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Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo Tese aguardando autorização para liberação do texto completo no Repositório da Produção Científica e Intelectual da UNICAMP Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar ação inseticida de Labramin, uma proteína que apresenta propriedades lectínicas, purificada de sementes de Labramia bojeri (Sapotaceae) sobre o inseto Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). Este lepidóptero é um dos principais predadores de produtos armazenados como milho, trigo, arroz e farinhas. Foi avaliado o efeito de Labramin sobre os diferentes estágios do desenvolvimento, parâmetros nutricionais, e o efeito sobre as duas principais enzimas envolvidas na digestão de proteínas (tripsina e quimiotripsina) desse inseto. Dietas artificiais foram preparadas misturando trigo integral, germe de trigo, farelo de trigo e levedura com 0,25, 0,5 e 1,0% (p/p) da proteína. Dietas livres de Labramin foram utilizadas como controle. Os seguintes índices nutricionais foram mensurados: eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD), digestibilidade aproximada (AD) e custo metabólico (CM). Os intestinos médios e fezes das larvas de 4° ínstar foram centrifugados e o sobrenadante utilizado nos ensaios enzimáticos. A atividade tríptica e quimiotríptica foi determinada usando como substratos BAPNA e SAAPPNA, respectivamente. Labramin 0,25% (p/p) afetou negativamente o crescimento e desenvolvimento de A. kuehniella, reduzindo o peso médio das larvas de 4° ínstar em 53% e prolongando a fase larval (14 dias) e pupal (2 dias). Apenas 43% das larvas neonatas alimentadas com Labramin 0,25% atingiram a fase adulta, enquanto o grupo controle aproximadamente 86% atingiu esse estágio. Labramin incorporada em dieta a 1% (p/p) provocou uma mortalidade de aproximadamente 90% das larvas. Larvas alimentadas com Labramin 0,25% mostraram baixos níveis de ECI e ECD e elevados níveis de AD e CM, demonstrando o potencial desta proteína inibir o consumo e a utilização do alimento. A atividade da enzima tripsina do fluido intestinal apresentou um aumento de 19%, bem como um aumento de 23 % na atividade dessa enzima nas fezes das larvas de 4° ínstar alimentadas com Labramin 0,25%. Estes resultados sugerem que Labramin afetou o mecanismo de reciclagem desta enzima. Em relação à atividade quimiotríptica, diferenças não significativa foram verificadas entre os tratamentos, tanto no intestino médio como nas fezes. Verificou-se através de ensaio de digestibilidade in vitro que Labramin é resistente à proteólise pelas enzimas digestivas deste inseto. Assim, Labramin é uma proteína que potencialmente poderá ser utilizada no combate de A. kuehniella e de outras pragas Abstract: The objective of this work was to study insecticidal action of Labramin, a protein that showing lectin properties obtained from Labramia bojeri (Sapotaceae) seeds, on the development of Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). This Lepidoptera is one of the main predators of stored products such as corn, wheat, rice and flours. The effect of Labramin was evaluated for different stages of development, nutritional parameters, and its effect on the two main enzymes involved in the digestion of proteins (trypsin and chymotrypsin) by this insect. Artificial diets were prepared mixing whole wheat flour, wheat husks, wheat and yeast with 0.25, 0.5 and 1.0% (w/w) of the protein. Diets free of Labramin were prepared as control. The following nutritional indexes were measured: efficiency of conversion of ingested food (ECI), efficiency of conversion of digested food (ECD), approximate digestibility (AD) and metabolic cost (MC). Midguts and feces of the larvae (4° ínstar) were centrifuged and the supernatants utilized in the enzymatic assays. Trypsin and chymotrypsin activity were determined using BAPNA and SAAPPNA, respectively, as substrate. Labramin 0.25% affected the growth and development of A. kuehniella negatively, reducing the mean weight of the larvae of 4° ínstar by 53% and prolonging the larval (14 days) and pupal phase (2 days). Only 43% of the neonatal larvae fed with Labramin 0.25% reached the adult phase, while for the group controls approximately 86% reached this stage. Labramin-fed 0.25% larvae showed a decrease in levels of ECI and ECD, and increase in levels of AD and MC, demonstrating the potential of this protein to inhibit consumption and utilization as food. The activity of the enzyme trypsin of the intestinal fluid presented an increase of 19%, as well as an increase of 23% in the activity of this enzyme in the feces of the larvae of 4° ínstar fed with Labramin 0.25%. These results indicate that Labramin affected the mechanism of recycling of this enzyme. In relation to the chymotryptic activity, not significant differences were verified among the treatments, both for the medium intestine and the feces. It was verified through an in vitro digestibility assay that Labramin is resistant to proteolysis by the digestive enzymes of this insect. Therefore, Labramin is a protein that can potentially be used in the combat of A. kuehniella Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Diego Stéfani Teodoro Martinez Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia Resumo: Há um crescente interesse voltado para o desenvolvimento tecnológico de produtos e processos inovadores utilizando nanomateriais multifuncionais. Contudo, é necessário entender os potenciais impactos e riscos desses materiais nanométricos sobre organismos vivos e meio ambiente. De fato, compreender os efeitos toxicológicos de nanomateriais durante seu ciclo de vida é fundamental para a exploração desses materiais em bases seguras e sustentáveis. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo principal estudar a toxicidade de nanomateriais do tipo óxido de grafeno (GO) e nanopartículas de óxido ferro (Fe3O4 NPs) sobre o organismo modelo Caenorhabditis elegans. No Capítulo 1 foi realizado uma revisão de literatura sobre o C. elegans em nanotoxicologia, incluindo suas vantagens, limitações e perspectivas futuras para seu emprego em protocolos de avaliação de segurança química. No Capítulo 2 foi dedicado para o estudo comparativo da toxicidade do GO e seu derivado degradado com água sanitária ou hipoclorito de sódio comercial (NaClO-GO), e onde também foi realizada uma integrada caracterização físico-química desses nanomateriais. Basicamente, verificamos que após a degradação química do GO, há uma drástica redução da sua toxicidade (mitigação) sobre o C. elegans, esses resultados sugerem que o hipoclorito de sódio pode ser um método de baixo custo, simples e efetivo em tratamento de resíduos e efluentes contendo materiais de grafeno. No Capítulo 3, realizamos o estudo da toxicidade de Fe3O4 NPs funcionalizadas com calixareno (Fe3O4@Calix) e modificadas com um complexo de tenoiltrifluoroacetona e európio (Fe3O4@Calix-TTA-Eu), na presença e ausência de matéria orgânica natural (NOM). A interação com NOM aumentou a estabilidade coloidal das nanopartículas estudadas em água mineral reconstituída e reduziu a toxicidade de ambas frente ao C. elegans, possivelmente devido a formação da "eco-corona" sobre a superfície das nanopartículas. Com base nos resultados obtidos neste trabalho podemos concluir que o C. elegans é um modelo biológico estratégico para triagem da toxicidade de diferentes tipos de nanomateriais, bem como de seus produtos de degração e transformações no ambiente na busca de melhores abordagens para mitigação da toxicidade e entendimento do ciclo de vida dos nanomateriais para apoiar a exploração tecnológica desses novos materiais com responsabilidade, segurança e sustentabilidade ambiental Abstract: There is growing interest focused on the technological development of innovative products and processes using multifunctional nanomaterials. However, it is necessary to proactively understand the potential impacts and risks of these nanometric materials on living organisms and the environment. In fact, understanding the toxicological effects of nanomaterials during their life cycle is essential for the exploration of these materials on a safe and sustainable basis. In this context, this work had as main objective to study the toxicity of graphene oxide (GO) nanomaterials and iron oxide nanoparticles (Fe3O4 NPs) on the model organism Caenorhabditis elegans. In Chapter 1, a literature review on C. elegans in nanotoxicology was carried out, including its advantages, limitations and future perspectives for its use in chemical safety assessment protocols and regulations. In Chapter 2, it was dedicated to the comparative study of the toxicity of GO and its derivative degraded with bleach or commercial sodium hypochlorite (NaClO-GO), and where an integrated physical-chemical characterization of these nanomaterials was also carried out. Basically, we found that after the chemical degradation of GO, there is a drastic reduction in its toxicity (mitigation) on C. elegans, these results suggest sodium hypochlorite may be an inexpensive, simple and effective method in treating waste and effluents containing graphene materials. In Chapter 3, we performed the toxicity study of Fe3O4 NPs functionalized with calixarene (Fe3O4 @ Calix) and with thenoyltrifluoroacetone an europium complex (Fe3O4@Calix-TTA-Eu ), in the presence and absence of natural organic matter (NOM). The interaction with NOM increased the colloidal stability of the studied nanoparticles in reconstituted mineral water and reduced the toxicity of both against C. elegans, possibly due to the formation of an "eco-corona" on the surface of the nanoparticles. In this way, based on the results obtained in this work, we can conclude that C. elegans is a strategic model for screening the toxicity of different types of nanomaterials, as well as their products for degeneration and transformations in the environment in the search for better approaches to mitigate toxicity associated with understanding the life cycle of nanomaterials, to support the technological exploration of these new materials with responsibility, safety and environmental sustainability Doutorado Ambiente Doutor em Tecnologia CAPES 23038006737/2012-53 FAPESP

Orientador: Diego Stéfani Teodoro Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de nanopartículas óxido de ferro em biodigestores anaeróbios de vinhaça (maior resíduo agroindustrial brasileiro oriundo da produção de etanol e açúcar), visando o aumento da produção de biogás (bioenergia). Inicialmente, as nanopartículas foram sintetizadas pelo método de co-precipitação em escala laboratorial (reatores de 2 L), e em seguida, foi realizado o escalonamento desta síntese empregando reatores de 40 L. As nanopartículas produzidas e dispersões foram caracterizadas através das seguintes técnicas: TEM, XRD, FTIR, TGA, UV-Vis, DLS, DCS e SQUID. As nanopartículas obtidas (11-17 nm) foram incubadas em biodigestores anaeróbios de vinhaça para avaliação do volume de biogás produzido e atividade metanogênica específica (AME). Ao longo deste trabalho foram utilizados biodigestores contendo 800 mL de lodo ativo microbiológico, 1000 mL de vinhaça bruta e dispersões contendo as nanopartículas. Após a padronização do funcionamento dos biodigestores, foram realizados experimentos comparativos de biodigestão da vinhaça para avaliação do efeito das nanopartículas produzidas em diferentes concentrações: 60, 120, 240, 270, 300, 500 e 1000 ppm. Nossos resultados demonstraram que a melhor concentração de nanopartícula foi 270 ppm, onde verificamos um aumento na produção de biogás/AME, com taxas variando de 5% até 57% de aumento. Contudo, estes resultados demonstram uma baixa reprodutibilidade do sistema empregado (biodigestores de batelada). Através de análises quantitativas do teor de ferro pela técnica de ICP-OES, foi demonstrado que as nanopartículas ficam acumuladas principalmente no lodo microbiológico e apresentam uma baixa taxa de dissolução na vinhaça. A interação entre os microrganismos e as nanopartículas precisa ser melhor elucidada, uma vez que foi verificado aumento na produção de biogás e não foi verificado toxicidade para o digestor anaeróbio após adição das nanopartículas, mesmo em altas doses (1000 ppm). Todavia, é recomendado a continuidade deste trabalho empregando biodigestores de vinhaça de fluxo contínuo. Com base nos resultados experimentais obtidos, concluímos que as nanopartículas de óxido de ferro são promissoras nanomateriais para aplicação em biodigestores anaeróbios de vinhaça para aumento da produção de biogás e geração de energia limpa e renovável Abstract: The main objective of this work was to evaluate the effects of iron oxide nanoparticles addition in anaerobic biodigestors of vinasse (the largest Brazilian agroindustry residue from production of ethanol and sugar), aiming to increase the production of biogas (bioenergy). Initially, the nanoparticles were synthesized by the co-precipitation method on a laboratory scale (2 L reactors), and then the synthesis was performed using 40 L reactors. The produced nanoparticles and dispersions were characterized by the following techniques: TEM, XRD, FTIR, TGA, UV- vis, DLS, DCS and SQUID. The nanoparticles obtained (11-17 nm) were incubated in the vinasse biodigesters to evaluate the volume of biogas produced and the specific methanogenic activity (AME). During this project, biodigesters containing 800 mL of microbiological active sludge, 1000 mL of crude vinasse and formulations containing the nanoparticles were used. After the standardization of the biodigesters operation, comparative experiments of vinasse biodigestion were carried out to evaluate the effect of the nanoparticles produced at different concentrations: 60, 120, 240, 270, 300, 500 and 1000 ppm. Our results demonstrated that the best nanoparticle concentration was 270 ppm. In this concentration, it was observed an increase in biogas/AME production, with rates ranging from 5% to 57%. However, these results demonstrate a low reproducibility of the system used (batch biodigesters). By means of quantitative analyzes of the iron content by the ICP-OES technique, it was demonstrated that the nanoparticles accumulate mainly in the microbiological sludge and present a low dissolution/leaching rate in the vinasse. Thus, the interaction between microorganisms and nanoparticles is promising and needs to be better elucidated, since there was an increase in biogas production and no toxicity of the nanoparticles applied at anaerobic digester was verified, even at high doses (1000 ppm). However, the continuity of this work using continuous flow system biodigesters is recommended. Finally, we concluded that iron oxide nanoparticles are promising nanomaterials to be applied in anaerobic biodigestors of vinasse for enhancing the biogas production towards clean and renewable energy generation Mestrado Ciência dos Materiais Mestre em Tecnologia

Orientador: Diego Stéfani Teodoro Martinez Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia Resumo: Neste trabalho foi estudada a interação do óxido de grafeno (GO) com soro fetal bovino (SFB) em meio de cultura de células, visando entender a formação da protein corona sobre a superfície destes materiais e seus impactos na citotoxicidade. Inicialmente foi realizado um estudo comparativo da interação de GO single-layer (GO-SL) e multi-layer (GO-ML) com SFB em meio de cultura DMEM, sendo observado que: (i) a composição da protein corona de SFB depende não apenas das propriedades físico-químicas do GO, mas também de seu comportamento coloidal em meio de cultura; (ii) as proteínas adsorvidas pelos materiais de GO variaram em quantidade (394 no GO-SL e 290 no GO-ML), tipo (115 exclusivas do GO-SL e 11 do GO-ML) e nas funções desempenhadas pelas proteínas (GO-SL enriqueceu proteínas envolvidas em processos metabólicos e transdução de sinais; e o GO-ML proteínas envolvidas no desenvolvimento/estrutura celular e processos metabólicos/transporte de lipídeos). Em seguida, foi avaliado o efeito do GO-SL sobre queratinócitos humanos (HaCat) na ausência e presença de protein corona de SFB e de albumina sérica bovina (BSA). Os principais resultados obtidos foram: (i) a formação da protein corona reduziu, mas não inibiu completamente a toxicidade do GO, tendo sido observado redução da viabilidade celular após 72h de exposição e alteração nas proteínas secretadas pelas células; (ii) a internalização do GO, as proteínas secretadas pelas células expostas ao GO, e a ativação ou inibição de vias de sinalização/mecanismos de toxicidade, variaram em função da presença ou ausência, e da composição da protein corona; (iii) além dos mecanismo já descritos na literatura, como estresse oxidativo, alteração do ciclo celular e disfunção mitocondrial, a análise do secretoma identificou novos mecanismos/vias de sinalização como indução da transição de células epiteliais em mesenquimais e ativação de receptores de hidrocarbonetos de arila. Desse modo, os resultados obtidos neste trabalho enfatizam a importância de se realizar uma caracterização avançada do GO e de sua interação com meio de cultura e SFB durante estudos nanotoxicológicos in vitro, uma vez que estas interações geram impactos na dosimetria (dose real de GO que chega até as células) e na resposta celular em função da composição da protein corona. Este trabalho contribuiu para a caracterização proteômica da protein corona de SFB em materiais de óxido de grafeno e na investigação dos mecanismos de toxicidade em células HaCat, e do papel da composição da protein corona no desencadeamento destes mecanismos Abstract: The interaction of graphene oxide materials (GO) with fetal bovine serum (FBS) in cell culture medium was evaluated in order to understand the protein corona formation and its impacts on cytotoxicity. First, it was performed a comparative study on single-layer GO (SL-GO) and multi-layer GO (ML-GO) interaction with FBS, and it was observed that: (i) the protein corona composition depends not only on GO physicochemical properties, but also on GOs behavior in the cell culture medium; (ii) the proteins adsorbed by GO materials have varied in quantity (394 on SL-GO and 290 on ML-GO), type (115 exclusive proteins on SL-GO and only 11 on ML-GO) and biological functions (SL-GO enriched proteins involved in metabolic processes and signal transduction, while ML-GO enriched proteins involved in cellular development/structure, and lipid transport/metabolic processes). Then, the cytotoxicity of SL-GO was evaluated for human kerationocytes (HaCat), in the absence or presence of a protein coating from FBS proteins or bovine serum albumin (BSA). Our results have shown that: (i) the protein corona formation has reduced, but not completely avoided the GO cytotoxicity, once it was observed a decrease in cell viability after a 72h exposure and a variation on proteins secreted by cells; (ii) the GO internalization, the proteins secreted by cells exposed to GO, and the signaling pathways/toxic mechanisms activation or inibhition have varied as function of the presence or absence, as well as, the composition of the protein corona; (iii) besides the already recognized mechanisms such as oxidative stress, cell cycle arrest and mitochondrial disfuntion, the secretome analysis has identified new mechanisms/signaling pathways such as the epithelial-mesenchimal transition and the aryl hydrocarbon receptor signaling. Thus, our data highlight the importance to perform an advanced characterization of GO materials and their interaction with cell culture medium and FBS during in vitro nanotoxicological studies, once these interactions can impact on dosimetry (the effective dose of GO delivered to cells) and cellular response as function of protein corona composition. Finally, we have contributed to the proteomics characterization of FBS protein corona on GO materials and to investigate the GO toxic mechanisms and the role of protein corona composition on activation of such mechanisms Doutorado Ciência dos Materiais Doutora em Tecnologia CAPES 88882.143413/2017-01; 88881.188728/2018-01 CNPEM

Orientadores Marcos Akira D'Ávila, Diego Stéfani Teodoro Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica Resumo: Um método de síntese verde foi utilizado para a preparação de um compósito de nanopartículas de fibroína-prata (Fib-NPsAg) em meio aquoso. A metodologia é baseada na redução direta dos íons de prata de fibroína sem a adição de qualquer outro agente redutor. O espectro Raman da fibroína purificada é dominado por duas bandas mais fortes devido às ligações peptídicas, incluindo a vibração amida I a 1665 cm-1 (vibração de alongamento C = O principalmente), a vibração amida III a 1230 cm-1 (principalmente NH no plano de curvatura e vibrações de alongamento CN), e vibração de alongamento C?-C a 1085 cm-1. As imagens de microscopia eletrônica de varredura mostraram que o compósito Fib-NPsAg exibe uma estrutura hiper ramificada com tamanhos micrométricas entre 500-1000 ?m, que é formado como resultado de uma agregação hierárquica de pequenas unidades micrométricas fibroína-prata. Os espectros de absorção de UV-vis dos quatro colóides Fib-Ag exibiram bandas com diferentes intensidades e em posições de 415-445 nm, correspondendo à ressonância de plasma de superfície localizada (RPSL). A intensidade da banda RPSL e a sua posição são dependentes da condição experimental utilizada para a síntese do composto Fib-NPsAg. Este resultado sugere que a solução dialisada e sob agitação é a melhor condição para preparar o composto Fib-NPsAg, caso o objetivo é a obtenção de concentração elevada de prata. Íons Na+ e Ca2+ podem competir com os íons de prata por sítios de adsorção das fibras, que deve ser o que interfere significativamente no processo de redução de Ag+ para Ag0. Consequentemente, esta interferência conduz à formação do compósito Fib-NPsAg com baixa concentração de nanopartículas de prata. Além disso, pode-se concluir que a condição de agitação também é um parâmetro importante para esta abordagem sintética. A banda RPSL aumenta significativamente a sua intensidade para as soluções mantidas sob agitação, até mesmo para a solução sem a etapa de diálise Este resultado indica que a banda plasmon do compósito Fib-NPsAg pode ser ajustada alterando as condições experimentais, que é um parâmetro importante a ser controlada para aplicações plasmônicas deste composto. NPsAg foram sintetizadas utilizando AgNO3, gelatina, glicose e NaOH como precursor de prata, agente estabilizador, redutor e acelerador de reação, respectivamente. As nanopartículas sintetizadas foram caracterizadas por Espectroscopia UV-vis, Espalhamento de Luz Dinâmico e Microscopia Eletrônica de Transmissão (Transmission Electron Microscopy ¿ TEM). As NPsAg apresentram concentração inibitória mínima em concentrações baixas e atividade antimicrobiana contra uma bactéria gram-positiva (B. subtilis) e uma gram-negativa (E. coli). Porém, as nanopartículas de prata foram mais eficazes contra a bactéria B. subtilis. Além disso, não foi observada atividade antimicrobiana em soluções que não apresentavam as nanopartículas (controle), mostrando que a atividade antimicrobiana está diretamente relacionada com as NPsAg Abstract: A green synthesis method was used for preparation of fibroin-silver nanoparticles composite (Fib-NPsAg) in aqueous media. The methodology is based on the direct reduction of the silver ions by the fibroin without adding any other reducing reagent. The Raman spectrum of the degummed fibroin is dominated by the strongest bands due to the peptide bonds, including the amide I vibration at 1665 cm-1 (mainly C=O stretching vibration), the amide III vibration at 1230 cm-1 (mainly N-H in-plane bending and C-N stretching vibrations), and C?-C stretching vibration at 1085 cm-1. Scanning electron microscopy images showed that the Fib-NPsAg composite exhibit an hyperbranched structure with micrometric sizes between 500-1000 ?m, which is formed as a result of an hierarchical aggregation of micrometric silver-fibroin small unities. The UV-vis absorption spectra of the four Fib-Ag colloids exhibited bands with different intensities and positions at 415-445 nm, corresponding to the localized surface plasmon resonance (LSPR). The LSPR band intensity and its position are dependent on the experimental condition used for the synthesis of the Fib-NPsAg composite. This result suggests that the dialyzed solution under stirring is the best condition to prepare the Fib-NPsAg composite, if the objective is to obtain high silver concentration. Na+ e Ca2+ ions can compete with the silver ions by the adsorption sites of the fibers, which should be interfering significantly in the reduction process from Ag+ to Ag0. Consequently, this interference leads to the formation of the Fib-NPsAg composite with low concentration of silver nanoparticles. Moreover, it can be concluded that the stirring condition also is a significant parameter for this synthetic approach. The LSPR band significantly increase its intensity for the solutions kept under stirring, even for the solution without the dialyze step This result indicated that the plasmon band of the Fib-NPsAg composite can be tuned changing the experimental conditions, which is an important parameter to be controlled for plasmonic applications of this composite. NPsAg were synthesized using AgNO3, gelatin, glucose and NaOH as silver precursor, stabilizing agent, reducing agent and reaction accelerator, respectively. The nanoparticles synthesized were characterized by UV-vis spectroscopy, Dynamic Light Scattering and Transmission Electron Microscopy (TEM). NPsAg had minimal inhibitory concentration at low concentrations and antimicrobial activity against gram-positive (B. subtilis) and gram-negative (E. coli) bacteria. However, silver nanoparticles were more effective against B. subtilis bacteria. In addition, no antimicrobial activity was observed in solutions that did not present the nanoparticles (control), showing that the antimicrobial activity is directly related to the NPsAg Mestrado Materiais e Processos de Fabricação Mestre em Engenharia Mecânica