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Given a problematic characterization of differentiation through natural sources and identified by natural sources of identification, in these possible works, linked to, an indication of natural protein markers by this metal in lactating women. Twenty-three samples of milk and hair were collected from riverine lactating women from the communities of Livramento-AM – Rio Negro and Abunã-RO, Fortaleza de Abunã-RO, Nova Mutum Paraná-RO and Vila da Penha-RO – Rio Madeira. The quantification of total mercury in the milk samples was performed by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS) and the results were between 6.03 ± 0.48 and 83.49 ± 1.08 µg L-1. As for the total reference concentration in the hair samples, the absorption technique was performed using the optics dedicated to continuous samples – Perkin Elmer's SMS 100, and the results were between 0.33 ± 0.005 and 6.04 ng g-1. The proteome fractionation process was performed by two-dimensional electrophoresis - 2D PAGE, with two replications per sample. The number of separate protein spots was between 92 ± 2 and 347 ± 3. The apparently average between the gels was between 75.5 and 94.5%. As points in relation to isoelectric points and molecular mass, a distributed distribution of distributors9 (isoelectric point) between 15 to 7kDa (molecular mass). The mercury in the spots performed by GFAAS indicated mapping in the range of 0.011 and 0.0158 ng/mL. The points associated with mercury were characterized by sequence mass spectrometry coupled with liquid chromatography - LS-MS/MS. Beta-casein O was identified in 35% of the spots, 35% the constant kappa immunoglobulin OS, 26% the alpha-S1-casein OS and 4% the immunoglobulin chain. These proteins were in contact with the most expressed, and may be possible biomarkers of breast milk. Dada a problemática de contaminação por mercúrio por fontes naturais e antrópicas na região estudada, neste trabalho buscou-se identificar e caracterizar possíveis biomarcadores de proteínas do leite materno, ligadas ao mercúrio, a fim de possibilitar uma indicação prévia de contaminação por esse metal em lactantes. Foram realizadas coletas de 23 amostras de leite e de cabelo de lactantes ribeirinhas das comunidades de Livramento-AM – Rio Negro e Abunã-RO, Fortaleza de Abunã-RO, Nova Mutum Paraná-RO e Vila da Penha-RO – Rio Madeira. A quantificação de mercúrio total nas amostras de leite foi realizada por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) e os resultados ficaram entre 6,03 ± 0,48 e 83,49 ± 1,08 µg L-1. Já a concentração de mercúrio total nas amostras de cabelo foi realizada utilizando-se a técnica de absorção atômica dedicado a amostras sólidas – SMS 100 da Perkin Elmer, e os resultados ficaram entre 0,33 ± 0,005 e 6,53 ± 0,04 ng g-1. O processo de fracionamento do proteoma foi feito por eletroforese bidimensional - 2D PAGE, com duas repetições por amostra. O número de spots proteicos separados ficou entre 92 ± 2 e 347 ± 3. A correlação média entre os géis (metching) ficou entre 75,5 e 94,5%. As distribuições dos spots em relação aos pontos isoelétricos e massa molecular apresentaram uma distribuição homogênea distribuídos na faixa de 4 a 9 (ponto isoelétrico) e entre 15 a 75 kDa (massa molecular). O mapeamento do mercúrio nos spots proteicos realizado por GFAAS indicaram concentrações na faixa de 0,0011 e 0,0158 ng/mL. Os spots associados ao mercúrio foram caracterizados por espectrometria de massa em sequência acoplada com cromatografia líquida - LS-MS/MS. Em 35% dos spots foi identificada a Beta-casein O, 35% a Immunoglobulin kappa constant OS, 26% a Alpha-S1-casein OS e 4% a Immunoglobulin J chain. Essas proteínas foram as mais expressas quando em contato com o mercúrio, podendo ser possíveis biomarcadoras do mercúrio no leite materno.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Trypanosma cruzi, é o agente causador da doença de Chagas. Essa tripanosomíase tem se tornado um problema de saúde mundial devido a migrações de latinoamericanos à países não endêmico. Na América Latina com o sucesso da implementação do controle da infestação doméstica pelo vetor e de transfusões sanguíneas, a importância da transmissão congênita tem aumentado recentemente. Considerando a cuidadosa regulação do sistema imune durante a gestação, nosso objetivo foi investigar as mudanças causadas pela infecção por T.cruzi ao sistema imune na progressão da gestação. Foram utilizadas cepas G e Y de T cruzi para infectar fêmeas BALB/c antes ou depois do acasalamento com machos não infectados. A presença da rolha vaginal foi usada como indicativo de acasalamento. As fêmeas foram eutanasiadas 8 dias depois da confirmação da rolha vaginal. Foram usados três grupos controles, fêmeas apenas infectadas, apenas grávidas e nenhuma das situações. Dois grupos de fêmeas foram infectadas antes do acasalamento e dois grupos 4 dias após a confirmação da rolha vaginal. O útero e o baço foram coletados para análises de imunohistoquímica, qPCR, imunfluorescência e dosagem de citocinas. Nossos resultados mostraram que, apesar do padrão de marcação para MMPs ter sido semelhante entre os grupos, a cepa mais virulenta de T.cruzi pode impedir a progressão da gestação quando anterior ao acasalamento; a infecção aumentou de forma sistêmica citocinas como IFN-γ, IL-1β e IL-4; e os leucócitos no ambiente uterino se apresesntaram alterados, respondendo de forma local à alteração sistêmica causada pela infecção. Em conclusão, esse trabalho sugere que a infecção por T.cruzi pode prejudicar o desenvolvimento da gestação e a resposta local a uma infecção sistêmica foi capaz de controlar a infecção e permitir a progressão da gestação sob algumas dentre as condições analisadas. Trypanosma cruzi is the causative agent of Chagas disease. This trypanosomiasis has become a global public health problem due to migration of Latin Americans to non-endemic countries. In Latin America with the succesful implementation of control domiciliated vector infestation and blood transfusion, the importance of congenital transmission has recently increased. Considering the tight regulation of immune system during gestation, we aimed to investigate the changes in the immune system caused by T.cruzi infection in the gestation outcome. T cruzi G and Y strain were used to infect female BALB/c mice before or after mating with non-infected male mice. The presence of vaginal plug was used as indicative of mating. Females were euthanized 8 days after confirmation of vaginal plug. We used three female control groups, only infected, only infected and non-infected and non-pregnant females. Two groups were infected before mating and other two were infected 4 days after confirmation of vaginal plug. The uterus and spleen were collected to immunochemistry, qPCR, immunofluorescence and cytokine analysis. Our results showed that despite the MMP’s identification being similarly among groups, T.cruzi higher virulent strain can impaire gestation outcome prior mating; the infection also increased cytokines like IFN-γ, IL-1β and IL-4; and leucocytes in uterine environment was altered, responding locally to systemic changes caused by T.cruzi infection. In conclusion this work suggests that T.cruzi infection can impaire gestation outcome and local response to sistemic infection was able to control the infection allowing pregnancy development in some conditions. Dissertação (Mestrado)

Orientador: Silvana Pereira Barros Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: O hormônio paratireóideo (PTH), um mediador da remodelação óssea, é o principal regulador da homeostasia do cálcio, sendo capaz de promover reabsorção e aposição ósseas. Em trabalhos realizados recentemente, foi verificado que o tratamento com PTH, administrado de maneira intermitente, diminuiu a perda óssea e também células inflamatórias no tecido gengival, em ratos com periodontite induzida. No intuito de melhor explicar os resultados obtidos nesses trabalhos, doença periodontal foi induzida em primeiros molares de ratos e após 15 e 30 dias de tratamento com PTH os animais foram sacrificados com o objetivo investigar o periodonto para: 1) avaliar a expressão gênica, por meio de RT-PCR, e localizar, por meio de reação imunohistoquímica, algumas citocinas inflamatórias (IL-1b, IL-6, TNF-alfa) e certas metaloproteinases da matriz (MMP-2 e MMP-9), 2) verificar, por meio de histoquímica, a atividade de fosfatase ácida tatarato resistente (TRAP) na superfície óssea alveolar, e 4) medir a atividade gelatinolítica das MMPs 2 e 9. Como resultados, observou-se que o PTH diminuiu a expressão de mRNA para MMP-2 (15 e 30 dias experimentais) e IL-6 (30 dias experimentais) nas gengivas dos animais estudados; que a localização de IL-1beta, MMP-2 e MMP-9 se deu basicamente no tecido conjuntivo da gengiva, e que a IL-6 foi detectada principalmente na superfície do osso alveolar. O número de células TRAPpositivas foi diminuído nos animais tratados 30 dias com PTH, e atividade gelatinolítica de MMP-9 foi diminuída após 15 dias de tratamento com o hormônio. Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que a administração intermitente de PTH pôde modular moléculas (MMP-2, MMP-9, IL-6 e número de células TRAP-positivas) que têm relação com degradação tecidual na doença periodontal em ratos Abstract: Intermittent Parathyroid hormone (PTH) administration has been used as an anabolic agent, and when it is administrated in rats with induced periodontitis, it is able to decrease alveolar bone loss, and reduce the inflammatory cells on the marginal gingival tissue. A possible action of the PTH in cytokines and metalloproteinase (MMPs), related with breakdown tissue in periodontitis, was hypothesized. After inducing periodontitis with cotton ligature in rats and PTH intermittent treatment during 15 and 30 days, inflamed gingival tissue was removed, and a decrease of IL-6 and MMP-2 mRNA expression was observed by semi-quantitative RT-PCR analysis. Zymography assay demonstrated that PTH treatment decreased MMP-9 activity after 15 experimental days. After jaw decalcification, TRAP positive cells were found in higher number on the alveolar bone surface in the group without PTH treatment, after 30 experimental days. Using immunohistochemistry, MMP-2, MMP-9, IL-beta and TNF-alpha were identified in all groups and they were found on the gingival tissue and IL-6 on alveolar bone surface. Within the limits of this study, it can be concluded that intermittent PTH administration may modulate IL-6, MMP-2, MMP-9 and TRAP-positive cells in experimental periodontitis Doutorado Histologia e Embriologia Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Jose Eduardo Tanus dos Santos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Metaloproteinases modulam a contratilidade vascular e podem afetar a hipertensão pulmonar que ocorre na embolia pulmonar induzida (EPA). Nós examinamos os efeitos da administração de doxiciclina ( um inibidor das metaloproteinases) em cães anestesiados e submetidos à EPA. Métodos: 5 cães no grupo sham receberam somente salina. EPA foi induzida por injeção intravenosa de microesferas em quantidade suficiente para aumentar a pressão média arterial pulmonar (PMAP) em 20 mmHg e cães do grupo embolia receberam salina (grupo embolia, N=8) ou doxiciclina (10 mg/Kg, i.v.) 5 ou 30 minutos após EPA (grupos embolia + doxi 5 e embolia + doxi 30, N=9 e 8, respectivamente). Avaliação hemodinâmica foi feita no momento basal e de 5 a 120 minutos após EPA. Zimografia da MMP-2 e da MMP-9 foi feita nas amostras de plasma. Resultado: nenhuma mudança hemodinâmica foi observada no grupo sham. Embolização aumentou a PMAP em 218+/-16% e índice de resistência vascular pulmonar (IRVP) em 289+/-42% no grupo embolia (ambos p

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Envenenamentos por serpentes das subfamílias Crotalinae e Viperinae são caracterizados por um complexo quadro fisiopatológico, em que a hemorragia é freqüentemente observada. Neste trabalho, purificamos e caracterizamos uma proteína hemorrágica (BlaH1) da peçonha de Bothrops lanceolatus. A hemorragina foi purificada utilizando-se uma combinação de Cromatografias de gel filtração, afinidade e interação hidrofóbica. Em SDS-PAGE, a enzima apresentou uma massa molecular estimada em 28 kDa, tanto na ausência quanto na presença de j3-mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A reação da BlaH1 com anticorpo foi confirmada pelos ensaios de imunobloting, ELlSA, imunoeletroforese e imunodifusão, onde o antisoro botrópico comercial foi capaz de reconhecer a proteína hemorrágica. BlaH1 possui atividade hemorrágica e caseinolítica. O uso do agente quelante EDTA inibiu as atividades hemorrágica e caseinolítica, sugerindo que a hemorragina é uma metaloproteinase. O pH ótimo da enzima foi de 8,0 e a temperatura ótima entre 30-40°C. Esses resultados mostram que a hemorragina isolada da peçonha de B. lanceolatus apresenta propriedades semelhantes a outras hemorraginas isoladas de peçonhas ofídicas Abstract: Bothrops snake venoms contain metalloproteinases that contribute to the local effects seen after envenoming. In this work, a hemorrhagic metalloproteinase (BlaH1) was purified from the venom of the snake Bothrops lanceolatus by a combination of gel filtration, affinity (metal chelating) and hydrophobic interaction chromatographies. The hemorrhagin was homogeneous by SDS-PAGE and had a molecular mass of 28 kDa that was unaltered by treatment with beta-mercaptoethanol. BlaH1 gave a single band in immunodiffusion, immunoelectrophoresis and immunoblotting using commercial bothropic antivenom. This reactivity was confirmed by ELlSA. BlaH1 had hemorrhagic, caseinolytic, fibrinogenolytic, collagenolytic and elastinolytic activities, but no phospholipase A2 activity. The hemorrhagic and caseinolytic activities were inhibited by EDTA, indicating that they were metal ion-dependent. In contrast, aprotinin, benzamidine and PMSF did not affect these activities. The caseinolytic activity of BlaH1 had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40°C; activity was completely lost at >70°C. The hemorrhagic activity was neutralized by commercial bothropic antivenom. These properties suggest that this new hemorrhagin belongs to class P-I snake venom metalloproteinases Mestrado Mestre em Farmacologia

Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Mestrado Química Analítica Mestre em Química

Orientador: Camilla Abbehausen Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Entre as causas da resistência bacteriana, a expressão de metalo-beta-lactamase (MBL) é uma das maiores preocupações devido ao seu amplo espectro de ação e à ausência de inibidores efetivos. A despeito dos estudos de mecanismos e da classificação estrutural entre subgrupos (B1, B2, B3), certos domínios estruturais podem construir chaves de especificidade na inibição destas proteínas. Nesse trabalho, através de um estudo sistemático in silico, foram demonstrados os principais aspectos que diferenciam os subgrupos B1 e B3 de uma perspectiva estrutural e físico-química. Dentre os grupos diferenciadores, uma região não conservada, uma alça (linker 1 ) presente nas enzimas do subgrupo B1, associada com seu amplo espectro de atuação. Já as enzimas de B3 possuem um motivo hélice-gancho-hélice (linker 2 ) que é associado à especificidade de substrato. Também, um triptofano bem conservado a uma distância de 6.3 Å do sítio ativo é encontrado em maior parte no subgrupo B3, sugerindo que a interação de empilhamento-pi, quando estabelecida, poderia estabilizar grupos aromáticos do substrato ou inibidor. Observando por uma perspectiva físico-química, o potencial eletrostático de superfície além de 6 Å de distância do centro metálico Zn(II) é próximo da neutralidade para o subgrupo B1 e negativo para o subgrupo B3. Não obstante, os índices de Fukui calculados para o sítio ativo revelaram que os resíduos Asp120 de B3 e Cis221 de B1 são mais susceptíveis a um ataque eletrofílico, o que diferencia B1 de B3. Os dados reportados aqui nos permitiu realizar uma campanha de ancoragem bem sucedida e propor dois inibidores com ação específica contra B1 versus B3. A atividade de inibição e a especificidade foi analisada através de simulação de dinâmica molecular e indicou que apenas um dos inibidores propostos apresentaram ação específica contra B3. Os resultados representam, portanto, um estudo in silico sistemático de todas as estruturas reportadas de MBL e descrevem domínios estruturais e características eletrônicas da superfície e de resíduos específicos que podem ser exploradas na elaboração de inibidores mais seletivos Abstract: Among the causes of bacterial resistance, metallo-beta-lactamase (MBL) production is one of the major concerns, due to its broad-spectrum of action and the absence of useful inhibitors. Despite MBL¿s mechanism studies and structural classification into subgroups (B1, B2, and B3), there are specific domains and structures that can construct a key for specificity towards the those protein inhibition. In this work, by a systematic in silico study, it was shown the major aspects that differentiate B1 and B3 subgroups from a structural and physicochemical perspective. Among the characteristic groups used to differ the structures, a non-conserved linker, known as a loop (linker 1 ) belonging to B1 enzyme , is associated with their broader-spectrum of action. Yet, the B3 enzymes has a helix-hairpin-helix (HHH) motif (linker 2 ) that is associated with their substrate specificity. Also, a well-conserved tryptophan at 6.3 Å from the active site is found mostly in the B3 subgroup, suggesting that a ?-stacking interaction, when established, would stabilize aromatic groups of the substrate, or inhibitor. Looking at the physicochemical descriptors, electrostatic potential at surface 6 Å apart from the Zn2+ center is close to neutral in B1 subgroup and negative in the B3 subgroup. Nevertheless, calculated Fukui indices for the active site revealed that the B3¿s Asp120 and B1¿s Cys221 residues are susceptible to electrophilic attack, which differentiate B1 from B3. The data reported here allowed us to perform a successful docking campaign and propose two inhibitors with specificity of action against B1 versus B3. The inhibition activity and their specificity were analyzed through molecular dynamic simulation, which suggested only one efective and with specificity of action inhibitor between the two proposed firstly. Therefore, the resultsfigure as a systematic in silico study of all reported M?L structures and describe structural motifs, surface electronic characteristic, and specific residues that can be deployed into the design of more selective inhibitors Mestrado Química Inorgânica Mestre em Química

Orientador: Edgard Graner Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: A Ciclosporina A (CSA) é uma droga imunossupressora, que atua de forma específica e reversível, principalmente em linfócitos T CD4. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da CSA sobre a produção e atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas ao processo de reparação alveolar de molares de ratos Wistar, através de análise zimográfica. Foram utilizados 30 ratos tratados diariamente com CSA na concentração de 10 mg/kg de peso corporal por via subcutânea, com o início do tratamento ocorrendo 7 dias antes das exodontias e permanecendo após as cirurgias por períodos de 1 a 10 dias, quando os grupos foram sacrificados. Como grupo controle foram utilizados 30 ratos aplicados com solução salina a 0,9%. Verificou-se a presença de enzimas gelatinolíticas com comportamento, frente a ação de inibidores específicos e massa molecular semelhantes às das enzimas pertencentes ao grupo das MMPs. A análise nos diversos períodos de reparação alveolar demonstrou que este processo é acompanhado por secreção e atividade gelatinolítica, principalmente de MMP-9 e MMP-2. A produção e atividade gelatinolítica total e das MMP-9 e MMP-2 dos meios de cultura condicionados com o tecido de granulação dos alvéolos dos ratos foi menor nos animais tratados com CSA do que no grupo controle. Estes resultados indicam que a CSA reduz a produção e atividade de enzimas pertencentes ao grupo das MMPs, que participam no processo de reparo alveolar Abstract: Cyclosporin A (CSA) is a potent immunosuppressive agent which acts in a specific and reversible way, mainly in T CD4 Iymphocytes. The aim of this study was to investigate the production and activity of matrix metalloproteinases (MMPs) through zymography during alveolar wound healing of inferior molars of Wistar's rats treated with CSA. Thirty Wistar rats where daily injected subcutaneously with 10 mg/kg/body weight of CSA starting seven days before the extraction and continuing from 1 to 10 days after surgery. The same numbers of rats were injected with the same volume of saline solution as a control group. Specific inhibitors were used to identify MMPs enzymes group. The data obtained from different healing periods, showed secretion and gelatinolytic activity, mainly by MMP-9 and MMP-2. The total gelatinolytic activity of MMP-9 and MMP-2 of the cell culture medium incubated with granulation tissue from the healing area, were lower in the CSA group than in the control group. The results showed that CSA use reduced the MMPs enzyme activity, which may have an important role in the alveolar wound healing process Doutorado Doutor em Biologia e Patologia Buco-Dental

Orientador: Camilla Abbehausen Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Zinco-proteínas desempenham papeis fundamentais em organismos. Os íons ZnII, que atuam nestas proteínas, são classificados conforme seu papel, catalítico ou estrutural. Como estão envolvidas em diversos processos de doença, a inibição ou regulação da atividade de várias zinco-proteínas pode representar a cura de muitas delas. Porém um dos grandes desafios no desenvolvimento de inibidores de zinco-proteínas é obter seletividade. Neste trabalho, compostos fosfinaouro(I) foram avaliados frente a modelos de zinco estrutural, representados por domínios dedos de zinco encontrados em uma proteína do vírus HIV-1 (NCp7) e em um fator de transcrição humano (Sp1), e frente a um modelo de zinco catalítico, representado por uma metalo-?-lactamase, visando compreender sua forma de atuação em cada um dos casos. Essa classe de compostos foi selecionada pois, dentre os complexos de ouro descritos na literatura, os fosfinaouro(I) se destacam por apresentarem uma forma de atuação singular frente a dedos de zinco. O fármaco auranofina, utilizado na clínica, pertence a essa classe e tem despertado especial interesse. No caso do zinco estrutural, a remoção ou substituição do ZnII causa inibição da atividade. Sabe-se que compostos de AuI e AuIII promovem a substituição de ZnII em proteínas dedo de zinco, mas pouco se conhece sobre o mecanismo ou a estrutura das proteínas substituídas, chamadas de dedos de ouro. Com o objetivo de desvendar essas estruturas a interação de compostos fosfinaouro(I) com os dois modelos de proteínas dedos de zinco foi estudada por espectroscopia de absorção de raios X. Observou-se que, no caso desses complexos, a reatividade depende da estrutura do dedo de zinco utilizado, o que não foi observado para outros complexos de ouro. Esse resultado demonstra que é possível modular a reatividade dos complexos metálicos através dos ligantes, permitindo o desenvolvimento de metalofármacos mais seletivos. Do ponto de vista do zinco catalítico, este trabalho representa o primeiro estudo da atividade inibitória de complexos de ouro frente a ?-lactamases. Os resultados sugerem que alguns complexos de AuI apresentam atividade inibitória. Esta primeira evidência de interação apresenta uma nova classe de compostos interessantes para estudos como inibidores de metalo-?-lactamases. Buscando modular a seletividade e melhorar a eficiência dos compostos de ouro nestes sistemas, foi também desenvolvido um novo complexo hidrossolúvel de AuI com tri(carboxietil)fosfina, que apresentou atividade inibitória frente a ?-lactamases, mas não frente aos dedos de zinco estudados Abstract: Zinc-proteins play key roles in organisms. The ZnII ions, which act on these proteins, can be classified in catalytic or structural according to their role. As they are involved in various disease processes, the inhibition or regulation of their activity may represent the cure of many of them. However, one of the major challenges in developing zinc-protein inhibitors is to achieve selectivity. In this work, phosphinegold(I) compounds were evaluated as inhibitors of structural zinc models represented by zinc finger domains found in the HIV-1 protein NCp7 and in the human transcription factor Sp1, and as inhibitors of a catalytic zinc model represented by a metallo-?-lactamase, in order to understand their way of action in each case. This class of compounds has been selected because among the gold complexes described in the literature, the phosphinegold(I) are distinguished by their unique performance against zinc fingers. The clinically approved drug auranofin, belongs to this class and has attracted much interest. In the case of structural zinc, the removal or replacement of ZnII causes inhibition of its activity. It is known that AuI and AuIII compounds promote the replacement of ZnII in zinc finger proteins, therefore the mechanism and structure of the substituted proteins, called gold fingers, are unknown. In order to unravel these structures, the interaction of phosphinegold(I) compounds were studied with two models of zinc finger proteins by X-ray absorption spectroscopy. It was observed that, in the case of these complexes, the reactivity depends on the structure of the zinc finger used, which was not observed for other gold complexes. This result demonstrates that it is possible to modulate the metal complexes reactivity through the ligands, allowing the development of more selective metallodrugs. From the point of view of catalytic zinc, this work represents the first study of the inhibitory activity of gold complexes against ?-lactamases. The results suggest that some AuI complexes have inhibitory activity. This first evidence of interaction presents a new class of interesting compounds for studies as inhibitors of metallo-?-lactamases. Aiming to modulate the selectivity and to improve the efficiency of the gold compounds in these systems, a new water soluble complex of AuI with tri(carboxyethyl)phosphine was also developed, which inhibited the activity of ?-lactamases, but not of the zinc fingers studied Mestrado Química Inorgânica Mestre em Química CNPQ 152782/2012-5 CAPES FAPESP

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais BpMP-I é uma metaloprotease não hemorrágica e fibrinogenolítica isolada da peçonha de B. pauloensis. No presente trabalho, foi investigada a reatividade cruzada de anticorpos policlonais anti-BpMP-I (IgG e IgY) isolados a partir do soro de camundongos (Balb-C) e da gema do ovo de galinhas (White Leghorn). Os anticorpos foram utilizados para detectar antígenos potenciais nas peçonhas para o enriquecimento do soro antiofídico. Posteriormente, os anticorpos anti-BpMP-I (IgG e IgY) foram acoplados à colunas de afinidade para o isolamento de proteínas alvo. As proteínas ligantes à anti-BpMP-I (IgG-Sepharose e IgY-Sepharose) foram submetidas às análises de eletroforese 2D e espectrometria de massa em MALDI TOF/ TOF. Os anticorpos anti BpMP-I também foram utilizados para identificar metaloproteases no secretoma de linhagem primária de câncer de mama (MACL-1). Inicialmente, os resultados de reatividade específica contra BpMPI confirmaram a eficácia da imunização e mostraram uma intensa reatividade cruzada entre as peçonhas de B. pauloensis, B. jararaca, B. diporus e B. atrox. Nenhuma reatividade cruzada foi detectada para a peçonha de Crotalus durissus collilineatus e a fosfolipase A2 (BnSP7), que foi utilizada como antígeno negativo. Os anticorpos foram eficientes em inibir as atividades azocaseinolítica e hemorrágica da BpMP-I e da peçonha de B. pauloensis, respectivamente, confirmando o seu potencial de neutralização. Aproximadamente, 20 (específico para IgY) e 23 (específico para IgG) spots foram detectadas em 2D SDS-PAGE, e somente 11 spots foram sequenciados, identificando principalmente metaloproteases da classe PIII e domínios lectina tipo-C. Além disso, os anticorpos anti-BpMP-I foram capazes de reconhecer proteínas na faixa de 72 kDa presentes no secretoma de linhagem primária de câncer de mama (MACL-1), provavelmente, a MMP-2, uma metaloprotease altamente expressa em uma variedade de células malignas, tais como câncer de mama. Analisados em conjunto, os nossos resultados mostraram que os anticorpos policlonais anti-BpMP-I foram capazes de reconhecer metaloproteases em diferentes peçonhas e no secretoma de células de câncer de mama, sugerindo a sua utilização como candidatos potenciais para inclusão no soro antiofídico ou tratamento e diagnóstico do câncer. BpMP-I is a non-hemorrhagic metalloprotease isolated and fibrinogenolytic the venom of B. pauloensis. In the present work , we investigated the cross-reactivity of polyclonal anti-BPMP-I (IgG and IgY) isolated from the serum of mice (Balb-C) and chicken egg yolk (White Leghorn). The antibodies were used to detect potential antigens in venoms for enrichment of antivenom. Subsequently, the anti-BPMP-I antibodies (IgG and IgY) were coupled to affinity columns for isolation of target proteins. Proteins binding to the anti-BPMP-I (IgY and IgG-Sepharose Sepharose) were subjected to 2D electrophoresis analysis and mass spectrometry MALDI TOF / TOF. The BPMP-I antibodies were also used to identify metalloproteinases in secretome primary line of breast cancer (MACL-1). Initially, the results of specific reactivity against BpMPI confirmed the efficacy of immunization and showed a strong cross reactivity between the venom of B. pauloensis, B. jararaca, B. and B. atrox diporus. No cross reactivity was detected in the venom of Crotalus durissus collilineatus and phospholipase A2 (BnSP7), which was used as a negative antigen. The antibodies were effective in inhibiting the azocaseinolítica and hemorrhagic activities BPMP-I and the venom of B. pauloensis respectively, confirming its potential neutralization. Approximately, 20 (specific for IgY) and 23 (specific for IgG) were detected spots on 2D SDS-PAGE, and only 11 spots were sequenced by identifying mainly metalloproteases PIII class and type-C lectin domains. Furthermore, the anti-BPMP-I antibodies were capable of recognizing proteins in the range of 72 kDa present in secretome primary line of breast cancer (MACL-1), probably, MMP-2, a highly expressed metalloprotease in a variety of malignant cells such as breast cancer. Taken together, our results showed that anti-BPMP-I polyclonal antibodies were able to recognize metalloproteases in different venoms and secretome breast cancer cells, suggesting their use as potential candidates for inclusion in antiophidic or treating and diagnosis of cancer. Tese (Doutorado)

Orientador: Carlos Augusto Real Martinez Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A retocolite de exclusão (RCE) é um processo inflamatório inespecífico que acomete segmentos do cólon e reto exclusos do trânsito intestinal. A incidência real da RCE é desconhecida, porém estima-se que 50% dos pacientes com cólon excluso apresentarão sintomas clínicos. Algumas hipóteses norteiam a fisiopatologia da RCE. A principal está baseada na deficiência de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e de outros nutrientes acarretada pela exclusão do trânsito intestinal. O tratamento de escolha para os pacientes sintomáticos com RCE é a cirurgia de reconstrução do trânsito. O tratamento clínico disponível, realizado naqueles pacientes que não podem, em decorrência de comorbidades ou impossibilidade cirúrgica, ou não desejam ser submetidos ao procedimento cirúrgico para reconstrução do trânsito intestinal, é considerado subótimo. O infliximabe, anticorpo anti-TNF alfa, é um anticorpo monoclonal quimérico humano-murino, que bloqueia a atividade biológica do fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa). O anticorpo anti-TNF alfa impede a ligação desse aos seus receptores, bloqueando citocinas pró- inflamatórias, deslocamento de leucócitos, expressão de moléculas de adesão e atividade funcional de neutrófilos e eosinófilos, controlando o processo inflamatório. Sendo assim, o anti-TNF alfa, teoricamente, poderia ser utilizado no tratamento da RCE. Objetivo: Verificar, em modelo experimental de RCE, se a aplicação de infliximabe melhora o processo inflamatório, aumenta o conteúdo tecidual das proteínas E- caderina, Claudina-3 e Colágeno e reduz o conteúdo tecidual de metaloproteinase-9 (MMP-9) nos segmentos exclusos de trânsito fecal. Método: Vinte e dois ratos foram submetidos à operação de Hartmann. Eles permaneceram com segmento cólico derivado por 12 semanas para o desenvolvimento da RCE. Após esse período, foram divididos em três grupos: um grupo recebeu intervenção subcutânea com solução salina 2,0 ml/semana; outro grupo recebeu infliximabe na dosagem de 5 mg/Kg/semana e, o terceiro grupo, infliximabe na dose de 10 mg/Kg/semana consecutivamente por 5 semanas. Finalizado o tempo de intervenção, os animais foram eutanasiados, sendo removidos os segmentos com e sem trânsito intestinal. RCE foi diagnosticada pela presença de alterações histológicas definidas por escore validado. A expressão tecidual de E- caderina, claudina-3 e metaloproteinase-9 foi identificada por ensaio imuno- histoquímico enquanto, a de colágeno, por histoquímica. O conteúdo tecidual de todas as proteínas foi mensurado por análise de imagem assistida por computador. Resultados: Houve maior intensidade do processo inflamatório nos segmentos desprovidos de trânsito fecal quando comparados aos segmentos com trânsito preservado. Verificou-se que os animais tratados com infliximabe apresentaram melhora do escore de inflamação nos segmentos sem trânsito intestinal. Houve redução no conteúdo tecidual das proteínas E-caderina e claudina-3 nos segmentos sem trânsito intestinal. A aplicação subcutânea de infliximabe aumentou o conteúdo de ambas as proteínas nos segmentos desprovidos de trânsito fecal, sendo a recuperação maior na dose de 10mg/kg/semana. Houve redução no conteúdo de colágeno nos segmentos sem trânsito fecal. O tratamento com infliximabe aumentou o conteúdo de colágeno no cólon excluso, principalmente ao utilizar-se doses mais elevadas. O conteúdo da enzima MMP-9 foi maior nos segmentos sem trânsito fecal e o tratamento com infliximabe, independentemente da dose aplicada, reduziu seu conteúdo tecidual no cólon sem trânsito. Conclusão: A terapia com infliximabe reduz o processo inflamatório nos segmentos exclusos de trânsito fecal, aumenta o conteúdo tecidual das proteínas E-caderina, claudina-3 e colágeno, e reduz o conteúdo de MMP-9 Abstract: Purpose: The diversion rectocolitis (DRC) is an unspecific inflammatory process on segments of the colon and rectum excluded. The real incidence of DRC is unknown, however up to 50% of the patients with diverted colon will have clinical symptoms. Some hypotheses guide the physiopathology of DRC. The main one is based on the deficiency of short-chain fatty acids (SCFA) and other nutrients caused by the exclusion of intestinal path. The current treatments are grounded on this physiopathology. Therefore, the best treatment for patients with symptomatic DRC is the restauration of the bowel path surgically. The available clinical treatment, performed in those patients who cannot, due to comorbidities or surgical unfeasibility, or do not wish to undergo the surgical procedure, is considered suboptimal. Anti-TNF alpha is a chimeric human-murine monoclonal antibody, which blocks the biological action of the tumor necrosis factor alfa (TNF-alfa). Anti-TNF alpha antibody prevents biding to its receptors, blocking pro-inflammatory cytokines, leukocyte migration, expression of adhesion molecules and functional activity of neutrophils and eosinophils, controlling the inflammatory process. Thus, anti-TNF alfa , theoretically, could be used to treat DRC. Objective: To verify in an experimental model of DRC whether the application of infliximab improves the inflammatory process, increases the tissue content of E- cadherin, claudin-3 and collagen proteins and reduces the tissue content of MMP-9 in the excluded segments of fecal transit. Methods: Twenty-two rats were submitted to the Hartmann procedure. They remained with the defected colic segment for the development of DRC for 12 weeks. After that period, they were divided into three groups: One received subcutaneous intervention with 2.0 mL saline solution/week; another group received subcutaneous infliximab at dose of 5 mg/Kg/week and the third group received subcutaneous infliximab at a dose of 10 mg/Kg/week consecutively for 5 weeks. After the resolution of the intervention period, the animals were euthanized, and the segments with and without intestinal function were removed. DRC was diagnosed by the presence of histological changes defined by a validated score. The tissue expression of E-cadherin, claudin-3 and metalloproteinase-9 were evaluated by immune-histochemistry while collagen by histochemistry. The tissue content of the mentioned proteins was quantified by computer assisted image analysis. Results: There was greater intensity of inflammatory process in segments devoid of fecal transit when compared to segments with preserved transit. It was found that animals treated with infliximab showed improvement in the intestinal segments without intestinal transit. There was a reduction in tissue content of E-cadherin and claudine-3 proteins in segments without intestinal transit. Subcutaneous application of infliximab increased the content of both proteins in fecal transit-free segments, with greater recovery at a dose of 10mg/kg/week. There was a reduction in collagen content in segments without fecal transit. Treatment with infliximab increased collagen content in the excluded colon, especially when using higher doses. The content of MMP-9 enzyme was higher in the segments without fecal transit and treatment with infliximab, regardless of the dose applied, reduces its tissue content in the colon without transit. Conclusion: Infliximab therapy reduces the inflammatory process in the colonic excluded segment, increases the tissue content of E-cadherin, claudin-3 and collagen, and reduces the tissue content of MMP-9 Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutor em Ciências CNPQ

Orientadores: Camilla Abbehausen, Frederico Alves Lima Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Um estudo sistemático do efeito da primeira esfera de coordenação sobre a reatividade e estrutura de modelos miméticos monozinco de metalo-beta-lactamases (MBL) foi realizado. Três complexos de ZnII com ligantes tripodais formando a série [Zn(N-NNN)], [Zn(N-NNS)], e [Zn(N-NNO)] onde N-NNX representa os átomos doadores do ligante tripodal, foram investigados no que tange sua habilidade de mimetizar os sítios ativos de MBLs e na influência do átomo doador na reatividade. A série de complexos tripodais foram inspirados nos sítios ativos de MBLs das três diferentes subclasses, representando o sítio 1Zn (His, His, His) presente nas subclasses B1 e B3, (His, His, Asp) presente na subclasse B3 e tiolados presentes nos sítios de B1 e B2. O resultados experimentais foram reforçados por estudos teóricos de DFT e TDDFT. As análises de XAS demonstraram que a deficiência eletrônica do ZnII varia significativamente seguindo a ordem [Zn(N-NNS)] < [Zn(N-NNN)] < [Zn(N-NNO)]. Essas alterações afetam diretamente a reatividade sobre hidrólise de nitrocefina, como observado nas cinéticas de hidrólise, e interação com amoxicilina que seguem a mesma tendência. A espectroscopia de RMN revelou que a polarização do grupo carboxílico no substrato B-lactâmico se alteram na mesma ordem que as observadas nas cinéticas de hidrólise. Os resultados mostram também que não só a acidez de Lewis é alterada com as mudanças no ligante, mas também as alterações na moleza (acidez de Pearson) do metal. O [Zn(N-NNS)] é \textquotedblleft amolecido\textquotedblright pelo grupo tiolato, promovendo reações de substituição de água ou cloreto coordenado por solventes mais moles como DMSO, e favorecendo interações secundárias com os substratos. Este comportamento não foi observado para o [Zn(N-NNO)]. A análise estrutural por DRX dos miméticos revelou aspectos de similaridade geométrica entre estes e o sítio ativo da estrutura cristalina da MBL GOB-18. A interação desses modelos miméticos com complexos de AuI/III foi avaliada utilizando RMN de 1H e ESI-MS, e mostrou interações seletivas e dependentes da primeira esfera de coordenação coerentes com o esperado pelo comportamente de acidez e basicidade de Pearson. Este trabalho demonstrou que detalhes da estrutura eletrônica do ZnII devem ser levadas em consideração no design de novos modelos miméticos de MBLs e que podem ser utilizando no busca e desenvolvimento de novos inibidores de uso clínico contra MBLs Abstract: A systematic study of the first coordination sphere over the reactivity and structure of metallo-beta-lactamase (MBL) monozinc model complexes is reported. Three ZnII complexes with the tripodal ligands forming the series [Zn(N-NNN)], [Zn(N-NNS)], and [Zn(N-NNO)] where N-NNX represents the tripodal donor atoms, were investigated regarding their ability to mimic MBL. The tripodal series was inspired by MBL active sites in the respective subclasses, which represents the (His, His, His) Zn1 site present in B1 and B3 subclasses, (His, His, Asp) presented in B3 subclass site and the thiolate presented in B1 and B2 sites. The results were reinforced by DFT and TD-DFT calculations. XAS analysis demonstrated the ZnII electronic deficiency significantly changes in the order [Zn(N-NNS)] < [Zn(N-NNN)] < [Zn(N-NNO)]. This effect directly affects the reactivity over nitrocefin and amoxicillin, observed by the kinetics of hydrolysis, which follows the same trend as the other measurements. NMR spectroscopy revealed that the polarization of carboxylic group in the substrate changes accordingly affecting the hydrolysis kinetic. Our results also demonstrated that not only Lewis acidity is changed by the ligand system but also the softness character of the metal. [Zn(N-NNS)] in particular, is softened by the thiolate, promoting the ligand substitution reaction with solvents and favoring secondary interaction with substrates, not observed for [Zn(N-NNO)]. XRD of the models reveals their similar geometric aspects in comparison to the single-crystal structure of GOB-18 (5K0W) MBL. The interaction of these model complexes with AuI/III complexes was evaluated using 1H NMR and ESI-MS and showed a selective interaction depending on the first coordination sphere and in agreement with Pearson acid-base behavior. The present work demonstrate the ZnII electronic details must be considered in the design of new MBL models and can be used in further aid in the design of new clinically useful MBL inhibitors Doutorado Química Inorgânica Doutor em Ciências CNPQ 140367/2015-2 FAPESP

[ES] Aspergilllus fumigatus es un hongo filamentoso que puede causar aspergilosis pulmonar invasora (API). Entre sus atributos de virulencia se encuentra la capacidad para obtener nutrientes esenciales a partir del hospedador, tales como el zinc. Se ha demostrado que el control de homeostasis de zinc en el hongo depende del factor transcripcional ZafA, el cual regula la expresión de genes que codifican transportadores de membrana (ZrfA, ZrfB y ZrfC) en condiciones limitantes en zinc, y es esencial para la virulencia del hongo. Además de los genes que codifican proteínas efectoras en homeostasis de zinc, ZafA regula la expresión de otros muchos genes en condiciones de escasez de zinc, entre los que se encuentra el gen AFUA_8G02620 (mchC) que exhibe un alto nivel de expresión independientemente del pH ambiental. Este gen codifica una proteína GTPasa de la familia COG0523 (MchC) que podría funcionar como metalochaperona de zinc en la maduración de ciertas metaloproteínas. Además, A. fumigatus codifica otras dos proteínas COG0523, MchA y MchB, las cuales no están reguladas por ZafA. El objetivo de este estudio fue determinar la función de las posibles metalochaperonas (Mchs) de la subfamilia COG0523 en la respuesta homeostática y/o adaptativa a la carencia de Zn2+ y su relevancia en la virulencia del hongo Aspergillus fumigatus. Para ello, como primera aproximación se realizaron experimentos de complementación funcional en S. cerevisiae y se encontró que MchB posiblemente interfiere con la función de Zch1 en la biosíntesis del ergosterol en la levadura. A la vez se construyeron mutantes simples (∆mchA, ∆mchB y ∆mchC), dobles (∆mchAB, ∆mchAC y ∆mchBC) y un mutante triple (∆mchABC) de A. fumigatus y se construyeron cepas revertientes (∆mchA[TAP-mchA], ∆mchB[TAP-mchB] , ∆mchC [TAP-mchC] para purificación de proteínas y ∆mchC [mchC] como control. Se realizaron análisis fenotípicos usando diferentes tipos de estrés en condiciones de carencia de zinc. Con los resultados se estableció que la carencia de los genes produce una reducción del peso neto de las cepas. MchB participa en la respuesta de Aspergillus fumigatus a estrés oxidativo generado por peróxido de hidrógeno y que su función está relacionada con la presencia de zinc en el medio. En el caso de MchA al parecer está involucrada con la cadena alternativa de transporte de electrones, y está actividad es independiente de la presencia de zinc en el medio. En la co-purificación de proteínas con MchB y MchC se identificó a la proteína Ydj1 como una posible candidata de interacción con MchB y MchC. En un experimento realizado en S. cerevisiae se encontró que MchB al parecer interfiere negativamente con la función de YDJ1 en la levadura. Teniendo en cuenta la posible relación de los genes con la función mitocondrial y el crecimiento de la cepa de S. cerevisiae ZCH1[mchB] se evaluó la presencia de un fenotipo “petite” y se cuantificó el ADN mitocondrial. Se encontró que la deleción de ZCH1 reduce la cantidad de ADN mitocondrial y que mchB al parecer acelera está reducción generando la pérdida de funciones respiratorias mitocondriales en la levadura. Al realizar este análisis en las cepas de A. fumigatus se encontró que la deleción de mchA y mchB reduce la cantidad de ADN mitocondrial. Con estos resultados se podría sugerir que la función de las proteínas COG0523, Zch1 en S. cerevisiae y MchA, MchB y MchC en A. fumigatus, están relacionadas con una función mitocondrial no esencial para el crecimiento de los microorganismos; pero importante para su respuesta adaptativa a estrés salino, estrés oxidativo o estrés de membrana.

La presente memoria está estructurada en cinco capítulos donde se presentan los resultados de la investigación, acompañados por un capítulo en el que se describe la parte experimental, y por último, el capítulo de conclusiones. Se adjuntan cuatro anexos que recogen los espectros de masas (FAB+), IR, RMN y los datos cristalográficos. Por último, para cumplir con los requerimientos exigidos para optar a la mención de Doctorado Europeo se incluye un Abstract en inglés de la Tesis. En el Capítulo I se hace una introducción a las metaloenzimas que contienen níquel en su centro activo. En el Capítulo II se describe la reactividad del níquel frente a moléculas sencillas de interés biológico. En el Capítulo III se presentan los complejos de níquel pentacoordinado con ligandos carbonato puente que sirven como modelos de Anhidrasa carbónica y fijan CO2(g). En el Capítulo IV se describen los complejos modelo de la Hidrogenasa [Ni-Fe] y en el capítulo V se describen los modelos del centro activo de la Fosfotriesterasa, incluyendo un estudio cinético de la hidrólisis del tris(nitrofenil) fosfato mediante hidroxocomplejos de níquel., This Thesis is structured in five chapters that reports the results of the research, accompanied by a chapter that describes the experimental part, and finally, the concluding chapter. Experimental data of the synthesis and characterisation of the new complexes as mass spectra (FAB +), IR, NMR and crystallographic data, are annexed. Finally, following the requirements to obtain the mention of European Doctor we include anin English of the Thesis. Chapter I provide an introduction to the nickel-containing Metalloenzymes in their active site. Chapter II describes the reactivity of Nickel versus single molecules of biological interest. Chapter III presents pentacoordinate nickel complexes with carbonate-bridge ligand that served as models for Carbonic Anhydrase and CO2 fixation. Chapter IV describes the [Ni-Fe] Hydrogenase model complexes and Chapter V describes the models of the active site of the Phosphotriesterase, including a kinetic study of the hydrolysis of the tris(nitrophenyl)phosphate by nickel hydroxocomplexes.

El estudio de sistemas biológicos se puede realizar a partir de dos enfoques opuestos y complementarios: el análisis del sistema completo o la evaluación de sus componentes aislados. Éste último permite explicar los fenómenos que ocurren cuando las unidades que forman parte del mismo interactúan. En el presente trabajo de tesis se han utilizado espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica y espectroscopia de rotación para el estudio de enzimas involucradas en el ciclo del azufre y obtenidas de la bacteria sulfato-reductora Desulfovibrio desulfuricans desde los dos enfoques mencionados anteriormente. En la reducción de sulfato a sulfito, intervienen ATP sulfurilasa y APS reductasa presentando ambas metaloenzimas centros paramagnéticos en su estructura. Mediante la técnica de resonancia paramagnética electrónica en fase condensada, se caracterizaron estructural y magnéticamente estas dos metaloproteínas y el sistema modelo de cobre [Cu(glu)phen].siendo glu = ácido L-glutámico y phen = 1,10-fenantrolina Se determinaron el rol del metal en la estructura y las propiedades magnéticas de ATP sulfurilasa; las interacciones de los sitios paramagnéticos durante el proceso de transferencia electrónica en APS reductasa y los caminos químicos e interacciones magnéticas de sitios metálicos en presencia de los ligandos orgánicos, glu y phen en el complejo de cobre [Cu(glu)phen]. En fase gas se caracterizaron dos ligandos de interés biológico: ácido picolínico y nicotinamida, mediante espectroscopia de rotación siendo las muestras sólidas previamente ablacionadas e inyectadas en un jet supersónico. Ambas moléculas presentan un anillo piridínico lo que ofrece posibilidades conformacionales para la formación de complejos con metales de transición y posibilita interacciones puente hidrógeno e hidrofóbicas, típicas de las que aparecen en metaloproteínas. De cada uno de los ligandos, se determinaron los confórmeros teóricos y experimentales y se caracterizaron mediante parámetros propios de la espectroscopia rotacional. Se compararon las estructuras cristalinas de los ligandos (fase condensada) con sus confórmeros en fase gas, lo que permitió el análisis de la configuración más estable para generar caminos químicos entre centros metálicos presentes en metaloproteínas. The study of biological systems can carried out from two opposite and complementary approaches: the complete system analysis or the evaluation of its individual components. The latter explains the phenomena that occur when units that are part of it interact. In this thesis we have used electron paramagnetic resonance spectroscopy and rotation spectroscopy for the study from these two approaches in enzymes involved in the sulfur cycle, obtained from the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio desulfuricans. In the reduction of sulfate to sulfide, the metalloenzymes ATP sulfurylase and APS reductase are involved, both have paramagnetic centers. By the technique of electron paramagnetic resonance in condensed phase, these two structurally and magnetically metalloproteins and a copper model system were characterized. The role of the metal in the structure and the magnetic properties of ATP sulfurylase, interactions of paramagnetic sites in the electron transfer process in APS reductase and the chemical pathways and interactions between magnetic metal sites in the presence of the organic ligands, L-glutamic acid and 1,10-phenantroline in the copper complex [Cu(glu)phen] were determined. In gas phase two ligands of biological relevance (picolinic acid and nicotinamide) are characterized. The solid molecules being previously ablated and injected into a supersonic jet. Boths molecules have a piridinic ring, which provides conformational possibilities for the formation of transition metal complexes analogous presenting hidrogen bonds and hidrofobic interactions to active sites of proteins. For each ligand, the theoretical and experimental conformers were determined and characterized by spectroscopic parameters specific to it the rotational spectroscopy. The crystal structures of the ligands in condensed phase were compared to the conformers in gas phase, allowed the analysis of the more stable configuration to generate chemical pathways between metal centers present in metalloproteins. Fil: Franco, Vanina Gisela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Física del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Física del Litoral; Argentina

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Agradecemos a compreensão. on 2016-08-26T14:31:27Z (GMT) Submitted by Camila Pereira Braga null (braga_ca@yahoo.com.br) on 2016-08-26T14:40:19Z No. of bitstreams: 1 TESE_CAMILA BRAGA final.pdf: 5689807 bytes, checksum: f5c50666be165236b9966f549368c97b (MD5) Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-26T18:55:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 braga_cp_dr_bot_par.pdf: 1630897 bytes, checksum: 195db1ebf08f600a02f35c1371f03709 (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-26T18:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 braga_cp_dr_bot_par.pdf: 1630897 bytes, checksum: 195db1ebf08f600a02f35c1371f03709 (MD5) Previous issue date: 2016-07-21 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Diabetes mellitus tipo 1 é caracterizado pelo aumento significativo de glicose circulante no sangue, resultado da deficiência na secreção e/ou ação de insulina. O quadro hiperglicêmico, quando cronicamente instalado, leva a anormalidades no metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos, além de alterar o balanço entre pró-oxidantes e antioxidantes. É um importante problema de saúde pública, pois compromete a qualidade de vida e sobrevida dos indivíduos, além de envolver elevados custos no seu tratamento. Quando se consegue identificar os fatores determinantes para o desenvolvimento do diabetes, novas estratégias de prevenção e tratamento são necessárias. Nesse contexto, as proteínas e os minerais apresentam fundamental importância como componentes estruturais e funcionais dos seres vivos. Estudos proteômicos e metaloproteômicos, auxiliam na compreensão da variabilidade do diabetes, contribuindo assim na elucidação dos aspectos fisiológicos e funcionais das biomoléculas presentes em amostras biológicas, como plasma e tecido animal, além disso, a possível identificação de biomarcadores relacionados ao desenvolvimento de doenças crônicas degenerativas, como o diabetes. O objetivo geral do trabalho foi utilizar ferramentas proteômicas e metaloproteômicas na identificação de possíveis biomarcadores presentes no plasma e fígado de ratos diabéticos tipo 1 induzido experimentalmente com estreptozotocina. Foram utilizados 24 ratos Wistar, distribuídos em 3 grupos experimentais (n= 8): C (controle); DM1 (diabéticos tipo 1); DM1 + I (diabéticos tipo 1, tratadas com insulina). O diabetes mellitus tipo 1 foi induzido com estreptozotocina (60mg/kg, i.p., dose única) e os animais do grupo DM1 + I receberam reposição insulínica (Humulin N100UI Protamina Neutra de Hagedorn - NPH, marca Lilly), com dose inicial de 3U/animal (administrada diariamente, via subcutânea, período vespertino) e de acordo com os valores obtidos de glicemia a dose inicial foi reajustada/mantida para que se atingissem os níveis séricos de euglicemia. No plasma, foi realizado estudo metaloproteômico para as proteínas que apresentaram diferença de expressão entre os grupos experimentais, utilizando-se a 2D-PAGE no processo de fracionamento de proteínas das amostras de plasma, GFAAS e FAAS na determinação quantitativa de Cu, Mg, Se e Zn nos spots que apresentaram diferença de expressão e ESI/MS-MS na caracterização dessas proteínas. Trinta e cinco proteínas apresentaram diferença de expressão no plasma, indicando a alpha-1-macroglobulina e haptoglobulina como possíveis biomarcadoras do diabetes tipo 1 controlado (tratado com insulina); e as proteínas 2'-desoxinucleósido-5'-fosfato de N-hidrolase 1, proteína transmembranar 1, soro amilóide P-componente, vitamina D de ligação e biliverdina como possíveis candidatas a biomarcadoras do diabetes tipo 1 não controlado. Já a quantificação de Cu, Mg, Se e Zn nos spots revelaram como esses minerais poderiam estar ligados nessas proteínas e como estariam envolvidos na expressão proteica, progressão e complicações do diabetes tipo 1. No fígado, primeiramente foi realizado estudo proteômico, onde as proteínas foram caracterizadas pela técnica de gel-free e classificadas como dependentes ou independentes de insulina (tratamento), em relação aos dados obtidos para abundância e diferença de expressão. Esse estudo identificou 305 proteínas com diferença de expressão entre os grupos experimentais, entre elas 147 foram classificadas como dependentes de insulina e 152 como independentes de insulina. O controle dos níveis de glicose sanguínea pelo tratamento com insulina, restaurou os níveis da enzima frutose-1,6 bifosfatase indicando controle da gliconeogênese, e afetou a abundância das enzimas que funcionam na desintoxicação de EROs, restaurando o equilíbrio redox e a função mitocondrial. No fígado também foi feito o estudo das proteínas diferencialmente expressas pelo Oxi-proteoma, utilizando a 2D-DIGE com os fluoróforos Cy3 e Cy-5-hidrazida no processo de fracionamento e caracterização dos spots proteicos por ESI-MS/MS. A identificação das proteínas carboniladas indicou que o tratamento com insulina está associado com a diminuição do estresse oxidativo por meio da regulação positiva das enzimas antioxidantes e diminuição da produção de EROs, controle das vias metabólicas envolvidas com o metabolismo de carboidratos (glicólise e gliconeogênese) e metabolismo energético. Estudo metaloproteômico também foi realizado no fígado, utilizando a 2D-PAGE no processo de fracionamento de proteínas, GFAAS e FAAS na determinação quantitativa de Cu, Mg, Se e Zn nos spots obtidos no fracionamento das proteína e caracterização das proteínas por ESI/MS-MS. Os resultados obtidos nesse estudo sugeriram diferentes interações entre os minerais estudados e as proteínas entre os grupos experimentais. Essas interações podem estar associadas com alterações funcionais nessas proteínas e envolvimento na progressão e complicações do diabetes tipo 1. Assim, as informações obtidas no presente trabalho fornecem subsídios técnico-científicos na área de saúde de extrema importância, possibilitando o entendimento dos dados proteômicos e metaloproteômicos gerados relacionados com suas respectivas vias metabólicas, função molecular, processo biológico e componente celular. O caráter inédito da proposta proporcionou a elucidação de aspectos fisiológicos e funcionais das biomoléculas presentes em amostras biológicas, como plasma e tecido hepático. Type 1 diabetes mellitus is characterized by the significant increase in circulating glucose in the blood as a result of deficiency in the secretion and/or insulin action. The hyperglycemic state, when chronically installed, leads to abnormalities in the metabolism of lipids, proteins and carbohydrates, in addition to changing the balance between pro-oxidants and antioxidants. This is an important public health problem because it affects the quality of life and the survival of individuals, often necessitating high-cost treatment. When one can identify the determining factors for the development of diabetes, new strategies for prevention and treatment are needed. In this context, our results reflect the fundamental importance of protein and minerals such as structural and functional components of living things, proteomic and metalloproteomic studies that can assist in the understanding of diabetes variability, thus helping to elucidate the physiological and functional aspects of biomolecules in biological samples such as plasma and animal tissue. In addition, the possible identification of biomarkers related to the development of chronic degenerative diseases like diabetes. The overall objective of the study was to use proteomics and metalloproteomic in identifying potential biomarkers present in the plasma and liver of diabetic rats type 1 experimentally induced with streptozotocin. The total of 24 rats, Wistar, were divided into 3 groups (n = 8): C (control); DM1 (type 1 diabetes); DM1 + I (type 1 diabetes treated with insulin). The type 1 diabetes mellitus was induced with streptozotocin (60 mg/kg, i.p., single dose) and animals of DM1 + I group received insulin replacement (Humulin N100UI Neutral Protamine Hagedorn - NPH, brand Lilly), with an initial dose of 3U/animal (daily administered subcutaneously evening period) and in accordance with the values obtained from the initial dose of glucose was readjusted/kept so that it reached serum euglycemia. In plasma was performed metalloproteomic study for proteins that showed differences in expression between the experimental groups, 2D-PAGE was used in protein fractionation process of plasma samples, GFAAS and FAAS for quantitative determination of Cu, Mg, Se and Zn in the spots that showed differences of expression and the proteins were characterized by ESI/MS-MS. Thirty-five proteins present in the plasma had difference of expression, indicating the alpha-1-macroglobulin and haptoglobulin as potential biomarkers of type 1 diabetes controlled (insulin treated); and 2'-deoxynucleoside 5'-phosphate N-hydrolase 1, transmembrane protein 11, serum amyloid P-component, vitamin D-binding protein and biliverdin as possible candidates for biomarkers of type 1 diabetes not controlled. The quantification of Cu, Mg, Se and Zn in spots revealed how these minerals could be linked these proteins and how they would be involved in protein expression, progression and complications of type 1 diabetes. In the liver, was first conducted the proteomic study where proteins were characterized by gel-free technique and classified as insulin dependent or independent (treatment), compared to the data obtained for abundance and difference in expression. This study identified 305 proteins with differential expression between experimental groups, among which 147 were classified as insulin-dependent and 152 as insulin-independent. The restoration of glucose levels in the blood by insulin treatment restored levels of the enzyme fructose-1,6 bisphosphatase indicating control of gluconeogenesis, and affected the abundance of enzymes that function in the detoxification of ROS, restoring redox balance and mitochondrial function. In the liver it has also been a study of the proteins differentially expressed by Oxi-proteome, using the 2D-DIGE with the fluorophores Cy3 and Cy-5-hydrazide in the fractionation process and characterization of protein spots by ESI-MS/ MS. The identification of the carbonyl proteins indicated that treatment with insulin was associated with decreased oxidative stress by upregulating the antioxidant enzymes and decreased production of ROS, controlling the metabolic pathways involved in carbohydrate metabolism (glycolysis and gluconeogenesis) and energy metabolism. The metalloproteomic study was also performed on liver, using 2D-PAGE for the protein fractionation process, GFAAS and FAAS for quantitative determination of Cu, Mg, Se and Zn in the spots obtained in the fractionation of the protein and characterization of proteins by ESI/MS-MS. The results suggested different interactions between minerals and proteins between experimental groups, and may be associated with functional alterations in these proteins and involvement in progression and complications of diabetes type 1. However, the work provides technical and scientific support in extreme health importance, enabling the understanding of proteomic and metalloproteomic data generated in relation to their respective metabolic pathways, molecular function, biological process and cellular component. The unprecedented of the proposal provided the elucidation of physiological and functional aspects of biomolecules present in biological samples, such as plasma and hepatic tissue. FAPESP: 2011/21672-1 FAPESP BEPE: 2014/14249-3

Mestrado em Bioquímica Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-07-21T14:35:14Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 4392999 bytes, checksum: 414bff91f7113ac55159ec5f57a51746 (MD5) Made available in DSpace on 2016-07-21T14:35:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 4392999 bytes, checksum: 414bff91f7113ac55159ec5f57a51746 (MD5) Previous issue date: 2015-12-23

Mestrado em Bioquímica As fluoroquinolonas são antibióticos que têm um largo espectro de ação contra bactérias, especialmente Gram-negativas. O seu mecanismo de ação assenta na inibição de enzimas responsáveis pela replicação do DNA. Porém, devido ao seu uso indevido, o surgimento de resistência bacteriana a estes antibióticos tem-se tornado um grave problema de saúde pública. Uma vez que os seus alvos de ação se situam no meio intracelular, a redução da permeabilidade da membrana externa de bactérias Gram-negativas constitui um dos mecanismos de resistência mais conhecidos. Esta redução é associada à baixa expressão ou mutações em porinas necessárias para permitir o seu transporte, mais concretamente, da OmpF. Estudos prévios demonstraram que a coordenação de fluoroquinolonas com iões metálicos divalentes e 1,10-fenantrolina (genericamente designados metaloantibióticos) são potenciais candidatos como alternativa às fluoroquinolonas convencionais. Estes metaloantibióticos exibem um efeito antimicrobiano comparável ou superior à fluoroquinolona na forma livre, mas parecem ter uma via de translocação diferente, independente de porinas. Estas diferenças no mecanismo de captura podem ser fundamentais para contornar a resistência bacteriana. De forma a compreender o papel dos lípidos no mecanismo de entrada dos metaloantibióticos, estudou-se a interação e localização dos metaloantibióticos da Ciprofloxacina (2ª geração), da Levofloxacina (3ª geração) e Moxifloxacina (4ª geração) com um modelo de membranas de Escherichia coli desprovido de porinas. Estes estudos foram realizados através de técnicas de espectroscopia de fluorescência, por medições em modo estacionário e resolvida no tempo. Os coeficientes de partição determinados demonstraram uma interação mais elevada dos metaloantibióticos relativamente às respetivas fluoroquinolonas na forma livre, um facto que está diretamente relacionado com as espécies existentes em solução a pH fisiológico. Os estudos de localização mostraram que estes metaloantibióticos devem estar inseridos na membrana bacteriana, confirmando a sua entrada independente de porinas. Este mecanismo de entrada, pela via hidrofóbica, é potenciado por interações eletrostáticas entre as espécies catiónicas de metaloantibiótico que existem a pH 7,4 e os grupos carregados negativamente dos fosfolípidos da membrana. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a via de entrada dos metaloantibióticos e das respetivas fluoroquinolonas deve ser diferente. Os metaloantibióticos são candidatos adequados para a realização de mais testes laboratoriais e uma alternativa promissora para substituir as fluoroquinolonas convencionais, uma vez que parecem ultrapassar um dos principais mecanismos de resistência bacteriana a esta classe de antibióticos. Fluoroquinolones are antibiotics that have a large spectrum of action against bacteria, especially Gram-negative. Their mechanism of action relies on the inhibition of the enzymes responsible for DNA replication. Unfortunately, due to their misuse, the emergence of antimicrobial resistance to these antibiotics has been one of the biggest problems of public health. The major permeability cellular barrier of Gram-negative bacteria for quinolones is the outer membrane. To access their target site, quinolones have to overcome this barrier and the reduction of the membrane permeability is a well-known mechanism of resistance. This reduction is associated to the down-regulation or mutations in porins. Some fluoroquinolones require porins to enter the bacterial cell, mainly OmpF. Previous studies have shown that the coordination of fluoroquinolones to divalent metal ions and 1,10-phenanthroline (known as metalloantibiotics) have potential as antimicrobial agent candidates to replace the conventional fluoroquinolones. These metalloantibiotics exhibit an antimicrobial action comparable or higher than that of fluoroquinolones. Furthermore, their route of translocation is different. This different uptake mechanism can be paramount in counteracting bacterial resistance. In view of the lipids role in bacterial metalloantibiotics uptake, the interaction and the location of Ciprofloxacin (2nd generation), Levofloxacin (3rd generation) and Moxifloxacin (4th generation) metalloantibiotics with Escherichia coli model membrane (without porins) were studied. These studies were performed by fluorescence spectroscopy, using time-resolved and steady-state measures. Partition coefficients determined showed that the interaction is higher for the metalloantibiotics than free fluoroquinolones, which reflects the metalloantibiotics species that are present in solution at physiological pH. Location studies showed that these metalloantibiotics must be located inside the bacterial membrane, confirming their entrance by a porin independent route. This mechanism of metalloantibiotics entry into the bacteria, by the hydrophobic pathway, is strongly dependent of electrostatic interactions. The cationic metalloantibiotics species that exist at pH 7.4 promotes electrostatic interactions with the negatively charged head groups of the membrane lipids. The results obtained in this work suggest that there is a different translocation route for the metalloantibiotics and its respective free fluoroquinolone. Additionally, metalloantibiotics are suitable candidates for more advanced laboratorial testing and also a promising route to bypass resistance mechanisms to fluoroquinolones.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Iron is an essential element for cell viability since it is a component of several metalloproteins, containing iron-sulfur clusters and heme centers. The ability to gain and lose electrons, switching between the ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+) states, renders the involvement of iron in many cellular processes. Iron acquisition systems have to be highly regulated to assure a continuous supply of iron but simultaneously prevent its toxicity associated with the formation of hydroxyl radicals by the Fenton reaction. Loss of iron homeostasis is behind many pathologies, highlighting the importance of understanding the mechanisms involved in iron homeostasis. The Saccharomyces cerevisiae inositolphosphosphingolipid phospholipase C (Isc1p) hydrolyses complex sphingolipids to produce ceramide, a bioactive sphingolipid. ISC1 deletion is characterized by premature aging, oxidative stress sensitivity and mitochondrial dysfunction. This mutant also exhibits an up regulation of genes involved in iron uptake leading to increased levels of iron. However the growth phase in which iron accumulation occurs, the specific site of accumulation or even the oxidation state of the accumulated iron in isc1Δ cells remains uncharacterized. Futhermore, the molecular mechanisms behind the iron overload in isc1Δ cells are not known. By monitoring iron levels and oxidation state along growth, it was possible to observe that deletion of ISC1 caused iron accumulation in all phases of growth in both the ferric and ferrous forms. Additionally to the increased iron levels, isc1Δ cells also exhibited an altered distribution of iron within the cell. Unlike wild type, isc1Δ cells did not accumulate ferric iron in the vacuole, but instead, iron seemed to be distributed throughout the cell. Furthermore, iron accumulation in isc1Δ cells was associated with the activation of Aft1p, the low iron-sensing transcriptional activator. Cells lacking Isc1p exhibed higher levels of Aft1p retained in the nucleus, and AFT1 deletion abolished iron accumulation in the isc1Δ mutant. It was also found that dephosphorylation of Aft1p in isc1Δ cells is associated with its activation. Additionally the activation of the phosphatase Sit4p in isc1Δ cells was discarded as a potential mechanism behind Aft1p dephosphorylation and activation, since isc1Δsit4Δ cells still exhibit iron overload. Overall, these results indicate that the dephosphorylation and activation of Aft1p is the factor behind the accumulation of iron in the isc1Δ mutant and reinforce the role of Isc1p in the regulation of iron homeostasis. O Ferro é um elemento essencial para a viabilidade celular, sendo um componente de diversas metaloproteínas, contendo grupos de ferro e enxofre e centros heme. A capacidade de ganhar e perder eletrões, alterando entre os estados ferroso (Fe2+) e férrico (Fe3+), faz com que o ferro esteja envolvido em diversos processos celulares. Os sistemas de aquisição de ferro têm de ser altamente regulados para assegurar um fornecimento contínuo de ferro e simultaneamente prevenir a sua toxicidade associada à formação de radicais hidroxilo pela reação de Fenton. A perda da homeostasia do ferro está associada a muitas patologias, o que enfatiza a importância do estudo dos mecanismos envolvidos na homeostasia do ferro. A proteína inositolfosfoesfingolípido fosfolipase C (Isc1p) presente em Saccharomyces cerevisiae hidrolisa esfingolípidos complexos para produzir ceramida, um esfingolípido bioativo. A deleção do ISC1 é caracterizada pelo envelhecimento celular prematuro, sensibilidade ao stresse oxidativo e disfunção mitocondrial. Este mutante também exibe uma sobreexpressão dos genes envolvidos na captação de ferro, resultando em níveis elevados de ferro. No entanto, a fase do crescimento em que a acumulação do ferro ocorre, o compartimento específico de acumulação ou mesmo o estado de oxidação do ferro acumulado nas células isc1Δ permanece por caracterizar. Além disso, os mecanismos moleculares subjacentes à acumulação de ferro nas células isc1Δ não são conhecidos. Monitorizando os níveis de ferro e o estado de oxidação ao longo do crescimento, foi possível observar que a deleção do ISC1 causou uma acumulação de ferro em todas as fases de crescimento em ambas as formas ferrosa e férrica. Além dos níveis de ferro elevados, as células isc1Δ também exibiram uma alteração na distribuição de ferro no interior da célula. Ao contrário das células wt, as células isc1Δ não acumularam ferro férrico no vacúolo, mas em vez disso, o ferro pareceu estar distribuído por toda a célula. Adicionalmente, a acumulação de ferro nas células isc1Δ foi associada à ativação do Aft1p, o ativador transcricional sensível a níveis baixos de ferro. Células sem a proteína Isc1p exibiram níveis mais elevados de Aft1p retido no núcleo e a delecção do AFT1 suprimiu a acumulação de ferro observada no mutante isc1Δ. Também se observou que a defosforilação do Aft1p nas células isc1Δ está associada à sua ativação. Adicionalmente, a ativação da fosfatase Sit4p nas células isc1Δ como um potencial mecanismo responsável pela defosforilação e ativação do Aft1p foi descartada, uma vez que as células isc1Δsit4Δ continuam a apresentar acumulação de ferro. Em conclusão, estes resultados indicam que a defosforilação e ativação do Aft1p é o fator responsável pela acumulação de ferro no mutante isc1Δ e reforça o papel do Isc1p na regulação da homeostasia do ferro.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-15T17:46:48Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2359543 bytes, checksum: ecd8a6d32bce02730fc58a2a0a528b75 (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-15T17:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2359543 bytes, checksum: ecd8a6d32bce02730fc58a2a0a528b75 (MD5) Previous issue date: 2015-12-22

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade UnB Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Rural, 2015. A mensuração de contaminantes no ambiente não traz respostas completas sobre os reais efeitos adversos que estas substâncias podem estar causando aos organismos. A identificação de biomarcadores relacionados ao mapeamento e expressão de metaloproteínas associadas a contaminantes poderão auxiliar na elucidação da dinâmica de vários elementos no ambiente, indicar previamente possíveis riscos de contaminação dos recursos ambientais e ser base para elaboração de mecanismos de neutralização dos seus efeitos. Dessa forma, este estudo buscou a identificação de possíveis biomarcadores de exposição ao mercúrio em tucunarés do rio Negro através de métodos metaloproteômicos. Inicialmente, foram determinadas as concentrações de mercúrio total no tecido muscular de tucunarés capturados em rios e reservatórios hidrelétricos. As concentrações apresentaram pouca variação independente do local de amostragem e algumas estavam superiores aos limites máximos definidos na legislação brasileira. As concentrações aumentaram na sequência: reservatório de Cana Brava < reservatório de Balbina < rio Madeira < rio Purus < reservatório de Tucuruí < rio Apuaú < rio Solimões < rio Negro. As amostras do rio Negro foram selecionadas para definição de um biomarcador proteico através da eletroforese bidimensional (2D-PAGE). O mercúrio foi determinado em 15 possíveis proteínas com massa molar abaixo de 20,1 kDa, sendo 2 mais promissoras à biomarcadoras. Além disso, foi extraído da musculatura dos tucunarés apenas 12,4% do mercúrio, sendo que 89% desse mercúrio foi aplicado na técnica 2D-PAGE, resultando em 49,74% de mercúrio nas proteínas. Essa porcentagem de mercúrio nos spots indica que os procedimentos otimizados de preparação da amostra foram eficientes para ser aplicados na 2D-PAGE. Os resultados metaloproteômicos desse estudo são importantes no subsídio de estudos futuros de identificação e caracterização de biomarcadores de mercúrio em peixes. The measurement of contaminants does not bring complete answers about the real effects that these substances may be causing the organisms. The identification of biomarkers related to mapping and metalloproteins expression associated with contaminants may help to elucidate the dynamics of various elements in the environment indicates previously possible contamination risks of environmental resources and be a basis for development of neutralizing mechanisms of its effects. Thus, this study sought to identify possible mercury exposure biomarkers in tucunares the Negro river through metalproteomics methods. Initially, were determined the total mercury concentrations in muscle tissue of tucunares caught in rivers and hydroelectric reservoirs. They were in a little independent variation of the sampling site and some were above the maximum limits set by Brazilian law. The concentrations increased following: Cana Brava reservoir < Balbina reservoir < Madeira river < Purus river < Tucurui reservoir < Apuau river < Solimões river < Negro river. Samples of the Negro river were selected for definition of a protein biomarker by two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE). Mercury was determined in 15 possible protein with molecular weight of 20.1 kDa below, 2 the most promising biomarkers. Moreover, it was extracted from the muscle of tucunarés only 12.4% of mercury, with 89% of mercury was applied to the 2D-PAGE technique, and 49.74% of mercury in proteins. This percentage of mercury in spots indicates that the sample preparation procedures were optimized for efficient be applied to 2D-PAGE. The metalproteomics results of this study are important in the allowance for futures studies of identification and characterization of mercury biomarkers in fish. La medición de los contaminantes no trae respuestas completas sobre los efectos reales que estas sustancias pueden estar causando los organismos. La identificación de biomarcadores relacionados con la cartografía y metalloproteins expresión asociada a contaminantes puede ayudar a dilucidar la dinámica de los diversos elementos en el ambiente indica anteriormente posibles riesgos de contaminación de los recursos ambientales y ser una base para el desarrollo de mecanismos de neutralización de sus efectos. Por lo tanto, este estudio trata de identificar posibles biomarcadores de exposición a mercurio en tucunarés el Río Negro a través metaloproteômicos métodos. Inicialmente, se determinó las concentraciones de mercurio total en el tejido muscular de tucunarés capturados en los ríos y embalses hidroeléctricos. Estaban en una pequeña variación independiente del sitio de muestreo y algunos estaban por encima de los límites máximos establecidos por la legislación brasileña. Las concentraciones aumentaron siguiente: Cana Brava embalses < Balbina embalses < río Madeira < río Purus < Tucuruí embalses < río Apuaú < río Solimões < río Negro. Las muestras del río Negro fueron seleccionados para la definición de un biomarcador de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D-PAGE). Mercurio se determinó en 15 posible proteína con peso molecular de 20,1 kDa abajo, 2 los biomarcadores más prometedores. Por otra parte, se extrajo desde el músculo de tucunarés sólo 12,4% de mercurio, con 89% de mercurio se aplicó a la técnica 2D-PAGE, y 49,74% de mercurio en proteínas. Este porcentaje de mercurio en puntos indica que los procedimientos de preparación de muestras se optimizaron para una eficiente aplicarse a 2D-PAGE. Los metaloproteômicos resultados de este estudio son importantes en la provisión para futuros estudios de identificación y caracterización de biomarcadores de mercurio en el pescado.

UFPA - Universidade Federal do Pará CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As proteínas oxigenases com ferro não hêmico compartilham um domínio conservado composto por oito histidinas, podem ser encontradas em organismos eucariotos e procariotos, e participam de importantes vias de biossíntese lipídica. Para compreender a relação evolutiva existente entre essas proteínas, foram realizadas análises comparativa e filogenética em procariotos e eucariotos que permitiram uma classificação dessa família, até então inexistente. A busca de seqüências resultou, após a curadoria, em uma coleção de 448 proteínas, pertencentes a 58 organismos previamente selecionados dentro dos principais taxa. O alinhamento múltiplo de seqüências gerado com a ferramenta MAFFT (BLOSUM 62; L-INS-i) mostrou a presença do domínio de histidinas com espaçamento conservado entre os motivos. A classificação das proteínas feita com o software CLANS gerou 28 grupos a partir da similaridade entre pares de seqüências. Dentre esses, 2 contêm seqüências que não tiveram similaridade com proteínas já caracterizadas e 48 seqüências não foram atribuídas a quaisquer dos grupos formados. As seqüências de plantas, representadas por 119 seqüências da coleção, foram distribuídas em 7 grupos correspondentes às funções C4 metilesterol monoxigenase, C5 esterol desaturase, ácido graxo hidroxilase, esfingolipídeo C4 monooxigenase, aldeído decarbonilase, β-caroteno hidroxilase e Acil-ACP desaturase. A análise filogenética, utilizando o método de máxima verossimilhança com a ferramenta PhyML, mostrou a formação de grupos bem definidos e que foram similares aos gerados por CLANS. Esses resultados começam a preencher a lacuna existente até o momento acerca da relação evolutiva e da classificação das oxigenases com ferro não hêmico. Além disso, sugerem que dentro dessa família ainda há proteínas com funções desconhecidas, reforçando a necessidade de realizar mais estudos de caracterização funcional das mesmas. Nonheme iron oxygenase proteins shares a conserved domain consisting of eight histidines, and they can be found in eukaryotes and prokaryotes organisms and participate in important pathways of lipid biosynthesis. To understand the evolutionary relationship among these proteins, we performed comparative and phylogenetic analyzes in prokaryotes and eukaryotes that allowed a classification of this family, nonexistent until now. The search of sequences resulted in a collection of 448 proteins, belonging to 58 organisms previously selected. The multiple alignment made with MAFFT (BLOSUM 62; L-INS-i) showed the presence of three histidine-rich motifs, with conserved spacing among them. The classification made with CLANS software has generated 28 clusters through of similarity among sequences. Two clusters contain sequences that had no similarity to proteins already characterized, and 48 sequences were not assigned to any of the 28 clusters. In the collection, 119 sequences are derived from plants, distributed in 7 clusters corresponding to C4 methysterol monooxygenase, C5 sterol desaturase, fatty acid hydroxylase, sphingolipid C4 monooxygenase, aldehyde decarbonylase, β-carotene hydroxylase and Acyl-ACP desaturase functions. Phylogenetic analysis using maximum likelihood method with PhyML tool showed the formation of well-defined groups that were similar to generated by CLANS. These results start to fill a gap existing so far about the evolutionary relationship and classification of nonheme iron oxygenases. Also, suggest that within this family there are still proteins with unknown functions, reinforcing the need for more studies of functional characterization.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:16Z : No. of bitstreams: 1 000841508_20160426.pdf: 1577360 bytes, checksum: f910ad7dfc28e389bbc2cb39d7f2de0f (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:26Z: 000841508_20160426.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:30Z : No. of bitstreams: 1 000841508.pdf: 3356205 bytes, checksum: 3b5f5a833cae5f299c4dce5b2edae0de (MD5) YacG é uma pequena proteína membro da família dos zinc-fingers, descoberta em E. coli. Sua função biológica está ligada a inibição da atividade de DNA girase e ao metabolismo do stress em procariotos. YacG atua na inibição da atividade de DNA girase por um mecanismo bipartido, a região do domínio zinc-finger atua impedindo a ligação do DNA à subunidade B e a região c-terminal liga-se a subunidade A. Embora a literatura cite YacG como sendo um inibidor de DNA girase, nada foi observado a respeito da atividade de inibição de YacG de E.coli e de outras linhagens de micro-organismos frente a outras DNA topoisomerases e não foi realizado nenhum trabalho envolvendo fragmentos peptídicos desta proteína, e tampouco ensaios de inibição do crescimento celular por estes. Sendo assim YacG de Klebsiella pneumoniae foi obtida por expressão heteróloga e uma série de peptídeos derivados desta foram sintetizados pelo método de fase sólida. Os peptídeo sintéticos foram projetados de forma a manter a região zinc-finger nativa (YacGAG1), substituídos os resíduos de cisteína por serina (YacGAG4), alanina (YacGAG5), histidina (YacGAG6 e YacGAG8) e também sintetizada a sua região c-terminal (YacGAG7). Os ensaios de inibição da atividade de DNA girase pelos peptídeos sintéticos e proteína, mostraram que YacG, YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 conseguem inibir a atividade desta enzima, ao contrario do fragmento nativo YacGAG1. Por outro lado YacGAG1 conseguiu inibir a atividade de Topoisomerase IIα humana juntamente com os demais peptídeos YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 e proteína YacG. Os ensaios aqui apresentados corroboram com os dados apresentados na literatura onde a região c-terminal por si só é capaz de inibir a atividade de DNA girase. Os ensaios de anisotropia de fluorescência demonstraram que a interação dos peptídicos sintéticos com DNA girase se dá pela interação destes com... YacG belongs to zinc-finger's protein family discovered in E. coli. Its biological function is connected to the catalytic inhibition of DNA gyrase and stress metabolism in prokaryotes. This protein inhibits DNA gyrase (gyrase) through a bipartite mechanism where the zinc-finger domain prevents the DNA ligation to the B subunit (GyrB) and the C-terminal bindings to the A subunit (GyrA). Although it is classified as a gyrase inhibitor neither the inhibition activity of YacG from E. coli and other microorganisms against other DNA topoisomerases nor the biological activity of fragments in cellular assays has been evaluated until present. In this study, YacG from Klebsiella pneumoniae was obtained by heterologous expression and derivative peptides from this protein were synthesized by the solid-phase method. The synthetic peptides were designed to keep the native region of zinc-finger (YacGAG1), to substitute cysteines to serines (YacGAG4), to alanine (YacGAG5), to histidine (YacGAG6 and YacGAG8) and also having only the C-terminal region (YacGAG7). The inhibition assays of gyrase by the peptides and the native protein revealed that YacG, YacGAG4, YacGAG4 e YacGAG7 inhibited this enzyme and the human topoisomerase IIα (htopoIIα). However, the same was not observed for the native fragment YacGAG1, which inhibited only the htopoIIα. The results are in agreement with literature showing that solely the C-terminal region is able to inhibit the gyrase. The assays of fluorescence anisotropy indicated that these synthetic peptides interact with GyrA. Besides inhibiting the gyrase and the htopoIIα, these peptides also revealed bacteriostatic activity against gram-negative and gram-positive bacteria. A computational study by applying a molecular dynamics protocol highlighted the importance of residues I47, R46 and W40 from YacG in the process of molecular recognition and interaction with GyrB. The results...

[eng] Metallothioneins (MTs) are a superfamily of ubiquitous and small cysteine rich metalloproteins present in all eukaryotes and some prokaryotes organisms, that exhibit preferences to coordinate divalent or monovalent heavy metal ions such as Zn(II), Cd(II) or Cu(I). This ability is used by MTs to participate in toxic metal detoxification, metal ion homeostasis and protection against oxidative stress. Features of MT sequences, as well as their structural arrangements, are crucial to determine their metal-abilities and the related functions. In this PhD thesis, we aimed at expanding the knowledge of some peculiar MTs, which are characterized by their unusual long sequence, their Cys-distribution and their modular folding. Thus, initially, the five Tetrahymena thermophila MTs (MTT1 to MTT5), which represent one of the longest MTs reported so far, were characterized to decipher their divalent or monovalent metal preferences. The modular structure of MTT1, MTT3 and MTT5 isoforms, which contain high occurrence of doublets and triplets confer a clear Zn-character to these MTs. Contrarily, MTT2 and MTT4 in which no modular structures, nor Cys doublets and triplets, are present, exhibit a specific Cu-thionein character. The gradation of metal-binding preferences from Zn-thionein to Cu-thionein shown by each MT, as well as the sequence features, constitute an important information source for MT evolutionary studies. Later, two other MTs from the human pathogenic opportunistic fungus Cryptococcus neoformans (CnMT1 and CnMT2) were characterized. Their unusual long sequence, not known in fungal MTs so far, together with their high Cys content, explained their extraordinary Cu detoxification capacity. The modular structure of CnMT1 and CnMT2, with three and five 7-Cys containing regions, respectively, separated by cysteine-free spacers, leads to their folding into Cu5 clusters upon Cu coordination, which enhances their detoxification capacity. This extraordinary ability becomes decisive for C. neoformans virulence in order to avoid the copper toxicity induced by macrophages during mammalian host infection. The sequence analysis of these Cys-rich regions in CnMTs revealed their homology to other well characterized fungal MT models, as Neurospora crassa and Agaricus bisporus MTs, whose Cys pattern almost exactly coincides with that found in CnMTs, this supporting the emergence of the long C. neoformans MTs by ancient tandem repetitions of a primeval fungal MT unit. Finally, in this work other hypothetical fungal MTs were identified in silico, among which those of other human opportunistic pathogenic fungi such as Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis or Fusarium genus fungi. The strategy used in our group to characterize MTs, allowed us to identify a new fungal MT from F. verticillioides which presents the same Cu-thionein features (Cu5 clusters) than each Cys-building blocks from C. neoformans MTs. Evenly, the characteristics presented in F. verticillioides MT is extensible to F. graminearum and F. oxysporum MTs, given that the MT sequences are identical. Overall, this PhD thesis work contributes to enlarge the current limited knowledge about molecular evolution of unicellular eukaryote MTs and at the same time, it opens the door to characterize new pathogenic fungal MTs, whose results may provide interesting conclusions to decipher the role of MTs as virulent determinants and its function as Cu detoxifying., [eng] Les Metal•lotioneïnes (MTs) són una superfamília de metal•loproteïnes petites, ubiqües i riques en cisteïna, presents en tot els eucariotes i alguns organismes procariotes, que coordinen metalls pesants divalents o monovalents com el Zn(II), el Cd(II) o el Cu(I). Aquesta habilitat és utilitzada per les MTs per participar en la detoxificació de metalls, en l'homeostasi d'ions metàl•lics i la protecció contra l'estrès oxidatiu. Les característiques de les seqüències de MT, així com la disposició estructural, són crucials per determinar les seves habilitat metàl•liques i les funcions que se'n deriven. Aquesta tesi pretén ampliar el coneixement d'algunes MTs peculiars, que es caracteritzen per la seva llarga seqüència inusual, la seva distribució de cisteïnes i el seu plegament modular. S'han caracteritzar les cinc MTs de Tetrahymena thermophila (MTT1 a MTT5), sent de les més llargues identificades fins ara. L'estructura modular de MTT1, MTT3 i MTT5, contenen un elevat nombre de doblets i triplets de cisteïna, conferint-los un caràcter de Zn-tioneïna. Contràriament, MTT2 i MTT4, les quals no contenen estructures modulars, ni doblets ni triplets, exhibeixen un caràcter específic de Cu-tioneïna. Els resultats obtinguts en les anàlisis constitueixen una font important d'informació per a l'estudi d'evolució de les MTs. Seguidament, es van caracteritzar dos MTs del fong oportunista patogen d'humans Cryptococcus neoformans (CnMT1 i CnMT2). La seva llarga seqüència, no descrita en MTs de fongs fins el moment, juntament amb l'elevat contingut en cisteïnes, expliquen la seva extraordinària capacitat de detoxificació del Cu. L'estructura modular amb tres (en CnMT1) i cinc (en CnMT2) blocs de 7-cisteïnes cadascun, separats per espaiadors lliures de cisteïnes, permeten el seu plegament en clústers Cus, millorant les seves capacitats detoxificants. Aquesta habilitat resulta decisiva per la virulència de C. neoformans, evitant la toxicitat per coure, induïda pels macròfags durant la infecció de l'hoste, en mamífers. Cadascun d'aquests blocs presenta homologia amb altres MTs de fongs models, com són la MT de Neurospora crassa o la d'Agaricus bisporus, fet que suggereix que les CnMT1 i CnMT2 van evolucionar a partir de repeticions en tàndem d'una mateixa MT primitiva. Finalment, es presenta també la identificació in silico d'MTs hipotètiques d'altres fongs patògens, entre les quals es troben les MTs del gènere Fusarium, i d'entre les que s'ha caracteritzat una nova MT.

La presente Tesis Doctoral se enmarca en el estudio de aspectos concretos del metabolismo de hierro, por una parte con un enfoque más clásico, que pretende entender mejor la función de determinadas metaloproteínas de hierro y por otra parte, con un enfoque más innovador, intentando recrear escenarios biológicos complejos compuestos de varias metaloproteínas donde poder estudiar las consecuencias patológicas que una disfunción en alguna de ellas podría desencadenar. Además, aprovechando el conocimiento generado, hemos llevado a cabo el desarrollo de nuevos materiales, que podríamos considerar bioinspirados en el metabolismo del hierro, con el objetivo de que puedan ser conceptualmente útiles para intervenir en dichos desajustes y actuar a nivel terapéutico en las patologías que de ello se derivan., Tesis Univ. Granada. Programa Oficial de Doctorado en: Química, Financiación de los proyectos CTQ-2009-09344 y CTQ-2012-32236, así como al proyecto POSTBIO financiado por BIOSEARCH S. A. y a la Junta de Andalucía (grupo FQM-368)., Beca del Ministerio de Ciencia e Innovación.

"En este trabajo se evalúo el efecto de la administración crónica de CdCl2 (65,5 mg/L en el agua de beber) sobre los cambios morfológicos, la acumulación del metal, nivel de metalotioneínas totales y triglicéridos (TG) en TA subcutáneo, perirrenal y epidimal, además de estudiar la existencia de cambios en el perfil lipídico sistémico. Los resultados obtenidos en los animales expuestos crónicamente a CdCl2 mostraron que los diferentes tejidos adiposos no acumulan cantidades significativas de Cd, sin embargo, hay una inducción en la expresión de MT total en todos los tejidos."

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:37:17Z : No. of bitstreams: 1 000740068.pdf: 1647648 bytes, checksum: b1d214f874d365863fcad053a496ee8f (MD5) O trabalho avaliou o perfil metaloproteômico de amostras de tecido muscular de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Métodos eletroforéticos em segunda dimensão (2D PAGE) foram utilizados no fracionamento das proteínas e na identificação por análise de imagens obtidas nos géis de poliacrilamida. Foi feito mapeamento de cálcio, cobre, ferro, manganês e zinco nos spots proteicos por Absorção Atômica usando o módulo chama (FAAS) e forno de grafite (GFAAS). As proteínas dos spots nos quais foram identificados a presença de Ca, Cu, Fe, Mn e Zn foram caracterizadas por Espectrometria de Massas (ESI MS MS). Em média foram detectados 620 spots por gel, com desvio padrão de 11,3 e correlação média de 73% entre os géis. As determinaçoes por FAAS/GFAAS indicaram a presença de cálcio em todos os spots, cobre em 2 spots, ferro em um único spot, manganês em 6 spots, e zinco em 3 spots. Dos 18 spots preoteicos nos quais foram identificados a presença dos íons metálicos, 11 foram caracterizados por ESI MS MS, proteínas podem ser candidatas a biomarcadoras de Ca, Cu, Fe, Mn e Zn The study evaluated the metalon protemic profile samples of muscle tissue of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Methods for second dimension electrophoresis (2D PAGE) has been used in the fractionation of proteins and identification by analysis of images obtained in polyacrylamide gels. Mapping of calcium, copper, iron, manganese and zinc in protein spots was done by Atomic Absorption using the module calls flame (FAAS) and graphite furnace (GFAAS). Were characterized by mass spectrometry (ESI MS MS) the protein spots were identified in which the presence of Ca, Cu, Fe, Mn and Zn. On average 620 spots per gel, with a standard deviation of 11.3 and average correlation of 73 % between the gels were detected. Determination by FAAS / GFAAS indicated the presence of all the spots calcium, copper in two spots of a single spot iron, manganese in 6 spots in 3 spots zinc. The 18 spots preoteicos in which the presence of metal ions have been identified, 11 were characterized by ESI MS MS proteins may be candidates for biomarkers Ca , Cu, Fe , Mn and Zn

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25Bitstream added on 2014-11-10T11:58:06Z : No. of bitstreams: 1 000785316_20141117.pdf: 884586 bytes, checksum: d5644acb078ea4fce1cc8312c9760339 (MD5) Neste trabalho de Dissertação, buscou-se avaliar e quantificar o teor de mercúrio presente em amostras de tecido hepático dos peixes jaraqui, tucunaré e filhote da área de influencia da AHE JIRAU - Bacia do rio Madeira, buscando definir um biomarcador proteico (metaloproteínas, metalotioneínas) para monitoramento deste elemento tóxico em peixes da região amazônica. Para realização desta pesquisa, utilizou-se técnicas de proteômica/metalômica: eletroforese bidimensional (2D-PAGE), espectrometria de massas, espectrometria de absorção atômica e bioinformática. Por espectrometria atômica foi possível analisar e quantificar o mercúrio presente nos spots proteicos com massa molar menor que 50 kDa, obtidos no fracionamento das proteínas por 2D-PAGE. As caracterizações das proteínas foram feitas por espectrometria de massas (ESI-MS), podendo assim, fazer uma correlação do mercúrio presente nos spots com as proteínas caracterizadas. Com esses resultados, podemos definir um perfil de biomarcador proteico para o mercúrio nas amostras estudadas. A seleção de spots para esse estudo foi baseada em trabalhos da literatura que afirmam a afinidade do mercúrio por proteínas de baixa massa molar e nas quantificações de mercúrio por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS), já que nos pellets de massa molares maiores que 50 não foi detectado mercúrio. Nas determinações por GFAAS, somente spost proteicos com massa molar menor que 20 kDA apresentaram mercúrio na faixa de concentração de 11,30 a 83,40 mg g-1. Esses spots proteicos apresentaram mercúrio nas quantificações por espectrometria de absorção atômica. De um total de 24 spots caracterizados, foram identificadas por ESI-MS 13 proteínas que apresentaram características de biomarcadoras deste elemento nas amostras estudadas In this dissertation work , we sought to evaluate and quantify the amount of mercury present in samples of fish jaraqui , tucunaré and filhote from the influence area of the AHE JIRAU - the Madeira basin , aiming to define a protein biomarker (metalloproteins, metallothionein) for monitoring this toxic metals in the environment. For this research, we used techniques of proteomics: two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE), mass spectrometry. atomic absorption spectrometry and bioinformatics. With the atomic absorption analysis was possible to analize and quantify the mercury in protein spots obtained from the 2D-PAGE of protein and pellets of greater molar mass and smaller than 50 kDa. The characterization of the proteins were performed by mass spectrometry (ESI-MS), and thus being able to make a correlation between mercury in spots and proteins found in them. With these results, we can define a profile of protein biomarker for mercury in the applied samples. The selection of spots for this study was based on literature reports claiming affinity of mercury for proteins of low molecular weight and the measurements of mercury made by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS), since the pellets with molar mass greater than 50 was not found mercury. Utilizing the GFASS requirements, the spots which their molecular mass were less than 20 kDa contained mercury concentration in the range of 11.30 to 88.40 mg g-1. Presented mercury in spots quantified by the atomic absorption spectrometry method. From 24 ESI-MS characterized spots, were identified 17 proteins, which may be used as biomarkers of this metal in the aquatic environment

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-21. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:47Z : No. of bitstreams: 1 000829802.pdf: 1465255 bytes, checksum: 2d7e1dd40db91bb9503377e7965f6c9d (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação do Instituto de Biociências (FUNDIBIO) Inserido na realidade de contaminação dos rios amazônicos pelo mercúrio, este trabalho busca, por meio do estudo metaloproteômico, a identificação e a caracterização de proteínas do tecido muscular de três espécies diferentes de peixes do rio Madeira que possam atuar como possíveis biomarcadores da toxicidade deste elemento na região de influência do Aproveitamento Hidrelétrico de Jirau (AHE JIRAU). As estratégias para este estudo foram separadas em três componentes distintos: de seletividade, de sensibilidade e estrutural. Ao longo desta pesquisa, diferentes metodologias foram empregadas nessas etapas para o estudo metaloproteômico: componente de seletividade - 2D PAGE no fracionamento bidimensional das proteínas; componentes de sensibilidade - SR XRF e GFAAS para identificação e quantificação do mercúrio nos spots proteicos, respectivamente; componente estrutural - ESI MS MS na caracterização das proteínas identificadas com mercúrio em sua estrutura. As espécies de peixes estudadas foram: dourada (Brachyplatystoma rousseauxii), pacu (Mylossoma sp., Myleus sp.) e jaraqui (Semaprochilodus sp.). Entre os resultados obtidos, a 2D PAGE se mostrou eficiente no fracionamento proteico do tecido muscular de peixes. Utilizando análises qualitativas por SR XRF foi possível identificar a presença de mercúrio no spot 68 da dourada (massa molar 20,8 kDa e pI 5,6) e no spot 72 do pacu (massa molar 19,8 kDa e pI 7,5). Determinações por GFAAS permitiram a quantificação do mercúrio no tecido muscular e em 28 spots, que apresentaram concentrações de 11,3 a 41,2 mg g-1 de mercúrio em sua composição; esses resultados possibilitaram o cálculo da estimativa do número de átomos de mercúrio por molécula de proteína entre os spots estudados. Após análise por ESI MS MS, foi possível caracterizar oito proteínas com diferentes isoformas em 21 spots que apresentaram pI de 3,5 a 9,8 e massa molar ... Inserted in the context of mercury contamination of Amazonian rivers, this work pursues through metaloproteomic study the identification and characterization of proteins from muscle tissue of three different species of fish from Madeira River that may act as potential biomarkers of toxicity of this element in the region of influence of Jirau Power Plant. The strategies for this study were separated into three distinct components: selectivity, sensitivity and structural. Throughout this research, different methodologies were used in these steps for metaloproteomic study: component of selectivity - 2D PAGE in two-dimensional proteins fractionation; components of sensitivity - SR XRF and GFAAS for mercury identification and quantification in protein spots, respectively; structural component - ESI MS MS in the characterization of proteins identified with mercury in its structure. The species studied were: dourada (Brachyplatystoma rousseauxii), pacu (Mylossoma sp., Myleus sp.) and jaraqui (Semaprochilodus sp.). Among the results, the 2D PAGE proved efficient in protein fractionation of fish muscle tissue. Using qualitative analysis by SR XRF was possible to identify the presence of mercury in the spot 68 of dourada (molar mass of 20.8 kDa and pI 5.6) and spot 72 of pacu (molar mass of 19.8 kDa and pI 7.5). Determinations by GFAAS allowed the mercury quantification in muscle tissue and in 28 spots that showed concentrations from 11.3 to 41.2 mg g-1 of mercury in its composition; these results enabled an estimative calculation of the number of mercury atoms per protein molecule between the spots studied. After analysis by ESI MS MS it was possible to characterize eight proteins with different isoforms in 21 spots that showed pI 3.5 to 9.8 and molar mass between 9.9 and 18.1 kDa, indicating that these proteins may be potential candidates for mercury biomarkers in ...

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2014. O ameloblastoma (AM) é um tumor odontogênico benigno que, apesar de apresentar crescimento lento, é localmente agressivo devido ao seu crescimento infiltrativo, o que resulta em alta taxa de recidiva quando não removido adequadamente. O objetivo deste estudo foi contribuir para um melhor entendimento sobre os mecanismos de invasão do AM, por meio da avaliação imunoistoquímica da expressão das metaloproteinases de matriz 1, 2 e 9, da presença de miofibroblastos (MF) e do índice de proliferação celular (Ki-67). A amostra foi composta por treze casos de ameloblastoma sólido (AS), cinco casos de ameloblastoma unicístico (AU) e oito casos de folículos pericoronários (FP), como amostra de tecido odontogênico não neoplásico. O teste estatístico de Kruskal-Wallis mostrou diferença estatística para as MMP-1 e -2 no epitélio, cuja expressão foi menor em AS, quando comparado a AU e FP. A expressão de MMP-9 no estroma foi significativamente maior em FP, quando comparado a AS e AU. Com base nos resultados obtidos é possível concluir que a expressão de MMP 1, 2 e 9, presença de MF e Ki-67 foi semelhante em AM e FP, o que demonstra uma intensa atividade de remodelação tecidual em todos os grupos, não sendo, portanto, o FP um tecido quiescente como o esperado. Abstract : Ameloblastoma (AM) is a benign but locally invasive odontogenic tumour, characterized by a slow infiltrative growth pattern with a high recurrence index. To better understand the interaction between tumor cells and the stroma, the present study aimed to evaluate the immunohistochemical expression of matrix metalloproteinases (MMP-1, -2 and -9), the cellular proliferation index (Ki-67), and the presence of myofibroblasts (MF) in AM. Thirteen cases of solid ameloblastoma (SA) and five cases of unicystic ameloblastoma (UA) were selected for an immunohistochemical investigation of the proteins MMP-1, MMP-2, MMP-9, Ki-67 and a-smooth muscle actin (a-SMA) in MF. Eight samples of pericoronal follicles (PF) were included as a normal ondontogenic tissue control. Kruskal-Wallis test showed statistically significant differences in the epithelial expression of MMP-1 and 2, with lower expression in SA when compared to UA and PF. Higher stromal expression of MMP-9 was found in PF, comparing to SA and UA. These results suggest that the proliferative activity, the presence of myofibroblasts and the production of matrix metalloproteinase 1, 2 and 9 were similar in AM and PF, showing an intense activity of tissue remodeling in all groups not being the PF a quiescent tissue as expected.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:40:38Z : No. of bitstreams: 1 000741383.pdf: 4661010 bytes, checksum: cea0b65f99a47eb077f2cdaa817049d0 (MD5) Neste trabalho, buscou-se identificar proteínas responsáveis pelo transporte de mercúrio em amostras de leite materno coletadas da população ribeirinha do rio Madeira. Para isso, inicialmente, foi obtido o proteoma das amostras de leite por eletroforese bidimensional (2D PAGE) após precipitação das proteínas em meio acetônico. Nos spots proteicos obtidos no processo de fracionamento das proteínas, nas amostras de cabelo e de leite das lactantes foram feitas determinações de mercúrio por espectrometria de absorção atômica de vapor frio (CVAAS) e espectrofotometria de fluorescência atômica de vapor frio (CVAFS). As determinações por CVAFS indicaram a presença de mercúrio em dois spots proteicos (spot 1, spot 2), os quais foram caracterizados por espectrometria de massas em sequência com ionização por electrospray (ESI MS MS) e por meio de busca no banco de dados Uniprot. A análise por ESI MS MS identificaram o spot 1 como sendo a proteína b caseína (pI = 5,52 e MM = 26,01 kDa) e o spot 2 como sendo a proteína Lisozima C (pI = 9,30 e MM = 16,50 kDa). Os resultados obtidos nas determinações de mercúrio nos spots 1 e 2 permitiram estabelecer relação estequiométrica de um átomo de mercúrio por quatro moléculas de b caseína e de um átomo de mercúrio por molécula de lisozima C. Com base nos dados obtidos é possível inferir, no caso da b caseína, que a ligação do mercúrio não é específica, tratando-se de uma proteína metal-binding, não configurando o mercúrio como um cofator metálico, o que não desqualifica a b caseína como possível biomarcadora de mercúrio. Em relação a Lisozima C, a presença de metionina (base mole) na sequência peptídica pode estabelecer ligações com íons metálicos com características de ácido mole, como o Hg2+, configurando uma ligação mais estável desse íon com grupos sulfidrilas da Lisozima C e, caracterizando essa proteína como possível biomarcador de... In this study, we aimed to identify proteins responsible for the mercury transport in breast milk samples collected from the lactating of Madeira River region, Rondônia - Brazil. For this, we first obtained the proteome of milk samples by two-dimensional electrophoresis (2D PAGE) after proteins precipitation in acetone medium. In the protein spots obtained from proteins fractionation, in hair and milk samples of lactating mercury determinations were carried out by cold vapor atomic absorption spectrometry (CVAAS) and by cold vapor atomic fluorescence spectrophotometry (CVAFS). CVAFS determinations indicated the presence of mercury in two protein spots (spot 1, spot 2), which were characterized by electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI MS MS) and by searching in the Uniprot database. The ESI MS MS analysis identified the spot 1 as the b casein protein (pI = 5.52 and MM = 26.01 kDa) and spot 2 as the lysozyme C protein (pI = 9.30 and MW = 16, 50 kDa). The results obtained in the mercury determinations in the spots 1 and 2 allowed to establish a stoichiometric ratio of one mercury atom per four molecules of b casein and one mercury atom per of lysozyme C molecule. Based on the obtained data it can be inferred, in the case of b casein, that mercury binding is not specific, treating yourself of a metal-binding protein, not configuring the mercury as a metal cofactor what does not disqualify the b casein as a possible mercury biomarker. Regarding lysozyme C, the presence of methionine (soft base) in the peptide sequence can establish links with metal ions with features of soft acid, such as Hg2+, configuring a stable binding of this metal ion with sulfhydryl groups of lysozyme C and, characterizing this protein as a possible mercury biomarker

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica A hemofilia A é um distúrbio hemorrágico congénito caracterizado pelo comprometimento da cascata de coagulação devido à ausência ou deficiência da atividade do fator VIII que é provocada por uma mutação presente no respetivo gene. As características clínicas e as complicações que acompanham os pacientes hemofílicos ao longo da sua vida, como hemorragias espontâneas ou artropatia resultante de hemartroses recorrentes, exigem o recurso frequente a serviços de saúde. Contudo, nem sempre se verifica uma correlação entre a severidade da doença, que é inferida a partir do genótipo, e o fenótipo apresentado clinicamente. Considerando que a distinção entre fenótipos tem implicações para a prática clínica, torna-se fundamental o seu estudo do ponto de vista bioquímico. O presente trabalho teve como objetivo a análise do perfil proteico de soro e plasma de pacientes com hemofilia A severa, acompanhados no Serviço de Imunohemoterapia do Hospital Infante D. Pedro, em Aveiro, para melhor compreender as alterações proteicas no soro/plasma induzidas pela mutação que provoca esta doença. Neste sentido, procedeu-se à análise do perfil de proteínas do soro/plasma por SDS-PAGE e da atividade de proteases, presentes nestes biofluidos, por zimografia em gel. Complementarmente, realizou-se uma análise por imunoblotting de forma a verificar se as alterações na atividade da MMP-9, detetada na análise por zimografia, se deviam a diferenças no teor desta protease. Por último, com vista a integrar a MMP-9 nos processos celulares, recorreu-se à ferramenta bioinformática String para analisar as interações proteína-proteína com a MMP-9. Os resultados obtidos mostraram que a hemofilia A promove alterações da atividade proteolítica do soro e do plasma, caracterizadas pela diminuição significativa da atividade de MMP-9, apesar de presente em maior quantidade, o que sugere o envolvimento do inibidor TIMP-1 na regulação da sua atividade. Por sua vez, a análise efetuada por String evidenciou a interação desta metaloproteinase com vários fatores da via intrínseca da cascata de coagulação, confirmando, desta forma, o potencial envolvimento da MMP-9 na hemofilia A. Hemophilia A is a congenital blood disorder, characterised by the impairment of the coagulation cascade due to the absence or deficiency of factor VIII activity, which is caused by a mutation in the factor’s gene. The clinical features and the complications that accompany hemophiliacs throughout their lives, such as spontaneous bleeds and arthropathy that results from recurrent hemarthrosis, require the frequent use of health services. However, the correlation between the disease’s severity, which is inferred from the genotype, and the phenotype presented clinically is not always found. Considering that the distinction between phenotypes has implications to clinical practice, its study becomes essential from the biochemical point of view. The present study aimed to analyse the protein profile of serum and plasma from severe hemophilia A patients, who have been accompanied at the Imunohemotherapy Service of Infante D. Pedro Hospital, in Aveiro. This analysis was designed to better understand the protein alterations in serum/plasma induced by the mutation that causes this disease. In this sense, we determined protein profile of serum/plasma by SDS-PAGE and protease activity by in gel zymography. Then, an immunoblotting analysis was performed in order to verify if the alterations in MMP-9 activity, which had been detected by in gel zymography, were due to differences in the quantity of this protease. Finally, we used the bioinformatical tool String to study the protein-protein interactions with MMP-9 with the purpose of integrating this protease in cellular activities. The results showed that hemophilia A promotes alterations of serum and plasma proteolytic activity, characterised by the significant decreased activity of MMP-9, despite being present in higher levels, which suggests the influence of inhibitor TIMP-1 in the regulation of its activity. Furthermore, the analysis carried with String highlighted the interaction of MMP-9 with several factors of the intrinsic pathway of the coagulation cascade, confirming the potential involvement of this protease in hemophilia A.

Tesis de maestría en ciencias de la salud A nivel mundial y en México las enfermedades cardíacas representan una de las principales causas de muerte en el ser humano. La hipertrofia cardíaca y la fibrosis intersticial son determinantes en la morbilidad y mortalidad por enfermedades cardíacas. Existen investigaciones para conocer los mecanismos moleculares implicados en las alteraciones cardíacas, principalmente en modelos experimentales patológicos, y poca tención se ha presentado a fenómenos como la hipertrofia cardíaca función que se manifiesta en el embarazo y es reversible en el posparto, sin embargo no se han identificado los factores prohipertróficos ni los mecanismos asociados a la disfunción cardíaca presente en el posparto. Estudios preliminares nuestros muestran un aumento en el contenido de colágena de la matriz extracelular en el corazón durante la preñez, que disminuye en el posparto. Estas evidencias nos despertaron el interés por explorar la participación que tiene el sistema de las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores endógenos (TIMPs), en la hipertrofia cardiaca inducida por la preñez y su papel en el posparto de rata. Usando metodologías como PCR en tiempo real, ELISA y Western blot, encontramos que el ventrículo izquierdo aumenta la expresión de TIMP-1 durante la preñez, y disminuye la concentración de MMP1, así como disminuye la expresión de MMP-2 y MMP-9. Al analizar las colágenas más importantes de la matriz extracelular, se centró que la colágena tipo I disminuye en el ventrículo izquierdo en la preñez, y la colágena tipo III aumenta su expresión. En general, los datos obtenidos en esta investigación hacen sugerir que TMP-1 inhibe MMP-1, MMP-2 y MMP-9, modulando la expresión diferencial, de colágenas tipo I y III en la matriz extracelular en hipertrofia cardíaca inducida durante la preñez de rata. Universidad de Sonora. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Programa de Posgrado en Ciencias de la Salud, 2013

Resumo: Gliomas são os tumores mais comuns do sistema nervoso central, e em seu mais alto grau de malignidade (também chamado de glioblastoma multiforme - GBM) são tidos hoje como incuráveis, sendo a sobrevida nesses casos de no máximo 15 meses. Uma das principais causas da alta taxa de mortalidade é a elevada capacidade de invasão, processo realizado pelas metaloproteinases de matriz (MMPs). As principais MMPs envolvidas na invasão de gliomas são as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. As MMPs são inibidas principalmente por seus inibidores tissulares solúveis (TIMPs) ou RECK, uma glicoproteína ancorada a membrana. RECK está presente principalmente em microdomínos ricos em colesterol na membrana celular (lipid rafts) e é capaz de inibir através de diversos mecanismos as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. Recentemente, foi descrito um transcrito alternativo do gene RECK (RECKB), e evidências suportam que RECKB esteja relacionado a um fenótipo maligno. Já as TIMPs (4 em humanos) são proteínas solúveis e menos específicas. O balanço negativo MMPs/Inibidores é fundamental para o controle do processo invasivo, tornando importante a busca de compostos capazes de estimular esse balanço a favor dos inibidores. As estatinas são inibidores da enzima HMG-CoA redutase, fundamental na síntese de colesterol e isoprenóides, e são hoje muito utilizadas por pacientes com hipercolesterolemia. Recentemente, alguns autores associaram o uso das estatinas a uma menor incidência em diversos tipos de tumores (inclusive gliomas), pois proteínas fundamentais para a proliferação e invasão, como Ras e Rho, necessitarem de moléculas isoprenóides para ancorarem-se na parte interna da membrana e assim exercerem suas funções corretamente. Posto isso, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da sinvastatina na viabilidade, migração e parada de proliferação em linhagens de gliobastoma humano U87MG e T98G, e verificar a contribuição do balanço MMPs/Inibidores para o fenótipo anti-invasivo atribuído à sinvastatina. Primeiramente, nossos dados mostraram que a sinvastatina foi capaz de diminuir a viabilidade celular a partir de 48 horas de tratamento, causando a perda de em média 70% na maior dose (5?M) e maior tempo de tratamento (72 horas). Após 48 horas de tratamento com 1 e 5?M de sinvastatina, houveram alteações significativas na morfologia das duas linhagens, um aumento em torno de 20% de células na fase G1 na linhagem U87MG aumentando também o conteúdo de DNA fragmentado em ambas as linhagens, indicando morte celular. Ainda, houve uma diminuição significativa na migração das duas linhagens já a partir de 24 horas de tratamento. Os dados de expressão de mRNA mostraram, de modo geral, que o tratamento com a sinvastatina foi capaz de favorecer o balanço à favor das TIMPs em relação às MMPs 2, 9 e MT1-MMP. Não houve modulação de RECK canônico (RECKA), tanto da proteína, quanto do mRNA, mas o tratamento diminuiu significativamente os níveis de mRNA do transcrito alternativo RECKB. Ainda, a sinvastatina foi capaz de alterar a localização na membrana de RECK, podendo estar afetando a ação dessa proteína como inibidor de MMPs. Os dados obtidos nesse trabalho ressaltam a importância da sinvastatina como possível adjuvante na terapia anti-tumoral e mostraram que os inibidores de MMPs podem ter uma importante contribuição na contenção da invasão, auxiliando na busca a um melhor prognóstico para pacientes com tumores malignos da glia.

Artículo en colaboración con : Kamila Filipiak, Maria Hidalgo, Jose Manuel Silvan, Benjamin Fabre, Rodrigo J. Carbajo, Antonio Pineda-Lucena, Beatriz de Pascual-Teresa and Sonia de Pascual-Teresa En: Food & Function. EISSN. 2042-650x. 2013, december, doi: 10.1039/c3fo60465a Gallic acid and anthocyanins are abundant plant food bioactives present in many fruits and vegetables, being especially important in the composition of berries. Gallic acid has been shown to possess cytotoxic properties in several cancer cell lines and to inhibit carcinogenesis in animal models. However, its 10 mechanism of action is not yet fully understood. The aim of this study was to elucidate whether the observed inhibitory activity of gallic acid against gelatinases corresponds to its cytotoxic activity in HT1080 cells and to determine if anthocyanins could have a similar behavior. Gallic acid and delphinidin-3-glucoside have shown selective cytotoxicity towards HT1080 cells. Further analysis in a migration and invasion assay showed anti-invasive activity of gallic acid, delphinidin and pelargonidin-3- 15 glucosides. Zymographic analysis demonstrated the inhibitory activity of gallic acid at the level of secreted and activated gelatinases. Moreover, gallic acid inhibited MMP-2 and MMP-9 proteolytic activity with very similar potency. NMR and molecular modelling experiments confirmed the interaction of gallic acid with MMP-2, and suggested that it takes place within the catalytic center. In this work we give some new experimental data supporting the role of those compounds in the inhibition of 20 metalloproteases as the mechanism for its cytotoxic activity against fibrosarcoma. Post-print del autor

Artículo en colaboración con : Benjamin Fabre, Kamila Filipiak, Natalia Díaz, Rodrigo J. Carbajo, Anne K. Schott, María Paz Martínez-Alcázar, Dimas Suárez, Antonio Pineda-Lucena, Ana Ramos and Beatriz de Pascual-Teresa En: Organic and Biomolecular Chemistry. EISSN. 1477-0539. 2013, 11, 6623-6641, doi: 10.1039/c3ob41046c Water solubility is a key aspect that needs to be addressed to obtain druglike compounds. In an effort to improve the water solubility of our recently reported nanomolar matrix metalloproteinase type 2 (MMP10 2) inhibitors based on triazole-substituted hydroxamates, we synthesized a new series of -sulfone, - tetrahydropyran and -piperidine, -sulfone clicked hydroxamates and determined their inhibitory activities against both MMP-2 and MMP-9. The best results were found for 13e, a water-soluble compound that displays a low nanomolar activity against MMP-2 and is 26-fold less active against MMP9. This finding allowed us to pursue in vitro permeability through Caco-2 monolayer and open the 15 possibility for carrying out further preclinical investigations. Docking and MD simulations have been performed in order to rationalize the biological results. The inhibitory activity of this compound against a panel of ten MMPs was determined showing an interesting MMP-2/MMP-1,-8,-14 selectivity profile. The cytotoxicity and anti-invasive activity of the compounds on highly metastatic human fibrosarcoma tumor cells (HT1080) were determined, showing, at 10 M concentration, a decrease in cell invasiveness up to 20 80 %. Post-print del autor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-23Bitstream added on 2014-06-13T20:51:26Z : No. of bitstreams: 1 fonseca_bm_me_sjc.pdf: 775997 bytes, checksum: e77eb2f75ac56e60c212e110b913bb06 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O objetivo deste estudo foi avaliar a interface adesiva de amostras de dentina bovina / adesivo e resina variando as estratégias adesivas e o tempo de armazenamento. Foram selecionados 80 incisivos bovinos, limpos e seccionados 2,0 mm além da junção amelocementária, desgaste da superfície vestibular do esmalte, com exposição de uma área plana de dentina, a qual foi submetida a diferentes protocolos adesivos. Aleatoriamente, as amostras foram divididas em 4 grupos (n= 20), submetidos às estratégias adesivas: SB – controle: sistema adesivo Adper Single Bond 2 aplicado segundo instruções do fabricante; CLX – clorexidina: aplicação de solução de digluconato de clorexidina 0,2% previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB; EGCG – EGCG10: aplicação da solução em gel de EGCG 10μM – principal componente ativo do chá verde – por 30 s previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB; e CV – solução aquosa de chá verde: aplicação do chá verde – preparado após infusão da erva acondicionada em sachê – previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB. Em todos os grupos foi aplicada resina composta (RC) Amelogen Plus com o auxílio de matriz de silicone, com fotopolimerização por 20 s cada incremento. Posteriormente, os grupos foram redivididos em dois subgrupos (n= 10) de acordo com o tempo de armazenamento em água destilada por 24 h e 6 meses, a 37ºC em estufa bacteriológica. Em seguida, todos os corpos-de-prova foram seccionados no sentido mésio-distal e cérvico-incisal em cortes paralelos de espessura aproximada de 0,8 mm2 em cortadeira Labcut (Extec Technologies – EUA) com refrigeração em baixa velocidade. Desta forma, foram obtidos em média 9 palitos por dente, sendo cada... The aim of this study was evaluate the adhesive interface of bovine dentin samples / adhesive and resin varying adhesive strategies and time of storage. Eighty bovine incisors were selected, cleaned and sectioned 2.0 mm beyond the cementoenamel junction; the labial surface of the enamel was worn to obtain a flat area of exposed dentin. The dentin was subjected to different adhesives protocols. Samples were randomly divided into 4 groups (n = 20), according to the adhesive strategies: SB - control: Adper Single Bond 2 (SB) system was applied according to manufacturer's instructions; CHX - chlorhexidine: application of 0.2% chlorhexidine gluconate solution prior to adhesive system similar to SB; EGCG - EGCG10: application 10 μM EGCG gel - the main active component of green tea - for 30 s prior to application of the adhesive system similar to SB; and GT - aqueous green tea: application of green tea - prepared after infusion of the herb sachet - prior to application of the adhesive system similar to SB. The composite resin Amelogen Plus was applied in all groups with aid of silicone matrix, and lightcured for 20 s. Subsequently, groups were re-divided into two subgroups (n = 10) in accordance with the time of storage in distilled water, for 24h or 6 months at 37°. Specimens were sectioned to obtain parallel cuts and beams of approximately 0.8 mm2. Cut procedure was performed in Labcut cutting machine (Extec Technologies - USA) at low speed with cooling. Nine beams per tooth were obtained. Each beam was attached with cyanoacrylate glue to a device prepared for submission to the microtensile test, using a universal testing machine (DL-1000, EMIC, Pinhais-PR-Brazil) with 10 kgf load and speed of... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 As lipases são enzimas altamente versáteis que catalisam reações químicas com diversos substratos em diferentes condições e possuem características tanto bioquímicas quanto estruturais que lhes conferem resistência e termotolerância, além de serem empregadas em vários bioprocessos industriais como na produção de alimentos e biocombustíveis. A lipase de S. xylosus (AF208229) foi recentemente isolada e inicialmente caracterizada por nosso grupo de pesquisa e colaboradores. Essa proteína possui uma alta homologia e identidade estrutural com diversas outras lipases da família I.5, e apresenta atividade enzimática sobre p-nitrofenil-ésteres. Apesar de ser considerada uma enzima moderadamente termoestável e ter atividade enzimática sobre diferentes ésteres, o mecanismo de ação catalítica ainda permanece desconhecido, e principalmente, os mecanismos estruturais envolvidos em sua estabilização térmica nunca foram descritos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquimicamente a lipase recombinante AF208229 de S. xylosus recentemente clonada e expressa heterologamente, e investigar os possíveis mecanismos envolvidos em sua termotolerância por meio de análises de espectroscopia de dicroísmo circular (DC). Nesse trabalho a lipase de S. xylosus (AF208229) foi expressa e purificada, submetida a ensaios enzimáticos em três temperaturas (25°C, 37°C e 42°C), e três pH (7,0 8,0 e 9,0), sua especificidade catalítica foi analisada utilizando-se diferentes p-nitrofenil-ésteres como substratos (de 2 a 18 carbonos) e sua termoestabilidade foi acompanhada durante 10, 20 e 30 minutos em 95°C. Para as análises espectroscópicas, a enzima foi submetida a um tratamento de remoção de íons (produzindo-se a apo enzima) e sua atividade enzimática e sua termotolerância foram reavaliadas. Por fim o espectro de dicroísmo circular (DC) da apo e da holo_enzima foram analisados em diferentes condições. Os resultados obtidos apresentam pela primeira vez o perfil estrutural e os mecanismos de estabilidade 8 térmica dessa lipase. O perfil de DC da holo_enzima foi avaliado nas mesmas temperaturas descritas para os ensaios enzimáticos, bem como sua capacidade de re-enovelamento. O perfil de DC e a capacidade de re-enovelamento também foram observados para a apo_enzima. O efeito dos cofatores metálicos Zn2+ e Ca2+ foram avaliados nos ensaios enzimáticos da apo_enzima, na sua termotolerância, no seu perfil de DC e na sua capacidade de re-enovelamento. Observou-se que a holo_enzima apresenta sua maior atividade em pH 9,0 e 42°C, que tem preferência por substratos de cadeias curtas (pNP-acetato, 2 carbonos) e que retem 77% de sua atividade enzimática após 10 minutos de tratamento térmico (95°C). A holo_enzima é capaz de se re-enovelar, readquirindo sua conformação estruturalmente estável e ativa. A apo_enzima também é capaz de se re-enovelar após o tratamento térmico, porém perde quase totalmente sua atividade. Observou-se que na presença do íon Zn2+ a apo_enzima se re-enovelou e reteve sua atividade enzimática. Com base nesses resultados poderia afirmar-se que a lipase de S. xylosus (AF208229) é uma metaloenzima dependente de zinco e que esse íon possivelmente localizado em um motivo estrutural rico em -hélices próximo ao ativo site. Lipases are highly versatile enzymes, which catalyze many chemical reactions with different substrates in different conditions. These enzymes have particular biochemical and structural characteristiscs which promote stability and thermal resistance. Besides, they are used by industries, i.e: food technology, detergents and biofuels. S. xylosus lipase (AF208229) was recently isolated and characterized by our group. This enzyme shares a high homology with other lipases among I.5 lipases family and has activity on p-nitrophenyl esters. Although considered a moderated thermostable lipase, its catalytic function remains unclear and its structural mechanisms for thermal stabilization have never been described. This work assessed the enzymatic activity of the recombinant lipase from S. xylosus in three different temperatures (25°C, 37°C and 42°C) and pH (7.0, 8.0 and 9.0), and the thermostability (incubation at 95°C for 10, 20 and 30 minutes). In order to investigate the mechanism involved in enzymatic activation, the enzyme was submitted to an ion removal treatment (to obtain an apo_- enzyme) and its activity and themotolerance were evaluated in the presence and absence of Zn2+ and Ca2+. The structural profile of apo-_enzyme and holo_enzyme were assessed by circular dichroism (CD) at different conditions in the presence an in the absence of metal cofactors as: Zn2+ and Ca2+. These results represent the first insights on S. xylosus lipases secondary structure and its mechanism for thermal stabilization. S. xylosus lipase (AF208229) was more active in pH 9.0, 42°C with specificity for short-chain substrates (pNP-acetate C2). In addition, this enzyme was able to maintain 77% of its activity after a thermal treatment (95°C for 10 min) and to refold to its stable conformation. apo_enzyme showed the same ability to refold as seen to holo_enzyme, but was not able to keep its activity after thermal treatment, which indicate the need of metal for its activity stabilization. Interesting, in the presence of Zn2+ the apo_enzyme was able to acquire a more stable conformation after thermal treatment and still keep residual activity. 10 These results propose that S. xylosus lipase (AF208229) is a metalloenzyme which uses Zn2+ as its metal coordinating, and the Zn2+ is possibly located in a-helical rich motif close to the active site.

Artículo en colaboración con : Jose Juan Rodríguez, Kamila Filipiak, Maciej Maslyk, Jakub Ciepielski, Sebastian Demkowicz, Sonia de Pascual-Teresa, Sonsoles Martín-Santamaría, and Ana Ramos En: Organic and Biomolecular Chemistry. EISSN. 1477-0539. 2012, 10, 7334, doi: 10.1039/c2ob26062j Post-print del autor

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira Halder, Silvia Mika Shishido Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Melanoma é o tipo mais agressivo de tumor de pele e uma das principais causas de morte por tumor de pele, devido a sua alta capacidade metastática. Em termos de estratégias terapêuticas de combate ao melanoma tem-se dado ênfase no controle da resistência e da metástase. Nosso grupo de pesquisa observou que a riboflavina irradiada (RFi) induz apoptose de células de câncer de próstata, renal e leucemia mielóide. Portanto, o objetivo geral deste trabalho foi utilizar a RFi para modular química e geneticamente as vias de transdução de sinal associadas com a sobrevivência, resistência e agressividade do melanoma. Assim, neste trabalho estão apresentados os dados sobre a influência da RFi em diferentes aspectos metabólicos das células de melanoma murino (B16F10), tais como: citotoxicidade, adesão, invasão, migração, capacidade de formação de colônia e em mediadores de transdução de sinal: Src quinase, mTOR e componentes da via sonic hedgehog. Em todos os experimentos a riboflavina (RF) foi previamente irradiada com UVA (dose de 9 J/cm²). Foi observado inibição da proliferação celular com valor de IC50 de 50 ?M. De forma interessante, RFi na faixa de concentração de nanomolar foi eficiente na inibição da formação de colônias. Além disso, causou a redução da adesão das células B16F10, quando utilizada na concentração de 1?M. A capacidade de migração e invasão das células de melanoma foi reduzida na presença da RFi, nas concentrações de 1 e 30 ?M respectivamente, porém a resposta foi independente da dose. A atividade e expressão das metaloproteinases foram diminuídas na presença de RFi, indicando inibição na capacidade de invasão. Sob o contexto de sinalização a RFi modulou negativamente a via sonic hedgehog, PI3K/mTOR e aumentou a expressão da p53 e PTEN. O conjunto de resultados obtidos nesse trabalho mostra que flavinas são candidatas promissoras para a intervenção farmacológica do melanoma Abstract: Melanoma is the most aggressive type of skin disorder and a major cause of death by skin's disease due to its highly metastatic ability. In terms of melanoma therapeutic strategies has given emphasis on control of resistance and metastasis. Our group observed that irradiated riboflavin (RF) induces apoptosis of prostate cancer cells, kidney cancer cells and myeloid leukemia. Therefore, the goal of this study was to employ irradiated RF for modulating chemical and genetically signal pathways associated with melanoma survival, resistance and aggressiveness. Thus, in this manuscript data about the influence of RF in different cellular metabolic aspects of murine melanoma (B16F10) such as cytotoxicity, adhesion, invasion, migration, colony formation and signal transduction mediators Src kinase, mTOR and sonic hedgehog components, will be presented. In all experiments the RF was previously irradiated with UVA (dose of 9 J/cm²). Inhibition of cell proliferation was observed with IC50 value of 50 ?M. Interestingly, RF in a nanomolar concentration inhibited the formation of colonies. In addition, 1 ?M irradiated RF caused a reduction of B16F10 cells adhesion. The ability of migration and invasion of melanoma cells was reduced in the presence of RF, however, those cells response was dose-independent. The activity and expression of metalloproteinases were diminished indicating reduction of cellular invasiveness capacity. Sonic hedgehog and PI3K/mTOR pathways were negatively modulated and the expression of p53 and PTEN were increased in melanoma cells treated with irradiated RF. The findings showed in this study brought out flavins as promising candidates for pharmacological intervention of melanoma Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. O processo de envelhecimento da pele em humanos é um mecanismo bastante complexo, uma vez que além dos efeitos do envelhecimento cronológico a pele também sofre os efeitos do envelhecimento extrínseco. De modo geral, as modificações ocorrem parcialmente como resultado do acúmulo de danos endógenos resultados da formação contínua de espécies reativas de oxigênio. O estrato córneo permanece relativamente inalterado, mas a epiderme e a derme sofrem um achatamento das junções dermo-epidérmicas, uma redução na capacidade proliferativa e biossintética das células, que resulta em uma diminuição da produção de matriz dérmica, um aumento da expressão das metaloproteinases de matriz (MMP), e um consequente adelgaçamento do tecido cutâneo, redução da vascularização, redução da expressão de colágeno tipo I e desaparecimento progressivo do tecido elástico na derme papilar. A L-arginina é o substrato da síntese de óxido nítrico e está envolvida na angiogênese e na proliferação celular. Ao mesmo tempo, a L-arginina é precursora indireta da síntese de colágeno, por ser utilizada na síntese de prolina, componente da fibra de pró-colágeno. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência de diferentes concentrações da L-arginina na elasticidade da pele de camundongos, através da avaliação da força tênsil suportada pela pele, avaliação histológica e imuno-histoquímica, determinação do grau de lipofilia da L-arginina, ensaio de retenção, penetração e permeação cutânea e da atividade proteolítica das MMPs por eletroforese em gel de poliacrilamida, com o intuito de avaliar a possibilidade de usá-la como ativo cosmético em produtos antienvelhecimento. Os resultados obtidos sugerem que a aplicação de L-arginina melhora a resistência da pele à força de tração para camundongos do grupo de fêmeas idosas e promove a formação de uma maior quantidade de fibras colágenas e elásticas na pele quando aplicada na concentração de 15%. Nos grupos de animais idosos, machos ou fêmeas, tratados com L-arginina foi observada também uma diminuição da atividade proteolítica das MMPs. Estudos posteriores devem ser realizados para melhor elucidar o mecanismo da melhora da elasticidade da pele pela aplicação de L-arginina. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT Skin, just like any other organ of the human body, suffers the effects of chronological aging and, unlike the others, also suffers the effects of extrinsic aging. The process of aging skin in humans is a quite complex mechanism that begins to be understood. Overall, the changes occur partly as a result of the accumulation of endogenous injuries resulting from the continuing formation of reactive oxygen species generated by cellular oxidative metabolism. The stratum corneum remains relatively unchanged, but the epidermis and dermis undergo a flattening of the dermal-epidermal junction, reduction in the proliferative and biosynthetic ability of cells, which results in a decrease in the dermal matrix production, increased expression of matrix metalloproteinases (MMP), with a consequent skin thinning, reduced vascularization, decreased collagen type I expression and progressive decrease of elastic tissue in the papillar dermis. The loss of elastic fibers integrity is associated with progressive reduction of skin elasticity. L-arginine is the substrate of nitric oxide synthesis and is thus indirectly involved in many important regulatory mechanisms, such as angiogenesis and cell proliferation. At the same time, L-arginine is an indirect precursor of collagen synthesis because of its use in proline synthesis, a component of procollagen. The aim of this study was to evaluate the influence of different concentrations of L-arginine in mice skin elasticity in order to evaluate the possibility of using it as a cosmetic ingredient in anti-aging products. For that, the tensile strength supported by the skin, histological and immunohistochemical analysis, the L-arginine lipophilicity, retention, penetration and permeation tests and proteolytic activity of MMPs in polyacrylamide gel were evaluated. The results suggested that the application of L-arginine improves the skin resistance to traction force in female elder mice and L-arginine promotes the formation of a higher amount of collagen and elastic fibers in the skin when applied at a concentration of 15%. In groups of aged animals, males or females, treated with L-arginine it was also observed a decrease in proteolytic activity of MMPs. Further studies should be performed to further elucidate the mechanism of the skin elasticity improvement by application of L-arginine.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. O tumor odontogênico ceratocístico (TOC) é uma neoplasia odontogênica benigna de origem epitelial, de evolução lenta, o qual apresenta crescimento infiltrativo e elevado índice de recidiva após tratamento conservador, podendo ainda estar associado à síndrome do carcinoma nevoide de células basais (SCNCB). O objetivo deste estudo foi contribuir para um melhor entendimento sobre o crescimento infiltrativo do TOC, por meio da avaliação de proteínas envolvidas no processo de proliferação das células neoplásicas e na interação parênquima/estroma. A atividade proliferativa foi avaliada utilizando-se o antígeno de proliferação celular Ki-67. A interação entre parênquima/estroma foi avaliada: 1) pela produção de metaloproteinases de matriz (MMP-1, MMP-2 e MMP-9) no parênquima e estroma e 2) pela presença de miofibroblastos (MF), através da expressão de ?-actina de músculo liso no estroma. Os casos submetidos à técnica de imuno-histoquímica pelo método streptavidina-biotina-peroxidase foram classificados em: G1, 11 casos de TOC isolados; G2, 12 casos de TOC associados à SCNCB e G3, 6 casos de folículos pericoronários livres de inflamação (grupo controle). A análise e quantificação das reações foram obtidas com auxílio do programa NIH ImageJ. Foi realizada avaliação estatística para comparação da expressão proteica entre os grupos em estudo. Também foi realizada a correlação de Spearman, nos casos de TOC, para avaliar a existência de correlação entre os marcadores. Diferença estatística foi observada entre o grupo controle (G3) e os casos de TOC (G1 e G2) para o antígeno Ki-67, e para a MMP-1 e MMP-9 no tecido conjuntivo. Foi observada uma correlação positiva entre a MMP-1 no epitélio e no conjuntivo, MMP-2 no epitélio e MMP-1 no conjuntivo, MMP-2 no epitélio e MMP-1 no conjuntivo, MMP-9 no epitélio e MMP-1 no conjuntivo, MMP-9 e MMP-2 no epitélio, Ki-67 e MMP-1 no epitélio, MF e MMP-1 no epitélio. Concluiu-se que o aumento da atividade proliferativa no TOC está associado a um aumento da produção da MMP-1 no epitélio, o que pode influenciar no crescimento da lesão, associado ao aumento de miofibroblastos no tecido conjuntivo. A associação entre as MMPs indica a interação existente entre essas MMPs, pois a MMP-1 realiza a ativação da MMP-2 que por sua vez realiza a ativação da MMP-9. The Keratocystic odontogenic tumor (KCOT) is a benign neoplasia of odontogenic epithelial origin. Despite its slow evolution, it shows infiltrative growth and a high recurrence index after conservative treatment. It can be associated with the naevoid basal cell carcinoma syndrome (NBCCS). The aim of this study was to provide a better understanding of the infiltrative growth of KCOTs. This was attempted by evaluating the proliferative activity of neoplastic cells and by evaluating the interaction between parenchyma and stroma. The proliferative activity was assessed by analyzing the nuclear antigen Ki-67. The interaction between parenchyma and stroma was assessed by analyzing the following: 1) the production of matrix metalloproteinase (MMP-1, MMP-2, MMP-9) in the parenchyma and stroma and 2) the presence of myofibroblasts (MF) in the stroma, via the expression of á-smooth-muscle actin. All samples were processed using the streptavidinbiotin-peroxidase immunohistochemical technique and were classified as: G1, 11 cases of isolated KCOT; G2, 12 cases of KCOT associated with NBCCS, and G3, 6 cases of pericoronal follicles without inflammation (control group). Reaction analysis and quantification was performed with the software NIH ImageJ. Protein markers from the study groups were compared using statistical techniques. The correlation between the protein markers in KCOT cases were evaluated using the Spearman correlation test. The control group (G3) and the KCOT cases (G1 and G2) presented statistical differences in relation to the Ki-67 antigen and to the MMP-1 and MMP-9 in the stroma. A positive correlation was observed between the following markers: MMP-1 (in the) stroma and parenchyma; MMP-2 parenchyma and MMP-1 stroma; MMP-2 parenchyma and MMP-1 stroma; MMP-9 parenchyma and MMP-1 stroma; MMP-9 and MMP-2 parenchyma; Ki-67 antigen and MMP-1 parenchyma; and MF and MMP-1 parenchyma. The results obtained lead us to conclude that increased proliferative activity in the KCOT is associated with the increase of MMP-1 production in the parenchyma, which, linked with an increase of MF, may influence the growth of the lesion. The association observed between MMPs indicates real interaction between them, due to chain activation from MMP-1 to MMP-9.

Universidade Federal de Sao Carlos This thesis aimed the fractionation of metalloproteins in beef samples. To this purpose initially it was proposed a method for extraction of proteins using the sample extractor in buffered alkaline medium and surfactant solutions. After optimization were observed approximately 85% extraction efficiency and r.s.d. < 5%, showing the efficiency, reproducibility, simplicity and velocity of the method. After that, the experimental conditions for the fractionation of metalloproteins were evaluated. High performance liquid chromatography (HPLC) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were used for physical-chemical separation and mass spectrometry and optical emission inductively coupled argon plasma (ICP OES and ICP-MS, respectively) as detection methods. The analytes Ca, Cu, Fe, Mg and Zn were evaluated; however, Mg was not detected in any condition of the study. To obtain a condition of appointment of detection for the other four elements, it was chosen to use less energy plasma conditions in ICP-MS (cool plasma), in order to avoid isobaric interference emanating from the plasma when the determination of the elements Ca and Fe. Finally, samples of meat with different maturation stages were analyzed by PAGE and HPLC-ICP-MS. Approximately 17 protein bands could be observed by PAGE and the band of 43 kDa was the more intense. Some peaks were detected for each element by HPLC size exclusion. All items showed at least a fraction above the dead volume of the column, Fe and Zn, and this fraction, also showed a fraction of 17 and 27 kDa respectively. Esta tese teve como principal objetivo o fracionamento de metaloproteínas em amostras de carne bovina. Para isso, inicialmente foi proposto um método para extração de proteínas nas amostras de interesse utilizando extrator em meio alcalino tamponado e o emprego de surfactantes. Após otimização foram observados aproximadamente 85 % de eficiência de extração e d.p.r. < 5%, demonstrando ser eficiente e reprodutível, além de ser um método simples e rápido. A seguir foram avaliadas as condições experimentais de análise para o fracionamento das metaloproteínas. Foram empregadas cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) como técnicas físico-químicas de separação e espectrometria de massa e de emissão óptica com plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP-MS e ICP OES, respectivamente) como métodos de detecção. Os analitos monitorados foram Ca, Cu, Fe, Mg e Zn, contudo, o Mg não foi detectado em nenhuma das condição estudadas. Para a obtenção de uma condição de compromisso de detecção para os outros 4 elementos, optou-se por utilizar condições de plasma menos energéticas em ICP-MS ( cool plasma), como forma de se evitar interferências isobáricas provindas do plasma quando da determinação dos elementos Ca e Fe. Por fim, amostras de carne com diferentes períodos de maturação foram avaliadas por PAGE e HPLC-ICP-MS. Aproximadamente 17 bandas protéicas puderam ser observadas por PAGE, sendo a banda de 43 kDa a mais intensa. Alguns picos foram detectados para cada elemento por cromatografia líquida por exclusão de tamanho. Todos os elementos apresentaram pelo menos uma fração acima do volume morto da coluna. O Fe e o Zn, além dessa fração, apresentaram também uma fração de 17 e 27 kDa, respectivamente.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-08Bitstream added on 2014-06-13T20:29:19Z : No. of bitstreams: 1 akao_pk_me_sjrp.pdf: 3271201 bytes, checksum: 442f358fe13f76b52392394d1b1519df (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Metaloproteinases presentes no veneno de serpentes são toxinas hemostaticamente ativas que interferem em diferentes níveis na cascata de coagulação e têm sido exploradas como ferramenta bioquímica nas pesquisas de coagulação, diagnósticos, modelos de inibidores de metaloproteinases e compreensão do mecanismo de ação de venenos. Estudos estruturais complementados por ensaios de docking molecular têm ajudado muito na compreensão de suas especificidades e mecanismo de ação. Assim, neste trabalho a metaloproteinase não-hemorrágica fibrinogenolítica da classe PI, isolada do veneno de Bothrops moojeni (BmooMP -I) foi cristalizada e sua estrutura resolvida a 1,76 Å de resolução. O íon zinco catalítico possui uma coordenação octaédrica formada por três histidinas canônicas (His 140 , His 144 e His 150 ) e por três moléculas de solvente. Uma comparação seqüencial e estudos estruturais indicaram que os motivos que compreendem os resíduos 153-164 e 167-176 possuem uma característica saliente, que diferencia as outras SVMPs hemorrágicas das não-hemorrágicas de classe PI, podendo estes motivos estarem diretamente envolvidos no desenvolvimento da atividade hemorrágica. Além do projeto principal, foram realizados estudos com a proteína endo-1,4-β-glicanase de Bacillus subtilis (Cel5A), que hidrolisa a ligação glicosídica β(1-4) do polímero de celulose. Esse polímero tem recebido grande atenção do meio acadêmico e industrial devido ao seu potencial na produção de açúcares solúveis, produtos químicos e biocombustíveis. Porém para o aproveitamento da biomassa celulósica é necessário a ação sinérgica do coquetel enzimático formado por endo-1,4-β-glicanases, celobiose-hidrolases ou exo-1,4-β-glicanases e β-glicosidases. Assim, o gene Cel5A constituído pelo domínio catalítico e o módulo de ligação à carboidratos (CBM) foi clonado... Snake venom metalloproteinases are hemostatically active toxins that interfere in different levels on the blood coagulation cascade. Therefore, they have been extensively investigated as biochemical tools for coagulation studies and diagnostics, and as model for design of metalloproteinases inhibitors and understanding of venom action mechanism. Structural studies complemented by molecular docking experiments have been instrumental to shed light on the the stereo specificity and action of enzymes. In this study, a fibrin(ogen)olytic non-hemorragic PI class metalloproteinase isolated from Bothrops moojeni (BmooMPα-I) was crystallized and its structure determined at 1,76 Å resolution. The catalytic zinc ion displays an octahedral coordination formed by three canonical histidines (His 140 , His 144 e His 150 ) and three solvent molecules. Comparative sequence and structural studies indicate that the motif comprising amino acid segments 153-164 e 167-176 is a salient feature that differentiates non- and hemorrhagic PI class SVMPs and it might be directly involved in the development of the hemorrhagic activity. In parallel to the main project, a biophysical study was carried out on the thermophilic endo-1,4-β-glucanase from Bacillus subtilis. Endo-cellulases are responsible for the cleavage of β(1-4) glycosidic linkages from cellulose. This polymer has been receiving great attention from both industrial and academic community due to its applications in food, chemical and biofuels industries. However, for its use is needed to reduce the cellulose into fermentable sugars and this process involves the synergistic action of endo-1,4-β-glucanases, celobiose-hydrolases or exo-β-1,4-glucanases and β-glucosidases. In this project, the gene of the Cel5A consisting of the parental catalytic domain and its carbohydrate-binding module was cloned in pET28a vector and expressed in BL21(DE3)... (Abstract complete click electronic access below)

Resumo: Introdução: As lesões císticas uniloculares intraósseas são as entidades patológicas mais comuns que afetam a região buco-maxilo-facial. O potencial proliferativo bem como a sua expansão ainda são incertos. Sugere-se que as metaloproteinases (MMPs) têm um papel importante no desenvolvimento de algumas condições patológicas. Objetivo: O objetivo desse estudo foi correlacionar os aspectos radiográficos (área) da lesão com a presença das MMPs-2 e -9 nos cistos dentígeros, cistos radiculares e tumores odontogênicos ceratocísticos. Métodos: A amostra foi composta por dez espécimes de cistos dentígeros, nove cistos radiculares e oito tumores odontogênicos. A área radiográfica de cada lesão foi calculada a partir da fórmula matemática da área da elipse. Todos os espécimes foram submetidos à análise imunoistoquímica para estas enzimas. As imunolocalizações das MMPs-2 e -9 foram classificadas em escores, como ausente, presente ou fortemente presente. Resultados e Conclusões: A média das áreas radiográficas das lesões foi de 284,17 mm2 para os cistos dentígeros, 235,81 mm2 para os cistos radiculares e 381,81 mm2 para os tumores odontogênicos. O resultado das análises estatísticas mostraram que a imunolocalização das MMPs e a área radiográfica das lesões não estão relacionadas para todas as lesões em questão (p>0,05), exceto para a MMP-2 nos cistos radiculares (p=0,02/rs= -0,659), o que significa que quanto menor o cisto radicular maior a imunomarcação para essa enzima. A MMP-2 e a MMP-9 estão envolvidas com os cistos dentígeros e radiculares, relacionando-os com a expansão cística enquanto a MMP-2 e a MMP-9, nos tumores odontogênicos ceratocísticos, estão relacionadas a invasão, proliferação celular e consequentemente agressividade. Além disso, há uma associação inversa, nesse tumor, entre a imunomarcação da MMP-2 e MMP-9 (p=0,03/rs=-0,660), indicando imunoexpressões em regiões distintas.

Orientador : Dr. Prof. Silvio Marques Zanata Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba,24/02/2011 Bibliografia: fls. 88-97 Resumo: A proteína príon celular (PrPC) é uma proteína de membrana ancorada por glicosilfosfatidilinositol de distribuição ubíqua. Embora se saiba que a sua isoforma anormal scrapie (PrPSc) é o agente etiológico das encefalopatias espongiformes transmissíveis, a função fisiológica de PrPC permanece em debate. Dados na literatura sugerem que as funções de PrPC incluem sobrevivência neuronal, europroteção, formação e manutenção de sinapses, atividade anti-oxidante e anti-apoptótica, participação em processos imunológicos e nos fenômenos de adesão celular, invasão e metástase de células tumorais. Sabe-se que PrPC interage com uma ampla gama de ligantes, como as proteínas da matriz extracelular (MEC) laminina e vitronectina. A disposição destas e outras proteínas de MEC é constantemente remodelada por uma família de enzimas proteolíticas conhecidas como Metaloproteases de Matriz (MMPs). Entre as MMPs, a MMP-9 tem recebido especial atenção na literatura devido à sua participação nos processos de aprendizado e memória, neuroplasticidade, neuroproteção, resposta imune, adesão célula-matriz, migração, invasão e metástase de células tumorais. O objetivo deste trabalho é investigar uma ossível relação funcional entre a proteína príon celular e a metaloprotease 9, duas proteínas que são expressas nos mesmos tipos celulares e participam dos mesmos processos fisiopatológicos. Para isso, analisamos a expressão e atividade de MMP-9 em células tipo selvagem e nocaute para PrPC. Não foi encontrada uma diferença significativa entre a expressão ou atividade gelatinolítica da MMP-9 entre as duas linhagens celulares. Analisamos então o efeito da superexpressão de PrPC em células HEK 293T sobre a secreção de MMP-9. Os resultados que obtivemos sugerem que superexpressão de PrPC não altera a atividade de MMP-9 em HEK 293T. Por último, a expressão de PRNP foi silenciada em células de tumor de mama MDA-MB-435 com RNA de interferência para e a expressão gênica de MMP-9 analisada. Os ados obtidos indicam que silenciamento do gene que codifica PrPC em células tumorais MDA-MB-435 não altera a expressão gênica de MMP-9. Concluindo, nos modelos experimentais utilizados neste trabalho, a expressão e atividade gelatinolítica de MMP- 9 parece ser independente da proteína príon celular. Abstract: The cellular príon protein (PrPC) is a glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane protein of ubiquitous distribution. Although it is known that its abnormal isoform scrapie (PrPSc) is the ethiological agent of transmissible spongiform encephalopathies, the physiological function of PrPC is still under debate. Data in the literature suggest that PrPC functions include neuronal survival, neuroprotection, formation and maintenance of synapses, antioxidant and antiapoptotic-activity, participation in immunological processes and in cell adhesion, invasion and metastasis of tumor cells phenomena. It is known that PrPC interacts with a wide range of ligands, such as the extracellular matrix (ECM) proteins laminin and vitronectin. The arrangement of these and other ECM proteins is constantly remodeled by a family of proteolitic enzymes known as Matrix Metalloproteinases (MMPs). Among the MMPs, MMP-9 has received special attention in the literature due to its participation in learning and memory processes, neuroplasticity, neuroprotection, immune response, cell-matrix adhesion, migration, invasion and metastasis of tumor cell. The aim of this study is to investigate a possible functional relationship between the cellular prion protein and etaloprotease-9, two proteins that are expressed in the same cell types and participate in the same physiopathological processes. In order to do that, we analysed MMP-9 expression and activity in PrPC wild type and knockout cells. A significant difference between the two cell lines in MMP-9 expression or gelatinolytic activity was not found. Then we analysed the effect of PrPC overexpression in MMP-9 secretion in HEK 293T cell. Our results suggest that MMP-9 activity is not altered by PrPC overexpression in HEK 293T cells. Finally, PRNP expression was silencied in MDA-MB-435 breast cancer cells with interfering RNA and the MMP-9 gene expression was analysed. Our data indicate that MMP-9 gene expression is not altered by PrPC encoding gene silencing in MDA-MB 435 tumor cells. In conclusion, in the experimental models used in his study, MMP-9 expression and gelatinolytic activity seems to be independent of PrPC.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-18Bitstream added on 2014-06-13T18:31:46Z : No. of bitstreams: 1 lima_pm_me_botfmvz.pdf: 842879 bytes, checksum: 6d83f475b744d68583fa0fe06786a4aa (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Universidade Estadual Paulista (UNESP) No presente trabalho foi feito uma análise qualitativa de cálcio, ferro e zinco em spots de proteínas de amostras de tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) por Fluorescência de Raios-X de Radiação Síncroton, após a separação das proteínas por Eletroforese Bidimensional em Gel de Poliacrilamida (2D-PAGE). Os espectros de fluorescência obtidos indicaram a presença de cálcio, ferro e zinco em doze, seis e oito spots protéicos das amostras de fígado, respectivamente. Os íons metálicos detectados nas amostras estão distribuídas principalmente em proteínas de massa molar menor que 45 kDa e com pI na faixa de 4,5 a 9,0. Além do cálcio, ferro e zinco foram detectados a presença de enxofre e fósforo, elementos não metálicos, que podem ser constituintes da estrutura das proteínas. As concentrações de cálcio, ferro e zinco ligados às proteínas foram determinadas por FAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos, encontrando-se concentrações na faixa de 1,08 a 5,80 mg g-1, 2,02 a 8,03 mm g-1 e 1,60 a 8,55 mg g-1, respectivamente An investigation was made into calcium, iron and zinc in protein spots in samples of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) liver tissue obtained after protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and subsequent qualitative and quantitative evaluation by synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and graphite furnace atomic absorption spectrometry (FAAS). An analysis of the fluorescence spectra indicated the presence of calcium, iron and zinc in twelve, six and eight liver protein spots, respectively. The metal ions found were distributed mainly in proteins with a molar mass of less than 40.00 kDa and more than 12.00 kDa, with pI in the range of 4.70 to 9.40. The only exception was a spot presenting protein with a molar mass of 10.10 kDa. In addition to calcium, iron and zinc, sulfur and phosphorus – which are non-metals that may be part of the protein structure, were also detected. After microwave-assisted acid mineralization of the proteins spots, a FAAS estimation of the concentration of calcium, iron and zinc bound to these proteins indicated a range of 1.08 to 5.80 mg g-1, 2.02 to 8.03 mg g-1 e 1.60 to 8.55 mg g-1, respectively

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-15Bitstream added on 2014-06-13T20:36:06Z : No. of bitstreams: 1 santos_fa_me_botfmvz.pdf: 1235942 bytes, checksum: 7b3f579b06b2874c741bde8ef170587e (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Universidade Estadual Paulista (UNESP) O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de manganês e zinco em “spots” protéicos de amostras de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE) para posterior avaliação qualitativa e quantitativa utilizando fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica em chama e em forno de grafite (FAAS/GFAAS). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de manganês e zinco em quatro e seis “spots” protéicos de plasma, respectivamente. Observou-se que os íons metálicos estão ligados em proteínas com massa molar na faixa de 19 a 70 kDa e com pI na faixa de 4,7 a 6,30. A concentração de manganês e zinco ligados a essas proteínas foi determinada por GFAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos, encontrandose concentrações na faixa de 3,40 a 4,20 mg g-1 e 2,30 a 13,90 mg g-1, respectivamente The aim of the present study was to investigate the presence of manganese and zinc in protein spots in samples of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) plasma obtained after protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and subsequent qualitative and quantitative determination by synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). An analysis of the fluorescence spectra indicated the presence of manganese and zinc in four and six plasma protein spots, respectively. It was observed that the metal ions are bound in proteins with molecular weight ranging from 19 to 70 kDa and pI ranging from 4.7 to 6.30. The manganese and zinc concentrations bound to these proteins were determined by GFAAS after acid digestion of protein spots, finding concentrations ranging from 3.40 to 4.20 mg g-1 and 2.30 to 13.90 mg g - 1, respectively

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T18:31:25Z : No. of bitstreams: 1 vilela_pgf_me_sjc.pdf: 389414 bytes, checksum: e94b74337996f5291f23f9666ba4f093 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP- 3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:09:51Z : No. of bitstreams: 1 laskoski_lm_me_jabo.pdf: 647030 bytes, checksum: 950b1f5d5358b98ef4e5d3a67333637b (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A laminite está associada a ativação inflamatória sistêmica, a qual ocorre em diversas afecções, principalmente as gastrointestinais. Sua patogenia este relacionada a ativação de metaloproteinases e degradação do colágeno e/ou hemidesmossomos. 0 objetivo deste estudo foi analisar alterações morfológicas, apoptose, metaloproteinases (MMP) 2 e 9 e infiltração leucocitária, pela pesquisa da lipocalina liberada por neutrófilos (NGAL), no tecido laminar de equinos submetidos a obstrução intestinal experimental. Os animais foram distribuídos nos grupos: controle (Gc), instrumentado (Gi), com procedimento de enterotomia sem obstrução; obstruído tratado com hidrocortisona (Gt) e obstruído não tratado (Gnt). 0 tecido laminar foi analisado pelas técnicas de microscopia em luz, imunohistoquímica e zimografia. Os animals dos grupos experimentais (Gi, Gt e Gnt) demonstraram alterações morfológicas, MMPs e substância formada pela M M P-9 e NGAL superiores aos resultados do Cc. A presença de apoptose não foi evidenciada pelo procedimento cirúrgico. 0 Gc não foi diferente quanto as alterações morfológicas quando comparado ao Gi, e também não diferiu do Gt em relação e MMP-9, principalmente associada a neutrófilos. Com estes resultados, conclui-se que: o modelo experimental pode causar alterações morfológicas associadas a laminite; a apoptose não participa da fase inicial de alterações laminares no córium laminar; a hidrocortisona pode ser utilizada para coibir os efeitos deletérios da ativação inflamatória associada a diversas doenças, sem comprometer o córium laminar. The laminitis is associated to systemic inflammatory activation that occur in several diseases, mainly gastrointestinal. The pathogeny of the laminitis is related to matrix metalloproteinases (MMPs) activation with collagen or hemidesmossomos degradation. The aim of this study is evaluated of the morphologic alterations, apoptosis, MMPs 2 and 9 and leukocyte infiltration, for research of MMP-9 related to neutrophil gelatinase associated to lipocalin (NGAL) in laminar corium of horses subjected to intestinal obstruction experimental. The animals were divided in groups: control (Cc), instrumented (Gi), with enterotomy without obstruction; obstruction treated by hydrocortisone (Gt) and without treatment (Gnt). The laminar tissue was analyzed by optical microscopy, immunohistochemistry and zymography. The animals showed morphologic alterations, MM Ps expression and MMP-9 associated to NGAL greater the Gc. The presence of apoptosis was not evidend by cirurgical procedure. However, the Gc was not different to Gi about morphologic alterations, and too Gt, about MMP-9, mainly the form conjugated to NGAL. The results indicate that the experimental model can cause morphologic alterations associated with laminitis. The apoptosis is not prerequisite for laminar lesion. The hydrocortisone can be administrated to reduce the deleterious effects of inflammatory activation in several diseases, without to affect the laminar corium.