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Resumen del trabajo presentado en el XXVIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Microbiología, celebrado de forma virtual del 28 de junio al 2 de julio de 2021, Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más importante en los hospitales. Puede producir infecciones graves y resistir a la mayoría de los antibióticos. Además, reside de manera asintomática en el 20-30% de la población, desde donde es capaz de contaminar diversos fómites y diseminarse a otros individuos. Su capacidad para sobrevivir en el ambiente favorece estas reinfecciones, acrecentando el riesgo para la salud pública cuando se trata de cepas multiresistentes. Los mecanismos necesarios para la adaptación de la bacteria cuando escapa del hospedador al ambiente son prácticamente desconocidos. En este estudio, descubrimos dos termosensores de RNA parálogos que controlan la producción de dos de las tres proteínas del “cold-shock” (CSPs) de S. aureus, CspB y CspC. Demostramos que las 5’UTR de cspB y cspC son capaces de adoptar estructuras alternativas en función de la temperatura. En el ambiente (22ºC), las 5’UTRs adoptan una estructura que facilita la traducción (conformación-ON), mientras que en el hospedador (37ºC), se forma una estructura alternativa que bloquea la RBS, inhibiendo la traducción (ConformaciónOFF). Esta inhibición requiere de la CSP restante, CspA, que reconoce un motivo rico en uridinas para evitar la formación de la conformación-ON, liberar la secuencia anti-RBS y formar de manera estable la conformación-OFF. Mutaciones dirigidas que bloquean ambas 5’UTRs en conformaciónOFF impiden el crecimiento de S. aureus a temperatura ambiente. Este estudio pone en evidencia la importancia de la termorregulación mediada por RNAs para la supervivencia de S. aureus fuera de su hospedador, lo que puede contribuir a su transmisión., ERC Consolidator Grant (European Research Council), Ref. ERC-CoG-2014-646869 Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación, Ref PID2019-105216GB-I00

Resumen del trabajo presentado en el World Microbe Forum. ASM-FEMS Congress, celebrado online del 20 al 24 de junio de 2021, Adaptation to the ever-changing environmental conditions and survival outside the host is crucial for dissemination and transmission of pathogenic bacteria. Staphylococcus aureus may be spread from human carriers to diverse environments and survive outside the host for long periods of time. This capacity has been linked to reinfections in addition to new host colonisations. One of the main variables that bacteria need to face when leaving the host is a shift in temperature. However, the mechanisms governing cold adaptation during this transition remain poorly understood. In this study, we found that two paralogous RNA-thermoswitches controlled the production of cold-shock proteins CspB and CspC in S. aureus. We demonstrated that the cspB and cspC 5’UTRs adopt alternative RNA structures that shift from one another upon temperature changes. These RNA structures resembled the thermo-responsive elements recently described in E. coli and L. monocytogenes. One of the conformations facilitated mRNA translation at ambient temperatures (22ºC) while the other folded into a double stranded RNA structure at host-related temperatures (37ºC) that blocked the ribosome binding site (RBS). We found that the structural rearrangements depended on a long RNA hairpin that sequestered the anti-RBS sequence depending on the environmental temperature. At the same time, the remaining S. aureus CSP, CspA, recognised a UUUGUUU motif located in this long hairpin. Such interaction favoured the release of the anti-RBS sequence and, as a result, repressed the CspB and CspC production at 37ºC. In addition, when both RNA-thermoswitches were simultaneously deleted, S. aureus growth was inhibited at ambient temperatures. All in all, our [ndings highlight the importance of CspB/CspC thermoregulation when S. aureus transitions from the host to the environment.

Bacterial messenger RNAs (mRNAs) are composed of 5′ and 3′ untranslated regions (UTRs) that flank the coding sequences (CDSs). In eukaryotes, 3′UTRs play key roles in post-transcriptional regulatory mechanisms. Shortening or deregulation of these regions is associated with diseases such as cancer and metabolic disorders. Comparatively, little is known about the functions of 3′UTRs in bacteria. Over the past few years, 3′UTRs have emerged as important players in the regulation of relevant bacterial processes such as virulence, iron metabolism, and biofilm formation. This MiniReview is an update for the different 3′UTR-mediated mechanisms that regulate gene expression in bacteria. Some of these include 3′UTRs that interact with the 5′UTR of the same transcript to modulate translation, 3′UTRs that are targeted by specific ribonucleases, RNA-binding proteins and small RNAs (sRNAs), and 3′UTRs that act as reservoirs of trans-acting sRNAs, among others. In addition, recent findings regarding a differential evolution of bacterial 3′UTRs and its impact in the species-specific expression of orthologous genes are also discussed. This work was supported by the European Research Council (ERC) under the European Union's Horizon 2020 research and innovation program (Grant Agreement No. ERC-CoG-2014-646869) and the Spanish Ministry of Science and Innovation grant (PID2019-105216GB-I00).

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad Pública de Navarra.--2020-08-11.--Sobresaliente Cum Laude, [ES] Una molécula de RNA mensajero (mRNA) está compuesta por una región codificante (CDS) flanqueada por dos regiones no traducidas (UTRs), la 5’UTR y la 3’UTR, respectivamente. En eucariotas, las 3’UTRs son elementos claves en la regulación post-transcripcional. El acortamiento o la desregulación de estas regiones están asociado con diversas enfermedades como el cáncer o trastornos metabólicos. En comparación, el conocimiento de las funciones de las 3’UTRs en bacterias es mucho menor. Durante los últimos años, se ha demostrado que las 3’UTRs bacterianas pueden regular la expresión del mRNA que las contiene al igual que pueden ser reservorios de RNAs no codificantes (ncRNAs). Se les ha vinculado en la regulación de procesos bacterianos esenciales como la virulencia, el metabolismo del hierro y la formación de biofilm. En consecuencia, las 3’UTRs pueden jugar un papel mucho más amplio de lo que se había sugerido inicialmente. Sin embargo, todavía hay muchas cuestiones por resolver, por ejemplo, ¿cuál es el grado de conservación de sus secuencias tanto a nivel intra- como inter-especie? ¿Con qué frecuencia los genes ortólogos de bacterias estrechamente relacionadas mantienen conservadas las 3'UTRs? ¿Cómo afectan las variaciones nucleotídicas a la funcionalidad de las 3'UTRs y, en consecuencia, a la expresión de los mRNAs? En esta Tesis, por medio de análisis comparativos globales de los mRNAs que codifican genes ortólogos en distintas especies del género Staphylococcus, descubrimos que la mayoría de los mRNAs contienen 3’UTRs que no están conservadas. Por el contrario, las 5’UTRs se encuentran más conservadas que las 3’UTRs, sugiriendo un sesgo evolutivo hacia las 3’UTRs. La realización de mapas transcriptómicos de diversas especies de Staphylococcus confirmó que las 3’UTRs de genes ortólogos presentaban variaciones en su longitud además de los cambios en sus secuencias. Con el fin de investigar si esta variabilidad afectaba a la expresión proteica, se crearon mRNA quiméricos fusionando las CDSs de los genes icaR, ftnA y rpiRc de Staphylococcus aureus con las 3’UTRs de los mRNAs ortólogos de diferentes especies del mismo género. Los resultados mostraron que las variaciones nucleotídicas en las 3’UTRs alteraban tanto los niveles de mRNA como de proteína. Estos resultados sugerían que las 3’UTRs de genes ortólogos podían tener funciones distintas en cada especie bacteriana. Los cambios en los niveles de expresión podían ser explicados por la presencia o ausencia de elementos reguladores específicos localizados en las diferentes 3’UTRs. Las variaciones en las secuencias de las 3’UTRs podían ocurrir por diferentes procesos incluyendo reordenamientos genómicos, variaciones nucleotídicas locales y transposiciones de secuencias de inserción. Por último, extendiendo los análisis comparativos globales a 3’UTRs funcionales ya descritas, al igual que a los sets completos de mRNAs de Escherichia coli y Bacillus subtilis, descubrimos que la variabilidad de las 3’UTRs es un fenómeno que se encuentra extendido en las bacterias. En resumen, esta Tesis demuestra que las variaciones nucleotídicas en las 3’UTRs, que ocurren de manera natural por la evolución, son capaces de producir cambios en la expresión del mRNA. Esto puede crear funciones reguladoras específicas en una determinada especie, lo que posiblemente podría contribuir a una mayor diversidad entre las especies bacterianas., [EN] A messenger RNA (mRNA) molecule is composed of a coding sequence (CDS) flanked by two untranslated regions (UTRs), the 5’UTR and the 3’UTR, respectively. In eukaryotes, 3’UTRs are key components of post-transcriptional regulatory mechanisms. Shortening or deregulation of these regions is associated with diseases such as cancer and metabolic disorders. Comparatively, little is known about the functions of 3’UTRs in bacteria. Over the past few years, researchers have shown how bacterial 3’UTRs can act as reservoirs for trans-acting non-coding RNAs (ncRNAs) as well as regulators of the expression of their own mRNAs. These recent findings place 3’UTRs as important players in the regulation of key bacterial processes such as virulence, iron metabolism and biofilm formation. As a consequence, 3’UTRs could play a broader role than initially anticipated with many questions still unanswered. For example, are 3’UTR sequences preserved within and between bacterial species? How often do orthologous genes from closely-related bacteria contain conserved functional 3’UTRs? Do nucleotide variations affect 3’UTRs functionality and, thus, mRNA expression? In this Thesis, we performed genome-wide comparative analyses of mRNAs encoding orthologous proteins in the genus Staphylococcus. We discovered that most of these mRNAs contained non-conserved 3’UTR sequences. In contrast, 5’UTRs were more conserved than 3’UTRs suggesting an evolutionary bias within 3’UTRs. Transcriptional mapping of different staphylococcal species confirmed that 3’UTRs were also variable in length. To test if the 3’UTR variability could affect protein expression, we created chimeric mRNAs by fusing the Staphylococcus aureus icaR, ftnA and rpiRc CDSs with the 3’UTRs of orthologous genes from several staphylococcal species. Northern and Western blot analyses revealed that the nucleotide variations in the 3’UTR sequences altered the mRNA and protein levels. This suggested that the 3’UTRs from orthologous mRNAs may have distinct functional roles. Next, we demonstrated that the differences in the mRNA and protein levels could be explained by the presence or absence of specific regulatory elements within the 3’UTRs. We also showed that sequence variations in the 3’UTRs might occur through different processes, including gene rearrangements, local nucleotide changes and transposition of insertion sequences. Finally, we extended the genome wide comparative analyses to already described functional 3’UTRs and the entire set of mRNAs from Escherichia coli and Bacillus subtilis. The results suggested 3’UTR variability to be a widespread phenomenon in bacteria. In summary, this Thesis shows how natural nucleotide variations in 3’UTRs affect mRNA expression. This common occurrence might be responsible for creating different functional species-specific regulatory roles and, ultimately, bacterial diversity through the course of evolution., Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida a través de los siguientes proyectos de investigación: European Research Council Consolidator grant ERC-coG-2014-646869: “High-throughput in vivo studies on post-transcriptional regulatory mechanisms mediated by bacterial 3’-UTRs”. Ministerio de Economía y Competitividad. BFU2011-56698-P: “Regulación post-transcripcional mediada por las regiones 3' no traducidas del RNA mensajero en bacterias”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. PIE-201540I013: “Regulación post-transcripcional mediada por RNAs y proteínas de unión a RNA en bacterias patógenas”

Trabajo presentado en el 5th Meeting of Regulation with RNA in Bacteria and Archaea, celebrado en Sevilla (España), del 19 al 22 de marzo de 2018

Trabajo presentado en la XII Reunión del Grupo Especializado SEM, celebrada en Zaragoza (España) del 5 al 7 de septiembre de 2018

Trabajo presentado en el 7th Congress of European Microbiologists (FEMS2017), celebrado en Valencia (España), del 9 al 13 de julio de 2017

Póster presentado en la XI Reunión del Grupo de Microbiología Molecular de la Sociedad Española de Microbiología (SEM), celebrada en Sevilla del 6 al 8 de septiembre de 2016., Un RNA mensajero (mRNA) está formado por tres regiones bien diferenciadas, una región central que codifica para la proteína correspondiente (CDS), la cual está rodeada por dos regiones que no son traducidas y se denominan 5’-UTR (que comprende desde el inicio de transcripción al inicio de traducción) y 3’-UTR (desde el final de la traducción al final de la transcripción). En eucariotas, las 3’-UTRs son elementos esenciales para modular la expresión de la proteína contenida en el mRNA. En esta región se encuentran los sitios de reconocimiento para diversas proteínas de unión a RNA y las zonas de interacción con los microRNAs que conjuntamente regulan la cantidad de proteína a traducir. Es interesante destacar que la complejidad y longitud de las 3’-UTRs se relaciona de manera directa con la evolución de los organismos. Es así que la longitud de las 3’-UTRs se incrementa a medida que subimos en el árbol evolutivo. Es también llamativo que la desregulación de ciertos genes causantes de algunas enfermedades como el cáncer está asociado con el acortamiento de las 3’-UTRs. En bacterias, la función de estas regiones es prácticamente desconocida. En trabajos previos de nuestro y otros grupos, se demostró que las bacterias también contienen elementos reguladores en las 3’-UTRs para modular la expresión proteica. Considerando que las 3’-UTRs han evolucionado de manera diferente según los organismos, quisimos analizar si esto también ocurría en procariotas. Así, basándonos en el mapa transcriptómico de S. aureus comparamos genes con 3’-UTRs largas con sus respectivos homólogos en diferentes especies del Género Staphylococcus. Sorprendentemente, descubrimos que la homología desaparecía a la altura del codón de parada, lo que indicaba que cada gen homólogo tiene una 3’-UTR diferente. Para comprobar si distintas 3’-UTRs provocan una expresión diferencial del mismo gen homólogo, realizamos quimeras entre una CDS y las distintas 3’-UTRs y medimos la expresión de la proteína. Los resultados mostraron que la expresión es diferente según la 3’-UTR clonada. Esto sugiere que la regulación post-transcripcional mediada por estas regiones ha evolucionado de manera diferente para un mismo gen según en la especie bacteriana que se encuentre., Agradecimientos: al Ministerio de Economía y Competitividad y al Consejo Europeo de Investigación por la financiación de los proyectos de investigación BFU2014-56698-P y ERC-2014-CoG-646869, respectivamente. A la Universidad Pública de Navarra por la financiación del contrato pre-doctoral de C.C.