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IntroductionClinical and preclinical data suggest accelerated bone fracture healing in subjects with an additional traumatic brain injury (TBI). Mechanistically, altered metabolism and neuro-endocrine regulations have been shown to influence bone formation after combined fracture and TBI, thereby increasing the bone content in the fracture callus. However, the early inflammatory response towards fracture and TBI has not been investigated in detail so far. This is of great importance, since the early inflammatory phase of fracture healing is known to be essential for the initiation of downstream regenerative processes for adequate fracture repair.MethodsTherefore, we analyzed systemic and local inflammatory mediators and immune cells in mice which were exposed to fracture only or fracture + TBI 6h and 24h after injury.ResultsWe found a dysregulated systemic immune response and significantly fewer neutrophils and mast cells locally in the fracture hematoma. Further, local CXCL10 expression was significantly decreased in the animals with combined trauma, which correlated significantly with the reduced mast cell numbers.DiscussionSince mast cells and mast cell-derived CXCL10 have been shown to increase osteoclastogenesis, the reduced mast cell numbers might contribute to higher bone content in the fracture callus of fracture + TBI mice due to decreased callus remodeling.

Die Zöliakie als systemische Autoimmunerkrankung entsteht durch Gluteningestion bei genetisch empfänglichen Menschen. Mastzellen (MZ) und Eosinophile (EO) interagieren eng miteinander und beeinflussen die intestinale Epithelbarriere, die auch bei der Zöliakie gestört ist. Duodenumbiopsate von 215 Kindern (109 mit Zöliakie,106 Kontrollen) wurden nach immunhistochemischer Färbung histologisch untersucht (Zellzahl und Zellverteilung). Zusätzlich wurden klinische Faktoren evaluiert. Beide Zellen waren bei Zöliakiepatient:innen erhöht, was deren Beteiligung in der Erkrankungspathobiologie unterstreicht. MZ waren häufiger gleichmäßig in der Lamina propria verteilt, wohingegen sie in Kontrollbiopsien weiter vom intestinalen Lumen entfernt waren. Dies wurde bei den EO nicht beobachtet. Diese MZ-Verteilung ist nicht abschließend erklärbar und sollte daher, ebenso wie der Einfluss weiterer Mediatoren, in weiteren Studien, beleuchtet werden.

There is evidence that mast cells contribute to inflammation induced by hemorrhagic shock, severe tissue injury or sepsis. Mast cells are highly responsive to alarm signals generated after trauma, and release many inflammatory mediators including interleukin-6, a key mediator of posttraumatic inflammation. An overwhelming posttraumatic inflammation causes compromised bone healing; however, the underlying cellular and molecular mechanisms are poorly understood. Recently, we found that mast cells trigger local and systemic inflammation after isolated fracture leading to uneventful bone repair. Here, we investigated whether mast cells critically contribute to trauma-induced compromised bone healing. Male Mcpt5-Cre+ R-DTA mice, which lack connective tissue type mast cells, and their mast cell-competent Cre− littermates underwent a femur fracture with/without thoracic trauma. Posttraumatic systemic and local inflammation and bone repair were assessed 3 h and 21 d post injury. Both, the systemic and pulmonary inflammation was significantly increased in mast cell-competent mice upon combined trauma compared to isolated fracture. In mast cell-deficient mice, the increase of inflammatory mediators in the circulation induced by the severe trauma was abolished. In the bronchoalveolar lavage fluid, the trauma-induced increase of inflammatory cytokines was not reduced, but the neutrophil invasion into the lungs was significantly diminished in the absence of mast cells. Locally in the fracture hematoma, mast cell-competent mice displayed reduced inflammatory mediator concentrations after combined trauma compared to isolated fracture, which was abolished in mast cell-deficient mice. Notably, while combined trauma resulted in compromised bone repair in mast cell-competent mice, indicated by significantly reduced bone and increased cartilage fracture callus contents, this was abolished in Mcpt5-Cre+ R-DTA mice. Therefore, mast cells contribute to trauma-induced compromised bone repair and could be a potential target for new treatment options to improve fracture healing in multiply injured patients., publishedVersion

Mast cells are important tissue‐resident sensor and effector immune cells but also play a major role in osteoporosis development. Mast cells are increased in numbers in the bone marrow of postmenopausal osteoporotic patients, and mast cell–deficient mice are protected from ovariectomy (OVX)‐induced bone loss. In this study, we showed that mast cell–deficient Mcpt5‐Cre R‐DTA mice were protected from OVX‐induced disturbed fracture healing, indicating a critical role for mast cells in the pathomechanisms of impaired bone repair under estrogen‐deficient conditions. We revealed that mast cells trigger the fracture‐induced inflammatory response by releasing inflammatory mediators, including interleukin‐6, midkine (Mdk), and C‐X‐C motif chemokine ligand 10 (CXCL10), and promote neutrophil infiltration into the fracture site in OVX mice. Furthermore, mast cells were responsible for reduced osteoblast and increased osteoclast activities in OVX mice callus, as well as increased receptor activator of NF‐κB ligand serum levels in OVX mice. Additional in vitro studies with human cells showed that mast cells stimulate osteoclastogenesis by releasing the osteoclastogenic mediators Mdk and CXCL10 in an estrogen‐dependent manner, which was mediated via the estrogen receptor alpha on mast cells. In conclusion, mast cells negatively affect the healing of bone fractures under estrogen‐deficient conditions. Hence, targeting mast cells might provide a therapeutic strategy to improve disturbed bone repair in postmenopausal osteoporosis. © 2021 The Authors. Journal of Bone and Mineral Research published by Wiley Periodicals LLC on behalf of American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR)., publishedVersion

Mastzellen (MZ) sind ein integraler Bestandteil des angeboren Immunsystems, welche verst��rkt an potenziellen Eintrittspforten f��r Pathogene angesiedelt sind. Trotz bekannter Interaktionen mit einer Vielzahl von Pathogenen, ist die Rolle der MZ im Rahmen einer Virusinfektion noch nicht vollst��ndig verstanden. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, welche Bedeutung der Interaktion von MZ und CD8+ T-Zellen bei einer Lymphozyteren Choriomeningitis Virus (LCMV) Infektion in vivo und in vitro zukommt. Hierf��r wurden Wildtyp (WT) und MasTRECK M��use intradermal mit LCMV infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion untersucht. Dabei diente das MasTRECK System als Modell f��r eine Mastzelldepletion, welche durch eine f��nft��gige Diphtherietoxingabe (DT-Gabe) erreicht wurde. Nach einer LCMV Infektion wurden in WT M��usen h��matopoetische Immunzellen zum Infektionsherd rekrutiert. Dieser Effekt war in mastzelldepletierten MasTRECK M��usen nicht zu beobachten. Dabei war neben der Rekrutierung auch die Proliferation von virusspezifischen CD8+ T-Zellen, in Abwesenheit von MZ, beeintr��chtigt. Ebenso war auch die Aktivierung sowie Funktionalit��t der Effektorzellen herabgesetzt, sodass die MasTRECK M��use nicht in der Lage waren die Viruslast in den Organen zu beseitigen. Als letzter Punkt sei die reduzierte H��ufigkeit und reduzierte Aktivierung der dendritischen Zellen (DZ) sowie der plasmazytoiden DZ (pDZ) in MasTRECK M��usen zu nennen. Es zeigte sich damit verbunden eine reduzierte IFN-�� Sekretion. Es l��sst sich zusammenfassen, dass w��hrend einer LCMV Infektion und in Abwesenheit von MZ die Reifung, Aktivierung und damit vermutlich auch die Funktionalit��t von DZ und pDZ beeintr��chtigt wurde. In dessen Folge k��nnte es zu einer weniger effektiven Initiierung einer antiviralen Immunantwort kommen. Dar��ber hinaus gilt es zu kl��ren welche Molek��le der MZ hierf��r essenziell sind. Auch der genaue Mechanismus der Modulation der antiviralen Immunantwort im Rahmen einer LCMV Infektion verbleibt ungekl��rt. Weitere Erkenntnisse in diesem Gebiet k��nnten helfen das komplexe Zusammenspiel von Immunzellen w��hrend einer Virusinfektion besser zu verstehen. Mittels jener k��nnte die Behandlungsqualit��t im klinischen Alltag verbessert werden und es k��nnten neue oder verbesserte Therapieans��tze abgeleitet werden., As a part of the innate immune system mast cells (MC) are strategically located at portals of entry, used by pathogens to enter the host. Although several studies have examined the role of MC in immune responses against pathogens, the role of MC during viral infections is still not completely understood. Therefore, we investigated the role of MC in the activation of CD8+ T cells using a well characterized model of viral infection, the lymphocytic choriomeningitis vi-rus (LCMV) infection model in vivo and in vitro. Wildtype (WT) and MasTRECK mice were infected intradermally with LCMV to analyze the development of virus-specific immune responses at different timepoints after the infection. MasTRECK mice were used as an inducible model for MC deficiency after treatment with diphtheria toxin for five consecutive days. WT mice were shown to recruit hematopoietic immune cells to the site of infection after an intradermal LCMV infection in contrast to MasTRECK mice. Furthermore, the expansion and recruitment of virus-specific CD8+ T cells to the secondary lymphoid organs and to the site of infection was reduced in absence of MC. In addition, MasTRECK mice displayed impaired CD8+ T cell activation and functionality which impeded viral clearance. Lastly, MasTRECK mice were shown to have reduced frequencies and less activated dendritic cells (DC) and plasmacytoid DC (pDC), which resulted in decreased IFN-�� levels in contrast that of infected WT mice. In summary, MC absence upon LCMV infection led to impaired maturation, activation and functionality of DC and pDC leading to defective virus-specific CD8+ T cell responses. The better understanding of the role of MC during immune cell responses will allow the develop-ment of novel therapeutic strategics against infections.

Mast cells (MCs) are important sensor and effector cells of the immune system that are involved in many physiological and pathological conditions. Increasing evidence suggests that they also play an important role in bone metabolism and bone disorders. MCs are located in the bone marrow and secrete a wide spectrum of mediators, which can be rapidly released upon activation of mature MCs following their differentiation in mucosal or connective tissues. Many of these mediators can exert osteocatabolic effects by promoting osteoclast formation [e.g., histamine, tumor necrosis factor (TNF), interleukin-6 (IL-6)] and/or by inhibiting osteoblast activity (e.g., IL-1, TNF). By contrast, MCs could potentially act in an osteoprotective manner by stimulating osteoblasts (e.g., transforming growth factor-β) or reducing osteoclastogenesis (e.g., IL-12, interferon-γ). Experimental studies investigating MC functions in physiological bone turnover using MC-deficient mouse lines give contradictory results, reporting delayed or increased bone turnover or no influence depending on the mouse model used. By contrast, the involvement of MCs in various pathological conditions affecting bone is evident. MCs may contribute to the pathogenesis of primary and secondary osteoporosis as well as inflammatory disorders, including rheumatoid arthritis and osteoarthritis, because increased numbers of MCs were found in patients suffering from these diseases. The clinical observations could be largely confirmed in experimental studies using MC-deficient mouse models, which also provide mechanistic insights. MCs also regulate bone healing after fracture by influencing the inflammatory response toward the fracture, vascularization, bone formation, and callus remodeling by osteoclasts. This review summarizes the current view and understanding of the role of MCs on bone in both physiological and pathological conditions.

Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war die nähere phänotypische und histo-logische Charakterisierung des Mastzellaktivitätssyndroms aus dem MCAD-Patientenkollektiv eines rheumatologischen Zentrums. Hierbei sollte der Zu-sammenhang zwischen der Ausprägung klinischer Symptome und dem histo-logischen Bild intestinaler Stufenbiopsien untersucht werden. Ferner sollten insbesondere muskuloskelettale Manifestationen der MCAD genau beschrie-ben und von koinzidenten entzündlich-rheumatischen Erkrankungen abge-grenzt werden. Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war die nähere phänotypische und histologische Charakterisierung des Mastzellaktivitätssyndroms aus dem MCAD-Patientenkollektiv eines rheumatologischen Zentrums. Hierbei sollte der Zusammenhang zwischen der Ausprägung klinischer Symptome und dem histologischen Bild intestinaler Stufenbiopsien untersucht werden. Ferner sollten insbesondere muskuloskelettale Manifestationen der MCAD genau beschrieben und von koinzidenten entzündlich-rheumatischen Erkrankungen abgegrenzt werden. Es wurden retrospektiv Daten einer monozentrischen Kohorte von Patienten mit MCAS ausgewertet ( 150 konsekutiven ambulanten und stationären Patienten, bei denen im Zeitraum 09/2015 bis 11/2016 nach den Kriterien von Valent et al. die Diagnose einer MCAD in der Klinik für Innere Medizin und Rheumatologie medius-Klinik Kirchheim Teck gestellt worden war). Die demographischen Charakteristika unserer Patientenkohorte entsprachen den bisher publizierten dermatologischen und gastroenterologischen Kohorten. Die Geschlechtsverteilung ist in unserer Studie deutlicher zugunsten Frauen verschoben. Die Häufigkeiten der gastrointestinalen, dermatologischen, kardiovaskulären, ZNS- und respiratorischen Symptome, sowie auch Fatigue-Symptomatik des untersuchten Patientenkollektivs war vergleichbar mit früher publizierten Kohorten. Muskuloskelettale Symptome sind die dritthäufigste klinische Manifestation der MCAD. Sie stellen dabei in unserem Krankengut einen häufigen Grund für einen Arztbesuch dar. Bei der histologischen Charakterisierung der MCAD konnte zum ersten Mal eine große Bedeutung der Ileum-Biopsien gezeigt werden, hier wurde die höchste Anzahl der pathologischen Befunde gefunden und dabei quantitativ auch die höchste Mastzelldichte/HPF. Die Mastzelldichte im Gewebe korrelierte nicht mit der erhobenen Punktzahl im Symptom-Fragebogen. Eine weitere Fragestellung der vorliegenden Arbeit war eine nähere Charakterisierung der muskuloskelettalen Manifestationen einer MCAD. Bei der Vergleichsanalyse der Patientengruppen mit isolierten MCAD und beiden Erkrankungen wurde ein signifikanter statistischer Unterschied für die Häufigkeit des Auftretens der Arthralgien, Myalgien und oralen Aphthen in der Gruppe mit koinzidenten entzündlich-rheumatischen Erkrankung festgestellt.

Die Mastzelltryptase ist eine Serinprotease, welche fast ausschließlich in der ubiquitär vorhandenen Mastzelle vorkommt, sodass man sagen kann, ihre Höhe korreliert mit der der Mastzellen. Material und Methode: 4185 erhobene Patientendaten in den Jahren 2005 und 2006 auf Höhe ihrer Serum-Trytasewerte und ICD-10 verschlüsselten Diagnosen sowie das Alter. Ergebnisse: Es zeigten sich Erkrankungen mit durchschnittlich erhöhten Serum-Tryptasewerten sowie ein altersabhängiger Anstieg der Serum-Tryptasewerte. Diskussion: Bei der Frage, ob die Abnahme der Serum-Tryptasewerte routinemäßig durchgeführt werden soll, um so frühzeitig Risikopatienten für anaphylaktische Reaktionen identifizieren zu können, konnten unsere Daten die Forderung einiger Arbeitsgruppen unterstützen, dies zu tun. Zusammenfassung: die Serum-Tryptase stellt ein allgemein deutlich unterschätzter wichtiger Prognosefaktor für mögliche anaphylaktische Reaktionen auf verschiedenste Allergene dar und zeigt gerade im Bereich der onkologischen Erkrankungen häufig überdurchschnittlich erhöhte Werte.

Seit 1996 wird den Mastzellen durch Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine eine wichtige Rolle bei der Initiierung der Abwehr einer bakteriell-induzierten Sepsis zugeschrieben. Die momentanen Mastzellmodelle - basierend auf Kit-Mutationen - haben einige Nachteile, weil auch andere Organsysteme betroffen sind. In der Arbeit soll die Auswirkungen der Mastzelllosigkeit anhand eines neuen Mausstamms (Mc-cpa cre/+) mit selektiven Mastzellmangel gezeigt werden. Im zweiten Teil soll die Rolle der Mastzell-Carboxypeptidase A (Mc-cpa) untersucht werden. Diese katalysiert den Abbau von Endothelin-1, einem starken Vasokonstriktor, welcher in der Sepsis stark erhöht ist und durch Minderperfusion weitere Komplikationen fördert. Als experimentelles Sepsismodell wird die Cecal Ligation and Puncture (CLP) gewählt. Die Konzentrationen ausgewählter Zytokine im Serum wird mit Hilfe eines Bead-Assays bestimmt. Die neuen mastzelllosen Mc-cpa cre/+-Tiere überlebten eine induzierte Sepsis besser als die bisher bekannten mastzelllosen WBB6F1 Kit W/Wv-Tiere (p

Mast cells (MCs) are sentinel cells of the immune system, residing in locations of interface between the body and environment. MCs function as initiators of defense against pathogens, however, they are also well known for their roles in allergic diseases. MCs are equipped with a host of receptors, including the high-affinity receptor for IgE, Fc epsilon R1, along with members of the Toll/IL-1 receptor family, which enables them to sense changes in their surrounding milieu. Depending on the precise extracellular stimulus, MCs respond by releasing preformed mediators from granules through a process called degranulation, and by de novo synthesis of lipid-derived mediators, cytokines and chemokines. The IL-1-type cytokine IL-33 induces the production of proinflammatory cytokines and chemokines from MCs. The first part of this study developed from an initial investigation to further detail IL-33-stimulated ERK1/2, p38 and cPLA2 signaling kinetics. We revealed that IL-33-stimulated MCs secrete factors within the first 30 min that are able to induce ERK1/2 and Akt phosphorylation in an autocrine fashion. We found that, similar to LTB4, these secreted factors triggered ERK1/2 and Akt activation in a Gi protein- and class IB PI3K-dependent manner. By employing PTX and pharmacological inhibitors targeting 5LO/FLAP, we revealed that 5LO-derived factors signaling through PTX-sensitive GPCRs play a part in IL-33-stimulated ERK1/2 signaling in bone marrow-derived MCs (BMMCs). This study also demonstrated that 5LO/FLAP activity and PTX-sensitive G proteins positively regulate IL-33-stimulated IL-6 production in BMMCs. Together, the results from the first part of this study suggest that IL-33 stimulation of MCs leads to the production of LTs by activated 5LO that regulate MC effector functions in an autocrine fashion. The second part of this project stemmed from previous work in our group recognizing the scaffold protein IQGAP1 as an interaction partner of Fc epsilon R1 in BMMCs. Through immunoprecipitation studies, we found that both IQGAP1 and one of its major binding partners, ß-catenin, are constitutively engaged in tyrosine-phosphorylated protein complexes in BMMCs. We showed that key factors required for Fc epsilon R1 signaling, namely the PTKs Lyn and Syk and the lipid phosphatase SHIP1, participate in these IQGAP1-containing protein complexes. To examine the functional relevance of IQGAP1 in antigen-stimulated MCs, we employed siRNA-mediated knockdown of IQGAP1 expression, achieving 50% reduction in IQGAP1 protein expression with this method. We found that IQGAP1 knockdown affected neither F-actin status nor ERK1/2 and Akt signaling in antigen-triggered BMMCs. However, IQGAP1 siRNA-treated BMMCs exhibited significantly attenuated antigen-stimulated degranulation and IL-6 production compared to cells treated with control siRNA, demonstrating that IQGAP1 positively regulates Fc epsilon R1 signaling inducing these effector functions. Collectively, we provide evidence that this scaffold protein participates in critical signaling complexes in MCs, acting as a positive regulator of Fc epsilon R1-mediated proinflammatory effector functions.

Belonging to the innate immune system, mast cells (MCs) are at the front line of the immune response. They are equipped with receptors capable of recognizing general pathogen-associated patterns, like the Toll-like receptors (TLRs), but also with the specific receptor for IgE, FcERI. Under certain circumstances, activation of the latter can lead to allergic reactions, to which MCs contribute by secretion of the powerful mediator histamine via degranulation of the cells. Apart from their role in allergies, they contribute to the immune response by releasing a varied set of mediators, like cytokines or eicosanoids, orchestrating the immune response based on the pathogens they recognize. Control of production of the important proinflammatory cytokines TNF-a and IL-6 is known to be regulated by various mRNA-binding proteins, influencing stability and translation of the respective transcripts. Research in macrophages has shown the importance of the p38-MK2-TTP axis for regulation of TNF-a mRNA stability and translation. In the first part of this study we examined a possible involvement of p38 and TTP in LPS-induced cytokine production in MCs. Initially, using pharmacological inhibitors we found strong dependence of LPS-induced IL-6, TNF-a and IL-1b production on p38 activation, whereas activation of the Erk pathway appeared dispensable. LPS treatment also induced p38-dependent gene expression of TTP. Unexpectedly, we found no significant differences between TTP-deficient and WT MCs in response to LPS, neither in gene expression or cytokine production of IL-6, TNF-a or IL-1b. Also, stability of TNF-a mRNA was not influenced by TTP deficiency in MCs. In contrast to TTP gene expression, TTP protein expression could not be detected in MCs. While we successfully precipitated and detected TTP from lysates of LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages, this was not possible from MC lysates. Otherwise we found gene and protein expression of the other TIS11 family members BRF1 and BRF2, their interaction with 14-3-3 proteins, and gene expression of Zfand5, all of which are connected to regulation of mRNA stability. These data suggest that control of cytokine mRNA stability and translation in MCs is exerted by proteins other than TTP. Most research in enzymes is in regard to their direct catalytic effector functions. Apart from catalytic domains, many enzymes also possess various domains involved in mediating interactions with other proteins. These interactions may have a big influence on the signaling in the cell, without activating the actual catalytic function of the protein. Previous work in our lab on the lipid phosphatase SHIP1 implied non-catalytic functions of the enzyme in the regulation of MC signaling. In the second part of this study we identified several novel interaction partners of SHIP1 using mass spectrometry. We confirmed interaction of these proteins with SHIP1 via immunoprecipitation. Many identified proteins were implicated in ubiquitin signaling, like CIN85, Nedd4 or STS1. We further concentrated on the interaction of SHIP1 and CIN85 and found that mostly the biggest isoforms of each protein are interacting. This interaction was constitutive and did not change after antigen treatment of MCs. We could confirm interaction of the two proteins in RBL-2H3 MCs using the proximity ligation assay for confocal microscopy.

SUMMARY Mast cell activation in allergic and inflammatory disease causes increased vascular permeability and edema. This thesis identifies a paracrine mechanism, by which heparin released from intracellular granules, is involved in mast cell-evoked alteration of endothelial barrier function in vivo. Negatively charged heparin initiated factor XII-driven contact activation. Activated factor XII triggered the formation of the inflammatory mediator bradykinin in plasma. Congenital deficiency and pharmacological targeting of factor XII and kinin B2 receptor provided protection from mast cell-heparin-induced leukocyte-endothelial adhesion and hypotension in rats and mice. Intravital laser scanning microscopy and tracer measurements showed that heparin increased leakage with fluid extravasation in skin microvessels in mice. Deficiency in factor XII or kinin B2 receptor conferred resistance to heparin-induced skin edema and largely protected mice from endothelial barrier dysfunction, caused by allergen-induced mast cell activation and anaphylactic reactions. In contrast, heparin and mast cell activation caused excessive edema formation in mice, deficient in the major inhibitor of factor XII, C1 esterase inhibitor. Hereditary angioedema patients, lacking C1 esterase inhibitor, suffered from allergeninduced edema. The data indicate that mast cell-heparin-initiated bradykinin formation plays a fundamental role in defective barrier function of pathological mast cell-mediated inflammation, hypotension and edema formation., ZUSAMMENFASSUNG Aktivierte Mastzellen sind bei Allergien und Entzündungskrankheiten an der Ödembildung beteiligt. Diese Arbeit zeigt, wie von aktivierten Mastzellen freigesetztes Heparin die Gefäßpermeabilität erhöht. Mastzell-Heparin aktiviert im Plasma den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet die Bildung des Entzündungsmediators Bradykinin durch Plasmakallikrein-vermittelte Spaltung von hochmolekularem Kininogen. Bradykinin führt zur Ödembildung und Vasodilatation. Bei Ratten und Mäusen blockieren Faktor XII- oder Kinin B2 Rezeptor-Inhibitoren die Heparin-induzierte und Bradykinin-vermittelte Leukozyten-Endothel Adhäsion und den arteriellen Blutdruckabfall. Um den Heparin-vermittelten Flüssigkeitsaustritt aus Mikrogefäßen in der Haut von Mäusen zu analysieren, wurde eine intravitale konfokale Mikroskopietechnik etabliert. Genetische Inaktivierung oder pharmakologische Blockierung von Faktor XII oder Kinin B2 Rezeptoren hemmen den Heparinvermittelten Flüssigkeitsaustritt. Sowohl in systemischen als auch in cutanen passiven Anaphylaxiemodellen waren Faktor XII- und Kinin B2 Rezeptor-defiziente Mäuse vor Allergen-induzierten Ödemen und anaphylaktischen Reaktionen geschützt. Im Gegensatz dazu führte eine Allergenexposition zu einer überschiessenden Ödembildung in C1 Esterase Inhibitor-defizienten Mäusen, bei denen das Gen für den wichtigsten Inhibitor von Faktor XII inaktiviert wurde. Bei Hereditären Angioödem- Patienten, denen funktionaler C1 Esterase Inhibitor fehlt, lösen allergischen Reaktionen Ödemattacken aus. Zusammenfassend zeigen diese Daten erstmals, dass die durch Heparin gestartet Bradykinin-Bildung, eine bedeutende Rolle bei der fehlerhaften Barrierenfunktion der pathologischen Mastzell-vermittelten Entzündungen, Blutdruckabfall und Ödembildung spielt.

[no abstract]

IPSE is an antigen of schistosoma mansoni, a helminth that can be found in tropical areas. IPSE causes mastcell degranulation without cross linking of IgE. The aim of this dissertation was to determine if IPSE binds to antibodies as a classical or a superantigen. Therefore we used mice with restricted antibody repertoire. The mice were limited in their ability to use any amino acid in the CDR-H3 region, which is the most important part of the classical antigen-binding site. We analyzed the B-lymphocytes of wildtype and two limited types of mice in FACS and the antibodies in ELISA. The expectation was, that differences in the ability to bind IPSE between the different types of mice would appear if IPSE was an classical antigen. If IPSE was a superantigen, there would be no differences to be found. As we did not find any differences, we concluded that IPSE is a superantigen., Die häufigsten allergischen Erkrankungen sind Asthma bronchiale, Neurodermitis und allergische Rhinitis. Diese Krankheiten nehmen an Inzidenz zu, sind für Betroffene sehr belastend und können lebensbedrohlich werden. Aktuelle Forschungsprojekte zielen darauf ab, die Mechanismen der Allergieentstehung besser zu verstehen, um dann spezifische Therapien entwickeln zu können. Die akute allergische Reaktion vom Typ I wird über IgE-Freisetzung vermittelt. Ein wichtiger Mechanismus hierbei ist die systemische Sensibilisierung bei einem Antigenkontakt und die folgende Aktivierung von Mastzellen bei erneutem Antigenkontakt durch Quervernetzung von Mastzell-gebundenem IgE, was zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren führt. Im Gegensatz zu klassischen Allergenen führt das Peptid Interleukin-4 induzierendes Prinzip von Schistosoma mansoni Eiern (IPSE) aus Schistosomeneiern schon beim ersten Antigenkontakt zur Mastzelldegranulation. Es bindet an Mastzell-gebundenes IgE, ohne dieses jedoch querzuvernetzen und weist damit andere Wege der Mastzellaktivierung auf als die bereits bekannten über eine systemische Sensibilisierung. Aus Voruntersuchungen ist bekannt, dass IPSE sowohl am Fc- als auch am Fab-Teil von IgE binden kann. Beide Bindungen sind für die Mastzelldegranulation relevant. Es ist unklar, ob die Bindung an den Fab-Teil über eine klassische Bindung oder eine Superantigenbindung erfolgt. Bei der Superantigenbindung bindet das Antigen an der Stelle des Antikörpers, die durch die Framework-Region des Variablen (VH) Fab-Teils kodiert wird. Die VH-Gensegmente werden in sieben Familien eingeteilt. Durch ein Superantigen werden in der Regel alle B-Lymphozyten aktiviert, die VH-Gene einer Familie exprimieren. Bei der klassischen Antigenbindung werden durch Bindung an die hypervariable „complemetarity determining region“ des Fab-Teils nur sehr wenige Zellen aktiviert. Die Fragestellung der folgenden Arbeit war, ob IPSE nach dem klassischen Prinzip oder als Superantigen bindet. Hierfür wurde die IPSE-Bindung durch B-Lymphozyten untersucht, die aus Mäusen stammten, die in ihrem Antikörperrepertoire eingeschränkt waren. Dabei wurden Wildtyp Balb/c Mäuse verglichen mit solchen, die überwiegend hydrophobe Aminosäuren in der klassischen Antigenbindungsstelle besitzen (= ∆-RF2 Maus) und mit solchen, die dort überwiegend geladene Aminosäuren besitzen (∆-iD Maus). Sollte die IPSE-Bindung über die klassische Stelle zustande kommen, so wäre ein Unterschied bei den verschiedenen Mauslinien zu erwarten. Bei einer Superantigenbindung wären keine Unterschiede zu erkennen. Wir etablierten Methoden zur Messung des Anteils IPSE-bindender B-Lymphozyten mittels FACS-Analyse und der IPSE-bindenden Antikörper mittels ELISA und konnten zeigen, dass es zwischen den verschiedenen Mauslinien keinen Unterschied in der IPSE-Bindungsfähigkeit gibt. Daraus lässt sich ableiten, dass die IPSE-Bindung höchstwahrscheinlich als Superantigen erfolgt. Dies erklärt die Mastzellaktivierung durch IPSE schon beim ersten Antigenkontakt. Weiterhin zeigte sich, dass die B-Lymphozyten der Peyer-Plaques des Darms einen geringeren Anteil IPSE-bindender Zellen enthalten als die der Milz und der Peritonealhöhle.

Mastzellen sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge im Körper beteiligt. Sie verfügen über ein breites Spektrum an gespeicherten sowie de novo synthetisierten inflammatorisch wirksamen Mediatoren, weshalb sie nicht nur - wie ursprünglich angenommen - bei allergischen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Mediatorfreisetzung reifer menschlicher Mastzellen zu vermitteln. Damit es zur Ausschüttung von Histamin, Proteasen, Zytokinen, Chemokinen und anderen Mediatoren kommen kann, müssen sekretorische Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren. An diesem Vorgang sind sogenannte SNARE-Proteine essenziell beteiligt. Diese werden allgemein in Vesikel¬membran (v) - und Ziel (target) membran (t) - SNAREs eingeteilt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine ganze Reihe von SNAREs in humanen Darmmastzellen exprimiert werden. Die t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4, -6 und Vti1b sowie die v-SNAREs VAMP-2, -3, -5, -7, - 8 konnten klar nachgewiesen werden, während SNAP-25, Syntaxin-1b und VAMP-4 nur schwach exprimiert vorliegen. Durch eine anschließende Markierung dieser Proteine mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern konnte deren Lokalisation in der Zelle mikroskopisch dargestellt werden. Es zeigte sich eine deutlich plasmamembranständige Anordnung der t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, während Syntaxin-2, Vti1b, VAMP-3, -7 und -8 in ruhenden Zellen zytoplasmatisch verteilt sind. Nach Aktivierung der Zellen änderte sich diese Anordnung jedoch für VAMP-7 und -8, die nach 15-minütiger Stimulation in Richtung Plasmamembran wanderten sowie Vti1b, das sich nach einer längeren Aktivierungsphase von 2 Stunden ebenfalls an den Zellrand verlagerte. In aktivierten Mastzellen gelang es außerdem, Kolokalisationen von SNAP-23, Syntaxin-3 und -4, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b sichtbar zu machen. Mittels Ko-Immunpräzipitation wurden Komplexbildungen von SNAP-23 mit Syntaxin-4, VAMP-7 und -8 bestätigt. Für die Aufklärung der funktionellen Bedeutung der jeweiligen SNARE-Proteine wurden einzelne SNAREs inhibiert. Hierzu wurden inhibitorische Antikörper in die Zelle eingebracht. Interessanterweise zeigte sich bei einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen eine Beteiligung an Ausschüttungs¬prozessen in Mastzellen. Die Freisetzung der gespeichert vorliegenden Beta-Hexosaminidase wurde durch Antikörper gegen SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b nach einer Stimulationszeit von einer Stunde deutlich reduziert. Erstaunlicherweise schien im Gegensatz dazu VAMP-7 im Falle einer längeren Aktivierungszeit der Zellen von sechs Stunden keine Rolle mehr zu spielen. Die gleichen SNAREs waren außerdem auch für die Freisetzung von LTC4 verantwortlich. Für die Ausschüttung der gemessenen Zytokine und Chemokine IL-5, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1-alpha und MIP-1-beta zeigte sich eine uneinheitliche Beteiligung von SNARE-Proteinen. Allerdings ergab sich durch die Inhibition von SNAP-23, Syntaxin-3 und Vti1b für alle gemessenen Zytokine eine fast vollständige Blockade der Freisetzung. Des Weiteren verursachten Antikörper gegen Syntaxin-6 eine signifikante Reduktion der Ausschüttung von IL-5, IL-8 und MCP-1 sowie eine tendenzielle Verminderung von IL 6, MIP-1-alpha und MIP-1-beta. Von den v-SNAREs VAMP-7 und -8 schien zum Teil das eine, zum Teil das andere für die Ausschüttung der verschiedenen Zytokine notwendig zu sein. Da für das Chemokin MIP-1-beta weder die Blockade von VAMP-7 noch VAMP-8 einen Effekt hervorriefen, könnte auch noch ein weiteres, nicht untersuchtes Mitglied der VAMP-Familie beteiligt sein. Die Inhibition von Syntaxin-4 führte nur für IL-8 zu einer deutlichen und signifikanten Reduktion der Freisetzung. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung verschiedener Mediatoren in humanen Darmmastzellen durch unterschiedliche SNAREs katalysiert wird und somit die Existenz spezifischer sekretorischer Vesikel und ein gezielter Transport von Mediatoren sehr wahrscheinlich sind. Eine Erklärung für die Beteiligung einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen an Ausschüttungsprozessen könnte sein, dass für das Ausbilden intrazellulärer Strukturen, die für die compound exocytosis notwendig sind, andere SNAREs verantwortlich sind, als für das Andocken von Vesikeln an der Plasmamembran. Ein detailliertes Verständnis der Mechanismen und der Beteiligung spezifischer SNARE-Proteine an der Freisetzung verschiedener Mediatoren menschlicher Mastzellen könnte eine Grundlage für neuartige Behandlungsformen von Allergien und Asthma bilden. Neue Therapieansätze könnten darauf abzielen, durch das zeitweilige Ausschalten bestimmter SNARE-Proteine eine gezielte Reduktion der Mediatorenfreisetzung zu erreichen. Mast cells are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes in the body. They posses a wide range of stored and de novo synthesized inflammatory mediators. Therefore they play an important role not only in allergic diseases - as it was originally assumed. The aim of the present work is to acquire a more detailed insight into the processes of mediator release of human intestinal tissue mast cells. To enable the release of histamine, proteases, cytokines, chemokines and other substances, it is necessary that secretory vesicles fuse with the plasma membrane. In this process so-called SNARE proteins are essentially involved. They are generally divided into vesicle membrane (v) - and target membrane (t) -SNAREs. The present work could show that a large number of SNAREs are expressed in human intestinal mast cells. The t-SNAREs SNAP-23, syntaxin-2, -3, -4, -6, Vti1b, and the v SNAREs VAMP-2, -3, -5, -7, -8 could be clearly detected, while SNAP-25, Syntaxin-1b and VAMP-4 were expressed only slightly. A subsequent visualization of these proteins by coupling with fluorescence-marked antibodies showed their localization in the cell. There is a clear arrangement of the t-SNAREs SNAP-23, syntaxin-3, -4 and -6 at the plasma membrane, whereas syntaxin-2, Vti1b, VAMP-3, -7 and -8 are distributed in the cytoplasm in resting cells. However, after activation of the cells for 15 minutes, this arrangement changed for VAMP-7 and -8 which moved in the direction of the plasma membrane, as well as Vti1b, which shifted after a prolonged activation phase of 2 hours also towards the cell edge. In activated mast cells colocalization of SNAP-23, syntaxin-3 and -4, VAMP-7 and -8, as well as Vti1b could be demonstrated. Using co-immunoprecipitation complex formation of SNAP-23 with syntaxin-4, VAMP-7 and -8 was confirmed. For the elucidation of the functional significance of individual SNARE proteins, respective SNAREs have been turned off. After transfection of human intestinal mast cells by using different transfection reagents failed, transfection of mast cells with siRNA by electroporation succeeded. However, it turned out that the electrically treated cells lost their ability to be stimulated. In contrast, blocking of the SNARE proteins achieved by using inhibitory antibodies was successful with no deterioration of cells. Interestingly enough it was revealed that a variety of SNARE proteins participate in degranulation processes in mast cells. The release of the prestored beta-hexosaminidase was significantly reduced by antibodies against SNAP-23, syntaxin-3, -4 and -6, VAMP-7 and -8 and Vti1b after a stimulation time of one hour. It could be noted that VAMP-7 seemed to play no role anymore in the case of a prolonged activation time of six hours. The same SNAREs were also responsible for the release of LTC4. The liberation of the cytokines and chemokines IL-5, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1-alpha and MIP-1-beta showed an inconsistent involvement of SNARE proteins. However, inhibition of SNAP-23, syntaxin-3 and Vti1b resulted in almost complete blockage of the release of all measured cytokines. Furthermore, antibodies against syntaxin-6 caused a significant reduction in the secretion of IL-5, IL-8 and MCP-1 and a trend towards a reduction of IL 6, MIP-1-alpha and MIP-1-beta. To different degrees both of the v-SNAREs VAMP-7 and -8 seemed to account individually for the release of different cytokines. Since release of the chemokine MIP-1-beta was not affected neither by the blockade of VAMP-7 nor by VAMP-8, another non-studied member of the VAMP family could be involved. Inhibition of syntaxin-4 led only for IL-8 to a marked and significant reduction in the release. In summary, it was shown that the release of different mediators in human intestinal mast cells is catalyzed by various different SNAREs and thus the existence of specific carriers and a targeted transport of mediators are very likely. One explanation for the involvement of a number of SNARE proteins in secretion processes may be that while some SNAREs are responsible for building up intracellular structures which are necessary for the compound exocytosis, some others are in charge of the docking of vesicles at the plasma membrane. A detailed understanding of the mechanisms and the involvement of specific SNARE proteins in the release of various mediators of human mast cells is the basis for new forms of treatments for allergies and asthma. New therapeutic approaches might aim through the temporary deactivation of certain SNARE proteins to achieve an intended reduction of mediator release.

Zusammenfassung 1. Hintergrund und Ziele Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine Rolle als Mediator bei Entzündungsprozessen und Allergien. Ziel dieser Untersuchung war es, eine direkte Antwort auf unspezifische und spezifische immunologische bzw. exogene Stimuli an gastrointestinalen Mukosamastzellen zu detektieren, um möglicherweise ein schnelles Instrument zur Immun- und Allergiediagnostik zu etablieren. 2. Methoden Es wurden hierzu Biopsien (n=156) aus dem unteren GIT von 17 Patienten mit gesicherter Nahrungsmittelallergie, 5 Patienten mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung und 4 Kontrollpatienten gemessen. Verwendet wurde eine NO-Sonde (WPI GmbH, Berlin), die Zellen wurden vital inkubiert (Mukosa-Oxygenations-Methode, 37°C, pH 7,0 und pO2 90mmHg). Eine Stimulation erfolgte mit unspezifischen Noxen, Ethanol 96% und Endotoxin (LPS), mit immunspezifischen Stimuli Anti-IgE, Anti-IgG, jeweils bereits bekannten Allergenen, sowie Histamin. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Es zeigte sich keine signifikante Freisetzung von NO bei immunspezifischer Stimulation mit Allergenen und Anti-IgG; Ethanol als toxische Substanz konnte eine NO-Freisetzung verursachen. Als Positivkontrolle wurde Ca-Ionophor benutzt, welches durch die Erhöhung des intrazellulären Calciums eine NO-Freisetzung auslöst. Anti-IgE konnte in der Allergiegruppe bei 2 von 11 Patienten (18%) eine NO-Freisetzung auslösen. Die NO-Produktion war nicht mit einer Histaminfreisetzung korreliert, Histamin konnte aber in der Allergiegruppe bei 2 von 3 Patienten (66%) sekundär eine NO-Freisetzung triggern. Eine allergeninduzierte Produktion konnte somit nicht nachgewiesen werden, jedoch eine NO-Produktion auf unspezifische Reize. 4. Praktische Schlussfolgerungen Diese Daten an lebenden humanen Darmbiopsien zeigen, dass die NO-Produktion am Darm ein unspezifisches, inflammatorisches Signal der angeborenen Immunität (innate immunitiy) anzusehen ist, welches einer komplexen Regulation unterliegt, zu deren genauer Entschlüsselung es noch weiterer Forschung bedarf. Summary 1) Introduction Nitric oxide (NO) plays a role as a mediator in inflammatory processes and allergies. Object of this study was to detect a direct answer to unspecific and specifically immunologic respectively exogenic stimuli in gastrointestinal mucosal mast cells to possibly establish a rapid instrument for immune and allergy diagnosis. 2) Materials and Methods Biopsies (n=156) from the lower gastrointestinal tract of 17 patients with confirmed food allery, 5 patients with chronic inflammtory bowel disease and 4 control patients were mesured. An NO-Probe (WPI GmbH, Berlin) was used, cells were incubated vitally (mucosa-oxigenation-method, 37°C, pH 7,0, pO2 90mmHg). Stimulation was accomplished with unspecific noxas, ethanol 96% and endotoxine (LPS), with specifically immunologic stimuli Anti-IgE, Anti-IgG, at any one time confirmed allergies, as well as histamine. 3) Results There was no sicnificant release of NO after specifically immunolgic stimulation with allergens and Anti-IgG; ethanol as a toxic substance was able to determine NO release. Ca-Ionophore, which causes NO release through increase of intracellular calcium, was used as positive control. Anti-IgE was able to induce NO release in 2 of 11 patients (18%) of the allergy group. NO production was not correlated to histamine release, but histamine could trigger a derivative NO release in 2 of 3 patients (66%) of the allergy group. An allergy induced production could not be demonstrated, however NO production in respose to unspecific stimuli. 4) Discussion This data of vital human gut biopsies show, that NO production in the gut has to be considered an unspecific, inflammatory signal of innate immunity, which is subject to complex regulation, of which decoding deserves further investigation.

Allergieerkrankungen gewinnen in der heutigen Gesellschaft zunehmend an Bedeutung. Sie beruhen auf einer Überreaktion des körpereigenen Immunsystems, die ihren Ausdruck in verschiedenen Krankheitsbildern, wie beispielsweise Heuschnupfen oder Asthma, findet. Wesentlich beteiligt an einer allergischen Reaktion sind Mastzellen, die überall dort zu finden sind, wo sich der Körper im direkten Kontakt zur Außenwelt befindet. Nach deren Aktivierung entlassen sie den Inhalt ihrer Mastzell-Granula, der hauptsächlich aus Tryptasen besteht, in die unmittelbare Zell-Umgebung. Viele Studien lassen einen engen Zusammenhang von Tryptase-Aktivität und Asthma-Erkrankung vermuten ? ein Umstand, der eine genaue strukturelle Untersuchung von Tryptasen erfordert. Humane Mastzell-Tryptasen repräsentieren eine Unterfamilie der Trypsin-artigen Serinproteinasen. Mehrere Tryptase-Isoformen sind auf genomischer Basis identifiziert worden, unter ihnen die a-Tryptasen aI und aII und die b-Tryptasen bIa, bIb, bII und bIII. Während die b-Tryptasen als vollständig aktive Serinproteinasen mit einer Trypsin-artigen Spezifität charakterisiert worden sind, konnte für a-Tryptasen bisher kein Substrat identifiziert werden. a-Tryptasen werden daher als inaktiv angesehen. Im Rahmen dieser Arbeit sind Vertreter dieser beiden Tryptase-Familien strukturell und biochemisch untersucht worden. b-Tryptasen bilden die vorherrschende Tryptase-Art in den Mastzell-Granula. Ihre wesentliche Rolle in diversen allergischen Erkrankungen macht deren selektive Inhibition zu einem wichtigen pharmakologischen Ziel. Hier werden die Kristallstrukturen der bisher ungelösten b-Tryptase-Isoformen bIa und bIII im Komplex mit den drei bifunktionalen Inhibitoren NS222, BYK76935 und BYK150640 vorgestellt. Hierbei konnte der bisher lediglich postulierte, durch Heparin-Bindung stabilisierte, rahmenartige Aufbau des b?Tryptase-Tetramers, bei dem die aktiven Zentren der vier beteiligten Monomere in die zentrale Pore zeigen, bewiesen werden. Die genaue Kenntnis der relativen Lage der aktiven Zentren eröffnet zugleich die Möglichkeit, spezielle bivalente und daher besonders selektive Tryptase-Inhibitoren zu entwickeln. Erstmalig konnte die wahrhaft bifunktionale Inhibitor-Bindung an zwei benachbarte aktive Zentren des b-Tryptase-Tetramers strukturell nachgewiesen werden. Für BYK76935 wurde ein unerwartet neuer bifunktionaler Bindungsmodus gezeigt. Die Kristallstrukturen der drei Inhibitoren im Komplex mit den b-Tryptase Isoformen liefern wertvolle Erkenntnisse für die weitere Optimierung der vorhandenen Leitstrukturen und eröffnen zusätzlich neue Perspektiven für das Design einer neuen Klasse von Tryptase-Inhibitoren. Als Mitglied der a-Tryptasen, der vorwiegenden Tryptase-Isoform in Basophilen, ist die Struktur der aI-Tryptase gelöst worden. Sie besitzt eine ähnliche, wenn auch ungleich stabilere Tetramerarchitektur wie die b-Tryptasen. Strukturell liegt diese erhöhte Tetramer-Stabilität in relativ kleinen Variationen im A-B-Interface begründet. Besonders auffällig ist das ?aktive? Zentrum der aI-Tryptase, das in einer bisher in Serinproteinasen noch nie beobachteten, inaktiven Konformation vorliegt. In starkem Kontrast zu anderen Trypsin-artigen Serinproteinasen verläuft das Ser214-Gly219-Segment, das normalerweise für die antiparallele Substratbindung verantwortlich ist, zick-zack-artig quer über die Substratbindungs-Region und blockiert hierbei sämtliche Substrat-Bindungstaschen. Daß a-Tryptasen aber dennoch aktiviert werden können, wurde in dieser Arbeit gezeigt. Eine solche Aktivierung muß mit einer Umordnung des inaktiven ?aktiven? Zentrums der a-Tryptasen einhergehen. Kinetische Untersuchungen mit den peptidischen Substraten N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA und N-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA erlaubten es, diese Tryptase-Isoform als eine sehr langsame Proteinase zu charakterisieren. Es wird daher ein Mechanismus postuliert, nach dem die Substrateinwirkung, möglicherweise zusätzlich durch Interaktion mit einer Exosite, die Umlagerung der inaktiven Form der aI-Tryptase in eine proteolytisch aktive Form bewirkt. In society today allergic diseases become more and more important. They are based on an over activity of the immune system resulting in a variety of clinical conditions ranging from rhinitis to asthma. A major player within the allergic reaction are mast cells, that are located everywhere, where the body is in direct contact with the environment. Upon their activation they release the content of the mast cell granula, which mainly consists of tryptases, into the surrounding medium. Many studies allow to propose a tight connection between tryptase activity and asthma, a situation, that demands a close structural investigation of tryptases. Human mast cell tryptases represent a sub-family of trypsin-like serine proteinases. Several tryptase isoforms have been identified on the genomic level, among them the a-tryptases aI and aII and the b-tryptases bIa, bIb, bII and bIII. While b-tryptases are characterized as fully active serine proteinase with a trypsin-like specificity, no substrate could be identified for a-tryptases, so far. Hence a-tryptases are considered inactive. In this dissertation members of both tryptase-families were structurally and biochemically investigated. b-Tryptases represent the predominant tryptase isoform in the mast cell granula. Their major role in several allergic disorders makes their selective inhibition an important pharmaceutical goal. Here, the crystal structures of the so far unsolved b-tryptase isoforms bIa and bIII are presented in complex with the three bifunctional inhibitors NS222, BYK76935 and BYK150640. The until now only postulated, heparin-stabilized frame-like tetrameric assembly of the b?tryptase monomers with their active sites directed into the central pore could be proved. Knowing the exact relative position of the active sites within the tetramer provides the unique possibility of designing bifunctional inhibitors to span the gap between them. For the first time, a truly bifunctional binding mode to two neighbouring active sites could be shown crystallographically. Unexpectedly, for BYK76935 a novel bifunctional binding mode was discovered. The crystal structures of all three inhibitors in complex with the b-tryptase isoforms provide valuable Information for further improvement of the present lead compounds and additionally open up new perspectives towards the design of a new class of tryptase inhibitors. As a member of the predominant tryptase family in basophils, a-tryptases, the crystal structure of aI-tryptase was solved. aI-Tryptase possesses a similar, even though far more stabile, tetramer architecture as b-tryptases. This increased stability is structurally based on small differences within the A-B interface. Very apparent is the ?active? site of aI-tryptase which is arranged in a conformation, that has never been observed in serine proteinases. In stark contrast to other trypsin-like serine proteinases the Ser214-Gly219 segment, that normally provides for the antiparallel substrate binding now runs zig-zag-like across the substrate binding region and thereby blocks all substrate binding pockets. In this dissertation is was shown, that a-tryptase can nevertheless be an active proteinase. Such an activation involves a reorganization of the inactive ?active? site of a-Tryptase. Kinetic investigations with the model-substrates N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA and N-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA allowed it to characterize this tryptase isoform as a very slow proteinase. Hence a mechanism is postulated, in which the interaction with the correct substrate, possibly involving interaction within an exosites, causes a rearrangement of the inactive form of aI-tryptase into a proteolytically active form.

Mastzellen (MZ) reifen zu terminal differenzierten Zellen erst in peripheren Geweben. ATRA ist ein wesentlicher Regulator der Hämatopoese und kann auf positive wie auf negative Weise deren Differenzierung beeinflussen – die Qualität ist dabei häufig abhängig vom Reifegrad. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der Frage, ob die Effekte von ATRA auf MZ ebenfalls abhängig von deren Reifegrad sind. Unreife HMC-1 5C6 Zellen, differenziertere LAD 2 Zellen und reife kutane MZ (KMZ) wurden mit ATRA behandelt und die Effekte auf spezifische Mastzellmarker auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Die Proteinexpression von c-kit, FceRI, Tryptase und Chymase wurde bei allen drei Zellsystemen herunterreguliert. Änderungen der Proteinexpression wurden qualitativ, wenngleich nicht immer quantitativ auf mRNA-Ebene reflektiert, d.h. es gab Marker, bei denen die Herunterregulation auf der einen oder anderen Ebene überwog. Eine genaue Quantifizierung der ATRA-Effekte auf die Tryptase und Chymase zeigte eine prozentual erheblich stärkere Herunterregulation der mRNA als des Proteins. Invers dazu war der Effekt bei c-kit, ein Effekt, der besonders deutlich bei HMC-1 5C6 auszumachen war. Zur Klärung, welcher Mechanismus der von der mRNA-Ebene unabhängigen Herunterregulation des c-kit-Proteins zugrunde liegt, wurden HMC-1 5C6 zusätzlich zu ATRA mit Inhibitoren fundamentaler Zellfunktionen inkubiert. Cycloheximid allein war dabei in der Lage, die Wirkung von ATRA zu imitieren. Es kann also vermutet werden, dass die starke Herunterregulation des Proteins im Vergleich zur mRNA einem translationellen Mechanismus folgt. Betrachtet man alle Effekte gemeinsam, so zeigte ATRA den stärksten Einfluss auf das am weitesten differenzierte Mastzellsystem, nämlich KMZ. Geringer waren die Effekte bei LAD 2, wohingegen bei HMC-1 5C6 das schwächste Ansprechpotential gegenüber ATRA gefunden wurde. Dies ist von besonderem Interesse, weil ATRA normalerweise wesentlich potenter auf unreif-proliferierende Systeme wirkt. ATRA hat auf humane MZ einen deutlich dedifferenzierenden Effekt, der weitgehend unabhängig vom Reifegrad der Zellen operiert. Die Effekte scheinen dabei in Abhängigkeit vom betrachteten Marker nicht auf die transkriptionelle Ebene beschränkt zu sein, sondern könnten auch einem translationellen Mechanismus unterliegen., Mast cells (MC) are of hematopoietic origin but complete their differentiation exclusively within tissues. A large number of mediators positively or negatively affect the maturation process of MC. ATRA is a potential master regulator of haematopoiesis, where it primarily affects immature and proliferative leukocytes. Here, the effects of ATRA (3-7d) on MC that span different stages of maturation, i. e. immature-leukemic HMC-1 5C6 cells, intermediately matured LAD 2 cells, and terminally differentiated skin MC were analyzed. The expression of the lineage markers c-kit, FceRI, tryptase, chymase und histidindecarboxylase (HDC) was studied in parallel at protein level by flow-cytometric analysis and at mRNA level by RT-PCR. ATRA exposure led to a down-regulation at protein and at mRNA level of c-kit, FceRI, tryptase and chymase by all MC subtypes. Comparing protein and transcript levels, however, substantial differences between c-kit and the proteases were noted. c-kit down-regulation was more pronounced at protein level, whereas the opposite was found with proteases. Further analysis revealed the existence of a second mechanism of c-kit down modulation that proceeded rapidly and independently of mRNA changes. This pathway was restricted to immature MC and could be mimicked by cycloheximide, suggesting that altered translation may account for the phenomenon. Taken together, the study indicates that MC are significant target cells of ATRA throughout their lifespan, but that the molecular events underlying down-regulation of lineage markers may be shifted in the course of MC differentiation. The strongest effects of ATRA were observed in mature MC, while this accounts to a lesser degree for LAD 2 cells. In contrast, the immature and highly proliferating HMC-1 5C6 cells presented even less sensitive to ATRA. Therefore, ATRA has dedifferentiating potential towards human MC that is most pronounced in mature MC. Depending on the specific marker, protein down regulation can underlie various mechanisms. In this regard, c-kit seems to follow a translational rather than transcriptional inhibitory process.

Die Synthese und -Freisetzung von FGF-2 aus humanen dermalen Mastzellen Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) ist ein Mitglied einer großen Familie von Wachstumsfaktoren. FGF-2 fördert das Wachstum und die Entwicklung von Blutgefäßen (Angiogenese) und nimmt somit Einfluss auf Wundheilungsprozesse, Gewebeentwicklung, als auch verschiedene pathologische Vorgänge im Organismus. Mastzellen wurden lange Zeit allein als Effektorzellen der Typ I Allergiereaktion betrachtet. Mittlerweile betrachten man sie auch als wichtige Zellen für die Gewebe Homöostase und Wundheilung. In der vorliegenden Arbeit wurden MC aus humenen dermalen Gewebe isoliert, um deren FGF-2 Synthese und –Freisetzung zu untersuchen. Die Zellen wurden mit verschiedenen proinflammatorischen Mediatoren stimuliert. FGF-2 wurde mit ELISA und PCR Methoden bestimmt. Durch Stimulationen mit a–IgE, SP, IL–4, IL–6 und IL–8 wurde eine gesteigerte FGF–2–Synthese induziert. Weiterhin zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass bei der Degranulation der MC FGF-2 freigesetzt wird, auch wenn der zugrunde liegende Mechanismus für die Freisetzung weiterhin unklar bleibt. UVA1–und PUVA1–Bestrahlung hatten einen inhibieren Effekt auf die Sekretion des Proteins. Synthesis and release of FGF-2 from human dermal mast cells Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) is a member of a large family of proteins. FGF-2 stimulates the growth and development of new blood vessels (angiogenesis) that contribute to the pathogenesis of several diseases (i.e. atherosclerosis), normal wound healing and tissue development. Mast cells are traditionally viewed as effector cells of immediate type hypersensitivity reactions. There is, however, a growing body of evidence that the cells might play an important role in the maintenance of tissue homeostasis and repair. In this present investigation we isolated MC from human tissue to investigate their FGF-2 synthesis and release after stimulation with different proinflammatory mediators. To detect FGF-2 we used ELISA and PCR technique. We could show the up-regulation of FGF-2 synthesis after stimulation with a-IgE, SP, IL-4, IL-6 and IL-8. Within the degranulation of MC there was a release of FGF-2 even though the mode of release still remains unclear. Through UV-light radiation we could show a downregulation of FGF-2 release.

Die Rolle der Mastzelle (MC) als Effektorzelle in IgE-abhängigen Prozessen wie der Typ I Allergie ist seit langem bekannt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass MC in weitere pathophysiologische Prozesse wie der Tumorentwicklung, rheumatoiden Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED), Gewebsfibrose und Arteriosklerose involviert sind. Aber auch bei physiologischen Prozessen, z.B. der Abwehr von bakteriellen und parasitären Erkrankungen, der Wundheilung und Angiogenese sowie der Neuro-Immun-Interaktion, spielen MC eine Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle menschlicher Darm-MC bei der Immunantwort gegen Pathogene untersucht. Es wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1. Exprimieren menschliche Darm-MC Toll-like Rezeptoren (TLR), die konservierte Strukturen von Bakterien und Viren erkennen, und sind sie durch TLR-Liganden aktivierbar? 2. Führt die Infektion menschlicher Darm-MC mit verschiedenen E. coli und Shigellen Stämmen zur Aktivierung und welche Mechanismen liegen dieser Aktivierung zugrunde? Hierfür wurden MC mittels mechanischer und enzymatischer Aufbereitung aus der Mukosa chirurgischer Darmresektate isoliert. Nach Aufreinigung durch Positivselektion und mehrwöchiger Kultur betrug die MC-Reinheit 98-100%. Es konnte gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC mRNA für TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 exprimieren, allerdings tolerant gegenüber TLR-Liganden sind. Stimulation menschlicher Darm-MC mit LPS (Lipopolysaccharide, TLR 4 Ligand), LTA (Lipoteichonsäure, TLR 2 Ligand), Zymosan (TLR 2 Ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 Ligand), R848 (TLR 7/8 Ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 Ligand) bzw. Non CpG führten weder zur Freisetzung von Histamin, Leukotrienen, TNF-alpha oder IL-8, noch zur mRNA-Expression von TNF-alpha oder IL-8. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Infektion menschlicher Darm-MC mit dem Stuhlisolat E. coli (O101:H-) oder dem probiotischen Stamm E. coli Nissle 1917 beobachtet. Selbst die pathogenen Bakterien-Stämme, wie der invasive S. flexneri M90T und der FimH-exprimierende E. coli ORN 103(pSH2), induzierten keine signifikante Freisetzung der oben genannten Mediatoren. Zwar führten E. coli Stämme bei menschlichen Darm-MC zur Aktivierung der intrazellulären Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren ERK1/2, c-Fos und AP1. Diese Aktivierung reichte allerdings nicht aus, um eine vollständige Immunantwort auszulösen. Interessanterweise bewirkten die hämolytischen E. coli Stämme ATCC 25922 und 35218 eine starke Aktivierung menschlicher Darm-MC. Mit Hilfe isogener Hämolysin-negativer E. coli Mutanten und der Hämolysin positiven Transformante des probiotischen E. coli Nissle 1917 konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC sensible Effektorzellen für E. coli alpha Hämolysin sind. Sublytische Hämolysin Konzentrationen führten bei menschlichen Darm-MC über einen Kalzium-abhängigen Signalweg zur mRNA-Expression von TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 und zur Freisetzung von Histamin und Leukotrienen. Der Einsatz von Inhibitoren intrazellulärer Signalmoleküle zeigte weiterhin, dass die durch Hämolysin bedingte Aktivierung der Zellen abhängig von L-Typ Kalzium Kanälen, Calcineurin und NFAT bzw. NFkappaB ist. Ansteigende Hämolysinkonzentrationen führten zur zweiten Phase der Aktivierung, die durch eine Lyse der Zellen gekennzeichnet war. The role of mast cells (MC) as effector cells in IgE dependent processes like the type 1 allergy has been known for a long time. During the decade, it has been shown that MC are also involved in other pathophysiological processes such as mucosal polyposis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowl disease, tissue fibrosis, and atherosclerosis. Furthermore, MC play an important role in the regulation of host defense against microbes, tissue remodeling processes, and neuro-immunology-interaction. The first aim of the present study was to clarify the question whether human intestinal MC express toll-like receptors (TLR), which recognize conserved bacterial and viral components, and can MC be activated through TLR-ligands. The second major focus of the present study was to investigate if the stimulation of human intestinal MC with different E. coli and Shigella strains, respectively, results in an activation of MC and to identify the underlying mechanism(s). Accordingly, human intestinal MC were isolated from surgery tissue with a mechanical and enzymatical protocol. The purity of the MC cultures used in all experiments was between 98 and 100% which was achieved by positive selection (MACS). We could show, that human intestinal MC express mRNA for TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 9. However, neither the stimulation with LPS (lipopolysaccharide, TLR 4 ligand), LTA (lipoteichoic acid, TLR 2 ligand), Zymosan (TLR 2 ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 ligand), R848 (TLR 7/8 ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 ligand) and non CpG, respectively resulted in a release of histamine, leucotriens, TNF-alpha, or IL-8. Furthermore, mRNA expression levels of TNF-alpha and IL-8 were not induced by any of the treatments. Similar results where found when human intestinal MC were stimulated with E. coli (O101:H-) isolated from human faeces or the probiotic strain E. coli Nissle 1917. Even after stimulation with pathogenic bacteria strains such as the invasive S. flexneri M90T and the fimbriated E. coli, respectively, no induction of any of the parameters mentioned above was found. However, E. coli strains activate the intracellular signal molecule and transcription factors ERK1/2, c-Fos, and AP1, but this activation failed to induce a complete immune answer. In contrast, the hemolytic E. coli stains ATCC 25922 and ATCC 35218 provoked strong activation of intestinal MC. Using the isogenic hemolysin negative E. coli mutants and the hemolysin positive transformants of the probiotic E. coli Nissle 1917 it was shown, that human intestinal MC are sensitive target cells for E. coli alpha hemolysin. Stimulation of MC with sublytic concentration of hemolysin resulted in an induction of TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 mRNA expression, the release of histamine as well as leucotrien. This activation was found to be regulated by calcium dependent signal cascades. Inhibition of intracellular signal molecules showed that the activation depends on L-typ calcium channels, calcineurin, NFAT and NFkappaB. Prolonged infection with hemolytic E. coli strains resulted in lysis of intestinal MC indicating a biphasic activation of hemolysin.

Ill., graph. Darst.

Das Vorkommen serotoninhaltiger Mastzellen in sympathischen Ganglien der Ratte ist bekannt. Das Vorkommen der Serotoninrezeptoren der Typen 2A und 3 ist aus verschiedenen Untersuchungen u.a. auf mRNA- und elektrophysiologischer Basis bekannt, nicht jedoch ihre zelluläre Lokalisation in den sympathischen Ganglien. In dieser Arbeit wurden im Ggl. cervicale superius und im Ggl. stellatum der Ratte 1.) die topographische Verteilung der Mastzellen innerhalb der Ganglien, eine mögliche topographische Beziehung zum Perineurium und zu den endoneuralen Gefäßen, 2.) das Vorkommen des Serotoninrezeptors 5-HT3 an Neuronen, Satellitenzellen und cholinergen Synapsen sowie 3.) das Vorkommen des Serotoninrezeptors 5-HT2A an Gefäßen immunhistochemisch untersucht. Mit Hilfe der Primärantikörper gegen die folgenden in Klammern genannten Antigene wurden Mastzellen (Serotonin), 5-HT2A-Rezeptoren, Endothelien und Perineurium (GluT-1) sowie selektiv Endothelien (RECA-1), Neurone (PGP 9.5), Satellitenzellen (Vimentin), 5-HT3-Rezeptoren sowie cholinerge Synapsen (VAChT, Synaptophysin) markiert. Es wurden neben einer Einfachmarkierung von Serotonin Doppelmarkierungen von Serotonin mit jeweils GluT-1 und RECA-1, eine Doppelmarkierung von GluT-1 und RECA-1 sowie des 5-HT2A-Rezeptors und RECA-1 angefertigt; außerdem Doppelmarkierungen des 5-HT3-Rezeptors jeweils mit PGP 9.5, VAChT, Synaptophysin und Vimentin. Danach erfolgte zur Quantifizierung eine überwiegend elektronische Bildvermessung und statistische Auswertung. Pro Ganglion ließen sich 31±22 serotoninpositive Mastzellen finden; Serotonin-Immunreaktivität war niemals an Neuronen, Glia und Gefäßen nachweisbar. Die Verteilung der Mastzellen erwies sich topographisch als homogen und übereinstimmend zwischen Ganglion cervicale superius und Ganglion stellatum. Auffällig war die ausgeprägte intra- und extraganglionäre Anhäufung der serotoninhaltigen Mastzelle im Bereich des Perineuriums; fast ein Viertel aller Mastzellen ließ sich unmittelbar dort lokalisieren. Die RECA-1-positiven Gefäße waren homogen in den sympathischen Ganglien verteilt und kamen häufiger als die GluT-1-positiven vor, die in bestimmten Regionen ohne erkennbare Regelmäßigkeit eine geringere Dichte aufwiesen. Auffallend war, dass sich die Mastzelle durchschnittlich 5 µm vom nächsten RECA-1-positiven Gefäß, jedoch 30 µm vom nächsten GluT-1-positivem Gefäß entfernt befand. Der Durchmesser des der Mastzelle nächstgelegenen Gefäßes betrug 22 µm±10 µm; anhand des Wandaufbaus ließen sich die meisten dieser Gefäße als postkapilläre Venulen identifizieren. 5-HT2A-Rezeptoren fanden sich an einem Teil der RECA-1-positiven Gefäße, der mit zunehmendem Kaliber signifikant stieg und die sich unter Einbeziehung der Wandstruktur als postkapilläre Venulen identifizieren ließen. Der 5-HT3-Rezeptor ließ sich immunhistochemisch an Perikaryen, im Neuropil und an Satellitenzellen detektieren, jedoch nicht an cholinergen Präsynapsen. Alle Ergebnisse dieser Arbeit galten gleichermaßen für das Ganglion cervicale superius und das Ganglion stellatum der Ratte. Mastzellen können in sympathischen Ganglien immunologisch und neuropeptiderg aktiviert werden. Eine Aktivierung von serotoninhaltigen Mastzellen durch die neuronal sezernierten Peptide SP und CGRP wurde u.a. für die Gl. lacrimalis sowie für die Mukosa des Magens beschrieben. SP wird im Ganglion cervicale superius in präganglionären Neuronen und in Kollateralen von unmyelinisierten sensiblen Fasern gefunden, die zu primär afferenten Neuronen gehören; SP ist in ihnen oft mit CGRP kolokalisiert. Vornehmlich Endothelien von postkapillären Venulen tragen den 5-HT2A-Rezeptor; eine serotonerge Permeabilitätserhöhung durch die Mastzelle ist somit möglich. Es ist prinzipiell bekannt, dass die Mastzelle beim peripheren Nerven via Serotonin auf die 5-HT2A-Rezeptoren der Schwannschen Zellen und des Gefäßbettes wirken kann. Möglicherweise kann die Mastzelle auch serotonerg die Funktion der 5-HT3-Rezeptor-tragenden Satellitenzellen beeinflussen und somit eine weitere, die Neurone direkt umgebende Barriere beeinflussen. Serotonin löst im Ganglion cervicale superius und Ganglion stellatum eine Depolarisation aus und kann überdies neben Acetylcholin als physiologischer Kotransmitter in sympathischen Ganglien aufgefasst werden, der während der Entwicklung mindestens in einem ontogenetischen Stadium funktionell aktiv ist. Für die Induktions- und Aufrechterhaltungsphase der tetanisch induzierten LTP ist im Ganglion cervicale superius die Aktivierung von 5-HT3-Rezeptoren sogar essenziell notwendig, so dass dem durch Mastzellen sezernierten Serotonin hierbei eine Schlüsselrolle zukommt. Außerdem ist bekannt, dass eine spezifisch-immunologische Aktivierung residenter Mastzellen die sog. Antigen-induzierte Langzeitpotenzierung auslöst, die durch Synergismus verschiedener Mediatoren außer Serotonin und Histamin zustandekommt und somit eine weitere Form mastzellinduzierter synaptischer Plastizität darstellt. Schlussfolgerung: Lokalisation der Mastzellen und der 5-HT2A- und 5-HT3-Rezeptoren legen eine serotoninvermittelte Regulation der Gefäßpermeabilität und der neuronalen Erregbarkeit durch Mastzellen in sympathischen Ganglien nahe. The occurence of mast cells containing serotonin in sympathetic ganglia of the rat ist commonly known. In this study the superior cervical and the stellate ganglion of the rat were analysed immunohistologically regarding (1) the topographical distribution of mast cells within the ganglia, a possible topographical connection with the perineurium and the endoneural blood vessels, (2) the occurence of the serotonin-receptor 5-HT3 on neurons, satellite cells and cholinergic synapses as well as (3) the occurence of the serotonin-receptor 5-HT2A on blood vessels. Using primary antibodies against the following antigens (in brackets) mast cells (Serotonin), 5-HT2A-receptors, endothelia and perineurium (GluT-1), as well as selective endothelia (RECA-1), neurons (PGP 9.5), satellite cells (Vimentin), 5-HT3-receptors and cholinergic synapses (VAChT, Synaptophysin) were labelled. An average of 31 (SD=22) mast cells per ganglion could be found. Serotonin immune responses were found in no cases regarding neurons, glial-cells and blood vessels. Distribution of mast cells was topographically homogeneous and correspondending with the superior cervical and the stellate ganglion. The pronounced intra- and extraganglionic accumulation of serotonergic mast cells along the perineurium was remarkable. Almost one fourth of the mast cells was localized directly there. RECA-1-positive blood vessels were distributed homogeneously in the sympathetic ganglia and were more frequently found than those which were GluT-1-positive. The mast cell was found at an average distance of 5 µm from the next RECA-1-positive blood vessel, but 30 µm from the next GluT-1-positive blood vessel. The diameter of the blood vessel next to the mast cell was 22 µm (SD 10 µm). By means of the wall structure most of these blood vessels were identified as postcapillary venules. 5-HT2A-receptors were found on a part of the RECA-1-positive blood vessels increasing significantly with the diameter of the blood vessels and being identified as postcapillary venules. The 5-HT3-receptor could be immunohistologically detected on peri-karya, within the neuropil and on satellite cells but not on cholinergic presynapses. Mast cells can be activated in sympathetic ganglia immunologically as well as through neuropeptides (i.e. SP and CGRP). Predominantly endothelia of post-capillary venules carry 5-HT2A-receptors; a serotonergic increase of permeability by the mast cell ist therefore possible. It is commonly known that mast cells of the peripherial nerve may influence via serotonin 5-HT2A-receptors of the Schwann-cells and the blood vessels. Possibly the mast cell influences by serotonin the function of satellite-cells carrying the 5-HT3-receptor. Serotonin causes a depolarisation within the superior cervical and stellate ganglia and can therefore be regarded as a physiological co-transmitter of sympathetic ganglia alongside Acetylcholine. For the phase of induction and the phase of maintenance of tetanic induced LTP within the superior cervical ganglion the activation of 5-HT3-receptors is even essential. Moreover it is known that specific immunological acti-vation of resident mast cells causes the so-called antigen-induced LTP. Conclusion: The localisation of mast cells and the 5-HT2A- and 5-HT3-receptors suggests a serotonin-moderated regulation of blood vessel permeability and of neuronal excitability through mast cells within sympathetic ganglia.

Die Fibrose der Wand der Samenkanälchen ist eine seit langem bekannte typische Veränderung bei Männern mit Spermatogenesedefekten, deren Ursache und deren direkte Konsequenz aber nicht bekannt sind. Da im Hoden von Männern mit Spermatogenesestörungen deutlich vermehrt Mastzellen vorkommen, von denen viele aktiviert und degranuliert sind, ist zu erwarten, daß Produkte der Mastzellen freigesetzt werden. Wir stellen die Hypothese auf, daß sie an der Entstehung der Tubulusfibrose und der Spermatogenesestörung beteiligt sind. Untersuchungen in menschlichen Zellkulturen zeigten, daß Tryptase, das Hauptprodukt der Mastzellen, die Bildung von COX-2 und von Prostaglandinen stimuliert. Bestimmte Prostaglandine (J2/15dJ2) stimulieren dann über ihren Rezeptor (PPARgamma) das Fibroblastenwachstum, eine Voraussetzung für die Fibrose. Diese Ergebnisse sind für krankhafte Bindegewebsumbauvorgänge und speziell für die Tubulusfibrose bei Spermatogenesedefekten von Bedeutung: Bei Spermatogenesedefekten fanden wir, daß Mastzellvermehrung und Aktivierung mit der Expression von COX-2 in interstitiellen Zellen einhergehen. Bei Hoden mit normaler Spermatogenese (und nur wenigen Mastzellen) war COX-2 dagegen nicht nachweisbar. Rezeptoren für Tryptase sind auf interstitiellen Zellen und relevante Prostaglandinrezeptoren auf peritubulären Zellen nachweisbar. Es ist demnach möglich, daß Mastzelltryptase COX-2- und Prostaglandinbildung im infertilen Hoden anregt und dies letztlich zur Fibrose in der Tubuluswand führt, eine Veränderung, die sicherlich zur Spermatogenesestörung beiträgt. Die Aufklärung des Signalweges der Tryptase erlaubt es erstmals auch, gezielt über eine Beeinflussung des Fibroseprozesses nachzudenken: Mastzellstabilisatoren, Antagonisten von Tryptase, von COX-2 oder PPARgamma bieten sich an. Fibrotic thickening of the wall of the seminiferous tubules is a hallmark of male infertility, but neither causes nor the direct consequences of tubular fibrosis are known. Since male infertility is also associated with increased numbers of activated mast cells, we propose that secreted mast cell products may be involved in the pathogenesis of tubular fibrosis and possibly male infertility. Evidence for this hypothesis is derived from cell culture and ex-vivo experiments: We found that actions of the major mast cell product, tryptase, includes formation of COX2 and synthesis of prostaglandins in target cells. Prostaglandin J2/15dJ2, which act via their receptor (PPARgamma), are responsible for fibroblast proliferation, a prerequisite of fibrosis. This may be of relevance for fibrosis in general and for testicular tubular fibrosis in particular: We found COX2 in testes of infertile men, but not of men with normal spermatogenesis, implying formation and action of prostaglandins. Since peritubular cells bear PPARgamma and since activated mast cells are at least tripled in infertile men, we propose a chain of events initiated by mast cell tryptase eventually leading to tubular fibrosis. Since tubular fibrosis is likely to be involved in the process leading to the damage of spermatogenesis, these results may pinpoint new targets for possible therapeutic interventions: mast cells, tryptase, COX2 and prostaglandins, as well as PPARgamma. Fil: Mayerhofer, Artur. Universitat Technical Zu Munich; Alemania Fil: Meineke, V.. Sanitätsakademie der Bundeswehr; Alemania Fil: Weidinger, S.. Universitat Technical Zu Munich; Alemania Fil: Köhn, F. M.. Universitat Technical Zu Munich; Alemania Fil: Frungieri, Monica Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina

This studie was designed to discover the influence of a perioperative prophylaxis with H1 and H2 receptor antagonists on postoperative abdominal infection. Studies were performed with large samples of rats following the concept of clinic modelling randomised trials (CMRT). ?Clinic modelling? means not only modelling medical details like drug regimes or surgical procedures but also consideration of rules for performance of prospective randomised trials. The CMRT?s are a new approach to analyse drugs and therapies in an intermediate stage between preclinical and clinical studies.The results of the studies show a optimum combination of dimetinden and cimitidin as antihistamines, in the next series there was a slight tendency towards higher survival in the single shot group compared with the group who got antihistamines on the following days, too. This result appeared under low and high mortality rate. Prophylaxis with cimetidin alone without H1-antagonist could not show a improvement of survival. The results of the definitive studies show a significant higher survival of the antihistamine-group compared with the placebo-group. This result was found with low and high mortality of placebo-group. The antibiotic in all studies above was co-amoxiclav. The surprising result of another studie with exactly the same setting but levofloxacin and metronidazol as antibiotics failed to show a gain in survival but showed a higher mortality compared with the placebo-group. This result may be caused due to interactions between the antibiotics and immune system or due to different pattern in LPS liberation. Ther were found similar differences between various antibiotics and immunemodulation with G-CSF,too. As a result of the studies the CMRT seem to be a promising new approach to analyse drugs and therapies in an intermediate stage between preclinical and clinical studies. A prophylaxis with a combination of cimetidin and dimetinden in exactly predefined clinical settings may show an advantage, but a prophylaxis with antihistamines can not be recommended in general.This studie was designed to discover the influence of a perioperative prophylaxis with H1 and H2 receptor antagonists on postoperative abdominal infection. Studies were performed with large samples of rats following the concept of clinic modelling randomised trials (CMRT). ?Clinic modelling? means not only modelling medical details like drug regimes or surgical procedures but also consideration of rules for performance of prospective randomised trials. The CMRT?s are a new approach to analyse drugs and therapies in an intermediate stage between preclinical and clinical studies.The results of the studies show a optimum combination of dimetinden and cimitidin as antihistamines, in the next series there was a slight tendency towards higher survival in the single shot group compared with the group who got antihistamines on the following days, too. This result appeared under low and high mortality rate. Prophylaxis with cimetidin alone without H1-antagonist could not show a improvement of survival. The results of the definitive studies show a significant higher survival of the antihistamine-group compared with the placebo-group. This result was found with low and high mortality of placebo-group. The antibiotic in all studies above was co-amoxiclav. The surprising result of another studie with exactly the same setting but levofloxacin and metronidazol as antibiotics failed to show a gain in survival but showed a higher mortality compared with the placebo-group. This result may be caused due to interactions between the antibiotics and immune system or due to different pattern in LPS liberation. Ther were found similar differences between various antibiotics and immunemodulation with G-CSF,too. As a result of the studies the CMRT seem to be a promising new approach to analyse drugs and therapies in an intermediate stage between preclinical and clinical studies. A prophylaxis with a combination of cimetidin and dimetinden in exactly predefined clinical settings may show an advantage, but a prophylaxis with antihistamines can not be recommended in general., Die vorliegende Studie befasst sich mit der Frage nach der Wirkung einer perioperativen Antihistaminika-Prophylaxe auf das Überleben bei postoperativer Kontamination und Infektion (Peritonitis und Sepsis) im Rahmen von Klinik modellierenden , randomisierten Tierstudien (CMRT) in der Ratte. Es wurde dabei ein Tierversuchsmodell etabliert, das sich nicht nur im Hinblick auf medizinische Details sondern auch bei den Standards für die Durchführung prospektiver, randomisierter, klinischer Studien an den Verhältnissen in der Klinik orientiert. Zielsetzung war es hierbei, die Übertragbarkeit der in präklinischen Tierstudien gefundenen Ergebnisse auf den klinischen Bereich zu verbessern. In den Vorversuchen zeigte sich die einfache perioperative Prophylaxe sowohl bei hohem als auch bei geringem Schaden durch die gesetzte Infektion tendenziell überlegen gegenüber der Mehrfachgabe perioperativ und an den postoperativen Tagen. Die effektivste Dosiskombination wurde durch Variation der beiden verwendeten Antihistaminika (H1+H2-Rezeptorantagonisten) ermittelt, die Ergebnisse dienten zur Berechnung der Fallzahlen für die definitiven Versuche. Eine alleinige Cimetidin-Prophylaxe (H2-Blocker) erwies sich unter Austestung verschiedener Dosierungen als nicht wirksam. Die definitiven Versuche wurden mit der aus den Vorversuchen ermittelten wirksamsten Dosiskombination durchgeführt. Die benötigte Fallzahl wurde anhand der Überlebensraten aus den Vorversuchen errechnet. In den definitiven Studien zeigte sich eine signifikante Senkung der Mortalitätsraten für die getestete Antihistaminika-Kombination (0,1 mg/kg KG Dimetinden und 5 mg/kg KG Cimetidin) sowohl bei einer geringen als auch bei einer stärkeren Schädigung durch die Infektion. In der Gruppe mit geringerem Schaden konnte das Überleben von 75% in der Kontrollgruppe auf 100% in der Antihistaminika-Gruppe gesteigert werden. In der Gruppe mit stärkerem Schaden zeigte sich ein signifikanter Anstieg des Überlebens von 40% in der Kontrollgruppe auf 67% in der Antihistaminika-Gruppe. Da es sich bei den verwendeten Antihistaminika um langjährig etablierte Medikamente handelt, deren zu erwartendes Nebenwirkungsspektrum bekannt ist, erscheint der Schritt hin zur klinischen Studie nicht weit. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen Ergebnisse ermutigten uns zu einem solchen Schritt. Eine prospektive, randomisierte, doppelblinde klinische Studie an 80 Patienten mit kolorektalem Karzinom, konnte Ende 2002 abgeschlossen werden. In dieser Studie wurde der Immunmodulator G-CSF (Granulozyten-Kolonie-Stimulierender-Faktor) in Kombination mit verschiedenen Antibiotikaprophylaxen und einer H1+H2-Antihistaminkaprophylaxe gestestet. Die in den Klinik modellierenden präklinischen Studien ermittelten Einflüsse und Interaktionen von G-CSF, Antibiotikaprophylaxe und Antihistaminkaprophylaxe auf die postoperative Wiederherstellung und Lebnsqualität der Patienten konnten teilweise in der klinischen Studie bestätigt werden. Die mitunter konträren Wirkungen bei Verwendung verschiedener Antibiotika-Kombinationen in den präklinischen Untersuchungen implizieren eine genaue präklinische Überprüfung der Wirksamkeit für die jeweilige Medikamentenkombination im Vorfeld einer klinischen Studie. Durch die Ergebnisse der klinischen Studie konnte bestätigt werden, dass das Konzept der CMRT?s ein geeignetes Werkzeug zur präklinischen Überprüfung möglicher pharmakologischer und chirurgischer Interaktionen mit Einfluss auf das postoperative Outcome darstellt.

Stimulation of mast cells with appropriate antigen results in the rapid release of a large number of mediators of allergy from the cells. The cells possess cell surface receptors for the Fc portion of IgE which serve to transmit the signal of binding of an antigen by the IgE molecule to the interior of the cell. Since monovalent antigens are not capable of inducing mast cell secretion it is believed that crosslinking of IgE molecules by di-or polyvalent antigens represent the appropriate stimuli (Foreman 1980). These stimuli ultimately result in the release of two groups of mediators of allergy: preformed mediators, and secondary or newly formed mediators. Preformed mediators are stored in the mast cell granules and become released upon fusion of the granules with the plasma membrane; they include histamine, serotonin, chemotactic factors, lysosomal enzymes and heparin. Secondary mediators are synthesized only after stimulation of mast cells and then immediately released; they include prostaglandin D2, leukotrienes and platelet activating factor (Siraganian 1983).

Ein Erklärungsansatz für die Migräne-Pathophysiologie stellt die neurogene Inflammation der \(\textit {Dura mater}\) im Tiermodell dar. Diese ist gekennzeichnet durch die Plasmaproteinextravasation (PPE) und Vasodilatation, die durch Substanz P (SP) und \(\textit {calcitonin gene-related peptide}\) (CGRP) induziert werden. Die PPE kann in Mäusen experimentell in einem Maus Migräne-Modell durch den 5-HT\(_{2B/2C}\)-Agonisten meta-Chlorphenylpiperazin nach einer Sensitivierung durch eine Hypoxiebehandlung ausgelöst werden. Sowohl CGRP als auch SP können Mastzellen degranulieren, weswegen ihre Beteiligung an der neurogenen Inflammation Nahe liegt. Die Relevanz von Mastzellen in diesem Maus Migräne-Modell, die Abhängigkeit der Mastzelldegranulation vom 5-HT\(_{2B}\)-Rezeptor und eine mögliche Sensitivierung der Mastzellen durch Hypoxie wurden \(\textit {ex vivo}\) untersucht. Darüber hinaus wurden die murinen Mastzellen der \(\textit {Dura mater}\) charakterisiert und die Expression von verschiedenen Rezeptoren auf diesen Mastzellen analysiert.