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Non-replicative recombinant HIV-1 derived lentiviral vectors (LV) are increasingly used in gene therapy clinical trials for various genetic diseases, infectious diseases or cancer. Before they are used in man, preparations of LV must undergo extensive biochemical and biological quality control testing. In particular, the legislation stipulates that the absence of replication-competent lentiviruses (RCL) must be demonstrated with suitable methods, on representative fractions of batches. Current standard and widely used methods based on cell culture are challenging because high titers of vector batches achieved translate into high volumes of cell culture that have to be tested. Since vector batch titers and sizes are continuously-increasing due to the improvement of production and purification methods, it is necessary to modify the current cell culture method. Here, we propose a practical optimization of the p24-decrease-based culture assay developed by Escarpe et al. (2003) using a pairwise pooling strategy enabling the test of higher vector inoculum volumes. These modifications significantly decrease material handling, operator time, leading to a cost effective method, while maintaining optimal sensibility of the RCL testing. This optimized RCL-pooling assay ameliorates the feasibility of the quality control of large-scale batches of clinical-grade LV while maintaining the same sensitivity.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) affects angiogenesis, atherosclerosis, and cancer. Although the heritability of circulating VEGF levels is high, little is known about its genetic underpinnings.Our aim was to identify genetic variants associated with circulating VEGF levels, using an unbiased genome-wide approach, and to explore their functional significance with gene expression and pathway analysis.We undertook a genome-wide association study of serum VEGF levels in 3527 participants of the Framingham Heart Study, with preplanned replication in 1727 participants from 2 independent samples, the STANISLAS Family Study and the Prospective Investigation of the Vasculature in Uppsala Seniors study. One hundred forty single nucleotide polymorphism (SNPs) reached genome-wide significance (P5×10(-8)). We found evidence of replication for the most significant associations in both replication datasets. In a conditional genome-wide association study, 4 SNPs mapping to 3 chromosomal regions were independently associated with circulating VEGF levels: rs6921438 and rs4416670 (6p21.1, P=6.11×10(-506) and P=1.47×10(-12)), rs6993770 (8q23.1, P=2.50×10(-16)), and rs10738760 (9p24.2, P=1.96×10(-34)). A genetic score including these 4 SNPs explained 48% of the heritability of serum VEGF levels. Six of the SNPs that reached genome-wide significance in the genome-wide association study were significantly associated with VEGF messenger RNA levels in peripheral blood mononuclear cells. Ingenuity pathway analyses showed found plausible biological links between VEGF and 2 novel genes in these loci (ZFPM2 and VLDLR).Genetic variants explaining up to half the heritability of serum VEGF levels were identified. These new insights provide important clues to the pathways regulating circulating VEGF levels.

Non disponible/Not available, L'hypertension est un facteur de risque cardiovasculaire important. Après avoir rassemblé les gènes et leurs polymorphismes susceptibles de moduler l'hypertension, y compris ceux impliqués en pharmacogénétique, nous avons approfondi dans ce travail un groupe de gènes et de leurs produits, les sélectines. Les sélectines (E-sélectine, P-sélectine et L-sélectine) sont des molécules d'adhésion localisées à la surface des cellules endothéliales activées et en surface des leucocytes. Elles participent à l'étape initiale du recrutement des leucocytes circulants qui précède leur migration vers la zone inflammatoire. Les sélectines sont impliquées dans de nombreuses pathologies parmi lesquelles les maladies cardio-vasculaires, les maladies inflammatoires et auto-immunes. Certains polymorphismes génétiques de la E-sélectine et de la P-sélectine sont associés à ces diverses pathologies. De même, les concentrations sanguines de ces molécules, reflet de leur expression cellulaire, sont augmentées en conditions pathologiques. Au sein d'une large population supposée saine (Cohorte Stanislas) nous avons montré que les facteurs environnementaux tels que l'âge, le sexe, la surcharge pondérale, et l'alcool sont susceptibles de modifier l'impact de polymorphismes de la E-sélectine sur la définition des niveaux de pression artérielle. Dans un second temps, nous avons étudié l'influence des polymorphismes génétiques de la E-sélectine et de la P-sélectine sur leur taux circulants. Bien qu'aucun des polymorphismes G98T, Serl28Arg et Leu554Phe, n'influencent le taux de E-sélectine, nous avons montré que les polymorphismes 599Val/Leu, 715 Thr/Pro, et N562D du gène de la P-sélectine influencent fortement la concentration en P-sélectine. Dans un troisième temps nous avons démontré qu'il existe des ressemblances familiales des concentrations en E-sélectine et P-sélectine, suggérant un rôle majeur de la génétique et de l'environnement partagé dans la régulation des concentrations de ces molécules d'adhésion. Enfin, nous avons débuté des études de transcriptomique et pour ce faire nous avons réalisé une banque de sang et de lymphocytes. L'ensemble de ces résultats permet de mieux comprendre la régulation physiologique de la E- sélectine et de la P-sélectine ainsi que les facteurs à prendre en compte lors d'études cliniques et pharmacologiques impliquant ces molécules. L'approche transcriptomique devrait par ailleurs renforcer la connaissance actuelle du lien entre le gène et la protéine.

In vivo gene therapy with adeno-associated viral (AAV) vectors is safe and effective in humans. We recently demonstrated that AAV8-mediated liver gene transfer is effective in animal models of mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI), a rare lysosomal storage disease that is caused by arylsulfatase B (ARSB) deficiency. In preparing for a first-in-human trial, we performed non-clinical studies to assess the safety of intravenous administrations of AAV2/8.TBG.hARSB produced under good manufacturing practice-like conditions. No toxicity was observed in AAV-treated mice, except for a transient increase in alanine aminotransferase in females and thyroid epithelial hypertrophy. AAV2/8.TBG.hARSB biodistribution and expression confirmed the liver as the main site of both infection and transduction. Shedding and breeding studies suggest that the risk of both horizontal and germline transmission is minimal. An AAV dose-response study in MPS VI mice was performed to define the range of doses to be used in the clinical study. Overall, these data support the non-clinical safety and efficacy of AAV2/8.TBG.hARSB and pave the way for a phase I/II clinical trial based on intravascular infusions of AAV8 in patients with MPS VI.