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Supplementary Figure 2

Purpose:Characterization of tumor antigen–specific CD4 T-cell responses in healthy donors and malignant melanoma patients using an in vitro amplified T-cell library screening procedure.Patients and Methods:A high-throughput, human leukocyte antigen (HLA)-independent approach was used to estimate at unprecedented high sensitivity level precursor frequencies of tumor antigen- and neoantigen-specific CD4 T cells in healthy donors and patients with cancer. Frequency estimation was combined with isolation and functional characterization of identified tumor-reactive CD4 T-cell clones.Results:In healthy donors, we report frequencies of naïve tumor-associated antigen (TAA)-specific CD4 T cells comparable with those of CD4 T cells specific for infectious agents (Tetanus toxoid). Interestingly, we also identified low, but consistent numbers of memory CD4 T cells specific for several TAAs. In patients with melanoma, low frequencies of circulating TAA-specific CD4 T cells were detected that increased after peptide-based immunotherapy. Such antitumor TAA-specific CD4 T-cell responses were also detectable within the tumor-infiltrated tissues. TAA-specific CD4 T cells in patients displayed a highly polyfunctional state, with partial skewing to Type-2 polarization. Finally, we report the applicability of this approach to the detection and amplification of neoantigen-specific CD4 T cells.Conclusions:This simple, noninvasive, high-throughput screening of tumor- and neoantigen-specific CD4 T cells requires little biologic material, is HLA class II independent and allows the concomitant screening for a large number of tumor antigens of interest, including neoantigens. This approach will facilitate the immunomonitoring of preexisting and therapy-induced CD4 T-cell responses, and accelerate the development of CD4 T-cell–based therapies.

The identification of patient-specific tumor antigens is complicated by the low frequency of T cells specific for each tumor antigen. Here we describe NeoScreen, a method that enables the sensitive identification of rare tumor (neo)antigens and of cognate T cell receptors (TCRs) expressed by tumor-infiltrating lymphocytes. T cells transduced with tumor antigen-specific TCRs identified by NeoScreen mediate regression of established tumors in patient-derived xenograft mice.

Predictions of epitopes presented by class II human leukocyte antigen molecules (HLA-II) have limited accuracy, restricting vaccine and therapy design. Here we combined unbiased mass spectrometry with a motif deconvolution algorithm to profile and analyze a total of 99,265 unique peptides eluted from HLA-II molecules. We then trained an epitope prediction algorithm with these data and improved prediction of pathogen and tumor-associated class II neoepitopes.

Selon le dernier rapport Lecocq les services de sante au travail (SST) tendent aujourd’hui a devoir repondre a une demande de plus en plus forte : mener des actions de prevention collectives dans le but de perenniser une politique de prevention globale dans les entreprises. Pour repondre a cette demande, infirmiers et medecins en sante au travail se sont coordonnes pour monter des projets adaptes et adaptables aux specificites des travailleurs. Des lors, comment et avec quels outils pouvons-nous aujourd’hui evaluer ces nouveaux types d’actions collectives ? A ce jour, nous avons pu rediger plusieurs comptes rendus d’actions et construire nos propres outils d’evaluation tels que des questionnaires de connaissances et de satisfaction. Les objectifs poses derriere les thematiques generales de prevention des risques permettent, apres une reflexion collective, de developper des objectifs specifiques. De ce fait, ces objectifs permettent par principe de cause a effet, d’elaborer des questionnaires exploitables en fin d’action. La specificite des SST permet aux equipes pluridisciplinaires de construire des questionnaires adaptes aux travailleurs mais aussi a leur environnement de travail et a leur jargon. Ces actions, basees non plus seulement sur des presentations formelles de prevention mais sur des outils pedagogiques tels que des jeux de plateaux ludiques, des peles-meles ou encore des jeux images, n’ont a ce jour plus vocation de transmettre des informations ascendantes. Des lors, l’evaluation de nos actions et des outils pedagogiques utilises semble primordiale afin d’entrer dans un processus de changement et de responsabilisation collective dans les entreprises. Dans ce contexte, le but des questionnaires n’est pas de developper des questions fermees mais d’obtenir des donnees exploitables par l’ensemble des SST telles que : des donnees sur les representations du risque, de l’interet de la thematique pour les participants, d’apprehender l’augmentation de connaissances engendree par l’intervention mais aussi d’envisager les actions futures telles que les moyens de prevention et les changements de pratiques individuelles souhaites etre mis en place en aval de ces actions. In fine, cette formalisation aurait pour but de : – valoriser le travail collectif ; – tracer nos actions de prevention afin d’y ajouter de la legitimite ; – permettre de travailler indirectement sur les representations ; – recueillir des donnees quantifiables et representatives des entreprises ; – partager des documents communs de travail ; – adapter et harmoniser les discours et les supports de travail ; – engager un echange constructif base sur des donnees concretes avec les employeurs afin de favoriser la prevention dans les entreprises.

Among immune correlates of clinical responses, tumor-specific neoantigens took the spotlight as relevant targets for cancer immunotherapy. The implementation of pipelines for personalized cancer therapy remains challenging due to the privacy, that is patient-specificity, of neoantigens and the low-frequency of neoantigen-specific T cells in blood and tumor samples. To overcome these obstacles, recent developments in the field of biotechnology have allowed the multiplexed identification of neoepitope-specific T cells. This review addresses the pros and cons of conventional neoantigen screening methodologies and highlights the current as well as the prospective biotechnological opportunities in the field.

Numerous neoepitope-based vaccination strategies are in testing for clinical use in the treatment of cancer. Rapid identification of immunostimulatory neoantigen targets hastens neoantigen vaccine development. Papers recently published in Nature Biotechnology describe two independent machine-learning-based algorithms that demonstrate improved identification of MHC class II-binding peptides. Herein, we outline the benefits of these algorithms and their implications for future immunotherapies.

CD4 T cells are key for priming and regulating immune recognition of infected and cancer cells, but predictions of class II epitopes have limited accuracy. We combined unbiased Mass Spectrometry-based HLA-II peptidomics with a novel motif deconvolution algorithm to profile and analyze a total of 99’265 unique HLA-II ligands. Our work demonstrates substantial improvement in the definition of HLA-II binding motifs and enhanced accuracy in class II epitope predictions.

Purpose: Characterization of tumor antigen–specific CD4 T-cell responses in healthy donors and malignant melanoma patients using an in vitro amplified T-cell library screening procedure. Patients and Methods: A high-throughput, human leukocyte antigen (HLA)-independent approach was used to estimate at unprecedented high sensitivity level precursor frequencies of tumor antigen- and neoantigen-specific CD4 T cells in healthy donors and patients with cancer. Frequency estimation was combined with isolation and functional characterization of identified tumor-reactive CD4 T-cell clones. Results: In healthy donors, we report frequencies of naïve tumor-associated antigen (TAA)-specific CD4 T cells comparable with those of CD4 T cells specific for infectious agents (Tetanus toxoid). Interestingly, we also identified low, but consistent numbers of memory CD4 T cells specific for several TAAs. In patients with melanoma, low frequencies of circulating TAA-specific CD4 T cells were detected that increased after peptide-based immunotherapy. Such antitumor TAA-specific CD4 T-cell responses were also detectable within the tumor-infiltrated tissues. TAA-specific CD4 T cells in patients displayed a highly polyfunctional state, with partial skewing to Type-2 polarization. Finally, we report the applicability of this approach to the detection and amplification of neoantigen-specific CD4 T cells. Conclusions: This simple, noninvasive, high-throughput screening of tumor- and neoantigen-specific CD4 T cells requires little biologic material, is HLA class II independent and allows the concomitant screening for a large number of tumor antigens of interest, including neoantigens. This approach will facilitate the immunomonitoring of preexisting and therapy-induced CD4 T-cell responses, and accelerate the development of CD4 T-cell–based therapies.

Objective Dietary proteins are sensed by hypothalamic neurons and strongly influence multiple aspects of metabolic health, including appetite, weight gain, and adiposity. However, little is known about the mechanisms by which hypothalamic neural circuits controlling behavior and metabolism sense protein availability. The aim of this study is to characterize how neurons from the mediobasal hypothalamus respond to a signal of protein availability: the amino acid l-leucine. Methods We used primary cultures of post-weaning murine mediobasal hypothalamic neurons, hypothalamic neurons derived from human induced pluripotent stem cells, and calcium imaging to characterize rapid neuronal responses to physiological changes in extracellular l-Leucine concentration. Results A neurochemically diverse subset of both mouse and human hypothalamic neurons responded rapidly to l-leucine. Consistent with l-leucine's anorexigenic role, we found that 25% of mouse MBH POMC neurons were activated by l-leucine. 10% of MBH NPY neurons were inhibited by l-leucine, and leucine rapidly reduced AGRP secretion, providing a mechanism for the rapid leucine-induced inhibition of foraging behavior in rodents. Surprisingly, none of the candidate mechanisms previously implicated in hypothalamic leucine sensing (KATP channels, mTORC1 signaling, amino-acid decarboxylation) were involved in the acute activity changes produced by l-leucine. Instead, our data indicate that leucine-induced neuronal activation involves a plasma membrane Ca2+ channel, whereas leucine-induced neuronal inhibition is mediated by inhibition of a store-operated Ca2+ current. Conclusions A subset of neurons in the mediobasal hypothalamus rapidly respond to physiological changes in extracellular leucine concentration. Leucine can produce both increases and decreases in neuronal Ca2+ concentrations in a neurochemically-diverse group of neurons, including some POMC and NPY/AGRP neurons. Our data reveal that leucine can signal through novel mechanisms to rapidly affect neuronal activity., Highlights • A neurochemically diverse group of mouse and human hypothalamic neurons rapidly sense and respond to l-leucine. • Leucine can produce neuronal activation or neuronal inhibition via distinct and novel Ca2+ signaling mechanisms. • Leucine activates 25% ARH POMC neurons. • Leucine inhibits 10% ARH NPY/AGRP neurons and reduces AGRP secretion from fasted mediobasal hypothalamic slices.

La schizophrénie est une maladie psychiatrique chronique, handicapante et invalidante, touchant près de 600 000 personnes en France. Cette psychose, caractérisée par une dissociation des différentes fonctions psychiques et mentales, d’une perte de contact avec la réalité et d’un repli sur soi, demeure une source majeure de handicap du fait de son retentissement sur le fonctionnement social des individus atteints. Les symptômes parfois très invalidants, les effets indésirables médicamenteux, le déni de la maladie (défaut d’insight) et le manque d’information, entrainent chez de nombreux patients une non observance au traitement, source majeure de rechutes et de ré-hospitalisations. Dans ce contexte, une démarche de psychoéducation s’avère indispensable et complémentaire à la prise en charge médicamenteuse, dans le but d’aider les patients à appréhender leurs troubles, améliorer leur prise de conscience de la maladie, favoriser l’observance et aider à prévenir les rechutes. La psychoéducation ne doit pas être réduite à une simple transmission d’informations théoriques, mais place le patient au centre de son apprentissage pour lui permettre de développer des compétences de « savoir-être » malade, de « savoir-faire » avec sa maladie, et d’acquérir un « savoir cognitif » propre à sa pathologie. Ce type d’intervention, de concept très proche de celui « d’Education Thérapeutique du Patient » (ETP), est répandu dans les Centres Médico-Psychologiques (CMP) et en Hôpital de jour (HDJ), à destination de patients stabilisés en voie de réinsertion socio-professionnelle, ainsi que de leurs familles. En revanche, les programmes de psychoéducation sont beaucoup plus rares en milieu hospitalier, centrés sur des patients difficiles au plus près de leur décompensation. De nos jours, tous les patients ne bénéficient pas encore d’un accompagnement psychoéducatif. Il semblerait que ce soit « service-dépendant », et qu’il y ait un manque de formation des équipes sur cette pratique. Le programme que nous avons créé et mis en place au centre hospitalier Henri Guérin de Pierrefeu du Var s’adresse justement à des patients schizophrènes hospitalisés en unité de soins sans consentement, afin de leur faire bénéficier d’un contenu éducatif au plus près de la crise. Le programme a été créé en 2016 par une équipe pluridisciplinaire et partiellement formée à l’ETP : deux médecins psychiatres, un interne en psychiatrie, trois infirmiers, un pharmacien et un interne en pharmacie. Quatre mois ont été nécessaires pour fixer les thèmes et les objectifs des séances, déterminer les méthodes d’intervention les plus pertinentes pour atteindre ces objectifs en s’adaptant aux contraintes de la pathologie, rechercher des outils pédagogiques adaptés à ce profil de patients, et créer des fiches pour protocoliser le programme et harmoniser les interventions. Il est très difficile de travailler sur des notions d’observance, d’alliance thérapeutique et de prévention des rechutes avec des patients qui n’ont pas conscience de leur maladie, voir qui refuse leur état de « malade ». Ce constat, impose de débuter le programme par une séance sur la maladie et son acceptation. Cette étape faite, un travail sur l’observance et l’alliance thérapeutique peut être mené, grâce à une séance sur les traitements médicamenteux. Ces notions sont complétées par une troisième séance sur l’hygiène de vie, complément indispensable aux traitements. Cette séance, placée au milieu du programme, possède un rôle pivot sur le fond et sur la forme. En plus de consolider les objectifs des deux premières séances, elle aborde un thème plaisant pour le patient et améliore l’alliance thérapeutique. En effet, il est agréable de parler de thèmes joyeux du quotidien (activités sportives et culturelles, alimentation, vie affective et sociale…) et de projets de vie, après avoir travaillé sur la maladie, qui est une séance émotionnellement difficile, et avant d’aborder la décompensation. La prévention des rechutes est travaillée au cours d’une quatrième séance, portant sur les symptômes d’une décompensation et les moyens pour y faire face. Pour finir, le programme se terminera par une cinquième séance visant à faire le point sur les notions importantes vues précédemment et à cibler individuellement les pistes d’amélioration à travailler pour intégrer la maladie dans sa propre vie. Afin d’évaluer l’impact de notre programme sur les objectifs souhaités, nous avons demandé aux patients consentants, et médicalement inclus, de remplir un questionnaire lors de la consultation médicale de présentation du programme, et au cours de la dernière séance. Ce questionnaireest une compilation des 18 questions du « Beliefs about Medicines Questionnaire », ou « échelle BMQ », et des 12 questions du « Helping Alliance Questionnaire de Luborsky », ou « HAQ Luborsky ». L’évaluation de notre programme porte sur l’évolution des réponses à ces 30 questions et montre dans l’ensemble : •Une amélioration de l’opinion que portent les patients sur le rôle, l’intérêt et la fiabilité vis à vis de leurs traitements médicamenteux •Une amélioration de la notion d’observance, et de la nécessité de maintenir cette bonne observance au long cours •Une amélioration de perception des patients vis-à-vis du rôle, de l’aide, de la confiance et de la relation qu’ils entretiennent avec l’équipe soignante. Ces résultats mettent en lumière l’intérêt d’une telle démarche éducative sur l’observance, l’alliance thérapeutique, et la prise de conscience du trouble, même au plus près d’une décompensation chez des patients présentant une forme grave de la maladie. D’une manière générale, la psychoéducation doit être considérée comme un complément indispensable aux traitements médicamenteux dans le rétablissement des patients schizophrènes. Cette démarche n’est en rien un remède miracle, tous les patients n’y adhérant pas ou ne s’en serviront pas dans leur vie future, mais peut contribuer à une meilleure intégration de la maladie dans la vie de bon nombre de patients. Le programme que nous avons créé ne doit pas être considéré comme une fin en soi. Une prise en charge psychoéducative en CMP, en HDJ ou au centre pénitentiaire devra être proposée aux patients dès leur sortie de l’hôpital afin de consolider leurs acquis et de poursuivre et approfondir leur apprentissage. Une meilleure articulation avec les acteurs de santé de ville devra ainsi être réalisée dans l’intérêt du patient. Cette continuité de prise en charge permettra également d’évaluer les modifications de comportements liés à l’observance dans la vie des patients une fois à l’extérieur.

Arnaud Marion. La représentation du poète dans les Elégies de Sannazar. In: Bulletin de l'Association Guillaume Budé, n°2,2012. pp. 155-178.

International audience; At the onset of meiosis, each chromosome needs to find its homologue and pair to ensure proper segregation. In Drosophila, pairing occurs during the mitotic cycles preceding meiosis. Here we show that germ cell nuclei undergo marked movements during this developmental window. We demonstrate that microtubules and Dynein are driving nuclear rotations and are required for centromere pairing and clustering. We further found that Klaroid (SUN) and Klarsicht (KASH) co-localize with centromeres at the nuclear envelope and are required for proper chromosome motions and pairing. We identified Mud (NuMA in vertebrates) as co-localizing with centromeres, Klarsicht and Klaroid. Mud is also required to maintain the integrity of the nuclear envelope and for the correct assembly of the synaptonemal complex. Our findings reveal a mechanism for chromosome pairing in Drosophila, and indicate that microtubules, centrosomes and associated proteins play a crucial role in the dynamic organization of chromosomes inside the nucleus.

International audience

Efforts to precisely identify tumor human leukocyte antigen (HLA) bound peptides capable of mediating T cell-based tumor rejection still face important challenges. Recent studies suggest that non-canonical tumor-specific HLA peptides derived from annotated non-coding regions could elicit anti-tumor immune responses. However, sensitive and accurate mass spectrometry (MS)-based proteogenomics approaches are required to robustly identify these non-canonical peptides. We present an MS-based analytical approach that characterizes the non-canonical tumor HLA peptide repertoire, by incorporating whole exome sequencing, bulk and single-cell transcriptomics, ribosome profiling, and two MS/MS search tools in combination. This approach results in the accurate identification of hundreds of shared and tumor-specific non-canonical HLA peptides, including an immunogenic peptide derived from an open reading frame downstream of the melanoma stem cell marker gene ABCB5. These findings hold great promise for the discovery of previously unknown tumor antigens for cancer immunotherapy., Non-canonical HLA-bound peptides from presumed non-coding regions are potential targets for cancer immunotherapy, but their discovery remains challenging. Here, the authors integrate exome sequencing, transcriptomics, ribosome profiling, and immunopeptidomics to identify tumor-specific non-canonical HLA-bound peptides.

In this study we present a novel microfluidic hydrodynamic trapping device to probe the cell-cell interaction between all cell samples of two distinct populations. We have exploited an hydrodynamic trapping method using microfluidics to immobilize a batch of cells from the first population at specific locations, then relied on hydrodynamic filtering principles, the flowing cells from the second cell population are placed in contact with the trapped ones, through a roll-over mechanism. The rolling cells interact with the serially trapped cells one after the other. The proposed microfluidic phenomenon was characterized with beads. We have shown the validity of our method by detecting the capacity of olfactory receptors to induce adhesion of cell doublets overexpressing these receptors. We report here the first controlled on-flow single cell resolution cell-cell interaction assay in a microfluidic device for future application in cell-cell interactions-based cell library screenings.