthesiol, Vet Med & Zootech Coll, Botucatu, SP, Brazil

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia resumo: As células musculares lisas (CML) são o principal componente do estroma prostático e desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia do órgão, atuando na contração durante a ejaculação, na sua remodelação frente a neoplasias e/ou privação androgênica, na produção de fatores parácrinos e na síntese/degradação/reorganização da matriz extracelular, segundo um intrincado mecanismo de comunicação com as células epiteliais. Além disso, tem sido também proposto que a invasão tumoral depende de uma participação ativa das células estromais, inclusas as CML, na produção de metaloproteinases de matriz (MMPs) e/ou seus inibidores dentre outros fatores. O presente estudo investigou a expressão dos marcadores de músculo liso na próstata ventral de ratos após longo período de castração. Em outra frente de investigação foi analisado o efeito do estiramento mecânico no comportamento das CML in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que as CML são afetadas pela privação androgênica. Embora demonstrem mudanças morfológicas, estas células expressam marcadores de músculo liso em nível de proteína (a-actina e cadeia pesada da miosina de músculo liso) e de RNAm (smoothelin, sm22 e calponina). Estes resultados suportam a idéia de que CML prostática pode modular o seu fenótipo (contrátil vs. sintético) sem alterar o estado de diferenciação. Sabe-se que a função primária das CML prostáticas está relacionada à contração do órgão e que isto impõe uma deformação mecânica sobre estas células. Por esta razão, resolveu-se investigar se haveria modulação do seu comportamento frente ao estiramento in vitro, sob condições controladas. Foi demonstrado que as CML diminuem a atividade proliferativa em resposta ao estiramento cíclico da mesma forma que ao estiramento estático. Em relação à expressão de proteínas relacionadas à atividade contrátil (a-actina e cadeia pesada da miosina de músculo liso), os resultados obtidos indicam que as CML respondem ao estiramento cíclico com um aumento na concentração destas proteínas o que poderia indicar hipertrofia celular, o que foi confirmado pela quantificação do conteúdo de F-actina por citometria de fluxo. Este efeito não foi observado frente ao estiramento estático. Os dois conjuntos de dados confirmam que as CML apresentam grande versatilidade fenotípica, respondendo de formas diferentes não somente a estímulos hormonais, mas também a variação na demanda funcional Abstract: Smooth muscle cells (SMC) are the main component of the prostatic stroma and play important roles in the organ physiology, acting on the contraction associated with ejaculation and on the remodeling related to neoplasias or androgen deprivation, on the production of paracrine factors and the synthesis/degradation/reorganization of extracellular matrix components, after an intricate mechanism of intercommunication with epithelial cells. Besides, it has been proposed that tumor invasion depends on the active participation of stromal cells, including SMC, on the production of MMPs and/or their inhibitors among other factors. The present study investigated the expression of smooth muscle markers on the rat ventral prostate after long term androgen deprivation. Another set of experiments were designed to study the effect of mechanical stretching on SMC behavior in culture. The results demonstrated that SMC are affected by androgen deprivation. Even though the SMC exhibited morphological changes, they kept the expression of smooth muscle markers at the protein (SM a-actin and SM-MHC) and mRNA levels (smoothelin, sm22 and calponin). These results reinforce the idea that prostatic SMC modulate their phenotype (contractile vs. synthetic) without compromise the differentiation state. It is well known that the primary function of the SMC is the organ contraction and that it subjects the cells to mechanical deformation. For this reason, it was decided to test whether SMC modulate their behavior in response to mechanical stretching in vitro under controlled conditions. It was demonstrated that both cyclic and static mechanical stretches decrease SMC proliferation. On the other hand, cyclic stretching increased the concentration in SM-MHC and SM a-actin that could be associated with cell hypertrophy. To confirm this hypothesis, the F-actin content was measured through the intensity of FITC-phalloidin labeling by flow cytometry at the single cell level. The results confirmed that cyclic stretching caused a significant increase in cytoskeleton mass, what is compatible with cell hypertrophy. This effect was not observed after static stretching. The two sets of results confirm that SMC exhibit great phenotypical versatility, responding not only to hormonal stimuli, but also to functional demands Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural