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Additional file 1. Methods. Laboratory methods.

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcos Tadeu Nolasco da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Este estudo teve como objetivos analisar a resposta imune celular de lactentes saudáveis à vacina de Bacillus Calmette-Guérin (BCG), vacinados ao nascer com BCG e Hepatite B combinada ou separada e compará-la à de lactentes expostos ao Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e não infectados. Nos lactentes sadios, a proliferação de linfócitos T frente a BCG, medida por citometria de fluxo, foi semelhante nos grupos que receberam a vacina combinada e separada e a subpopulação que mais expandiu nos ensaios in vitro foi a TCR ?d+. As concentrações de IL-10, IL-12, IFN-? e TNF-a nas culturas estimuladas com BCG, determinadas por ELISA, não diferiram entre os grupos, sugerindo que a vacinação combinada de BCG e Hepatite B promoveu resposta celular semelhante à separada. Os lactentes expostos ao HIV foram recrutados no Ambulatório de Pediatria da UNICAMP. A proliferação de linfócitos T específica para BCG foi reduzida em relação a lactentes sem exposição e apenas nos expostos com idades entre 18,1 e 23,4 meses as porcentagens de blastos CD4+, CD8+ e TCR ?d+ foram semelhantes aos controles. A concentração de IFN-? estimulada por BCG em cultura foi mais baixa nos expostos entre 6,7 a 8,8 meses, em relação às outras faixas etárias e aos controles. IL-10 e TNF-a não foram diferentes entre os lactentes com e sem exposição ao HIV. A deficiência da resposta imune celular específica para BCG observada nos lactentes expostos ao HIV sugere um atraso na maturação do sistema imune, fazendo-se necessário um seguimento prospectivo para definir se esta alteração é ou não transitória Abstract: The objectives of this study were to evaluate cell-mediated immune response to Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccination in infants vaccinated with combined or separated BCG and Hepatitis B and to compare with BCG-specific response from uninfected infants with vertical exposure to Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1). BCG-specific proliferation by flow cytometry and IL-10, IL-12, IFN-? and TNF-a concentrations by ELISA were similar in PBMC from infants vaccinated with combined or separated BCG and Hepatitis B. There was CD4+, CD8+ and remarkable ?d+ T cell proliferation in BCG-stimulated cultures. The results suggested that the combined BCG and Hepatitis B vaccine was as immunogenic as BCG vaccine inoculated alone. Exposed HIV-uninfected infants were recruited at Pediatrics Out-Patients Unit of Hospital das Clínicas in UNICAMP and separated into three groups: E1 (aged 6.7-8.8 months), E2 (aged 9.1-17.1) and E3 (aged 18.1-23.4). Unexposed infants (UE, aged 7.0-8.7 months) and E1 matched for age. Proliferation in cell cultures with BCG was significantly reduced in all exposed groups in comparison to UE. Only BCG-stimulated cultures from E3 were similar to UE in relation to CD4+, CD8+ and ?d+ T cell subsets. TNF-a and IL-10 production was not different in BCG-stimulated cultures of unexposed and exposed infants from all groups and there were lower IFN-? concentration in the samples from E1 in comparison to all of the other groups. The results demonstrated a delay in immune system development of HIV-exposed infants Mestrado Saúde da Criança e do Adolescente Mestre em Saúde da Criança e do Adolescente

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcos Tadeu Nolasco da Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Este estudo teve como objetivo analisar se há associação entre a viremia plasmática do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e a resposta imunológica adaptativa de crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV-1 em uso de terapia antirretroviral combinada (TARVc). Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas e no Centro de Orientação e Apoio Sorológico (COAS), em Jundiaí, ambos no estado de São Paulo, Brasil. Constituíram-se dois grupos de pacientes: a) com controle virológico sustentado por mais de um ano (Carga viral - CV < limite de detecção de 50 cópias de RNA viral/mL, pelo método de Branched-DNA); e b) com CV > 1000 cópias/mL. Crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Foram realizadas, por citometria de fluxo, imunofenotipagens de linfócitos T CD4+, T CD8+, B total e de memória e a proliferação de linfócitos T em culturas de células mononucleadas do sangue periférico estimuladas com HIV-1 inativado por aldritiol-2. A concentração de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? e TGF-?1 no sobrenadante destas culturas foi analisada com Cytometric Bead Array e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Também foram dosados imunoglobulinas por nefelometria; anticorpos anti-hepatite B e anti-rubéola por Chemiluminescent Microparticle Immunoassay e anti-tétano e anti-difteria por Toxin Binding Inhibiton test. Empregaram-se os testes estatísticos de Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, exato de Fisher, Comparações Múltiplas Não Paramétricas e Correlação de Spearman, sendo o nível de significância de p < 0,05. Não houve diferença na contagem de linfócitos T CD8+, B total e de memória entre os grupos de pacientes. O número de linfócitos T CD4+ estava reduzido no grupo virêmico no momento da avaliação da resposta vacinal. Observaram-se maiores valores absolutos de linfócitos B de memória nos pacientes com CV indetectável (CVI) de menor idade à introdução de TARVc. A concentração de IgM e IgG foi superior nos pacientes virêmicos em relação aos com CVI e controles. Pacientes com CVI tiveram maior nível de IgA que os controles. Os pacientes com CVI apresentaram maior proliferação de linfócitos T e produção de IL-2 e IFN-? HIV-1 específicas em relação aos virêmicos. A proliferação e produção de IFN-? e IL-2 se correlacionaram com a duração da TARVc bem-sucedida no controle da viremia. Em pacientes virêmicos, a concentração de IFN-? correlacionou-se inversamente à CV e a proliferação foi menor nos que iniciaram TARV após um ano de idade. A proporção de respondedores para as vacinas de tétano, difteria, rubéola e hepatite B foi similar entre os grupos de pacientes, e aqueles com CVI apresentaram maiores títulos de anti-hepatite B e anti-rubéola. Os controles apresentaram maior número de respondedores para rubéola, hepatite B e difteria e maiores títulos de anti-hepatite B, anti-rubéola e anti-tétano que os pacientes. Concluímos que o controle virológico sustentado em crianças e adolescentes com infecção crônica pelo HIV trouxe benefícios diretos na manutenção das respostas anti-HIV e vacinais e que a administração de TARV precoce contribuiu para melhor resposta celular ao HIV e maior número de linfócitos B de memória Abstract: The aim of this study was to evaluate if there was an association of Human Immunodeficiency Virus (HIV) plasma viremia and the development of adaptative immune responses from vertically-HIV-1 infected children and adolescents under combination Antirretroviral Therapy (cART). The individuals were recruited at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the University of Campinas Clinical Hospital (UNICAMP, Campinas) and at the Center for Orientation and Serologic Support (COAS, Jundiaí), in São Paulo State, Brazil. They were separated in two groups, according to HIV RNA plasma viral load (VL): one had sustained undetectable VL (UVL, with VL < 50 copies of RNA/mL) for at least one year before blood collection; the other had VL > 1,000 copies/mL. Healthy children and adolescents participated in the study as controls. Aldrithiol-2-inactivated HIV-1-stimulated peripheral blood mononuclear cells were cultured to evaluate HIV-specific lymphoproliferation by flow cytometry and IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? and TGF-?1 concentration by Cytometric Bead Array and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Adaptative immunity was also evaluated with T CD4+, T CD8+, total and memory B cell counts by flow cytometry, immunoglobulin dosage by nephelometry, Chemiluminescent Microparticle Immunoassay to antibodies anti-hepatitis B and anti-rubella and Toxin Binding Inhibiton test to anti-tetanus and anti-diphtheria were carried out to humoral response evaluation. Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, Fisher's exact, Nonparametric Multiple Comparisons and Spearman Correlation tests were used, with a p value < 0.05. There was no difference in T CD8, total and memory B cell counts between the groups of patients. T CD4 cell numbers were decreased in the viremic group at the time humoral immunity was performed. Greater memory B cell counts were observed among patients with UVL who were younger at cART beginning. IgM and IgG levels were higher in viremic patients in comparison to control and patients with UVL, which had increased levels of IgA in comparison to controls. There was no difference in the proportion of responders for tetanus, diphtheria, rubella and hepatitis B vaccines between the two groups of patients; nevertheless, the group with UVL showed higher titers of anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus than the viremic group. Controls showed higher frequency of responders to diphtheria, rubella and hepatitis B and titers to anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus in comparison to patients. Patients with UVL showed higher HIV-1-specific T lymphocyte proliferation and IL-2 and IFN-? production in comparison to viremic patients. Greater time since the start of successful cART in patients with UVL was associated with higher proliferation and IFN-? and IL-2 levels in cultures with HIV. Among viremic patients, HIV-specific proliferation was lower in individuals who started ART after one year of age, and IFN-? concentration was inversely correlated with VL. We concluded that sustained HIV-1 virologic control was valuable on mounting responses to HIV and vaccines and the early initiation of ART contributed to improved HIV cellular immunity and greater memory B cell counts Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências

Agradecimentos: We would like to acknowledge the generous contribution of all the patients and healthy controls who agreed in participating in this project. We also would like to thank the nursing staff at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Unit, for helping in blood collection Abstract: HIV infection harms adaptive cellular immunity mechanisms. Long-term virological control by combined antiretroviral therapy (cART) reduces the risk of mycobacterial infections. Thus, we aimed to study cellular responses to mycobacterial antigens in 20 HIV-infected adolescents with at least one year of virological control (HIV-RNA

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Taís Nitsch Mazzola Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A vacinação terapêutica com células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC) têm sido associada com o controle da carga viral em adultos infectados pelo HIV, mas os seus efeitos em crianças não foram explanados. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a função das MDDC isoladas de crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV sob terapia antiretroviral combinada. Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, sendo 25 com carga viral indetectável e 14 com carga viral ?1000 cópias de RNA/mL. Além disso, 20 crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Monócitos obtidos do sangue periférico foram cultivados durante seis dias com GM-CSF e IL-4 para a obtenção das MDDC, as quais foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão de CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN e HLA-DR. As MDDC foram pulsadas com HIV-1 inativado por aldritiol-2 e cocultivadas com linfócitos autólogos para avaliação da expressão gênica e proteica de citocinas e da linfoproliferação HIV específica. Foram avaliados também hemogramas, subpopulações de células dendríticas mielóides e plasmocitóides e de linfócitos CD3, CD4 e CD8. As MDDC dos pacientes infectados pelo HIV apresentaram um fenótipo semelhante aos controles saudáveis e foram capazes de induzir a produção de citocinas do tipo Th1; no entanto, crianças com carga viral ?1000 cópias de RNA/mL apresentaram menor linfoproliferação HIV-específica. Em geral, as MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV geradas in vitro foram capazes de induzir resposta imune celular HIV específica, mostrando-se potenciais candidatos para imunização terapêutica usando MDDC Abstract: Therapeutic vaccination with monocyte-derived dendritic cells (MDDC) has been associated with viral load control in immunized HIV-infected adults, but its effects in children were not explored yet. We aimed to evaluate the function of MDDC isolated from vertically HIV-infected children and adolescents under combined antiretroviral therapy. Patients were recruited at the Out-Patients Unit at the University of Campinas, which 25 patients had undetectable viral load and 14 patients had viral load ?1000 RNA copies/mL. In addition, 20 healthy children and adolescents served as controls. Monocytes obtained from peripheral blood were cultured for six days with GM-CSF and IL-4 to get the MDDC, which were assessed by flow cytometry for CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN and HLA-DR expression. T cell proliferation and cytokine expression and production were evaluated in cocultures of MDDC pulsed with aldrithiol-2-inactivated HIV-1 and autologous lymphocytes. Hemogram, myeloid and plasmacytoid dendritic cells and CD3, CD4 and CD8 lymphocytes were evaluated in the peripheral blood. MDDC from HIV-infected children exhibited a similar phenotype to those in healthy individuals and were able to induce a Th1-type cytokine production; however, T lymphoproliferation was impaired in children with viral load ?1,000 RNA copies/mL. MDDC generated in vitro boosted HIV-specific cellular immune responses in vertically HIV-infected children and could be potential candidates for MDDC therapeutic immunization Mestrado Saúde da Criança e do Adolescente Mestra em Ciências