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Certain DNA sequences can adopt a non-B form in the genome that interfere with DNA-templated processes, including transcription. Among the sequences that are intrinsically difficult to transcribe are those that tend to form R-loops, three-stranded nucleic acid structures formed by a DNA-RNA hybrid and the displaced ssDNA. Here we compared the transcription of an endogenous gene with and without an R-loop-forming sequence inserted. We show that, in agreement with previous in vivo and in vitro analyses, transcription elongation is delayed by R-loops in yeast. Importantly, we demonstrate that the Rat1 transcription terminator factor facilitates transcription throughout such structures by inducing premature termination of arrested RNAPIIs. We propose that RNase H degrades the RNA moiety of the hybrid, providing an entry site for Rat1. Thus, we have uncovered an unanticipated function of Rat1 as a transcription restoring factor opening up the possibility that it may also promote transcription through other genomic DNA structures intrinsically difficult to transcribe. If R-loop-mediated transcriptional stress is not relieved by Rat1, it will cause genomic instability, probably through the increase of transcription-replication conflicts, a deleterious situation that could lead to cancer.

Certain DNA sequences can adopt a non-B form in the genome that interfere with DNA-templated processes, including transcription. Among the sequences that are intrinsically difficult to transcribe are those that tend to form R-loops, three-stranded nucleic acid str uct ures f ormed b y a DNA-RNA hybrid and the displaced ssDNA. Here we compared the transcription of an endogenous gene with and without an R-loop-forming sequence inserted. We show that, in agreement with previous in vivo and in vitro analyses, transcription elongation is delayed by R-loops in y east. Importantly, w e demonstrate that the Rat1 transcription terminator factor facilitates transcription throughout such str uct ures by inducing premature termination of arrested RNAPIIs. We propose that RNase H degrades the RNA moiety of the hybrid, pro viding an entry site for Rat1. T hus, w e ha v e unco v ered an unanticipated function of Rat1 as a transcription restoring f actor opening up the possibility that it ma y also promote transcription through other genomic DNA str uct ures intrinsically difficult to transcribe. If R-loop-mediated transcriptional stress is not relie v ed b y Rat1, it will cause genomic inst abilit y, probably through the increase of transcription-replication conflicts, a deleterious situation that could lead to cancer.

DNA double-strand breaks (DSBs) are the most harmful DNA lesions and their repair is crucial for cell viability and genome integrity. The readout of DSB repair may depend on whether DSBs occur at transcribed versus non-transcribed regions. Some studies have postulated that DNA-RNA hybrids form at DSBs to promote recombinational repair, but others have challenged this notion. To directly assess whether hybrids formed at DSBs promote or interfere with the recombinational repair, we have used plasmid and chromosomal-based systems for the analysis of DSB-induced recombination in Saccharomyces cerevisiae. We show that, as expected, DNA-RNA hybrid formation is stimulated at DSBs. In addition, mutations that promote DNA-RNA hybrid accumulation, such as hpr1∆ and rnh1∆ rnh201∆, cause high levels of plasmid loss when DNA breaks are induced at sites that are transcribed. Importantly, we show that high levels or unresolved DNA-RNA hybrids at the breaks interfere with their repair by homologous recombination. This interference is observed for both plasmid and chromosomal recombination and is independent of whether the DSB is generated by endonucleolytic cleavage or by DNA replication. These data support a model in which DNA-RNA hybrids form fortuitously at DNA breaks during transcription and need to be removed to allow recombinational repair, rather than playing a positive role.

DNA double-strand breaks (DSBs) are the most harmful DNA lesions and their repair is crucial for cell viability and genome integrity. The readout of DSB repair may depend on whether DSBs occur at transcribed versus non-transcribed regions. Some studies have postulated that DNA-RNA hybrids form at DSBs to promote recombinational repair, but others have challenged this notion. To directly assess whether hybrids formed at DSBs promote or interfere with the recombinational repair, we have used plasmid and chromosomal-based systems for the analysis of DSB-induced recombination in Saccharomyces cerevisiae. We show that, as expected, DNA-RNA hybrid formation is stimulated at DSBs. In addition, mutations that promote DNA-RNA hybrid accumulation, such as hpr1∆ and rnh1∆ rnh201∆, cause high levels of plasmid loss when DNA breaks are induced at sites that are transcribed. Importantly, we show that high levels or unresolved DNA-RNA hybrids at the breaks interfere with their repair by homologous recombination. This interference is observed for both plasmid and chromosomal recombination and is independent of whether the DSB is generated by endonucleolytic cleavage or by DNA replication. These data support a model in which DNA-RNA hybrids form fortuitously at DNA breaks during transcription and need to be removed to allow recombinational repair, rather than playing a positive role.

El mantenimiento de la integridad del DNA y la transmisión fiel de su información a la descendencia es una prioridad para los seres vivos. Al mismo tiempo, la molécula de DNA es el sustrato de numerosas reacciones vitales para la célula, como la replicación o la transcripción, las cuales pueden suponer una fuente de daño cuando se desregulan o entran en conflicto con otros procesos. Esto puede producir alteraciones genéticas que incluyen la pérdida de información, mutaciones y reordenaciones cromosómicas en un proceso conocido como inestabilidad genómica. La transcripción es uno de los procesos centrales en el metabolismo del DNA que puede generar inestabilidad genómica en determinadas circunstancias. La transcripción está acoplada al procesamiento del transcrito y desemboca en la producción de una ribonucleopartícula mensajera (mRNP) apta para ser exportada al citoplasma. Se ha demostrado que la ausencia de determinados factores de ensamblaje de la mRNP produce fallos en la elongación de la transcripción, generalmente asociados a la acumulación de híbridos de DNA:RNA y que pueden dar lugar a colisiones entre las maquinarias de transcripción y replicación, mutaciones y daño en el DNA. Estos híbridos de DNA:RNA se forman cuando el transcrito naciente hibrida con la hebra molde del DNA, dando lugar a un dúplex de DNA:RNA y a una hebra de cadena sencilla de DNA en una estructura conocida como bucle R (R-loop). Si bien estas estructuras se forman naturalmente, la acumulación de R-loops es una marca de inestabilidad genómica. El objetivo de esta tesis es estudiar nuevos factores que puedan generar inestabilidad genómica asociada a híbridos de DNA:RNA mediante defectos en el ensamblaje de la mRNP, así como entender el efecto que tienen la acumulación de R-loops y otras fuentes de daño poco estudiadas, como las roturas de cadena sencilla (SSBs), sobre la transcripción y la propia RNA polimerasa II (RNAPII). Recientemente se ha demostrado que no solo la ausencia de factores

El mantenimiento de la integridad del DNA y la transmisión fiel de su información a la descendencia es una prioridad para los seres vivos. Al mismo tiempo, la molécula de DNA es el sustrato de numerosas reacciones vitales para la célula, como la replicación o la transcripción, las cuales pueden suponer una fuente de daño cuando se desregulan o entran en conflicto con otros procesos. Esto puede producir alteraciones genéticas que incluyen la pérdida de información, mutaciones y reordenaciones cromosómicas en un proceso conocido como inestabilidad genómica. La transcripción es uno de los procesos centrales en el metabolismo del DNA que puede generar inestabilidad genómica en determinadas circunstancias. La transcripción está acoplada al procesamiento del transcrito y desemboca en la producción de una ribonucleopartícula mensajera (mRNP) apta para ser exportada al citoplasma. Se ha demostrado que la ausencia de determinados factores de ensamblaje de la mRNP produce fallos en la elongación de la transcripción, generalmente asociados a la acumulación de híbridos de DNA:RNA y que pueden dar lugar a colisiones entre las maquinarias de transcripción y replicación, mutaciones y daño en el DNA. Estos híbridos de DNA:RNA se forman cuando el transcrito naciente hibrida con la hebra molde del DNA, dando lugar a un dúplex de DNA:RNA y a una hebra de cadena sencilla de DNA en una estructura conocida como bucle R (R-loop). Si bien estas estructuras se forman naturalmente, la acumulación de R-loops es una marca de inestabilidad genómica. El objetivo de esta tesis es estudiar nuevos factores que puedan generar inestabilidad genómica asociada a híbridos de DNA:RNA mediante defectos en el ensamblaje de la mRNP, así como entender el efecto que tienen la acumulación de R-loops y otras fuentes de daño poco estudiadas, como las roturas de cadena sencilla (SSBs), sobre la transcripción y la propia RNA polimerasa II (RNAPII). Recientemente se ha demostrado que no solo la ausencia de factores, En un primer capítulo de esta tesis, y empleando Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo, buscamos otros genes cuya sobreexpresión pudiera causar inestabilidad genómica asociada a híbridos de DNA:RNA. Para ello, realizamos un escrutinio de sobreexpresión en mutantes hpr1 que acumulan R-loops, identificando aquellos genes cuya sobreexpresión produjera una reducción en el crecimiento como indicativo de un aumento en la cantidad de híbridos de DNA:RNA. Mediante esta aproximación hemos identificado tres proteínas de unión al RNA cuyo exceso produce un aumento de daño en el DNA que es dependiente de R-loops: Dis3, la unidad catalítica esencial del exosoma; She2, implicada en el transporte al citoplasma de ciertos mRNAs; y Rie1, una proteína de unión al RNA de función desconocida. Hemos mostrado que la sobrexpresión de DIS3 posiblemente produce su agregación y por tanto la reducción de los niveles de esta proteína disponibles para formar el exosoma, causando fenotipos similares a los de la pérdida de función de esta proteína: Aumento del daño en el DNA dependiente de híbrido y defectos en el procesamiento del RNA ribosómico. La sobreexpresión de DIS3 da lugar a un ligero aumento de híbridos a nivel global en el núcleo, como sucede en el mutante condicional de dis3, probablemente debido a que el exceso de Dis3 produce una desregulación de la transcripción que conlleva la expresión de RNA aberrantes, antisentido y no codificantes que no son degradados. Por otra parte, la sobreexpresión de SHE2 produce una acumulación de R-loops en genes que codifican para RNAs con estructuras en forma de tallo-lazo (stem-loop), posiblemente porque el exceso de She2 favorece la re-hibridación del transcrito con el DNA, o estabiliza los híbridos de DNA:RNA. Por último, hemos mostrado cómo la sobrexpresión de RIE1 provoca la entrada de su proteína, que es citoplasmática a niveles endógenos, en el núcleo. Aquí, Rie1 produce una fuerte acumulación de R-loops, posiblemente debido a la gene