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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 1996. Bean yellow mosaic virus (BYMV) é uma espécie do gênero Potyvirus, da família Potyviridae. Esses vírus são transmitidos por afídeos de maneira não persistente, exigindo para tal a presença de duas proteínas codificadas pelo vírus: a proteína da capa (CP) e a proteinase “helper component” (HC-Pro). Mutações em alguns poucos blocos de aminoácidos nestas duas proteínas estão relacionadas com a perda da transmissão de potyvirus por afídeos. Mutações no “triplet” altamente conservado D/NAG, localizado na região N-terminal da CP, e nos blocos KITC e PTK, localizados respectivamente no N-terminal e no C-terminal de HC-Pro, foram associadas com esta perda. Uma estirpe necrótica de BYMV, denominada BYMVn, não foi transmitida por 15 diferentes espécies de afídeos. Ensaios de transmissão dependente, utilizando-se BCMV como vírus auxiliar, e com dez diferentes fontes de inóculo também foram negativos. Visando elucidar a base molecular da não transmissão de BYMVn, a porção Nterminal da CP foi caracterizada. RNA total de planta infectada com BYMVn foi extraído e utilizado como molde na obtenção de cDNA. Este último foi submetido à amplificação por PCR e o produto obtido (414pb da região N-terminal da CP) foi ligado ao plasmídio pGemT Vector. O clone obtido foi sequenciado, permitindo a leitura de 170 nucleotídeos da região 5’ e 208 da região 3’ do fragmento. O “triplet” NAG da CP mostrou-se conservado, não podendo ser associado a não transmissão de BYMVn por afídeos. Análise molecular subsequente de HC-Pro poderia mostrar se mutações nos blocos KITC e/ou PTK estariam, portanto, envolvidas na perda da capacidade de transmissão de BYMVn pelo inseto vetor. Como aproximadamente 40% da CP, representando a metade N-terminal, de BYMVn foi sequenciada, os valores de homologia encontrados devem representar as diferenças reais existentes entre a CP deste isolado e as dos demais já caracterizados. Diferenças variando de 18,3 à 29,6% de nucleotídeos e de 12,0 à 25,5% de aminoácidos demonstram que mesmo dentro de uma espécie de potyvirus, variações significativas nas seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos podem ser encontradas, refletindo as diferenças biológicas observadas entre este e os demais isolados. A análise dos valores de identidade e similaridade da seqüência de aminoácidos entre BYMVn e os demais isolados demonstrou que o isolado necrótico BYMVn é mais relacionado com a estirpe S. 62 Estudos adicionais de western blot mostraram uma massa molecular da CP de BYMVn de cerca de 30 kDa, sendo que a proteína manteve sua reatividade sorológica. O perfil peptídico da CP, obtido através de digestão tríptica e HPLC, mostrou que esta técnica pode ser usada na diferenciação de espécies de potyvirus, mas não permite localizar diferenças menores na seqüência de aminoácidos, como as responsáveis pela transmissão por afídeos. Bean yellow mosaic virus is a virus species identified as a member of the genus Potyvirus within the Potyviridae family. These viruses are aphid transmitted in a nonpersistent manner. The transmission depends upon both virus encoded proteins: the coat protein (CP) and the heiper component proteinase (HC-Pro). Mutational studies in some of the amino acids domains demonstrated that both proteins are related with the loss of transmission of these viruses by aphids. Mutations on the highly conserved triplet D/NAG, located at the CP N-terminal, and on KITC and PTK boxes, located at HC-Pro N-terminal and C-terminal respectively, were associated with the lack of vector transmissibility. Fifteen different species of aphids were tested for the transmission of a BYMV necrotic strain, denoted BYMVn. None of them was able to transmit this virus strain. Dependent transmission assay, using BCMV as helper virus, was also negative. Ten different inocullum sources for virus acquisition by the aphid were also tested and no virus transmission was obtained. In order to elucidate the molecular basis of this non aphid-transmissibility of the viruses, part of the N-terminal of the BYMVn coat protein was sequenced. Total RNA was extracted from plants infected with BYMVn and used as template for cDNA synthesis. This cDNA was used as template for amplification by PCR and the product (414 bp from the CP N-terminal) was cloned in the pGemT Vector and sequenced. A nucleotide sequence of 170 bases from 5’ region and 208 base from 3’ region of that fragment was obtained The triplet NAG showed to be conserved in the BYMVn coat protein and it can not be associated to inability of the virus to be aphid transmitted. Further molecular analysis of the HC-Pro may show if mutations on KITC or PTK boxes are involved on the BYMVn transmissibility by aphids. Approximately 40% of N-terminal coat protein of BYMVn was sequenced. The similarity values found may correspond to the real difference between the BYMVn CP and the other previously isolates characterize. Differences ranging from 18,3 - 29,6% of nucleotides sequences, and 12 - 25,5% at amino acids levei demonstrate that even in the some species of potyvirus, significant variations in the nucleotides and amino acids sequences can be found and it can express the biological differences observed between BYMVn and the other BYMV isolates. Analysis of the amino acid similarities and identities between BYMVn and the other isolates demonstrated that the necrotic isolate is closer related to the S strain. 65 Additional western blot studies showed that CP of BYMVn has a molecular welght of about 30 kDa, showing no changes In its serologlcal reactivlty. The HPLC peptlde profile of tryptlc dlgest CP showed that this technlque can be used to separate spoclos wlthln tho potyvirus gonus, but it doos not allow us to locnlo smoll dlfferoncos In the amino acld sequence responslble for aphid transmission.

Rice stripe necrosis virus (RSNV) é um benyvirus transmitido pelo plasmodioforomiceto Polymyxa graminis Ledingham e que causa a doença conhecida como encarquilhamento do arroz. O genoma do RSNV é composto por dois segmentos de RNA de fita simples, poliadenilados e de sentido positivo que são encapsidados individualmente em partículas em formato de bastonete. A reemergência do vírus na África e na América do Sul e sua recente disseminação para além da região Sul do Brasil indicam a necessidade de entender sua variabilidade genética a fim de gerar informações que auxiliem na diagnose e controle da virose. Assim, os objetivos deste trabalho foram caracterizar molecularmente dois isolados de RSNV obtidos de arroz no estado de Goiás e analisar a variabilidade genética deste vírus. Para tanto, amostras de duas plantas sintomáticas, coletadas em experimentos da Embrapa Arroz e Feijão em Goianira e Santo Antônio de Goiás, GO, foram submetidas a extração de RNA total, enriquecimento de dsRNA e sequenciamento de alto desempenho (HTS), resultando em 27 e 66 milhões de leituras de cada amostra. Após montagem com o programa Tadpole, dez contigs foram obtidos, correspondendo a dois genomas virais, cada um composto por dois segmentos de RNA (RNA1 e RNA2). A organização genômica e tamanho do genoma dos isolados estudados foram similares àqueles de outros seis isolados de RSNV previamente caracterizados. As sequências de aminoácidos das proteínas do capsídeo dos dois isolados apresentaram identidade superior a 95% com outras sequências de RSNV e a identidade geral das sequências de nucleotídeos dos RNA1 e RNA2 foi igual ou superior a 95%. Análises executadas com o programa RDP4 não detectaram eventos de recombinação nos isolados estudados. Árvores filogenéticas baseadas nas sequências completas dos RNA1 e RNA2 e da região codificadora do motivo helicase revelaram estreita relação filogenética entre os isolados de RSNV caracterizados neste trabalho e aqueles previamente caracterizados e indicaram um padrão de agrupamento de acordo com a origem geográfica dos isolados. Estes resultados colaboram para ampliar o entendimento da diversidade molecular de isolados de RSNV e, assim, contribuir para o seu controle. Rice stripe necrosis virus (RSNV) is a benyvirus transmitted by the plasmodioforomycete Polymyxa graminis Ledingham that causes the disease known as rice crinkling. RSNV genome is composed of two single-stranded, polyadenylated, and positive-sense RNA segments that are individually encapsulated in rod-shaped particles. The reemergence of the virus in Africa and South America as well its recent spread beyond the southern region of Brazil indicates the need to understand its genetic variability in order to generate information to assist in the diagnosis and control of the virus. Thus, the objectives of this work were to molecularly characterize two isolates of RSNV obtained from rice in the state of Goiás and to analyze the genetic variability of this virus. For this purpose, samples of two symptomatic plants, collected in experiments at Embrapa Arroz e Feijão in Goianira and Santo Antônio de Goiás, GO, were subjected to total RNA extraction, enrichment of dsRNA, and high-performance sequencing (HTS), resulting in 27 and 66 million reads for each sample. After assembling with Tadpole software, ten contigs were obtained, corresponding to two viral genomes, each composed of two RNA segments (RNA1 and RNA2). The genomic organization and genome size of the studied isolates were similar to those of the other six previously characterized RSNV isolates. The amino acid sequences of the capsid protein of the two isolates showed an identity greater than 95% with other RSNV sequences, and the general identity of the nucleotide sequences of RNA1 and RNA2 was equal to or greater than 95%. Analyzes performed with the RDP4 software program did not detect recombination events in the studied isolates. Phylogenetic trees based on the complete sequences of RNA1 and RNA2 and the coding region of the helicase motif revealed a close phylogenetic relationship between RSNV isolates characterized in this work and those previously characterized and indicated a cluster pattern according to the geographic origin of the isolates. These results collaborate to broaden the understanding of the molecular diversity of RSNV isolates and, thus, contribute to their control.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brazilian and foreign isolates of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), as well as a foreign strain of X. campestris pv. armoraciae were studied regarding their phenotipic and genotipic variability by metabolic analysis (BiologTM), fatty acids methyl ester (FAME), pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and inoculation in differential series. Results showed that identification of a same strain may vary depending on which system is used as 58% of all strains tested were identified differently by comparing Biolog and FAME results. Xanthomonas campestris pv. armoraciae is not present in Biolog database and the isolates were identified as X. campestris pv. campestris (70%), X. campestris pv. raphani (19%), X. axonopodis pv. malvacearum (5,5%) and X. axonopodis pv. phaseoli (5,5%). FAME identified the isolates as X. campestris pv. raphani (46%), X. campestris pv. campestris (30%), X. campestris pv. armoraciae (11%), X. campestris pv. zinniae (11%) and Stenotrophomonas maltophilia (2%). Both techniques delivered preciser results when identification of a less specificity level was recquired (from gender to patovar). One or both tecquinies can be used as auxiliary systems to identify plant pathogenic bacteria, but should be combined with host range tests, specially if the identification is being made to patovar level. In order to reduce erros, the systems databases could be divided, e.g. according to host. As patovars campestris, raphani and armoraciae are able to infect brassica plants, a broad study of brassica plants and corresponding X. campestris patovars should be made in order to stablish a more consistent classification. All strains used 14 carbon sources in Biolog. Asparagine was not used by any strain while sacarose was not used by some. Strain made six different groups by FAME. Genetic variability of brazilian strains was observed in PFGE with 11 different band patterns formed when restriction enzyme XbaI was used and 12 band patterns when SpeI was used. Foreign strains formed seven band patterns no matter which enzyme was used. A comparative association was made between some of FAME and PFGE groups. Insuficient space on the banchs due to an exceedingly number of plants, which may have cause cross contamination, was probably one of the causes of inconsistent results from greenhouse experiments. Despite that, it was observed virulence variation among the strains when inoculated in plants from the differential series and atypical symptoms were observed, e.g. blight, which could be an evidence of a different X. campestris patovar. A differential series made only with Brassica oleracea species would be interesting. It was also observed a reaction similar to Vascular Hypersensitive Response, which might be an interesting subject to epidemiolgy of black rot and breeding for resistance to Xcc. Isolados brasileiros e estrangeiros de Xanthomonas campestris pv. campestris, bem como um isolado estrangeiro de X. campestris pv. armoraciae foram estudados quanto à sua variabilidade fenotípica e genotípica por meio de análises metabólicas (BiologTM), análise de ácidos graxos (FAME), eletroforese de campo pulsado (PFGE) e inoculação em série diferenciadora. Os resultados mostram que a identificação de uma mesma fitobactéria pode variar dependendo da técnica aplicada, pois 58% dos isolados estudados receberam identificação conflitante quando os resultados do Biolog e da análise de ácidos graxos foram comparados. No sistema Biolog, em cujo banco de dados não consta a presença de X. campestris pv. armoraciae, os isolados foram identificados como X. campestris pv. campestris (70%), X. campestris pv. raphani (19%), X. axonopodis pv. malvacearum (5,5%) e X. axonopodis pv. phaseoli (5,5%). Na análise de ácidos graxos, os isolados foram identificados como X. campestris pv. raphani (46%), X. campestris pv. campestris (30%), X. campestris pv. armoraciae (11%), X. campestris pv. zinniae (11%) e Stenotrophomonas maltophilia (2%). Para estas duas técnicas, os resultados tiveram, em geral, maior precisão quanto menor a especificidade do nível de classificação (gênero, espécie e patovar). Portanto, uma ou ambas as técnicas não devem ser utilizadas isoladamente e sim como ferramentas auxiliares para confirmação da identidade de uma fitobactéria e sempre associadas à inoculação em gama de hospedeiros, especialmente quando a identificação for ao nível de patovar. Uma subdivisão nos bancos de dados desses sistemas, por exemplo, para espécie hospedeira de onde o material foi isolado, poderia reduzir as chances de uma identificação equivocada. Como os patovares campestris, raphani e armoraciae são capazes de infectar brássicas, recomenda-se também que seja feito um estudo abrangente envolvendo plantas da família Brassicaceae e os patovares de X. campestris capazes de infectá-las, visando estabelecer uma classificação mais consistente. Quando submetidos ao sistema Biolog, todos os isolados utilizaram 14 fontes de carbono. A asparagina não foi utilizada por nenhum isolado e a sacarose não foi utilizada por alguns. Seis grupos foram formados por meio da análise de ácidos graxos. A variabilidade genética dos isolados foi observada na eletroforese de campo pulsado pela formação de 11 (enzima XbaI) e 12 (enzima SpeI) padrões diferentes de bandas nos géis, para isolados brasileiros, e sete padrões para isolados estrangeiros, independente da enzima de restrição utilizada. Foi possível fazer associação entre alguns grupos formados pela análise de ácidos graxos e perfis observados na eletroforese de campo pulsado. Nos experimentos em casa-devegetação, o grande número de plantas resultou em espaçamento insuficiente, o que, provavelmente, contribuiu para uma mistura de isolados, gerando inconsistência nos resultados. Mesmo assim, verificou-se que houve variação de virulência entre os isolados inoculados nas plantas da série diferenciadora e sintomas atípicos, como queima de folhas, foram observados. Estes podem, futuramente, servir de indício para a classificação de um novo patovar de X. campestris. Seria interessante o desenvolvimento de uma série diferenciadora somente com plantas de Brassica oleracea. Resposta semelhante à reação de hipersensibilidade vascular foi observada em alguns casos e deve ser melhor estudada visando a sua aplicação na epidemiologia da podridão negra e nos processos de melhoramento para resistência à X. campestris pv. campestris.