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International audience; We report the complete genome sequences of Pudu puda papillomavi-rus 1 (PpudPV1) and Cervus elaphus papillomavirus 2 (CelaPV2), isolated from healthy skin hair follicles of a Southern pudu and a red deer, respectively. PpudPV1 is basal to the DyokappaPVs, whereas CelaPV2 is basal to the XiPVs (Beta-XiPV crown group).

International audience; We report the complete genome sequences of Rusa timorensis papillo-mavirus 1 (RtimPV1) and Rusa timorensis papillomavirus 2 (RtimPV2), isolated from hair follicles of asymptomatic skin from the same Timor deer specimen. RtimPV1 and RtimPV2 are evolutionarily only distantly related. RtimPV1 lacks a canonical E2-binding site, and RtimPV2 does not carry an E6 gene. T he genome of papillomaviruses (PVs) is a single double-stranded DNA (dsDNA) circular molecule of approximately 8 kbp, carrying genes involved in cell replication, viral replication, and viral encapsidation. Most PVs cause epithelial asymptomatic infections in amniotes and probably also in bony fishes, while some of them induce proliferative benign lesions and different cancers (1, 2). The Timor deer Rusa timorensis (de Blainvillee, 1822) is native to the island of Java and is classified as "vulnerable" by the International Union for Conservation of Nature (IUCN) Red List of Threatened Species (http://www.iucnredlist.org) (3). A biopsy specimen from asymptomatic skin (isolate IZW 39/08) was collected from a female deer, about 19 years old, living in captivity in a zoo in Berlin, Germany. The animal did not present papilloma-like lesions and was euthanized because of a severe internal infection that was unrelated to any PV infection. Total DNA was extracted from hair bulbs and PCR tested for the presence of PV DNA using broad-spectrum primers targeting the E1 and L1 genes (4). Using this partial information, we designed tail-to-tail primers to amplify the full-length genomes using long-range PCR, which were then Sanger sequenced in both strands through primer walking and cloned. Phylogenetic relationships for the E1E2, L2L1, and E1E2L2L1 gene concatenates were inferred under a maximum-likelihood framework (5). We retrieved two complete PV genomes from the same skin sample of the R. timorensis individual, here named Rusa timorensis papillomavirus 1 (RtimPV1) (isolate IZW 39/08) and Rusa timorensis papillomavirus 2 (RtimPV2) (isolate IZW 39/08). Both viral genomes display the standard features of PVs, with a long control region; the early genes E7, E1, and E2; and the late genes L2 and L1. Remarkably, RtimPV2 does not carry an E6 gene. This gene may have been lost independently in several PV lineages through time (6, 7). The RtimPV1 L1 gene displays maximum nucleotide similarity values around 65% with very divergent PVs, while RtimPV2 L1 displays identity values around 65% with divergent PVs in the 5= end, and only above 50% in the 3= end. Therefore, this criterion alone does not suffice for taxonomic assignment following the current rules (8), which need to be revised (7, 9). Phylogenetic reconstruction confidently places RtimPV1 as a sister lineage to Capra hircus papillomavirus 1 (ChPV1), isolated from healthy skin of a female goat (10), a Phipapillomavirus in the Beta Xi PV supergroup

1.1. Introducción Con el fin de averiguar las causas de las devastadoras epidemias de finales del siglo XIX, se llevaron a cabo diferentes estudios que dieron como resultado la identificación de unos nuevos agentes infecciosos, para los que se acuñó el nombre de “virus”. Desde entonces el descubrimiento de nuevos virus ha sido incesante, lo que llevó, en los años 70, a la creación de un organismo encargado de desarrollar, refinar y mantener la clasificación taxonómica de los virus, el Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV), en el seno de la Unión Internacional de Sociedades Microbiológicas (IUMS). En 2014 este organismo había reconocido 3.186 especies virales pertenecientes a 104 familias (http://www.ictvonline.org/virusTaxInfo.asp). Éstos están ampliamente extendidos en la naturaleza y son capaces de infectar a miembros de los tres dominios Eukarya, Bacteria y Archaea, además de ser capaces de infectar a otros virus. Más allá de la gran cantidad de virus humanos conocidos, estudios epidemiológicos sugieren que todavía quedan un gran número por descubrir (Relman 1999), que pueden estar contribuyendo no sólo a las enfermedades infecciosas clásicas, sino también a varios tipos de cánceres, trastornos autoinmunes, así como a enfermedades degenerativas (Dalton-Griffin and Kellam 2009). La primera descripción sobre los virus del papiloma (VP) pertenece a Richard Shope, quien en 1933 identificó el primer VP en verrugas cutáneas presentes en conejos (Shope and Hurst 1933). Sin embargo, no fue hasta dos años más tarde cuando Peyton Rous propuso que dichas verrugas eran en realidad tumores benignos (Rous and Beard 1935), lo que le mereció el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1966, por "su descubrimiento de virus inductores de tumores". Sin embargo, el interés sobre los VPs no creció hasta mediados de los años 70. Por aquel entonces se pensaba que el virus del herpes podría estar relacionado con el desarrollo del cáncer de cuello de útero, sin embargo, en 1974 Harald zur Hausen postuló que los VPs podrían estar también involucrados en este tipo de cáncer (zur Hausen 1977), lo que le llevó a obtener el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2008, por "su descubrimiento del virus del papiloma humano como causa de cáncer". Estudios posteriores, además, demostraron que la infección por virus del papiloma humano (VPH) es una causa necesaria para el desarrollo de casi todos los casos de cáncer de cuello de útero (Smith et al. 2007; Bosch et al. 2008). Además, estos virus también están involucrados en otros cánceres anogenitales, tales como el cáncer de vulva, con una prevalencia estimada del 40-65% (Insinga et al. 2008; De Vuyst et al. 2009); el cáncer de vagina con una prevalencia estimada del 70-81% (Ferreira et al. 2008; De Vuyst et al. 2009); el cáncer de pene, con un 29-47% de prevalencia (Lont et al. 2006; Backes et al. 2009; Miralles-Guri et al. 2009); el cáncer de ano, con una prevalencia del 84,3-88,3% (De Vuyst et al. 2009; Alemany et al. 2015); al igual que se ha constatado su presencia en cánceres del tracto digestivo superior, como son los de la cavidad oral, la orofaringe y la laringe, con prevalencias de 4,4%, 22,4% y 3,5%, respectivamente (Castellsague et al. 2016). Desde entonces, debido a la importancia de los VPHs en la salud humana, más de 200 tipos diferentes de VPHs han sido aislados y completamente secuenciados a partir de muestras humanas (PAVE: base de datos de genomas de papilomavirus; https://pave.niaid.nih.gov/). Sin embargo, solo una pequeña proporción de estos VPHs están relacionados con estos tipos de cáncer, siendo el VPH16 el que presenta una mayor prevalencia en todos ellos. Mientras que otros VPHs son responsables de papilomas cutáneos, tales como las verrugas comunes, y el resto, se asocian con infecciones asintomáticas y se detectan en tejido sano tanto de piel como de mucosa (Nindl et al. 2007; Gottschling et al. 2009; Bruni et al. 2010; Ekstrom et al. 2010; Bottalico et al. 2011). A pesar de que el estudio de los VPs se ha centrado fundamentalmente en aquellos que infectan a humanos, se han descrito también infecciones por estos virus en otras muchas especies animales. Las cuales, al igual que los humanos son capaces de albergar a un gran número VPs diferentes. Este es el caso de los perros, el ganado vacuno, los macacos, o los caballos de los que se han aislado respectivamente 16, 15, 11 y 7 VPs diferentes. (PAVE: base de datos de genomas de papilomavirus; https://pave.niaid.nih.gov/). La mayoría de los hospedadores conocidos son mamíferos, pero también se han encontrado VPs en tortugas, aves y serpientes, pudiéndose encontrar tanto en piel como en mucosa sanas, así como en diferentes tipos de lesiones tanto benignas como malignas. Una publicación reciente (Lopez-Bueno et al. 2016), ha descrito a un nuevo virus aislado de la dorada Sparus aurata, que posee un genoma con la misma estructura que los genomas de VPs, lo que lleva a suponer que el rango de hospedadores de estos virus aún podría ser mayor. Los VPs son virus de DNA circular, bicatenario, de aproximadamente 8000 pares de bases, carentes de envoltura, cuya cápside es de simetría icosaédrica de un diámetro aproximado de 52-55nm. Posee ocho marcos abiertos de lectura (ORF) codificados en la misma dirección y en la misma hebra, organizándose en dos grupos de genes funcionales. Al primer grupo se le ha denominado como "genes tempranos" y se compone de los genes E6 y E7 (involucrados en la desestabilización inicial de la célula hospedadora) (Roman and Munger 2013; Vande Pol and Klingelhutz 2013), de los genes E1 y E2 (implicados en la replicación del genoma) (Bergvall et al. 2013; McBride 2013), del gen E4 (que participa en la interacción con el citoesqueleto celular) (Doorbar 2013), y del gen E5 (implicado en la evasión del sistema inmune, la prevención de la apoptosis, y de la respuesta a factores de crecimiento) (DiMaio and Petti 2013). Los genes E6, E7 y E5 no están presentes en todos los VPs, algunos poseen el gen E6 pero no el E7 (Stevens et al. 2008a; Stevens et al. 2008b; Gottschling et al. 2011a) y viceversa, algunos VPs poseen E7 pero no E6 (Ahola et al. 1986; Chen et al. 2007; Nobre et al. 2009). Por otro lado, el gen E5 se encuentra en VPs pertenecientes a los géneros Alfa y Delta, pero no en VPs de otros géneros. Debido a su papel en la interrupción del ciclo celular de la célula huésped, mediante la interacción con proteínas supresoras de tumor en las capas superiores del epitelio, estos tres genes son conocidos como oncogenes en VPs involucrados en cáncer. El segundo grupo de genes son los llamados "genes tardíos" y está compuesto por los genes L2 y L1, que codifican las proteínas de la cápside (Buck et al. 2013; Wang and Roden 2013). Además, el genoma presenta una región reguladora aguas arriba (URR), que alberga a los sitios de unión de los factores de transcripción (TBFs). De todos estos genes, solo cuatro de ellos, E1, E2, L2 y L1 están presentes en todos los VPs. Teóricamente, las proteínas que éstos codifican, junto con la maquinaria de replicación de la célula huésped, podrían ser suficientes para la replicación y encapsidación del ADN viral (Garcia-Vallve et al. 2006). Se piensa que la tasa de evolución de los VPs es lenta en comparación con otros muchos virus. Se estima que ésta es de 2x10-8-5x10-9 substituciones por sitio por año en zonas codificantes (Rector et al. 2007; Shah et al. 2010), mientras que esta tasa es aproximadamente el doble en regiones no codificantes (Ong et al. 1993; Garcia-Vallve et al. 2006). Estas bajas tasas de substitución probablemente son debido a la naturaleza del ADN genómico, que al ser de doble cadena es genéticamente más estable, así como a la alta fidelidad con la que este ADN es replicado, gracias a la utilización de la maquinaria de replicación del ADN de la célula hospedadora. Además, la introducción de mutaciones por este proceso puede ser corregida por la capacidad de corrección de errores que posee la ADN polimerasa, así como por otros enzimas celulares (Gago et al. 2009). Otra posible explicación que se baraja a esta baja tasa de susbstitución presente en los virus de ADN bicatenario, es el supuesto de que estos virus han co-evolucionado con sus hospedadores durante millones de años (Duffy et al. 2008). De hecho, la co-evolución es el mecanismo de evolución más ampliamente reconocido en estos virus (Moreira and Lopez-Garcia 2009; Sharp and Simmonds 2011; Tao et al. 2013). Esto es debido a la observación de que ciertos virus sólo generan infecciones productivas en su hospedador natural, pero no en otros hospedadores. Esta hipótesis sigue siendo, hoy en día, muy común en los VPs (Rector et al. 2007). Para que ésta fuera cierta, las topologías de las filogenias de los hospedadores y de los VPs deberían ser congruentes (regla de Fahrenholz (Fahrenholz 1913)). Sin embargo, tal congruencia no se observa y la co-evolución entre VP y hospedador solo puede explicar un tercio de todos los eventos necesarios para reconciliar las filogenias de los VPs con la de sus hospedadores (Gottschling et al. 2011b). Otros mecanismos que pueden estar implicados en la evolución de los VPs son la radiación adaptativa, la colonización de nuevos nichos dentro de un mismo hospedador, el salto de hospedador -completo o incompleto-, la pérdida de linajes virales durante la especiación de los hospedadores, la duplicación de linajes víricos dentro de una misma especie hospedadora o la especiación incompleta (Gottschling et al. 2007). Los eventos de recombinación también pueden haber jugado un papel importante, habiendo sido descritos previamente en la familia Papillomaviridae, tanto entre géneros (Gottschling et al. 2011a; Robles-Sikisaka et al. 2012), como intragénero (Bravo and Alonso 2004; Narechania et al. 2005; Carvajal-Rodriguez 2008), así como entre variantes (Jiang et al. 2009). Además, también se han descrito genomas virales derivados de la recombinación de virus que pertenecen a diferentes familias. Este es el caso de los virus quiméricos recuperados del bandicoot Perameles bougainville, que presentan los genes transformantes de los poliomavirus y los genes de la cápside de los VPs (Woolford et al. 2007). Los VPs son normalmente específicos de especie, pero se conocen varias excepciones. El caso más notable es el Bovine papillomavirus 1 (VPB1). En su huésped natural, el ganado vacuno, el VPB1 induce grandes verrugas cutáneas (Chen et al. 1982). Sin embargo, este virus también puede infectar a otros animales filogenéticamente muy distantes de los bovinos, tales como caballos (Amtmann et al. 1980), burros (Nasir et al. 1997), cebras (van Dyk et al. 2009), jirafas (van Dyk et al. 2011), tapires (Kidney and Berrocal 2008), y búfalos (Silvestre et al. 2009). El salto de hospedador puede liberar al virus de presiones selectivas presentes en el hospedador original, dando lugar a cambios en la temporalización y la agresividad de la infección. Es por ello, que la infección por VPB1 en jirafas y búfalos es más agresiva que en ganado, mientras que en caballos puede dar lugar al desarrollo de unos tumores benignos conocidos como sarcoides (Lancaster et al. 1977; Nasir and Reid 1999). En el caso de los caballos, aunque la vida de los animales infectados no se ve amenazada, la falta de eficacia del tratamiento, la disfuncionalidad que causan los sarcoides, la multiplicidad en la aparición de nuevos sarcoides o la carga económica que conlleva el cuidado de estos caballos, llevan a la necesidad de recurrir a la eutanasia o al sacrificio de dichos caballos, con las consiguientes pérdidas económicas asociadas. El modo por el que se contagian los caballos con este virus es desconocido, puede que sea por contacto directo con el ganado (Jackson 1936) o por contagio indirecto, a través de cuidadores o fómites (Antonsson and Hansson 2002). Sin embargo, el VPB1 también ha sido detectado en un 30% de caballos sanos sin contacto previo con animales infectados (Bogaert et al. 2008), con lo que el contagio puede también darse a través de moscas u otros insectos que actúen como vehículos de transmisión (Voss 1969; Reid et al. 1994; Torronttegui and Reid 1994; Pascoe and Knottenbelt 1999). De hecho se ha demostrado la presencia de VPB1 y/o VPB2 en las moscas Musca autumnalis, las cuales infestan los sarcoides de los caballos (Kemp-Symonds 2000), así como en las moscas Fannia canicularis y Stomoxys calcitrans (Finlay et al. 2009). Sin embargo, actualmente no poseemos ninguna información sobre la dinámica del sistema virus-vector-hospedador, así como tampoco conocemos si determinados insectos pueden actuar como vectores de transmisión de VP en humanos. 1.2. Objetivos A pesar de los importantes avances alcanzados tanto en biología básica como médica, nuestra comprensión sobre el origen y la evolución de los VPs todavía carece de una base científica sólida. La opinión popular sobre los VPs asume que estos virus son evolutivamente estáticos y que divergen tan lentamente que no es necesario integrar su evolución en modelos biológicos, médicos o epidemiológicos. Sin embargo, la visión antropocéntrica actual que se tiene sobre los VPs ignora el origen común que existe entre algunos VPHs y otros PVs que corresponden a otras especies animales, lo que podría resultar en una pérdida de oportunidades para la investigación médica. Ahora bien, si fueramos capaces de explicar y comprender cómo han evolucionado los VPs y poder inferir sobre sus propiedades ancestrales, entonces podríamos ser capaces de dilucidar el camino que va desde el genotipo hasta el fenotipo. De esta manera podríamos explicar las diferencias existentes entre los VPs que infectan mucosa de los que infectan tejido cutáneo, así como saber qué es lo que hace a un VP oncogénico diferente de uno que no lo es (Bravo and Alonso 2006). Se han aislado y secuenciado los VPs de aproximadamente 68 especies hospedadoras diferentes. Entre las especies más estudiadas se incluyen a los humanos y a las especies de interés humano, tales como los animales domésticos. Sin embargo, se considera probable que todas las especies dentro de Amniota pueden albergar sus propios VPs. Este clado se compone de 2611 especies, por lo tanto, menos del 3% de las especies potencialmente hospedadoras han sido sometidas a estudio. El principal objetivo de este proyecto es aumentar nuestro conocimiento sobre la diversidad de los VPs, su taxonomía y la historia natural de su infección. Para abordar este objetivo, es fundamental identificar nuevos VPs que infecten a hospedadores no humanos, tanto de lesiones como de tejido sano y dilucidar las relaciones evolutivas dentro de la familia Papillomaviridae. De este modo, las nuevas secuencias obtenidas ayudarán a refinar el análisis de elementos estructurales conservados (con especial relevancia para aquellos VPs con un alto riesgo de transformación maligna) y por lo tanto, proporcionarán nuevas claves para el diseño de vacunas de segunda generación. Los objetivos específicos de esta tesis son: Objetivo 1: ampliar sustancialmente nuestro conocimiento sobre la diversidad de los VPs, con un enfoque en muestras no humanas, • recolectar muestras de individuos de un amplio rango de nuevos hospedadores. • aislar, amplificar, clonar y secuenciar el ADN de los nuevos VPs. Objetivo 2: ampliar sustancialmente nuestro conocimiento sobre la evolución de los VPs, • detectar y describir grupos de VPs estrechamente relacionados. • correlacionar la distribución de los VPs y sus hospedadores correspondientes. Objetivo 3: profundizar en el estudio de la incongruencia entre los árboles filogenéticos realizados a partir de genes individuales, • identificar genes homólogos adecuados para la inferencia filogenética. • aplicar esta nueva metodología al estudio de la evolución y la diversidad de otros virus. 1.3. Metodología Más de 270 muestras de ADN fueron recogidas de más de 100 especies de vertebrados no humanos. Estas muestras tenían diferentes orígenes. Mientras que la mayoría pertenecían a animales que procedían de diferentes parques zoológicos de Berlín y Heidelberg (Alemania), otras muestras procedían de otros lugares. Las muestras de cetáceos procedían de Londres (Reino Unido) y Lima (Perú), las muestras de focas antárticas de Bremerhaven (Alemania) y diversas muestras de rebeco de Aosta (Italia). Las muestras comprendían folículos pilosos y biopsias, tanto de piel sana como de lesiones. El ADN de todas las muestras se aisló en un laboratorio, mientras que el resto de procedimientos posteriores fueron realizados en otro laboratorio, con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Cabe destacar que en ambos laboratorios, todas las manipulaciones de pre y post-PCR se llevaron a cabo en salas y campanas diferentes para minimizar la contaminación entre muestras y amplicones. Para amplificar los genomas completos de los VPs, las muestras fueron enriquecidas en ADN viral mediante la metodología de replicación por círculo rodante (RCA) (Rector et al. 2004). Para testar la presencia de VP en una muestra dada, fueron utilizados los cebadores universales FAP59/FAP64 (Forslund et al. 1999), y CP4/CP5 (Iftner et al. 2003) utilizando como molde el producto de la RCA. Los amplicones así obtenidos fueron secuenciados con el método de Sanger y las secuencias fueron comparadas con una base de datos no-redundante, con el fin de determinar que esas secuencias no eran conocidas previamente. Por la corta longitud de las secuencias obtenidas, de alrededor de 500 pb, su posición taxonómica fue determinada introduciendo estas nuevas secuencias parciales en una filogenia bien resuelta que fue utilizada como árbol de referencia. Posteriormente, el genoma completo de algunos de estos nuevos VPs fue aislado y completamente secuenciado. Para ello se realizó una PCR larga con cebadores específicos inversos, capaces de amplificar el genoma viral completo en un único fragmento. Posteriormente, ambas hebras fueron secuenciadas por Sanger mediante paseo con cebador. En todos los casos, los genomas completos fueron clonados con el fin de almacenar y mantener el genoma viral. Los ORFs fueron anotados para cada VP secuenciado, y los posibles TBFS fueron identificados. Posteriormente, fueron llevados a cabo análisis estadísticos con el fin de agrupar a los VPs según sus motivos conservados y para analizar si esta agrupación era debida a ciertas características de los VPs tales como su taxonomía, su presentación clínica, su localización anatómica en el hospedador, la especie animal a la que infectan o incluso la familia a la que pertenecen sus hospedadores. Los nuevos VPs fueron clasificados dentro de la familia Papillomaviridae en géneros, especies, tipos, subtipos, o variantes, de acuerdo con el porcentaje de identidad de la secuencia en nucleótidos del gen más conservado, el gen L1. Siguiendo este criterio, diferentes géneros comparten menos del 60% de identidad, diferentes especies de un mismo género comparten entre el 60% y el 70%, diferentes tipos de una misma especie comparten entre el 71% y el 89%, mientras que los subtipos comparten entre el 90% y el 98% y las variantes comparten más del 98% de identidad. Posteriormente, se realizaron reconstrucciones filogenéticas con el fin de encontrar los VPs más cercanos. Al igual que buscamos reconciliar las filogenias de los VPs con las de sus hospedadores, con el fin de evaluar la co-evolución como mecanismo principal de la evolución de los VPs. Debido a que la reconstrucción filogenética de los VPs varía en función del gen utilizado para inferir las relaciones evolutivas, se abordó la necesidad de identificar aquellos genes que comparten historias evolutivas similares. Con este propósito diseñamos un método para identificar grupos de genes que comparten historias evolutivas similares, basados en una técnica de escalado multidimensional, en la que se ven implicadas once variables que describen las relaciones filogenéticas de los genes y sus presiones evolutivas. Estas variables están obtenidas a partir de las topologías y las longitudes de las ramas de las filogenias, teniendo en cuenta la contribución relativa de la segunda y la tercera posición de los codones a la longitud total del árbol; la congruencia entre las topologías y longitud de las ramas de las reconstrucciones filogenéticas; las presiones de selección que actúan sobre cada uno de los nucleótidos de los genes; y la comparación entre los genes de las distancias que hay entre los diferentes taxones. Este método fue aplicado a dos conjuntos de virus diferentes con el fin de ilustrar la aplicabilidad de nuestro método. Estos dos conjuntos virales fueron, por un lado los VPs y por otro lado los virus del mosaico del nabo (TuMV). Ambos conjuntos de virus son diferentes tanto en la organización de su genoma, como en su distancia evolutiva y su biología. Los TuMV son una de las 100 especies del género Potyvirus perteneciente a la familia más grande de virus que infectan plantas, la familia Potyviridae. Los TuMV están distribuidos por todo el mundo y se transmiten a través de la savia por muchas especies de áfidos a una amplia gama de especies de brassicas, tanto silvestres como cultivadas. Los TuMV divergieron hace aproximadamente 1000 años de unos virus que infectan orquídeas. Estos dos virus, junto con otros cinco más forman el grupo TuMV. De todos ellos sólo el TuMV es capaz de infectar a las dicotiledóneas en la naturaleza (Gibbs et al. 2015). Los TuMV tienen un genoma de ARN monocatenario positivo de alrededor de 10 kb de longitud, que codifica un único ORF, el cual es traducido en una única poliproteína, que autocatalíticamente se corta en diez proteínas maduras. 1.4. Resultados y discusión En la presente tesis presentamos el mayor estudio dedicado a la exploración de la diversidad de nuevos VPs que infectan a especies animales. El cual ha dado lugar a la publicación de cinco artículos originales y la elaboración del manuscrito de un sexto, de los cuales la doctoranda es primera autora de cinco de ellos. En este proyecto, fueron testadas cerca de 300 muestras procedentes de 102 especies hospedadoras, cubriendo un total de 40 familias de mamíferos pertenecientes a 18 órdenes. Las muestras fueron obtenidas tanto de lesiones como de tejido sano, procedentes de animales que viven alrededor de todo el mundo, tanto en cautividad como en libertad. A partir de estas muestras aislamos, secuenciamos y clonamos el genoma completo de siete nuevos VPs, de animales de los que todavía no se había comunicado la presencia de ningún VP. De este modo aumentamos a 73, el número total de especies hospedadoras conocidas hasta la fecha. Así como también aislamos secuencias parciales de, posiblemente, otros cinco nuevos VPs, a partir de muestras de chimpancé, coatí, marsopa, pudú y burro. Los siete genomas virales comunicados en esta tesis fueron obtenidos de especies hospedadoras, en su mayoría, pertenecientes al clado Cetartiodactyla, aunque también encontramos VPs en un carnívoro y en un quiróptero (Garcia-Perez et al. 2013). Estos nuevos genomas virales presentaron la estructura clásica de los VPs y recibieron su nombre de acuerdo a la especie hospedadora de la que fueron aislados. De este modo, los VPs obtenidos a partir de las muestras de cetartiodáctilos fueron nombrados como sigue: Cervus elaphus papilomavirus tipo 2, CelaVP2; Pudu puda papilomavirus tipo 1, PpudVP1; Rupicapra rupicapra papilomavirus tipo 1, RrupVP1; Rusa (Cervus) timorensis papilomavirus tipo 1, RtimVP1, y R. (Cervus) timorensis papilomavirus tipo 2, RtimVP2. El VP obtenido a partir de una muestra de carnívoro fue nombrado Vulpes vulpes papilomavirus tipo 1, VvulVP1. Mientras que el obtenido del quiróptero recibió el nombre de Eidolon helvum papilomavirus tipo 1, EhelVP1. Tras los análisis realizados, observamos que cinco de los siete nuevos VPs pertenecen a géneros no descritos con anterioridad o a géneros de los que, previamente, sólo se conoce un único VP. De hecho, hemos observado que los VPs aislados de muestras animales, muy frecuentemente nos dan a conocer nuevos géneros virales que no conocíamos con anterioridad. Así pues, nos encontramos con 26 géneros que solo cuentan con un VP, tres que solo contienen dos VPs y cuatro que solo contienen tres VPs, todos ellos aislados de muestras no humanas. A la vista de esto, podemos claramente concluir que algunos géneros dentro de la familia Papillomaviridae todavía están poco estudiados, al igual que todavía hay géneros que nos quedan por descubrir. Además, de manera más particular, también mostramos que los VPs extraídos de animales de la familia Cervidae (Cetartiodactyla) pertenecen a seis géneros y no a uno solo como se creía hasta ahora. Los análisis filogenéticos presentados en esta tesis no apoyan algunos supuestos sobre la evolución de los VPs, tales como la históricamente asumida co-evolución VP-hospedador (Rector et al. 2007), ya que la reconstrucción filogenética de los VPs aislados de cetartiodáctilos no muestra correlación con la reconstrucción filogenética de las especies hospedadoras correspondientes (Gottschling et al. 2011a; Robles-Sikisaka et al. 2012; Mengual-Chulia et al. 2014). Lo mismo ocurre con los VPs aislados de quirópteros y sus hospedadores (Garcia-Perez et al. 2014). Del mismo modo, cabe destacar la posición filogenética inferida para el VvulVP1. Este VP, aislado de una muestra de un zorro, pertenece a un género compuesto exclusivamente de VPs aislados de humanos, y sin embargo, no está vinculado a ninguno de los otros 32 VPs aislados de otros carnívoros. Dado que la mayoría de los VPs comunicados en esta tesis doctoral se aislaron a partir de cetartiodáctilos, actualmente estamos realizando estudios adicionales sobre estos VPs. Hemos estado explorando la asociación existente entre la presencia de motivos conservados en el genoma viral con la taxonomía de los VPs, la presentación clínica de su infección y la especie hospedadora a la que infectan. Hemos observado que cada VP presenta su propio repertorio de motivos en la URR. Sin embargo, cierto grado de inercia filogenética genera que los VPs estrechamente relacionados muestren repertorios de motivos similares. Además, hemos podido observar que VPs que infectan a las mismas especies hospedadoras tienden también a compartir un mayor número de motivos conservados. Resultados similares han sido comunicados en un estudio centrado en TBFS localizados en la URR de un grupo seleccionado de VPs, en el que concluyen que la presencia/ausencia de motivos podría servir para diferenciar entre VPs que infectan a primates de aquellos que infectan a otros animales, así como para diferenciar entre VPs pertenecientes a diferentes géneros (Garcia-Vallve et al. 2006). En el caso que nos concierne, hemos detectado una correlación significativa entre las variables elegidas para explicar la presencia/ausencia de los motivos conservados en los VPs de cetartiodáctilos. Con lo que hemos restringido nuestro análisis a dos variables no correlacionadas, que reflejan los rasgos centrales de la biología del virus, principalmente la presentación de la infección y el hospedador. Es comúnmente sabido que los diferentes genes que componen un único genoma no tienen porqué compartir historias evolutivas comunes, tanto sea un genoma eucariótico, como uno bacteriano. Lo mismo ocurre con los genomas virales y sus genes (Chen et al. 2009; Briddon et al. 2010). Por esta razón, la reconstrucción filogenética de los VPs no podría haberse realizado sin un previo análisis exhaustivo de la historia evolutiva de los diferentes genes que componen el genoma de estos virus. Con este propósito diferentes métodos han sido ya descritos. Sin embargo, la mayoría de ellos se centran en una sola característica de los genes. Por esta razón, hemos explorado una nueva estrategia que tenga en cuenta, no una, sino, múltiples características. De este modo hemos desarrollado y descrito un enfoque sistemático que combina once variables que recapitulan información sobre las relaciones filogenéticas y las presiones evolutivas de los diferentes genes. Usando este método hemos sido capaces de identificar dos grupos de genes en VP que comparten historias evolutivas similares. Uno de estos grupos fueron seleccionados para inferir la relación filogenética de la familia Papillomaviridae presentada en esta tesis. Pero además, este método nos proporciona información adicional de gran utilidad. Por ejemplo, desde un punto de vista evolutivo, podemos recuperar los datos funcionales acumulados sobre los virus bien caracterizados, como es el caso de los VPs. Los grupos de genes identificados en VP con esta metodología, son consistentes con la hipótesis que sugiere que un proto-VP fue compuesto por los genes implicados en la replicación del genoma y su encapsidación, mientras que los oncogenes fueron incorporados más tarde, dotando al virus de unas capacidades de transformación que son prescindibles (Garcia-Vallve et al. 2005). Otra gran utilidad de este método reside en el estudio de virus menos conocidos. Con él podemos desentrañar características desconocidas de la historia evolutiva de los genes, probablemente relacionadas con las funciones de las proteínas y de este modo crear hipótesis plausibles a cerca de la evolución de estos virus. Con el fin de probar la utilidad de este método en este propósito, nos dispusimos a trabajar con TuMV. El conocimiento de la biología de este virus es moderado y las funciones de sus proteínas están bien descritas para algunas, pero no para otras. Los resultados que obtuvimos dieron paso a la generación de dos nuevas hipótesis sobre la evolución de los TuMVs y las interacciones entre sus genes. La primera hipótesis sugiere que el orden de los genes podría guiar la historia evolutiva, mientras que la segunda hipótesis sugiere que la historia evolutiva podría ser la responsable del orden de los genes. Además, este método podría aplicarse también al estudio de otros organismos tales como las bacterias, con el fin de identificar grupos de genes con patrones evolutivos similares dentro del core del genoma. Debido a sus múltiples usos, la estrategia propuesta en esta tesis para distinguir historias evolutivas comunes entre los genes, abre perspectivas para la generación de hipótesis evolutivas y funcionales. Dada la importancia clínica de los VPs en salud pública, se han aplicado estudios de biología comparativa en VPs que infectan a humanos, prestando especial interés en identificar las diferencias entre aquellos VPHs capaces de producir cáncer de aquellos que no lo son. Los VPHs pertenecen a diferentes géneros filogenéticamente alejados y la comparación entre ellos puede ser altamente informativa, ya que podría sugerir eventos de evolución convergente (Garcia-Vallve et al. 2006). Sin embargo, no debemos confundir evolución convergente con evolución divergente, y no podemos ignorar el hecho de que los diferentes géneros de VPs que infectan a humanos son polifiléticos. Además, por ejemplo, los VPHs causantes del cáncer de cuello uterino no son monofiléticos, algunos de ellos están más próximos a otros VPs que infectan a otros primates (Chen et al. 2009). Por tanto, la praxis de representar y analizar exclusivamente los VPs que infectan a humanos genera una impresión poco realista de monofilia (Schiffman et al. 2009). Esta diversidad de VPs no es exclusiva de humanos, otras especies animales albergan VPs filogenéticamente muy alejados, que pueden causar diferentes manifestaciones clínicas en los animales que infectan. Los VPs que infectan a los cetartiodáctilos son un buen ejemplo de ello, siendo los más conocidos los VPs que infectan a los bóvidos. El ganado vacuno es hospedador de al menos 15 VPs pertenecientes a diferentes géneros, aislados tanto de lesiones como de tejido sano, tanto de piel como de mucosa. Ejemplos similares se encuentran en otros animales tales como caballos, perros y macacos, entre otros. En conclusión, los resultados comunicados en esta tesis doctoral apoyan la idea de que, dada la importancia clínica de los VPs, una buena clasificación debería ser informativa y útil tanto para los clínicos como para los investigadores de ciencias básicas. Tratar de entender los paralelismos de aquellos VPs que están próximos filogenéticamente, tanto hayan sido aislados de humanos como de animales, podría ayudar a dilucidar el camino que va desde el genotipo viral al fenotipo, lo que podría guiar la investigación biomédica o incluso podría ayudar a identificar modelos animales adecuados (Borzacchiello et al. 2009). Sólo una percepción integradora podría arrojar luz sobre lo que hace a un VP susceptible de causar cáncer, mientras que otros se limitan a producir transformaciones benignas y otros muchos a no causar lesiones. 1.5. Conclusiones 1. En esta tesis doctoral se comunican los genomas completos de siete nuevos VPs, así como las secuencias parciales de otros cinco, probablemente nuevos VPs. Éstos han sido los primeros VPs aislados y secuenciados completamente de sus respectivas especies hospedadoras, en los siguientes clados: Cetartiodactyla, Carnivora y Chiroptera. 2. El estudio de la diversidad en la familia Papillomaviridae requiere todavía de una gran atención. La identificación de nuevos VPs nos proporciona, continuamente, el conocimiento de nuevos géneros, de los que en su mayoría seguimos conociendo tan solo un único VP. En este sentido, en esta tesis ampliamos considerablemente el número de géneros conocidos, capaces de infectar a la familia Cervidae (Cetartiodactyla). 3. Los resultados aquí comunicados no son compatibles con la históricamente asumida co-evolución VP-hospedador, ya que VPs muy divergentes son capaces de infectar a hospedadores estrechamente relacionados, del mismo modo, que VPs filogenéticamente muy próximos son capaces de infectar a hospedadores muy alejados. Por lo tanto, otros mecanismos evolutivos pueden, también, haber contribuido en la evolución de los VPs, tales como la radiación adaptativa, la colonización de nuevos nichos dentro de un mismo hospedador, el salto de hospedador -completo o incompleto-, la pérdida de linajes virales durante la especiación de los hospedadores, la duplicación de linajes víricos dentro de una misma especie hospedadora, la especiación incompleta, así como eventos de recombinación. 4. Tanto aquellos VPs filogenéticamente cercanos, como aquellos que infectan a la misma especie hospedadora de la familia Cetartiodactyla muestran repertorios de motivos reguladores similares. 5. En esta tesis describimos un nuevo método para identificar grupos de genes que comparten historias evolutivas similares. Este método es capaz de recuperar, desde un punto de vista evolutivo, los datos funcionales acumulados sobre los virus bien caracterizados y permite proponer hipótesis evolutivas acerca de los genes de virus menos estudiados.