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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Durante a gestação, o organismo materno é submetido à uma série de alterações imunológicas, necessárias para a manutenção do feto. Esta tolerância fetal é dependente das relações celulares que ocorrem na interface materno-fetal. Dessa forma, células trofoblásticas interagem com as células imunes, dentre elas os monócitos, e isto é determinante para o sucesso gestacional. Entretanto, como consequência deste processo de imunomodulação, o organismo materno se torna mais susceptível às infecções causadas por patógenos, como Toxoplasma gondii, e estes microrganismos interferem diretamente nas relações que se estabelecem entre essas células, podendo causar complicações gestacionais. Os mecanismos de morte celular que acometem as populações celulares presentes na interface materno-fetal são um dos fatores envolvidos na manutenção da gestação e, por isso, este estudo teve como objetivo avaliar a influência de células trofoblásticas (linhagem BeWo) e infecção por T. gondii na modulação dos mecanismos de morte celular em monócitos (linhagem THP-1). Para isso, células THP-1 foram estimuladas ou não com sobrenadante de células BeWo (infectadas ou não-infectadas com T. gondii) e posteriormente foram infectadas ou não com T. gondii. Foram analisados em células THP-1: os índices de morte celular e apoptose, a expressão de receptor de morte (Fas/CD95) e de proteínas intracelulares associadas à morte nestas células (survivina, ERK1/2 fosforilada, p38, JNK, caspase 3 ativa), secreção de Fas ligante (FasL) e a influência de alguns fatores solúveis secretados por células BeWo que têm a capacidade de interferir nestes mecanismos de morte celular em células THP-1. Os resultados demonstraram que ambos os sobrenadantes de células BeWo aumentaram o índice de morte celular em células THP- 1 não-infectadas, mas apenas o sobrenadante de células BeWo infectadas alterou este índice de morte em células THP-1 infectadas, reduzindo-o. Além disso, células THP-1, 11 quando infectadas, apresentaram índice de morte celular maior do que células THP-1 não-infectadas. Ambos os sobrenadantes de células BeWo induziram aumento na expressão de fosfatidilserina em células THP-1 não-infectadas e células THP-1, quando infectadas, expressaram menos fosfatidilserina do que células THP-1 não-infectadas. Fator de inimigração de macrófago (MIF) e fator transformador de crescimento (TGF)- P1, secretados por células BeWo, atuaram na indução de morte celular em células THP- 1 não-infectadas, enquanto que, apenas TGF-P1 interferiu na morte de células THP-1 infectadas, inibindo-a. Além disso, estes dois fatores solúveis mostraram-se capazes de diminuir a expressão de fosfatidilserina em células THP-1 não-infectadas, mas apenas TGF-pi alterou esta expressão em células THP-1 infectadas. Células THP-1 infectadas expressaram mais Fas/CD95 do que células THP-1 não-infectadas. Em células THP-1 não-infectadas, a expressão de Fas/CD95 foi maior quando estas células foram estimuladas com os diferentes sobrenadantes de células BeWo e em células THP-1 infectadas este fenômeno só se repetiu quando elas foram estimuladas com o sobrenadante de células BeWo infectadas. A secreção de FasL foi maior em células THP-1 infectadas, mas em células BeWo, a infecção não alterou a secreção deste ligante. As proteínas intracelulares, ERK1/2 fosforilada e caspase 3 ativa, foram menos expressas em células THP-1 infectadas e ambos os sobrenadantes de células BeWo induziram a diminuição da expressão de caspase 3 ativa em células THP-1, infectadas e não-infectadas. Assim, nossos resultados mostraram que células trofoblásticas BeWo modulam os mecanismos de morte celular em células THP-1 e estas alterações podem estar associadas à manutenção e sucesso da gestação. Além disso, a infecção por T. gondii também altera estas interações celulares que ocorrem na interface materno-fetal. During pregnancy, maternal organism is submitted to immunological alterations, which are necessary to fetus maintenance. This fetal tolerance depends on the cell interactions that occur at maternal-fetal interface. Therefore, trophoblast cells interact with immune cells, as monocytes, and it is determinant for gestational success. However, in consequence of this immunomodulation process, the maternal organism becomes more susceptible to infections by pathogens, such as Toxoplasma gondii, which interfere directly in the crosstalk between trophoblast cells and monocytes, causing pregnancy complications. Mechanisms of cell death that occurs in cell populations present at maternal-fetal interface are involved in the gestational development and, in this way, this study aimed to evaluate the influence o trophoblast cell (BeWo line) and T. gondii infection in the modulation of death mechanisms in monocytes (THP-1 line). For this, THP-1 cells were stimulated or not with supernatants of BeWo cells (infected or uninfected with T. gondii) and then infected with T. gondii. In THP-1 cells were analyzed: the index of cell death and apoptosis, the expression of death receptor (Fas/CD95) and intracellular proteins associated to death in these cells (survivin, phosphorylated ERK1/2, p38, JNK, active caspase 3), human Fas ligand (FasL) secretion and the influence of soluble factors secreted with BeWo cells, which have the capacity to interfere in these mechanisms of THP-1 cell death. The results showed that supernatants of BeWo cells induced the increase of the index of cell death in uninfected THP-1 cells, but only supernatant of infected BeWo cells altered this index in infected THP-1 cells, reducing it. Moreover, infected THP-1 cells presented cell death index higher than uninfected THP-1 cells. Both supernatants of BeWo cells induced increased in the expression of phosphatidylserine in uninfected THP-1 cells and infected THP-1 cells expressed less phosphatidylserine than uninfected THP-1 cells. Macrophage 13 migration inhibitory factor (MIF) and transforming growth factor beta 1 (TGF-pi), both secreted by BeWo cells, actuated in the induction of cell death in uninfected THP-1 cells, but only TGF-pi, interfered in the cell death of infected THP-1 cells, inhibiting it. Furthermore, both of these soluble factors were able to decrease the expression of phosphatidylserine in uninfected THP-1 cells, but only TGF-pi altered this expression in infected THP-1 cells. The expression of Fas/CD95 was higher in infected THP-1 cells than uninfected THP-1 cells. In uninfected THP-1 cells, Fas/CD95 expression was higher when these cells were stimulated with supernatants of BeWo cells and in infected THP-1 cells, this phenomenon was repeated in those that were stimulated with supernatant of infected BeWo cells. The secretion of FasL was higher in infected THP-1 cells, but in BeWo cells, the infection did not altered the secretion of this ligand. Both intracellular proteins analyzed, phophorylated ERK1/2 and active caspase 3 were less expressed in infected THP-1 cells and both supernatants of BeWo cells, induced decreased of active caspase 3 expression in uninfected and infected THP-1 cells. These results showed that BeWo trophoblast cells modulate mechanisms of cell death in THP- 1 cells and these alterations can be associated with the maintenance and success of pregnancy. Furthermore, T. gondii infection also interferes in these cell interactions which occur in the maternal-fetal interface. Tese (Doutorado)

rea de concentra??o: Ci?ncias farmac?uticas. Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2018-01-03T17:55:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT). 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Em virtude disso, e com base em relatos populares sobre uma poss?vel a??o antitumoral, o objetivo principal deste trabalho foi pesquisar se estes extratos apresentariam ou n?o efeito citot?xico sobre a linhagem tumoral Jurkat, utilizando-se concentra??es n?o t?xicas, j? avaliadas sobre c?lulas mononucleares do sangue perif?rico humano (PBMC). Uma vez que os extratos vegetais foram dilu?dos no solvente Dimetilsulf?xido (DMSO), inicialmente investigou-se a concentra??o m?xima de DMSO que n?o alteraria a viabilidade das c?lulas Jurkat ap?s 24, 48 e 72 horas de cultura. O efeito citot?xico dos extratos foi avaliado sobre linf?citos tumorais (Jurkat) e sobre linf?citos humanos de volunt?rios h?gidos pelo m?todo de exclus?o com azul de tripan, com exce??o das culturas tratadas com P.brasilensis, onde a viabilidade foi avaliada por citometria de fluxo. Tamb?m foram calculados os ?ndices de seletividade e percentuais de efic?cia dos extratos com rela??o ao f?rmaco antineopl?sico Paclitaxel. Foi avaliada tamb?m a interfer?ncia desses extratos sobre as fases do ciclo celular das c?lulas Jurkat, bem como os mecanismos de morte envolvidos na a??o citot?xica dos extratos. De acordo com os resultados obtidos, o DMSO n?o apresentou efeito t?xico sobre as c?lulas Jurkat na concentra??o de 1%v/v nos tr?s tempos de incuba??o, sendo esta a concentra??o de solvente utilizada em todos os ensaios realizados. Extratos etan?licos das folhas da P. brasilensis (PBf) a 200?g/mL, das partes a?reas da A. fastigiatum (Afpa) a 50?g/mL e extratos etan?licos e aquosos da M. ferruginata (Mfet, Mfaq) a 125?g/mL mostraram maior toxicidade sobre as c?lulas Jurkat principalmente ap?s 72h de tratamento. O tratamento, por 24h, com extrato Afpa 50 ?g/mL mostrou ser o mais seletivo e eficaz com rela??o aos outros extratos. Foi evidenciado em todos os extratos, que nas maiores concentra??es, ap?s de 24 horas de tratamento, houve uma inibi??o na progress?o da fase G2M do ciclo celular. O extrato das partes a?reas de Ageratum fastigiatum tamb?m produziu uma reten??o dessas c?lulas na fase G0-G1. Todos os extratos induziram a apoptose as c?lulas Jurkat, onde o n?mero de c?lulas em apoptose tardio foi predominante em rela??o aos processos necr?ticos. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. The Cerrado Mineiro has many vegetable species used in folk medicine. Plants like Pseudobrickellia Brasilensis, Miconia ferruginata and Ageratum fastigiatum are widely used as analgesic, healing or anti-inflammatory. Studies carried on the Immunology Laboratory (UFVJM) shown that extracts from these plants has inhibitory effects in the activation of in-vitro-cultured human lymphocytes. In this way, and based on folk stories related with their anti-tumor action, the main objective of this work was research about the cytotoxic effect of this plants on Jurkat tumor line-cell cultures, using as first experiment non-toxic extract concentrations previously proved on peripheral blood mononuclear cells (PBCM). Once the vegetable extracts were diluted in dimetilsulfoxide (DMSO), previously, the maximum DMSO concentration not-altering cell viability was determined after 24, 48 and 72 hours. Cytotoxic effect was studied using the exclusion method with tripam blue on tumor lymphocytes (Jukart) and human lymphocytes, donated by healthy volunteers, except for P.brasilensis treated line cells, for which cell viability was studied by flux cytometer. The selectivity index and extracts efficiency percentage were calculated and related with the antineoplastic Paclitaxel drug. The extracts interference on the Jukart cell cycle phases and the cell death mechanisms related with the cytotoxic activity were evaluated. According to the obtained results, DMSO does not show cytotoxic effects on Jukart cells in 1% (v/v) concentration at the three incubation times, being this the solvent concentration used in all the experiments. Ethanol extracts of P. brasilensis leaves (PBf) at 200?g / mL, aerial parts of A. fastigiatum (Afpa) at 50?g / mL and M. ferruginata aqueous and ethanolic extracts (Mfet, Mfaq) at 125?g / mL showed higher Toxicity on Jurkat cells mainly after 72h of treatment. The 24 h treatment with Afpa at 50 ?g/mL was the most selective and effective in comparison with the other tested extracts. It was evidenced in all extracts, that at the highest concentrations, after 24 hours of treatment, there was an inhibition in the progression of the G2M phase of the cell cycle. The extract of Ageratum fastigiatum aerial parts also produced the G0-G1 phase retention. All extracts induced Jukart cell apoptosis, and cell number on late apoptotic phase predominated on the necrotic ones.